IAP抑制剂和FLT3抑制剂的组合.pdf

本发明涉及IAP抑制剂和FLT3抑制剂的组合产品；涉及含有所述组合产品的药用组合物；涉及治疗恶性血液病(包括急性髓性白血病(AML))的方法，该方法施用包括能够抑制半胱天冬酶(Smac)蛋白的二级线粒体衍生的活化剂与细胞凋亡(IAPs)抑制剂(IAP抑制剂)结合的化合物与一或多种药学活性成分的组合；还涉及这些组合产品在治疗急性髓性白血病中的用途；并且还涉及包含所述组合产品的商业包装产品。

1.  组合产品，所述组合产品包含：
(a)式(I)化合物或其可药用盐：

其中：
R₁为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，它们是未取代的或取代的；
R₂为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，它们是未取代的或取代的；
R₃为H、-CF₃、-C₂F₅、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基、-CH₂-Z，或
R₂和R₃与氮一起形成杂环；
Z为H、-OH、F、Cl、-CH₃、-CF₃、-CH₂Cl、-CH₂F或-CH₂OH；
R₄为C₁-C₁₆直链或支链烷基、C₁-C₁₆链烯基、C₁-C₁₆炔基或-C₃-C₁₀环烷基、-(CH₂)_1-6-Z₁、-(CH₂)_0-6-芳基苯基和-(CH₂)_0-6-杂环，其中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的；
Z₁为-N(R₈)-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(O)-N(R₉)(R₁₀)、-C(O)-O-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-O-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-苯基、-C(O)-O-(CH₂)_1-6-杂环、-O-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-O-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-O-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-O-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环，其中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的；
所述杂环基为含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-7元杂环，或者为8-12元稠合环系，该环系包括至少一个含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的5-7元杂环，所述杂环或稠合环系是未取代的或者在碳原子或氮原子上被取代；
R₈为H、-CH₃、-CF₃、-CH₂OH或-CH₂Cl；
R₉和R₁₀独立为H、C₁-C₄烷基、C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-苯基，其中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的，或
R₉和R₁₀与氮一起形成杂环；
R₅为H、C₁-C₁₀烷基、芳基、苯基、C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C₁-C₁₀烷基-芳基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基-(CH₂)_0-6-苯基、-(CH₂)_0-4CH-((CH₂)_1-4-苯基)₂、-(CH₂)_0-6-CH(苯基)₂、-茚满基、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-(CH₂)_0-6-C(O)-苯基、-(CH₂)_0-6-杂环、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环，或
R₅为氨基酸残基，其中所述烷基、环烷基、苯基和芳基取代基是未取代的或取代的；
U如结构(III)所示：

其中：
n＝0-5；
X为-CH或N；
Ra和Rb独立为O、S或N原子或C₀-C₈烷基，其中烷基链上的一或多个碳原子可以被选自O、S或N的杂原子代替，其中所述烷基可以是未取代的或取代的；
Rd选自：
(a)-Re-Q-(Rf)_p(Rg)_q，或
(b)Ar₁-D-Ar₂，或
(c)Ar₁-D-Ar₂；
Rc为H，或者Rc和Rd可以一起形成环烷基或杂环；如果Rd和Rc形成环烷基或杂环时，R₅在C或N原子上与形成的环连接；
p和q独立为0或1；
Re为C_1-C₈烷基或亚烷基，Re可以是未取代的或取代的；
Q为N、O、S、S(O)或S(O)₂；
Ar₁和Ar₂为未取代的或取代的芳基或杂环；
Rf和Rg分别独立为不存在，或为H、-C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷基芳基、-OH、-O-C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-O-(CH₂)_0-6-芳基、苯基、芳基、苯基-苯基、-(CH₂)_1-6-杂环、-O-(CH₂)_1-6-杂环、-OR₁₁、-C(O)-R₁₁、-C(O)-N(R₁₁)(R₁₂)、-N(R₁₁)(R₁₂)、-S-R₁₁、-S(O)-R₁₁、-S(O)₂-R₁₁、-S(O)₂-NR₁₁R₁₂、-NR₁₁-S(O)₂-R₁₂、S-C₁-C₁₀烷基、芳基-C₁-C₄烷基、杂环-C₁-C₄烷基，其中所述烷基、环烷基、杂环和芳基是未取代的或取代的，或为-SO₂-C_1-C₂烷基、-SO₂-C_1-C₂烷基苯基、-O-C₁-C₄烷基，或者
Rg和Rf形成选自杂环或芳基的环；并且
D为-CO-；-C(O)-或C_1-C₇亚烷基或亚芳基；-CF₂-；-O-；或-S(O)_m，其中m为0-2；1，3-二氧五环；或C₁-C₇烷基-OH，其中烷基、亚烷基或亚芳基可以是未取代的或被一或多个下列基团取代：卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃，或
D为-N(Rh)，其中Rh为H；C_1-C₇烷基(未取代的或取代的)；芳基；-O(C_1-C₇环烷基)(未取代的或取代的)；C(O)-C₁₀-C₁₀烷基；C(O)-C₀-C₁₀烷基-芳基；C-O-C₁-C₁₀烷基；C-O-C₀-C₁₀烷基-芳基或SO₂-C₁₀-C₁₀-烷基；SO₂-(C₀-C₁₀-烷基芳基)；
R₆、R₇、R’₆和R’₇各自独立为H、-C₁-C₁₀烷基、-C₁-C₁₀烷氧基、芳基-C₁-C₁₀烷氧基、-OH、-O-C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-O-(CH₂)_0-6-芳基、苯基、-(CH₂)_1-6-杂环、-O-(CH₂)_1-6-杂环、-OR₁₁、-C(O)-R₁₁、-C(O)-N(R₁₁)(R₁₂)、-N(R₁₁)(R₁₂)、-S-R₁₁、-S(O)-R₁₁、-S(O)₂-R₁₁、-S(O)₂-NR₁₁R₁₂、-NR₁₁-S(O)₂-R₁₂，其中烷基、环烷基和芳基是未取代的或取代的；并且R₆、R₇、R’₆和R’₇可以结合形成环系；并且
R₁₁和R₁₂独立为H、C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-(CH)_0-1(芳基)_1-2、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(O)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(S)-C₁-C₁₀烷基、-C(S)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(S)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(S)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_1-6-杂环，其中所述烷基、环烷基和芳基是未取代的或取代的，或
R₁₁和R₁₂为有助于转运分子通过细胞膜的取代基，或者
R₁₁和R₁₂与氮原子一起形成杂环，
其中R₁₁和R₁₂的烷基取代基可以是未取代的或被一或多个选自下列基团的取代基取代：C₁-C₁₀烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃；
R₁₁和R₁₂的取代的环烷基取代基被一或多个选自下列的取代基取代：C₁-C₁₀亚烷基、C₁-C₆烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃；
R₁₁和R₁₂的取代的苯基或芳基被一或多个选自下列的取代基取代：卤素、羟基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、硝基、-CN、-O-C(O)-C₁-C₄烷基和-C(O)-O-C₁-C₄芳基，
或
式Ia化合物或其可药用盐：

