一种制备高纯度马蔺子甲素的方法.pdf

本发明制备高纯度马蔺子甲素的方法，其特征在于采用反相制备色谱法，包括在液相色谱柱中洗脱和洗脱流份的后处理过程，其中洗脱的条件是：样品：制备用马蔺子素溶液，是由马蔺子提取物分别经乙醇、乙腈溶解，析晶、过滤得到的，流动相：含水的乙腈溶液温度：20℃～30℃后处理过程：洗脱后含马蔺子甲素的洗脱流份，经结晶、过滤、洗涤、干燥即得。本发明具有制备产品纯度高，操作简易的特点。

1、  一种制备高纯度马蔺子甲素的方法，其特征在于采用反相制备色谱法，包括在色谱柱中洗脱和洗脱流份的后处理过程，
其中洗脱的条件是：
样品：制备用马蔺子素溶液，是由马蔺子提取物分别经乙醇、乙腈溶解，析晶、过滤得到的，
流动相：含水的乙腈溶液
温度：20℃～30℃
后处理过程：洗脱后含马蔺子甲素的洗脱流份，经结晶、过滤、洗涤、干燥即得。

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于制备用马蔺子素溶液的方法为：马蔺子提取物用无水乙醇回流温度下溶解，降温至35±5℃，保温2小时，过滤，滤液降温至零下15±5℃，结晶，过滤，滤饼减压干燥后，用乙腈溶解，溶解温度为50±5℃，降温至25±5℃，保温2小时，过滤，得制备用马蔺子素溶液。

3、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于流动相为含水的乙腈溶液，其中水的体积百分比为1至10。

4、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于后处理过程是将含马蔺子甲素的洗脱流份，于零下20±5℃结晶，过滤，零下20±5℃的乙腈洗涤，五氧化二磷为干燥剂室温减压干燥。

5、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述马蔺子提取物中含有马蔺子甲素83％～86％，马蔺子乙素9％～12％，均以质量百分数计。

一种制备高纯度马蔺子甲素的方法
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及使用反相制备色谱法制备高纯度马蔺子甲素。
背景技术
马蔺子素是由鸢尾科植物马蔺子中提取的主要抗癌活性成分，主要含马蔺子甲素和马蔺子乙素。
马蔺子甲素(I)的结构为：

