肿瘤抗原TRAG3模拟表位肽及其应用.pdf

本发明公开了肿瘤抗原TRAG-3模拟表位肽及其应用，该模拟表位肽由Ile-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Val所示的氨基酸序列组成，其中，第5位Asp为D-Asp或者第6位Ala为D-Ala；与TRAG-3天然表位肽相比，本发明的模拟表位肽具有更好的抗酶降解稳定性，与HLA-A2.1具有更强的亲和力，并且对TRAG-3阳性肿瘤细胞表现出更强的CTL特异性杀伤效应，可以用于制备治疗TRAG-3阳性肿瘤的多肽疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

1、  肿瘤抗原TRAG-3模拟表位肽，其特征在于：由Ile-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Val所示的氨基酸序列组成，其中，第5位Asp为D-Asp或者第6位Ala为D-Ala。

2、  权利要求1所述的肿瘤抗原TRAG-3模拟表位肽在制备治疗TRAG-3阳性肿瘤的多肽疫苗中的应用。

3、  根据权利要求2所述的肿瘤抗原TRAG-3模拟表位肽的应用，其特征在于：所述TRAG-3阳性肿瘤包括非小细胞肺癌、软骨肉瘤和黑色素瘤。

肿瘤抗原TRAG-3模拟表位肽及其应用
技术领域
本发明涉及一种肿瘤抗原模拟表位肽，特别涉及肿瘤抗原TRAG-3模拟表位肽，还涉及该模拟表位肽的应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病。其治疗方法主要包括手术切除、放射治疗和化学药物治疗，但这些方法对某些肿瘤特别是晚期恶性肿瘤的治疗效果还不尽如人意。近年来，肿瘤免疫治疗作为恶性肿瘤的第四种治疗方法得到迅速发展。已有大量文献报道，基于肿瘤抗原细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的肿瘤疫苗在体内可有效诱导特异性杀瘤CTL的产生，使部分患者的病情得到控制和缓解，而对正常组织无损害。因此，肿瘤疫苗的研制具有重要意义和良好的应用前景。
随着生物技术的发展，多种肿瘤抗原及其CTL表位被鉴定并成为肿瘤免疫学及肿瘤疫苗发展的基础。其中，肿瘤睾丸抗原(CT)家族是一类包含多个基因家族的肿瘤特异性共享抗原，广泛表达于多种实体瘤组织中，而在除睾丸、胎盘外的其他正常组织不表达。因其在肿瘤组织表达的特异性和在体内激发细胞免疫应答和体液免疫应答的有效性，CT抗原成为多种实体瘤特异性疫苗免疫治疗的首选抗原。
泰素耐药相关基因(TRAG-3)编码的TRAG-3是由Duan等在寻找泰素耐药基因时在泰素耐药的卵巢癌细胞株SKOVTR中发现的一个新CT抗原，在多种恶性肿瘤如非小细胞肺癌、软骨肉瘤和黑色素瘤中高表达，而在除睾丸组织外的其他正常组织(肝脏、肺脏、肾脏、胰腺、骨骼肌、胎盘、心脏和脑)中不表达。发明人在前期研究中发现，TRAG-3_58-66(ILLRDAGLV)为HLA-A2.1限制性CTL表位，该表位肽负载树突状细胞肿瘤疫苗在体外能够有效激发抗瘤CTL免疫反应。
但是，天然表位肽存在不易被抗原递呈细胞摄取，易被肽酶降解等缺陷，以其为基础构建的肿瘤多肽疫苗不能满足肿瘤免疫治疗的要求，必须对天然表位肽进行改造，以增加CTL免疫应答强度和抗肽酶降解能力。近年来，运用非天然氨基酸对生物活性肽进行化学修饰，研究其构效关系，进一步发展高效肽类似物，已成为多肽化学研究的重要手段和方向之一。运用这种方法已得到许多具有高活性、高选择性、半衰期长的肽类似物。因此，利用非天然氨基酸对天然表位肽进行改造，有望获得既能激发较强CTL免疫应答，又能抗肽酶降解的模拟表位肽。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于利用非天然氨基酸对TRAG-3天然表位肽(TRAG-3_58-66，ILLRDAGLV)进行改造，获得既能激发较强CTL免疫应答，又能抗肽酶降解的模拟表位肽；目的之二在于提供所得模拟表位肽的应用。