其中：
R₁为H、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，其中R₁是未取代的或取代的；
R₂为H、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，其中R₂是未取代的或取代的；
R₃为H、-CF₃、-C₂F₅、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基、-CH₂-Z，或
R₂和R₃与它们所连接的氮原子一起形成杂环，所述烷基、链烯基、炔基或杂环可以是未取代的或取代的；
Z为H、-OH、F、Cl、-CH₃、-CH₂Cl、-CH₂F或-CH₂OH；
R₄为C₀-C₁₀烷基、C₀-C₁₀链烯基、C₀-C₁₀炔基、-C₃-C₁₀环烷基，其中C₀-C₁₀烷基或环烷基是未取代的或取代的；
A为杂环，它可以是未取代的或取代的；
D为C₁-C₇亚烷基或C₂-C₉亚烯基、C(O)、O、NR₇、S(O)_r、C(O)C₁-C₁₀烷基、OC₁-C₁₀烷基、S(O)_r-C₁-C₁₀烷基、C(O)C₀-C₁₀芳烷基、OC₀-C₁₀芳烷基或S(O)_rC₀-C₁₀芳烷基，其中烷基和芳基可以是未取代的或取代的；
r为0、1或2；
A₁为取代的或未取代的芳基或未取代的或取代的杂环，芳基或杂环上的取代基为卤素、烷基、低级烷氧基、NR₅R₆、CN、NO₂或SR₅；
每一个Q独立为H、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、芳基C₁-C₁₀烷氧基、OH、OC₁-C₁₀烷基、(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、芳基、芳基C₁-C₁₀烷基、O-(CH₂)_0-6芳基、(CH₂)_1-6杂环、杂环、O(CH₂)_1-6杂环、-OR₁₁、-C(O)R₁₁-、C(O)N(R₁₁)(R₁₂)、N(R₁₁)(R₁₂)、SR₁₁、S(O)R₁₁、S(O)₂R₁₁、S(O)₂-N(R₁₁)(R₁₂)或NR₁₁-S(O)₂R₁₂，其中烷基、环烷基和芳基为未取代的或取代的；
n为0、1、2或3、4、5、6或7；
所述杂环为含有1-4个选自N、O和S的杂环原子的5-7元单环杂环，或者为8-12元稠合环系，该环系包括至少一个含有1、2或3个选自N、O和S的杂环原子的5-7元单环杂环，该杂环是未取代的或者取代的；
R₁₁和R₁₂独立为H、C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-(CH)_0-1(芳基)_1-2、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(O)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(S)-C₁-C₁₀烷基、-C(S)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(S)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(S)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-芳基或-C(S)-(CH₂)_1-6-杂环、、C(O)R₁₁、C(O)NR₁₁R₁₂、C(O)OR₁₁、S(O)_nR₁₁、S(O)_m-NR₁₁R₁₂(m＝1或2)、C(S)R₁₁、C(S)NR₁₁R₁₂、C(S)OR₁₁，其中烷基、环烷基和芳基为未取代的或取代的；或R₁₁和R₁₂为有助于转运分子通过细胞膜的取代基，或者
R₁₁和R₁₂与氮原子一起形成杂环，
其中
R₁₁和R₁₂的烷基取代基可以是未取代的或被一或多个选自下列基团的取代基取代：C₁-C₁₀烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基、-CF₃或NR₁₁R₁₂；
R₁₁和R₁₂的取代的环烷基取代基被一或多个选自下列的取代基取代：C₂-C₁₀亚烷基、C₁-C₆烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基、-CF₃或NR₁₁R₁₂；并且
R₁₁和R₁₂的取代的杂环或取代的芳基被一或多个选自下列的取代基取代：卤素、羟基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、硝基、CNO-C(O)-C₁-C₄烷基和C(O)-O-C₁-C₄芳基；
R₅、R₆和R₇独立为氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、环烷基或环烷基低级烷基、C(O)R₅、S(O)R₅、C(O)OR₅、C(O)NR₅R₆，并且
R₁、R₂、R₃、R₄、Q、A和A₁基团上的取代基独立为卤素、羟基、低级烷基、低级链烯基、低级炔基、低级烷酰基、低级烷氧基、芳基、芳基低级烷基、氨基、氨基低级烷基、二低级烷基氨基、低级烷酰基、氨基低级烷氧基、硝基、氰基、氰基低级烷基、羧基、低级烷氧羰基、低级烷酰基、芳酰基、低级芳烷酰基、氨基甲酰基、N-单或N，N-二低级烷基氨基甲酰基、低级烷基氨基甲酸酯、脒基、胍基、脲基、巯基、磺基、低级烷硫基、磺氨基、磺酰胺、苯磺酰胺、磺酸酯、硫烷基低级烷基、芳基磺酰胺、卤素取代的芳基磺酸酯、低级烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、低级烷基芳基亚磺酰基、低级烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基低级烷基磺酰基、低级芳基烷基低级烷基芳基磺酰基、卤素-低级烷基巯基、卤素-低级烷基磺酰基、膦酰基(-P(＝O)(OH)₂)、羟基低级烷氧基磷酰基或二低级烷氧基磷酰基、(R₉)NC(O)-NR₁₀R₁₃、低级烷基氨基甲酸酯或氨基甲酸酯或-NR₈R₁₄，
其中：
R₈和R₁₄可以相同或不同，独立为氢或低级烷基，或者
R₈和R₁₄与N原子一起形成含有氮杂环原子的3-8元杂环，可以任选含有1或2个选自氮、氧和硫的其它杂环原子，所述杂环可以是未取代的或被下列基团取代：低级烷基、卤素、低级烯基、低级炔基、羟基、低级烷氧基、硝基、氨基、低级烷基、氨基、二低级烷基氨基、氰基、羧基、低级烷基羰基、甲酰基、低级烷酰基、氧代、氨基甲酰基、N-低级烷基或N，N-二低级烷基氨基甲酰基、巯基或低级烷硫基；并且
R₉、R₁₀和R₁₃独立为氢、低级烷基、卤素取代的低级烷基、芳基、芳基低级烷基、卤素取代的芳基、卤素取代的芳基低级烷基，
和一或多个下列化合物：
(b)式(II)化合物或其盐：