马蔺子乙素(II)的结构为：

马蔺子素是山东新华制药股份有限公司与天津市医药科学研究所联合开发的西药二类新药，1996年上市，临床作为放疗增敏剂与放疗合用。
马蔺子甲素和马蔺子乙素二者结构相似，不易分离与测定。马蔺子素成分分离测定方法已报导的HPLC法：药物分析杂志，10(4)，1990，P230-232。提供的方法是以甲醇-水-乙腈-乙醚(65∶30∶20∶20)为流动相，但该流动相乙醚极易挥发，组分变动较大，不适合制备用。中草药，16(3)，1985，P5。提供的方法是以无水甲醇加入硝酸银(5×10^-2M)为流动相，但该流动相对仪器及色谱柱有损害，而且硝酸银不易从样品中除去，同样也不适合制备用。
马蔺子甲素也可以用全合成的方法制备出来：化学学报，47(9)，1989，P896-900。全合成路线比较长，试剂比较昂贵，难度较大。
使用反相制备色谱法制备高纯度马蔺子甲素至今未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备高纯度马蔺子甲素的方法，产品纯度高，操作简易。
本发明制备高纯度马蔺子甲素的方法，其特征在于采用反相制备色谱法，包括在液相色谱柱中洗脱和洗脱流份的后处理过程，
其中洗脱的条件是：
样品：制备用马蔺子素溶液，是由马蔺子提取物分别经乙醇、乙腈溶解，析晶、过滤得到的，
流动相：含水的乙腈溶液
温度：20℃～30℃
后处理过程：洗脱后含马蔺子甲素的洗脱流份，经结晶、过滤、洗涤、干燥即得。
使用的高效液相色谱柱是C-18制备色谱柱，直径为10mm，25mm；长度为250mm。有很多供应商能够生产这种性质的制备色谱柱，如Phenomenex公司等。
制备用马蔺子素溶液的制备：将采购的马蔺子种皮，经粉碎、用乙酸乙酯回流提取、过滤，滤液控温60℃以下，压力-0.07～-0.09MPa减压浓缩至干，用乙醇室温溶解，氧化铝柱层析，乙醇洗脱。洗脱液控温60℃以下，压力-0.07～-0.09MPa减压浓缩至原体积的二分之一，-20℃冷冻结晶，过滤得粗品。粗品通过石油醚、乙醇反复重结晶(50℃溶解，-20℃结晶)，得马蔺子提取物，其中马蔺子甲素83％～86％(W/W)，马蔺子乙素9％～12％(W/W)。
马蔺子提取物经预处理得制备用马蔺子素溶液。具体方法为：马蔺子提取物用无水乙醇回流温度下溶解，降温至35±5℃，保温2小时，过滤，滤液降温至零下15±5℃，结晶，过滤，滤饼减压干燥后，用乙腈溶解，溶解温度为50±5℃，降温至25±5℃，保温2小时，过滤，得制备用马蔺子素溶液。
马蔺子素各成分在固定相上吸附并被含有水的乙腈流动相洗脱，其中水的体积百分比为1％至10％，优选2％至6％，最优为3％至5％。
本发明的反相制备色谱方法在20℃至30℃下进行。较高温度对马蔺子甲素的稳定性有影响，较低温度容易析出结晶。
纯化后含马蔺子甲素的洗脱流份，于零下20±5℃结晶，过滤，零下20±5℃的乙腈洗涤，五氧化二磷为干燥剂室温减压干燥，得马蔺子甲素，HPLC法测定含量＞99％(面积归一化法)。
本发明的优点：
使用本发明方法制备马蔺子甲素，产品纯度高，操作简易。本发明提供的方法与文献提供的方法相比较具有如下特点：1)流动相组分合理。马蔺子甲素与马蔺子乙素结构相似，区别在于马蔺子甲素侧链第十位有一个双键，马蔺子乙素侧链为饱和碳链，其余部分完全相同。根据其结构差别，选择了乙腈/水作为流动相使两者得到了良好分离。样品在该流动相中溶解度较大，易于扩大进样量。该流动相对仪器及色谱柱无损害，稳定，适合制备用。2)含马蔺子甲素的洗脱流份，零下20±5℃结晶，过滤，零下20±5℃的乙腈洗涤，五氧化二磷为干燥剂室温减压干燥。不需要浓缩处理，避免了温度高，容易分解的现象。3)制备周期短。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的上述内容作进一步的详细说明。对于本领域的技术人员而言，不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例；凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
马蔺子提取物的制备过程(公知技术)：
将采购的马蔺子种皮，经粉碎、用乙酸乙酯回流提取、过滤，滤液控温60℃以下，压力-0.07～-0.09MPa减压浓缩至干，用乙醇室温溶解，氧化铝柱层析，乙醇洗脱。洗脱液控温60℃以下，压力-0.07～-0.09MPa减压浓缩至原体积的二分之一，-20℃冷冻结晶，过滤得粗品。粗品通过石油醚、乙醇反复重结晶(50℃溶解，-20℃结晶)，得马蔺子提取物，其中马蔺子甲素83％～86％(W/W)，马蔺子乙素9％～12％(W/W)。
制备用马蔺子素溶液的制备：
马蔺子提取物用无水乙醇回流溶解。马蔺子提取物的浓度为0.1g/mL，降温至35±5℃，保温2小时，过滤。滤液降温至零下15±5℃，结晶8小时，过滤。
滤饼减压干燥后，用乙腈溶解，马蔺子提取物的浓度为0.06g/mL，溶解温度为50±5℃，降温至25±5℃，保温2小时，过滤，得制备用马蔺子素溶液。
含量测定方法是按照国家食品药品监督管理局颁布的《国家药品标准》WS₁-(X-234)-2003Z公布的测定方法。
实施例1
上样组分：制备用马蔺子素溶液(含马蔺子甲素83％，马蔺子乙素12％)
固定相：十八烷基(C18)配体的硅胶
柱子：Phenomenex公司Luna色谱柱，250×10mm
流速：5mL/min
温度：20℃-30℃
检测波长：270nm
流动相：95％(v/v)乙腈水溶液
收集甲素峰的洗脱流份，零下20±5℃结晶24小时，过滤，零下20±5℃的乙腈洗涤三遍。五氧化二磷为干燥剂室温减压干燥至恒重。得马蔺子甲素，HPLC法测定含量99％(面积归一化法)。
实施例2
上样组分：制备用马蔺子素溶液(含马蔺子甲素85％，马蔺子乙素9％)
固定相：十八烷基(C18)配体的硅胶
柱子：Phenomenex公司Jupiter色谱柱，250×25mm
流速：10mL/min
温度：20℃-30℃
检测波长：270nm
流动相：97％(v/v)乙腈水溶液
收集甲素峰的洗脱流份，零下20℃～零下25℃结晶24小时，过滤。冷乙腈洗涤三遍。五氧化二磷为干燥剂室温减压干燥至恒重。得马蔺子甲素，HPLC法测定含量99％(面积归一化法)。