为达到上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种TRAG-3模拟表位肽，由Ile-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Val所示的氨基酸序列组成，其中，第5位Asp为D-Asp或者第6位Ala为D-Ala。
在本发明的第二方面，提供了所述TRAG-3模拟表位肽在制备治疗TRAG-3阳性肿瘤的多肽疫苗中的应用。
进一步，所述TRAG-3阳性肿瘤包括非小细胞肺癌、软骨肉瘤和黑色素瘤。
本发明的有益效果在于：研究结果显示，与TRAG-3天然表位肽相比，本发明的TRAG-3模拟表位肽具有更好的抗酶降解稳定性，与HLA-A2.1具有更强的亲和力，并且对TRAG-3阳性肿瘤细胞表现出更强的CTL特异性杀伤效应；因此，本发明的模拟表位肽可以用于制备治疗TRAG-3阳性肿瘤的多肽疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为TRAG-3模拟表位肽T1的空间结构模拟图；
图2为TRAG-3模拟表位肽T1与HLA-A2.1的复合物的空间结构模拟图；
图3为TRAG-3模拟表位肽T2的空间结构模拟图；
图4为TRAG-3模拟表位肽T2与HLA-A2.1的复合物的空间结构模拟图；
图5为TRAG-3模拟表位肽T1的质谱鉴定图；
图6为TRAG-3模拟表位肽T2的质谱鉴定图；
图7为TRAG-3模拟表位肽T1和T2与HLA-A2.1的亲和力检测结果图；
图8为TRAG-3模拟表位肽T1和T2的抗酶解稳定性检测结果图；
图9为TRAG-3模拟表位肽T1和T2对TRAG-3阳性肿瘤细胞的体外杀伤能力检测结果图；
图10为TRAG-3模拟表位肽T1和T2对TRAG-3阳性肿瘤细胞的体内杀伤能力检测结果图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、候选TRAG-3模拟表位肽的序列
将TRAG-3天然表位肽(TRAG-3_58-66，ILLRDAGLV，SEQ ID No.1)中各个位置的L-氨基酸分别单独用对应的D-氨基酸进行替换，获得9个候选TRAG-3模拟表位肽。
二、候选TRAG-3模拟表位肽的分子动力学模拟
1、分子模型构建
运用Silicon graphics工作站及Insight II软件包中的Discover 3.0模块(采用CVFF力场)，对9个候选TRAG-3模拟表位肽与HLA-A2.1的复合物进行分子动力学模拟。HLA-A2.1的初始坐标来自于蛋白质晶体结构数据库(Protein DataBank)中流感病毒蛋白M1_58-66与HLA-A0201的复合物(登录号为1HHI)，候选TRAG-3模拟表位肽是运用Bioploymer模块对流感病毒M1_58-66进行氨基酸替换而得。分子动力学模拟分五步进行：第一步，将HLA-A2.1与β2m固定，运用最陡下降法对候选TRAG-3模拟表位进行2000步优化计算，然后用共轭梯度法优化，直到能量均方根误差(RMS)小于第二步，在复合物周围加一层的水分子，并固定复合物对水分子进行2000步能量优化，以消除水分子之间以及水分子与蛋白质之间的不合理接触；第三步，对溶液状态下的复合物进行能量最小化计算，非键相互作用采用的截断值，先后运用最陡下降法和共轭梯度法优化，直到能量RMS小于第四步，在298K的恒定温度下进行20皮秒的分子动力学计算；第五步，对动力学优化得到的最后构象进行分子力学优化5000步，即得候选TRAG-3模拟表位肽与HLA-A2.1的复合物的最终构象。
2、结合特征参数计算
借助Homology模块，计算候选TRAG-3模拟表位肽中各残基的溶剂可及表面积、锚定残基间距及氢键数等结合特征参数。溶剂可及表面积的计算采用Lee和Richards定义的空间填充模型，选择水分子作为探针分子，溶剂半径选为0.14nm。各残基尤其是锚定残基的溶剂可及表面积越小，说明模拟表位肽与HLA-A2.1的嵌合越紧密。
结果：9个候选TRAG-3模拟表位肽中有2个(T1和T2)能够与HLA-A2.1紧密结合，T1和T2的空间结构模拟图及其与HLA-A2.1的复合物的空间结构模拟图见图1～4；T1和T2与HLA-A2.1的结合特征参数计算结果见表1。
表1候选TRAG-3模拟表位肽与HLA-A2.1的结合特征参数