(c)多柔比星，和
(d)阿糖胞苷。

2.  组合产品，所述组合产品包含权利要求1所定义的化合物(I)和权利要求1所定义的化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷。

3.  权利要求2的组合产品，其中所述化合物(I)为N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺。

4.  组合产品，所述组合产品包含权利要求1所定义的化合物(Ia)和权利要求1所定义的化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷。

5.  权利要求4的组合产品，其中所述化合物(Ia)为(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。

6.  药用组合物，所述药用组合物含有权利要求1-5中任一项的组合产品。

7.  权利要求6的药用组合物，该药用组合物任选含有药用载体。

8.  含有权利要求1所定义的化合物(I)或(Ia)的药用组合物，该药用组合物与含有权利要求1所定义的化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷的药用组合物组合。

9.  治疗患有急性髓性白血病(AML)的温血动物的方法，所述方法包括给于所述动物治疗有效量的权利要求1-5中任一项的组合产品。

10.  权利要求9的方法，其中所述急性髓性白血病(AML)对常规化疗具有抗性。

11.  权利要求9和10的方法，其中所述温血动物为人类。

12.  权利要求11的方法，其中所述人类为青少年。

13.  权利要求1-5中任一项的组合产品在治疗急性髓性白血病(AML)中的用途。

14.  权利要求6或8中任一项的药用组合物在治疗急性髓性白血病(AML)中的用途。

15.  权利要求1-5中任一项的组合产品在制备用于治疗急性髓性白血病(AML)的药物中的用途。

16.  权利要求6或8中任一项的药用组合物在制备用于治疗急性髓性白血病(AML)的药物中的用途。

17.  权利要求13-15中任一项的用途，其中所述急性髓性白血病(AML)对常规化疗具有抗性。

18.  商业包装产品，所述商业包装产品包含权利要求1-8任一项的组合产品以及在AML治疗中同时、分别或顺序使用它们的说明书。

IAP抑制剂和FLT3抑制剂的组合
技术领域
本发明涉及IAP抑制剂和FLT3抑制剂的组合产品；涉及含有所述组合产品的药用组合物；涉及治疗恶性血液病(包括急性髓性白血病(AML))的方法，该方法包括施用能够抑制半胱天冬酶(Smac)蛋白的二级线粒体衍生的活化剂与细胞凋亡(IAPs)抑制剂(IAP抑制剂)结合的化合物与一或多种药学活性成分的组合产品；还涉及这些组合产品在治疗急性髓性白血病中的用途；涉及包含所述组合产品的商业包装产品。
本发明也涉及与一或多种药学活性成分组合的IAP抑制剂在制备用于治疗恶性血液病包括AML的药物中的用途。
在一个实施方案中，本发明也涉及与一或多种FLT抑制剂组合的IAP抑制剂在制备用于治疗恶性血液病包括AML的药物中的用途。
背景技术
FLT3为治疗白血病的有前景的靶点，在约1/3的AML患者中发生突变。然而，越来越多的关注点集中于由于靶酪氨酸激酶中突变点的出现而产生的药物抗性研究，从而用于治疗急性白血病患者。参见Shah等(2002)和Cools等(2003)。能够对抗此类抗性的一种方法为结构上不具有相关性的抑制剂的组合应用和/或具有不同信号通路的抑制剂的组合应用。
发明内容
本发明涉及治疗患有对常规化疗具有抗性的白血病特别是AML的温血动物特别是人类的方法，该方法包括给于所述动物治疗有效量的用于AML治疗的IAP抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及IAP抑制剂在制备用于治疗恶性血液病包括AML的药物中的用途。
在一个实施方案中，本发明还涉及IAP抑制剂与一种或多种FLT抑制剂联合在制备用于治疗恶性血液病包括AML的药物中的用途。
附图说明
图1表示采用PKC412、N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)或PKC412和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)的组合对FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理3天后的增生性实验。
图2表示采用PKC412、N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)或PKC412和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)的组合对G697R-Ba/F3细胞处理3天后的增生性实验。
图3表示采用PKC412、多柔比星或PKC412和多柔比星的组合对FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理3天后的增生性实验。
图4表示采用多柔比星、N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)或多柔比星和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)(n＝1)的组合对FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理3天后的增生性实验。
图5表示采用Ara-c、N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)或Ara-c和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)(n＝1)的组合对FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理3天后的增生性实验。
图6表示采PKC412和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)的组合作用的体内实验；生物荧光成像测定IV注射7天后肿瘤负荷。
图7表示以基线百分比描绘的图6的图形。
图8表示经N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)、PKC412或N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412的组合治疗10天后小鼠的脾重量百分比。
图9表示在有或无人类基质细胞系HS-5存在下采用不同浓度的PKC412处理MOLM13-luc+细胞的结果。
图10表示XIAP、CIAP、Bcl-2和Bcl-XL在突变FLT3-Ba/F3细胞以及对照Ba/F3细胞中表达的免疫印迹。免疫印迹采用作为内参(loadingcontrol)的β-肌东蛋白抗体和/或α-微管蛋白抗体杂化。
图11表示增生性研究，显示采用(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)、PKC412或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和PKC412的组合对MOLM13-luc+细胞处理3天的结果。
图12表示增生性研究，显示采用(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)、PKC412或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和PKC412的组合对FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理2天的结果。
图13表示增生性研究，显示采用(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)、Ara-c或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和Ara-c的组合对FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理2天的结果。
图14表示增生性研究，显示采用(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)、Ara-c或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和Ara-c的组合对MOLM13-luc+细胞处理3天的结果。
图15表示增生性研究，显示采用(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)、多柔比星或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和多柔比星的组合对FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理2天的结果。
图16表示鼠FLT3-ITD-Ba/F3细胞在小鼠体内的肿瘤生长。
本发明详述
蛋白激酶C(下文中缩写为PKC)在细胞信号转导通路中重要的酶之一，它在细胞增生和分化的控制中具有非常重要的作用。PKC为丝氨酸/苏氨酸激酶家族的一员。
PKC的至少12个同工型已经被鉴定，根据其结构和对底物的要求，它们通常可以分为三类。最近在研究蛋白酪氨酸激酶抑制剂PKC412对携有FLT3蛋白突变的AML患者的作用的临床试验中获得了具有良好希望的结果。
米哚妥林(midostaurin)为式(II)的N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬烯(diazonin)-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或其盐：

在下文中称为“式II化合物或米哚妥林”。
式(II)化合物或米哚妥林[国际非专有名称]也称为PKC412。
米哚妥林为天然存在的生物碱星形孢菌素的衍生物，特别描述于1988年12月21日公开的欧洲专利号0296110以及1992年3月3日公开的美国专利号5,093,330和日本专利号2 708 047中。
米哚妥林用于治疗上文中所述疾病和病症的精确剂量取决于多种因素，包括宿主、待治疗疾病的特性和严重程度、给药的模式。通常，当米哚妥林以0.1-10mg/kg体重(1-5mg/kg体重)的日剂量通过下列途径给药可以获得满意的效果：胃肠外途径，例如腹膜内、静脉内、肌肉、皮下、肿瘤内给药，或直肠途径，或肠道途径(例如口服给药)，优选静脉内给药，或者，优选口服给药、静脉内给药。在人体试验中，总剂量225mg/日为推定确的最大耐受剂量(MTD)。优选的静脉内日剂量为0.1-10mg/kg体重，或者，对大型灵长类动物而言，日剂量为200-300mg。典型的静脉内剂量为3-5mg/kg，每周3-5次。
米哚妥林口服给药的日剂量约300mg，例如100-300mg/日。米哚妥林可以单次给药，或者每日分为2或3次给药，优选2次。特别优选的剂量为200-225mg/日，特别是每次100mg，每日2次(每日总剂量200mg)。剂量的上限取决于副作用，可以通过对待治疗患者的试验而决定。
PKC412为FLT抑制剂，这是因为PKC412能够通过必需蛋白与DNA的结合从而干扰异常FLT功能。FLT抑制剂能够阻断改变的LFT基因的作用，从而使其失去作用。其他FLT抑制剂包括但不限于化合物N-苯甲酰基-星孢菌素、星孢菌素衍生物、SU11248和MLN518。
PKC412在体外能够抑制表达突变体FLT3的细胞的生长和存活，也可以延长具有采用突变体FLT3转导的骨髓的小鼠的生命周期。参见Weisberg等(2002)。在患者中对抗FLT3抑制的固有抗性的有效策略为组合使用结构上无关的抑制剂和/或具有不同信号通路的抑制剂。
细胞凋亡的调节剂代表了介入疗法的一种有希望的靶点。Smac能够调节固有凋亡通路中所产生的凋亡[参见Du等(2000)]，它能够与蛋白IAP家族结合并对其进行抑制。参见Liu等(2000)和Wu等(2000)。
AML对细胞凋亡的固有抗性说明：IAP有可能是所述该疾病中很好的治疗靶点，而且，PKC412与IAP抑制剂的组合应用在治疗上是有益的。
本发明中使用的IAP抑制剂的实例包括式(I)化合物或其可药用盐：

其中：
R₁为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，它们是未取代的或取代的；
R₂为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，它们是未取代的或取代的；
R₃为H、-CF₃、-C₂F₅、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基、-CH₂-Z，或者
R₂和R₃与氮一起形成杂环；
Z为H、-OH、F、Cl、-CH₃、-CF₃、-CH₂Cl、-CH₂F或-CH₂OH；
R₄为C₁-C₁₆直链或支链烷基、C₁-C₁₆链烯基、C₁-C₁₆炔基或-C₃-C₁₀环烷基、-(CH₂)_1-6-Z₁、-(CH₂)_0-6-芳基苯基和-(CH₂)_0-6-杂环(het)，其中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的；
Z₁为-N(R₈)-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(O)-N(R₉)(R₁₀)、-C(O)-O-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-O-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-苯基、-C(O)-O-(CH₂)_1-6-杂环、-O-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-O-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-O-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-O-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环，其中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的；
所述杂环为含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-7元杂环，或者为8-12元稠合环系，该环系包括至少一个含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的5-7元杂环，所述杂环或稠合环系是未取代的或者在碳原子或氮原子上被取代；
R₈为H、-CH₃、-CF₃、-CH₂OH或-CH₂Cl；
R₉和R₁₀独立为H、C₁-C₄烷基、C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-苯基，其中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的，或者
R₉和R₁₀与氮一起形成杂环；
R₅为H、C₁-C₁₀烷基、芳基、苯基、C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C₁-C₁₀烷基-芳基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基-(CH₂)_0-6-苯基、-(CH₂)_0-4CH-((CH₂)_1-4-苯基)₂、-(CH₂)_0-6-CH(苯基)₂、-茚满基、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-(CH₂)_0-6-C(O)-苯基、-(CH₂)_0-6-杂环、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环，或者
R₅为氨基酸残基，其中所述烷基、环烷基、苯基和芳基取代基是未取代的或取代的；
U如结构(III)所示：

其中：
n＝0-5；
X为-CH或N；
Ra和Rb独立为O、S或N原子或C₀-C₈烷基，其中烷基链上的一或多个碳原子可以被选自O、S或N的杂原子代替，其中烷基可以是未取代的或取代的；
Rd选自：
(a)-Re-Q-(Rf)_p(Rg)_q；或
(b)Ar₁-D-Ar₂；或
(c)Ar₁-D-Ar₂；
Rc为H，或者Rc和Rd可以一起形成环烷基或杂环；如果Rd和Rc形成环烷基或杂环时，R₅在C或N原子上与形成的环连接；
p和q独立为0或1；
Re为C₁-C₈烷基或亚烷基，Re可以是未取代的或取代的；
Q为N、O、S、S(O)或S(O)₂；
Ar₁和Ar₂为未取代的或取代的芳基或杂环；
Rf和Rg分别独立为不存在，或为H、-C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷基芳基、-OH、-O-C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-O-(CH₂)_0-6-芳基、苯基、芳基、苯基-苯基、-(CH₂)_1-6-杂环、-O-(CH₂)_1-6-杂环、-OR₁₁、-C(O)-R₁₁、-C(O)-N(R₁₁)(R₁₂)、-N(R₁₁)(R₁₂)、-S-R₁₁、-S(O)-R₁₁、-S(O)₂-R₁₁、-S(O)₂-NR₁₁R₁₂、-NR₁₁-S(O)₂-R₁₂、S-C₁-C₁₀烷基、芳基-C₁-C₄烷基、杂环-C₁-C₄烷基(其中上述烷基、环烷基、杂环和芳基是未取代的或取代的)、-SO₂-C₁-C₂烷基、-SO₂-C₁-C₂烷基苯基、-O-C₁-C₄烷基，或
Rg和Rf形成选自杂环或芳基的环，并且
D为-CO-；-C(O)-或C₁-C₇亚烷基或亚芳基；-CF₂-；-O-；或-S(O)_m，其中m为0-2；1，3-二氧五环；或C₁-C₇烷基-OH，其中烷基、亚烷基或亚芳基可以是未取代的或被一或多个下列基团取代：卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃，或者
D为-N(Rh)，其中Rh为H、C₁-C₇烷基(未取代的或取代的)、芳基、-O(C₁-C₇环烷基)(未取代的或取代的)、C(O)-C₁₀-C₁₀烷基、C(O)-C₀-C₁₀烷基-芳基、C-O-C₁-C₁₀烷基、C-O-C₀-C₁₀烷基-芳基或SO₂-C₁₀-C₁₀-烷基、SO₂-(C₀-C₁₀-烷基芳基)；
R₆、R₇、R’₆和R’₇各自独立为H、-C₁-C₁₀烷基、-C₁-C₁₀烷氧基、芳基-C₁-C₁₀烷氧基、-OH、-O-C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-O-(CH₂)_0-6-芳基、苯基、-(CH₂)_1-6-杂环、-O-(CH₂)_1-6-杂环、-OR₁₁、-C(O)-R₁₁、-C(O)-N(R₁₁)(R₁₂)、-N(R₁₁)(R₁₂)、-S-R₁₁、-S(O)-R₁₁、-S(O)₂-R₁₁、-S(O)₂-NR₁₁R₁₂、-NR₁₁-S(O)₂-R₁₂，其中烷基、环烷基和芳基是未取代的或取代的；并且R₆、R₇、R’₆和R’₇可以结合形成环系；
R₁₁和R₁₂独立为H、C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-(CH)_0-1(芳基)_1-2、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(O)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(S)-C₁-C₁₀烷基、-C(S)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(S)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(S)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_1-6-杂环，其中烷基、环烷基和芳基是未取代的或取代的，或者
R₁₁和R₁₂为有助于转运分子通过细胞膜的取代基，或者
R₁₁和R₁₂与氮原子一起形成杂环，
其中R₁₁和R₁₂的烷基取代基可以是未取代的或被一或多个选自下列基团的取代基取代：C₁-C₁₀烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃；
R₁₁和R₁₂的取代的环烷基取代基可以被一或多个选自下列的取代基取代：C₁-C₁₀亚烷基、C₁-C₆烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃；
R₁₁和R₁₂的取代的苯基或芳基可以被一或多个选自下列的取代基取代：卤素、羟基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、硝基、-CN、-O-C(O)-C₁-C₄烷基和-C(O)-O-C₁-C₄芳基。
本发明中使用的IAP抑制剂的另一个实例包括公开于PCT/US2007/074790中的式(Ia)化合物或其可药用盐：