三、候选TRAG-3模拟表位肽的合成、纯化及鉴定
候选TRAG-3模拟表位肽T1和T2的合成、纯化及鉴定委托深圳瀚宇药业有限公司进行，合成采用多肽合成仪与标准Fmoc方案，精氨酸采用两次偶联；纯化采用中压液相色谱仪；纯度鉴定采用反相高效液相色谱仪，分子量鉴定采用质谱仪。
结果：所得T1和T2的纯度均在95％以上，分子量测定值与理论值基本相符，质谱鉴定图见图5～6。
四、候选TRAG-3模拟表位肽与HLA-A2.1的亲和力检测
本实验使用HLA-A2.1表达阳性且内源性抗原加工处理能力缺失的T2细胞。实验原理为：T2细胞表面空载的HLA-A2.1表达极不稳定，呈递后很快降解，而结合了抗原肽的HLA-A2.1表达稳定，且抗原肽与HLA-A2.1的结合力越强，HLA-A2.1的表达量越高；因T2细胞的内源性抗原加工处理能力缺失，故T2细胞表面HLA-A2.1的表达量增加直观地反应了外源性抗原肽与HLA-A2.1的结合力。利用BB7.2杂交瘤细胞产生的鼠抗人HLA-A2.1单克隆抗体，采用间接荧光免疫法可以检测T2细胞表面HLA-A2.1的表达量。
T2细胞(购自ATCC公司)用含有质量分数为10％的胎牛血清的IMDM培养液在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下培养，每隔2～3天传代1次。BB7.2杂交瘤细胞用含有质量分数为10％的胎牛血清的DMEM培养液在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下培养，每隔2～3天传代1次，收集培养上清液，即得鼠抗人HLA-A2.1单克隆抗体。T2细胞用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，以1×10⁶/孔接种于12孔培养板中，加入候选TRAG-3模拟表位肽至终浓度为100μg/ml，同时设置空白对照(不加入候选TRAG-3模拟表位肽)，在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下共孵育18小时，离心弃上清，细胞沉淀用PBS洗涤后，加入鼠抗人HLA-A2.1单克隆抗体100μl，温度4℃孵育1小时，离心弃上清，细胞沉淀用PBS洗涤后，加入稀释度为1∶50的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG(购自Biolegend公司)100μl，温度4℃孵育30分钟，离心弃上清，细胞沉淀用PBS洗涤后，在流式细胞仪上检测平均荧光强度，检测波长为488nm，按照下述公式计算荧光系数(FI)：FI＝(样品平均荧光强度-空白对照平均荧光强度)/空白对照平均荧光强度，判断标准：FI＞1.5为高亲和力，1.0＜FI＜1.5为中等亲和力，1.0＞FI＞0.5为低亲和力。
结果：T1和T2与HLA-A2.1的亲和力检测结果见图7和表2，由图表可知，与天然表位肽相比，T1和T2与HLA-A2.1的亲和力更高。
表2候选TRAG-3模拟表位肽与HLA-A2.1的亲和力

五、候选TRAG-3模拟表位肽的抗酶降解稳定性检测
取HLA-A2.1阳性健康者的浓缩白细胞(购自西南医院血库)，每10ml中加入1000IE的肝素钠，低速离心分离血细胞，血浆于温度-20℃保存备用；在冰浴条件下向离心管中加入所得血浆190μl，再加入候选TRAG-3模拟表位肽至终浓度为50μg/ml，振荡1～2秒，温度37℃孵育，分别于第1、2、4、8小时取出20μl，加入冰冷的乙腈90μl，涡旋混匀终止孵育，冰上放置5分钟，再加入冰冷的质量分数为0.5％的乙酸溶液90μl稀释以确保酶解过程停止，13000g离心15分钟，收集上清液，过滤，取滤液进行高效液相色谱分析，按下述公式计算降解率：降解率(％)＝[(初始量-残留量)/初始量]×100。
结果：T1和T2的抗酶降解稳定性检测结果见图8和表3，由图表可知，与天然表位肽相比，T1和T2的抗酶降解稳定性更好。
表3候选TRAG-3模拟表位肽的抗酶降解稳定性