其中：
R₁为H、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，其中R₁是未取代的或取代的；
R₂为H、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，其中R₂是未取代的或取代的；
R₃为H、-CF₃、-C₂F₅、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基、-CH₂-Z，或者
R₂和R₃与它们所连接的氮原子一起形成杂环，所述烷基、链烯基、炔基或杂环可以是未取代的或取代的；
Z为H、-OH、F、Cl、-CH₃、-CH₂Cl、-CH₂F或-CH₂OH；
R₄为C₀-C₁₀烷基、C₀-C₁₀链烯基、C₀-C₁₀炔基、-C₃-C₁₀环烷基，其中C₀-C₁₀烷基或环烷基是未取代的或取代的；
A为杂环，它可以是未取代的或取代的；
D为C₁-C₇亚烷基或C₂-C₉亚烯基、C(O)、O、NR₇、S(O)+、C(O)C₁-C₁₀烷基、OC₁-C₁₀烷基、S(O)_rC₁-C₁₀烷基、C(O)C₀-C₁₀芳烷基、OC₀-C₁₀芳烷基或S(O)_rC₀-C₁₀芳烷基，其中烷基和芳基可以是未取代的或取代的；
r为0、1或2；
A₁为取代的或未取代的芳基或未取代的或取代的杂环，芳基或杂环上的取代基为卤素、烷基、低级烷氧基、NR₅R₆、CN、NO₂或SR₅；
每一个Q独立为H、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、芳基C₁-C₁₀烷氧基、OH、OC₁-C₁₀烷基、(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、芳基、芳基C₁-C₁₀烷基、O-(CH₂)_0-6芳基、(CH₂)_1-6杂环、杂环、O(CH₂)_1-6杂环、-OR₁₁、-C(O)R₁₁、-C(O)N(R₁₁)(R₁₂)、N(R₁₁)(R₁₂)、SR₁₁、S(O)R₁₁、S(O)₂R₁₁、S(O)₂-N(R₁₁)(R₁₂)或NR₁₁-S(O)₂R₁₂，其中烷基、环烷基和芳基为未取代的或取代的；
n为0、1、2或3、4、5、6或7；
所述杂环为含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-7元单环杂环，或者为8-12元稠合环系，该环系包括至少一个含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的5-7元单环杂环，该杂环是未取代的或者取代的；
R₁₁和R₁₂独立为H、C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-(CH)_0-1(芳基)_1-2、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(O)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(S)-C₁-C₁₀烷基、-C(S)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(S)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(S)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-芳基或-C(S)-(CH₂)_1-6-杂环、C(O)R₁₁、C(O)NR₁₁R₁₂、C(O)OR₁₁、S(O)_nR₁₁、S(O)_m-NR₁₁R₁₂(m＝1或2)、C(S)R₁₁、C(S)NR₁₁R₁₂、C(S)OR₁₁，其中烷基、环烷基和芳基为未取代的或取代的；或R₁₁和R₁₂为有助于转运分子通过细胞膜的取代基，或者
R₁₁和R₁₂与氮原子一起形成杂环，
其中
R₁₁和R₁₂的烷基取代基可以是未取代的或被一或多个选自下列基团的取代基取代：C₁-C₁₀烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基、-CF₃或NR₁₁R₁₂；
R₁₁和R₁₂的取代的环烷基取代基可以被一或多个选自下列的取代基取代：C₂-C₁₀亚烷基、C₁-C₆烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基、-CF₃或NR₁₁R₁₂；并且
R₁₁和R₁₂的取代的杂环或取代的芳基可以被一或多个选自下列的取代基取代：卤素、羟基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、硝基、CNO-C(O)-C₁-C₄烷基和C(O)-O-C₁-C₄芳基；
R₅、R₆和R₇独立为氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、环烷基或环烷基低级烷基、C(O)R₅、S(O)R₅、C(O)OR₅-、C(O)NR₅R₆，并且
R₁、R₂、R₃、R₄、Q、A和A₁基团上的取代基独立为卤素、羟基、低级烷基、低级链烯基、低级炔基、低级烷酰基、低级烷氧基、芳基、芳基低级烷基、氨基、氨基低级烷基、二低级烷基氨基、低级烷酰基、氨基低级烷氧基、硝基、氰基、氰基低级烷基、羧基、低级烷氧羰基、低级烷酰基、芳酰基、低级芳烷酰基、氨基甲酰基、N-单或N，N-二低级烷基氨基甲酰基、低级烷基氨基甲酸酯、脒基、胍基、脲基、巯基、磺基、低级烷硫基、磺氨基、磺酰胺、苯磺酰胺、磺酸酯、硫烷基低级烷基、芳基磺酰胺、卤素取代的芳基磺酸酯、低级烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基低级烷基亚磺酰基、低级烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基低级烷基磺酰基、低级芳基烷基低级烷基芳基磺酰基、卤素-低级烷基巯基、卤素-低级烷基磺酰基、膦酰基(phosphono)(-P(＝O)(OH)₂)、羟基低级烷氧基磷酰基或二低级烷氧基磷酰基、(R₉)NC(O)-NR₁₀R₁₃、低级烷基氨基甲酸酯或-NR₈R₁₄，
其中：
R₈和R₁₄可以相同或不同，独立为氢或低级烷基，或者
R₈和R₁₄与N原子一起形成含有氮杂环原子的3-8元杂环，可以任选含有1或2个选自氮、氧和硫的其它杂环原子，所述杂环可以是未取代的或被下列基团取代：低级烷基、卤素、低级烯基、低级炔基、羟基、低级烷氧基、硝基、氨基、低级烷基、氨基、二低级烷基氨基、氰基、羧基、低级烷基羰基、甲酰基、低级烷酰基、氧代、氨基甲酰基、N-低级烷基或N，N-二低级烷基氨基甲酰基、巯基或低级烷硫基；并且
R₉、R₁₀和R₁₃独立为氢、低级烷基、卤素取代的低级烷基、芳基、芳基低级烷基、卤素取代的芳基、卤素取代的芳基低级烷基。
优选的化合物选自下列一组化合物及其可药用盐：
(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺；
(S)-N-[(S)-环己基-(乙基-{(S)-1-[5-(4-氟-苯甲酰基)-吡啶-3-基]-丙基}氨基甲酰基)-甲基]-2-甲基氨基-丙酰胺；
(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[5-(4-氟-苯氧基)-吡啶-3-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺；和
N-[1-环己基-2-(2-{2-[(4-氟苯基)-甲基-氨基]-吡啶-4-基}吡咯烷-1-基)-2-氧代-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺。
其它IAP抑制剂的实例包括公开于2005年10月20日公布的WO05/097791，该专利在此引入本申请作为参考。式(I)范围内的优选的化合物为N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺。
其它IAP抑制剂包括公开于WO 04/005284、PCT/US2006/013984和PCT/US2006/021850中的化合物。本发明中使用的其它IAP抑制剂化合物公开于下列专利中的化合物：WO 06/069063、WO 05/069888、US2006/0014700、WO 04/007529、US2006/0025347、WO 06/010118、WO05/069894、WO 06/017295、WO 04/007529和WO 05/094818。
优选的化合物之一为化合物A，(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
化合物A可以例如通过下列反应流程制备：

化合物A
本文所用的术语“芳基”被定义为具有6-14个环碳原子并且无环杂原子的芳族基团。该芳基可以是单环或稠合的二环或三环。它可以是未取代的或者被一个或多个(优选一个或两个)取代基取代，其中取代基如本文描述。无论是单环还是二环，本文定义的芳基可以是完全芳族的。但是，如果其包含多于一个本文定义的环，那么术语芳基包括其中至少一个环是完全芳族的部分，而其它的环可以是部分不饱和的或饱和的或完全芳族的基团。优选的“芳基”为苯基、萘基或茚满基。最优选的芳基为苯基。
本文所用的“杂环(het)”指的是含有至少一个S、O或N环杂原子的杂芳基和杂环化合物。更特别的是，“杂环”是包含1-4个选自N、O和S的杂原子的5-至7-元杂环，或者是包含至少一个5-至7-元杂环的8-至12-元稠环系，所述的5-至7-元杂环含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子。本文所用的杂环的实例包括未取代的和取代的吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻喃基(thiofuryl)、哌啶基、哌嗪基、嘌呤基、四氢吡喃基、吗啉代、1，3-二氮杂基、1，4-二氮杂基、1，4-氧氮杂环庚基、1，4-氧硫杂环庚基(oxathiapanyl)、呋喃基、噻吩基、吡咯基(pyrryl)、吡咯基、三唑基、四唑基、吲唑基、噁二唑基、咪唑基、吡咯烷基、吡咯烷基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、异噁唑基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、吡啶并吡嗪基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻喃基、苯并吲哚基、苯并噻吩基、吡唑基、哌啶基、哌嗪基、二氢吲哚基、吗啉基、苯并噁唑基、吡咯并喹啉基等。杂芳基也包含在该杂环定义的范围内。杂芳基的实例为吡啶基、嘧啶基、喹啉基、噻唑基和苯并噻唑基。最优选的杂环为吡啶基、嘧啶基和噻唑基。该杂环可以是未取代的或如本文中所述取代的。优选其是未取代的，或者如果是取代的，其在碳原子上被以下基团取代：卤素(特别是氟或氯)、羟基、C₁-C₄烷基(例如甲基和乙基)、C₁-C₄烷氧基(特别是甲氧基和乙氧基)、硝基、-O-C(O)-C₁-C₄烷基或-C(O)-O-C₁-C₄烷基、氨基甲酰基、N-单-或N，N-二低级烷基氨基甲酰基、低级烷基氨基甲酸酯、脒基、胍、脲基、巯基、磺基(sulfo)、低级烷硫基、硫代氨基(sulfoamino)、磺酰胺、磺酸酯、硫烷基、SCN或硝基，或在氮原子被以下基团取代：C₁-C₄烷基(特别是甲基或乙基)、-O-C(O)-C₁-C₄烷基或-C(O)-O-C₁-C₄烷基(例如甲氧基羰基或乙氧基羰基)。当两个取代基与常规结合的氮一起构成杂环时，可以理解，所得到的杂环为含氮杂环，例如氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯、哌啶、哌嗪、吗啉、吡咯、吡唑、噻唑、噁唑、吡啶、嘧啶、异噁唑等，其中所述该杂环可以是未取代的或如上述被取代的。
卤素为氟、氯、溴或碘，特别是氟和氯。
除非另外说明，“烷基”(以上烷基或其组合)包括直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和支链戊基、正己基和支链己基等。
“环烷基”指的是具有3-10个环碳原子的C₃-C₁₀环烷基，可以是例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基、环壬基等。环烷基可以是单环或稠合的双环。优选其为单环。另外，优选的环烷基是环戊基或环己基。最优选的环烷基是环己基。环烷基可以是完全饱和的或部分不饱和的，优选其为完全饱和的。如本文定义的，它不包括芳基。该环烷基可以是未取代的或被下面所定义的任何取代基取代，优选卤素、羟基或C₁-C₆烷基，例如甲基。
有助于分子跨细胞膜转运的取代基对于药物化学领域的技术人员来说是已知的[参见例如Gangewar S.等，Drug Discov Today，第2卷，第148-155页(1997)；以及Bundgaard H.和Moss J.，Pharma Res，第7卷，第885页(1990)]。通常，此类取代基为亲脂性取代基。此类亲脂性取代基包括C₆-C₃₀烷基(为饱和的、单不饱和的、多不饱和的)，包括有亚甲基插入的多烯、苯基、被一个或两个C₁-C₈烷基取代的苯基、C₅-C₉环烷基、被一个或两个C₁-C₈烷基取代的C₅-C₉环烷基、-X₁-苯基、在苯环中被一个或两个C₁-C₈烷基取代的-X₁-苯基、X₁-C₅-C₉环烷基或被一个或两个C₁-C₈烷基取代的X₁-C₅-C₉环烷基；其中X₁为C₁-C₂₄烷基，它是饱和的、单不饱和的或多不饱和的并且是直链或支链的。
未取代的指在表示氢是唯一的取代基。
除了本文中描述的，以上定义的任何芳基、杂环、烷基、链烯基、炔基或环烷基可以是未取代的或者独立地被至多4个(优选1、2或3个)选自下列的取代基取代：卤素，例如Cl或Br；羟基；低级烷基，例如C₁-C₃烷基；可以被任何本文定义的取代基取代的低级烷基；低级链烯基；低级炔基；低级烷酰基；低级烷氧基，例如甲氧基；芳基，例如苯基或萘基；取代的芳基，例如氟苯基或甲氧基苯基；芳基低级烷基，例如苄基；氨基单或二低级烷基，例如二甲基氨基；低级烷酰基氨基乙酰基氨基；氨基低级烷氧基，例如乙氧基胺；硝基；氰基；氰基低级烷基；羧基；低级烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、正丙氧基羰基或异-丙氧基羰基；低级芳酰基，例如苯甲酰基；氨基甲酰基；N-单-或N，N二-低级烷基氨基甲酰基；低级烷基氨基甲酸酯；脒基；胍；脲基；巯基；硫代；低级烷硫基；硫代氨基；磺酰胺；苯磺酰胺；磺酸酯；硫烷基低级烷基，例如甲基硫烷基；硫代氨基；芳基磺酰胺；卤素取代的或未取代的芳基磺酸酯，例如氯代-苯磺酸酯；低级烷基亚磺酰基；芳基亚磺酰基；芳基-低级烷基亚磺酰基；低级烷基芳基亚磺酰基；低级烷磺酰基；芳基磺酰基；芳基-低级烷基磺酰基；低级芳基烷基；低级烷基芳基磺酰基；卤素-低级烷基巯基；卤素-低级烷基磺酰基，例如三氟甲烷烷氧基磷酰基；脲和式(R₉)NC(O)N(R₁₀)(R₁₃)的取代的脲，其中R₉、R₁₀和R₁₃如本文所定义，例如脲或3-三氟-甲基-苯基脲；烷基氨基甲酸酯或氨基甲酸酯，例如乙基-N-苯基-氨基甲酸酯；或-NR₈R₁₄，其中R₈和R₁₄可以相同或不同，独立为H、低级烷基，例如，甲基、乙基或丙基；或R₈和R₁₄与N原子一起形成含有氮杂环原子以及任选的1或2个选自氮、氧和硫的其它杂环原子的3-8元杂环(例如哌嗪基、吡嗪基、低级烷基-哌嗪基、吡啶基、吲哚基、噻吩基、噻唑基、苯并噻吩基、吡咯烷基、哌啶子基或咪唑啉基)，其中所述杂环可以被上述所定义的任何取代基所取代。
优选上述烷基、环烷基和芳基独立为未取代的或者被下列基团所取代：低级烷基、芳基、芳基低级烷基、羧基、低级烷氧基羰基，特别是卤素、-OH、-SH、-OCH₃、-SCH₃、-CN、-SCN或硝基。
当单独或组合应用时，本文定义的术语“低级烷基”指的是包含1-6个碳原子的烷基。该烷基可以是支链的或直链的并且如上文定义。
术语“低级链烯基”指的是含有2-6个碳原子的链烯基。链烯基是包含至少一个碳-碳双键的烃基。如本文定义，它可以是未取代的或者被本文描述的取代基取代。碳-碳双键可以是在链烯基的任何两个碳原子之间。优选其包含1或2个碳-碳双键，更优选一个碳-碳双键。链烯基可以是直链的或支链的。实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、1，3-丁二烯基等。优选的链烯基为乙烯基。
本文所用的术语“低级炔基”指的是包含2-6个碳原子的炔基。炔基是包含至少一个碳-碳三键的烃基。碳-碳三键可以位于炔基的任何两个碳原子之间。优选炔基包含1或2个碳-碳三键，更优选一个碳-碳三键。炔基可以是直链的或支链的。实例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基等。优选的炔基为乙炔基。
本文所用的术语“芳基烷基”指的是通过桥连的亚烷基与主链连接的芳基。实例包括苄基、苯乙基、萘甲基等。
优选的芳基烷基为苄基。同样，氰基烷基指的是通过桥连的亚烷基与主链连接的氰基。
另一方面，术语“烷基芳基”指的是通过亚苯基与主链桥连的烷基。实例包括甲基苯基、乙基苯基等。
本文所用的术语“低级烷酰基”指的是其中一个碳原子被C＝O基团代替的低级烷基链。所述C＝O基团可以在取代基的一端存在或在基团的中间存在。实例包括甲酰基、乙酰基、2-丙酰基、1-丙酰基等。
术语“烷氧基”指的是通过氧与主链连接的本文定义的烷基。实例包括甲氧基、乙氧基等。
术语“低级硫代烷基”指的是通过硫原子与主链连接的本文定义的烷基。实例包括硫代甲基(或巯基甲基)、硫代乙基(巯基乙基)等。
术语“低级烷氧羰基”或其同义词指的是通过芳基(C(O))与主链连接的烷氧基羰基。实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基等。
应当理解的是，术语C(O)指的是-C＝O基团，包括酮、醛或酸或酸衍生物。同样，S(O)指的是-S＝O基团。
本文中使用的术语“S(O)_r”是指与硫原子结合的氧的数目。当r＝2时，则S(O)_r＝SO₂；当r为1时，则S(O)_r为SO；当r＝0时，则S(O)_r为S。
本文中使用的术语“C₀”(作为烷基定义的一部分，例如C_0-10烷基)是指0个碳原子。因此，“C₀-C₁₀芳基烷基”是指芳基直接与主链(C₀)连接，或C₁-C₁₀亚烷基将主链与芳基桥连。
术语“(CH₂)_0-6”(作为较大基团的一部分，例如(CH₂)_0-6C₃-C₇环烷基)是指基团不存在(CH₂)₀，或者是指含有1-6个碳原子的基团(CH₂)_1-6。
在R₁₁和R₁₂的定义中，术语“(CH₂)_0-6-(CH)_0-1(芳基)_1-2”是指下列基团之一：(CH₂)_1-6芳基、芳基、-CH(芳基)₂或(CH₂)_1-6(CH)(芳基)₂。
本文中使用的变量“n”是指吡咯烷基(四氢吡咯基)环上取代基的数目。术语“n”定义为0-7，它决定了吡咯烷基(四氢吡咯基)环上Q取代基的数目。Q只能在吡咯烷基环的2、3、4或5位上存在，即在吡咯烷基环的碳原子上存在。当碳的数数目为2时，只能存在1个取代基，其它每一个碳原子均为饱和的，它们每一个都可以携有两个取代基。当n为7时，则每一个碳原子如本文中所定义与Q结合。每一个Q可以相同或不同。然而，当n为6时，则7个可能的取代基中的一个为H，其它5个为Q，它们可以是相同或不同的。另外，当n为5时，则可能存在的取代基中的2个为H，其它5个独立为Q，如本文所定义。当n为4时，则7个可能存在的取代基中的3个为H，剩余的独立为本文所定义的Q。当n为3时，则7个可能存在的取代基中的4个为H，其它3个为本文所定义的Q。当n为2时，则7个可能存在的取代基中的2个为Q，剩余的为H。当n为1时，则7个可能存在的取代基中只有1个为Q，剩余的为H。最后，当n为0时，所有的7个取代基均为H。
可以理解，每一个Q取代基可以是相同或不同的。
当化合物、盐、药用制剂采用复数形式时，它意味着还应当包含单一的化合物、单一的药用制剂、盐等。
同样也包括本文中公开的其药学上可接受的盐、相应的外消旋物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体，以及(如果存在的话)上述公开化合物的相应晶态变体，例如溶剂化物、水合物和多晶形物。
使用的IAP抑制剂化合物的精确剂量取决于多种因素，包括宿主、待治疗疾病的特性和严重程度、给药的模式。IAP抑制剂化合物可以通过任何途径给药，包括口服、胃肠外(例如腹膜内、静脉内、肌肉、皮下、肿瘤内)或直肠或肠道给药。优选IAP抑制剂化合物经口服给药，优选日剂量为1-300mg/kg体重，或者，对于大多数大型灵长类动物而言，日剂量为50-5,000mg，优选500-3,000mg。优选的日剂量为1-75mg/kg体重，或者，对于大多数大型灵长类动物而言，日剂量为10-2,000mg，可以单次剂量给药或者分为多次剂量给药，例如每日给药2次。
通常，开始时给于小剂量，然后逐渐增加剂量直到被治疗的宿主获得最佳剂量。剂量的上限取决于副作用，可以根据待治疗宿主的试验而确定。
剂量方案一定要适合于特定的适应症、患者的年龄、体重和一般身体状况以及期望的响应，但常规剂量为约10mg/日至约500mg/日，根据需要每日单次给药或者多次给药。
一方面，本发明提供了组合产品，它包括：
(a)式(I)化合物或其可药用盐：