六、候选TRAG-3模拟表位肽对TRAG-3阳性肿瘤细胞的体外杀伤能力检测
1、效应细胞的制备
取HLA-A2.1阳性健康者的浓缩白细胞(购自西南医院血库)，用聚蔗糖-泛影葡氨分层液梯度离心法分离，获得外周血单个核细胞(PBMC)，用含有质量分数为10％的胎牛血清的PBS调整细胞浓度为1×10⁶/ml，接种至24孔培养板中，每孔0.5ml，加入候选TRAG-3模拟表位肽至终浓度为100μg/ml以及重组人白细胞介素-2(rhIL-2，购自Biolegend公司)至终浓度为30U/ml共培养，之后每周收集细胞，1000r/min离心5分钟，细胞沉淀按同样方法加入相同浓度的候选TRAG-3模拟表位肽和rhIL-2进行共培养，连续刺激PBMC 3次，收集细胞作为效应细胞；同时，以H2-K^k限制性小鼠肝炎病毒CTL表位肽(IEPYNGVI)作为阴性参照肽。
2、靶细胞的制备
将TRAG-3阳性的黑色素瘤细胞LB373-MEL(购自ATCC公司)用含有质量分数为10％的胎牛血清的IMDM培养液培养，作为靶细胞。
3、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验
将靶细胞调整细胞浓度为2×10⁵/ml，接种至96孔培养板中，每孔100μl，加入不同稀释度的效应细胞100μl使效靶比分别为20∶1、40∶1和80∶1，同时设置自然释放孔(加入培养液)和最大释放孔(加入终浓度为15μg/ml的植物血凝素)，在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下孵育3小时，加入LDH补充液及裂解液(LDH检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司)，继续孵育1小时，1000r/min离心10分钟，取上清液50μl，加入LDH反应液及显色液，室温避光孵育30分钟，加入LDH终止液，用酶标仪检测吸光度A值，按照下述公式计算特异性杀伤率：特异性杀伤率(％)＝(样品孔A值-自然释放孔A值)/(最大释放孔A值-自然释放孔A值)×100。
结果：T1和T2对黑色素瘤细胞的体外杀伤能力检测结果见图9和表4，由图表可知，与天然表位肽相比，T1和T2对黑色素瘤细胞的体外杀伤能力更强。
表4候选TRAG-3模拟表位肽对黑色素瘤细胞的体外杀伤能力

七、候选TRAG-3模拟表位肽对TRAG-3阳性肿瘤细胞的体内杀伤能力检测
1、实验动物
8～12周龄的HLA-A2.1转基因鼠，是将含有HLA-A2.1全长基因的EcoRI片段注射入C57BL/6小鼠的卵细胞而获得，购自重庆医科大学动物中心。
2、效应细胞的制备
于HLA-A2.1转基因鼠尾根部皮下注射经福氏不完全佐剂(购自Sigma公司)乳化的候选TRAG-3模拟表位肽，每只100μg，每周1次，连续3周，末次免疫后1周，处死小鼠，无菌条件下取脾脏，分离T淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的1640培养液调整细胞浓度为1×10⁶/ml，接种至24孔培养板中，每孔0.5ml，加入候选TRAG-3模拟表位肽至终浓度为100μg/ml以及rhIL-2(购自Biolegend公司)至终浓度为20U/ml共培养，7天后收集细胞作为效应细胞；同时，以H2-K^k限制性小鼠肝炎病毒CTL表位肽(IEPYNGVI)作为阴性参照肽。
3、靶细胞的制备
将TRAG-3阳性的黑色素瘤细胞LB373-MEL(购自ATCC公司)用含有质量分数为10％的胎牛血清的IMDM培养液培养，作为靶细胞。
4、LDH释放实验
将靶细胞调整细胞浓度为2×10⁵/ml，接种至96孔培养板中，每孔100μl，加入不同稀释度的效应细胞100μl使效靶比分别为20∶1、40∶1和80∶1，同时设置自然释放孔(加入培养液)和最大释放孔(加入终浓度为15μg/ml的植物血凝素)，在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下孵育3小时，加入LDH补充液及裂解液(LDH检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司)，继续孵育1小时，1000r/min离心10分钟，取上清液50μl，加入LDH反应液及显色液，室温避光孵育30分钟，加入LDH终止液，用酶标仪检测吸光度A值，按照下述公式计算特异性杀伤率：特异性杀伤率(％)＝(样品孔A值-自然释放孔A值)/(最大释放孔A值-自然释放孔A值)×100。
结果：T1和T2对黑色素瘤细胞的体内杀伤能力检测结果见图10和表5，由图表可知，与天然表位肽相比，T1和T2对黑色素瘤细胞的体内杀伤能力更强。
表5候选TRAG-3模拟表位肽对黑色素瘤细胞的体内杀伤能力

基于上述实验结果，可得出如下结论：与TRAG-3天然表位肽相比，TRAG-3模拟表位肽T1和T2具有更好的抗酶降解稳定性，与HLA-A2.1具有更强的亲和力，并且对TRAG-3阳性肿瘤细胞表现出更强的CTL特异性杀伤效应，可用于制备治疗TRAG-3阳性肿瘤的多肽疫苗。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110>中国人民解放军第三军医大学第二附属医院
<120>肿瘤抗原TRAG-3模拟表位肽及其应用
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<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>智人(homo sapiens)
<400>1
Ile Leu Leu Arg Asp Ala Gly Leu Val
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