其中：
R₁为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，它们是未取代的或取代的；
R₂为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，它们是未取代的或取代的；
R₃为H、-CF₃、-C₂F₅、C₁-C₄烷基、C₁-C₄链烯基、C₁-C₄炔基、-CH₂-Z，或者
R₂和R₃与氮一起形成杂环；
Z为H、-OH、F、Cl、-CH₃、-CF₃、-CH₂Cl、-CH₂F或-CH₂OH；
R₄为C₁-C₁₆直链或支链烷基、C₁-C₁₆链烯基、C₁-C₁₆炔基或-C₃-C₁₀环烷基、-(CH₂)_1-6-Z₁、-(CH₂)_0-6-芳基苯基和-(CH₂)_0-6-杂环(het)，其中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的；
Z₁为-N(R₈)-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-N(R₈)-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(O)-N(R₉)(R₁₀)、-C(O)-O-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-O-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-苯基、-C(O)-O-(CH₂)_1-6-杂环、-O-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-O-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-O-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-O-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环，其中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的；
所述杂环为含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-7元杂环，或者为8-12元稠合环系，该环系包括至少一个含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的5-7元杂环，所述杂环或稠合环系是未取代的或者在碳原子或氮原子上被取代；
R₈为H、-CH₃、-CF₃、-CH₂OH或-CH₂Cl；
R₉和R₁₀独立为H、C₁-C₄烷基、C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-苯基，中烷基、环烷基和苯基是未取代的或取代的，或者
R₉和R₁₀与氮一起形成杂环；
R₅为H、C₁-C₁₀烷基、芳基、苯基、C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C₁-C₁₀烷基-芳基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基-(CH₂)_0-6-苯基、-(CH₂)_0-4CH-((CH₂)_1-4-苯基)₂、-(CH₂)_0-6-CH(苯基)₂、-茚满基、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-(CH₂)_0-6-苯基、-(CH₂)_0-6-C(O)-苯基、-(CH₂)_0-6-杂环、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环，或者
R₅为氨基酸残基，其中所述烷基、环烷基、苯基和芳基取代基是未取代的或取代的；
U如结构(III)所示：

其中：
n＝0-5；
X为-CH或N；
Ra和Rb独立为O、S或N原子或C₀-C₈烷基，其中烷基链上的一或多个碳原子可以被选自O、S或N的杂原子代替，其中烷基可以是未取代的或取代的；
Rd选自：
(a)-Re-Q-(Rf)_p(Rg)_q；或
(b)Ar₁-D-Ar₂；或
(c)Ar₁-D-Ar₂；
Rc为H，或者Rc和Rd可以一起形成环烷基或杂环；如果Rd和Rc形成环烷基或杂环时，R₅在C或N原子上与形成的环连接；
p和q独立为0或1；
Re为C₁-C₈烷基或亚烷基，Re可以是未取代的或取代的；
Q为N、O、S、S(O)或S(O)₂；
Ar₁和Ar₂为未取代的或取代的芳基或杂环；
Rf和Rg分别独立为不存在，或为H、-C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷基芳基、-OH、-O-C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-O-(CH₂)_0-6-芳基、苯基、芳基、苯基-苯基、-(CH₂)_1-6-杂环、-O-(CH₂)_1-6-杂环、-OR₁₁、-C(O)-R₁₁、-C(O)-N(R₁₁)(R₁₂)、-N(R₁₁)(R₁₂)、-S-R₁₁、-S(O)-R₁₁、-S(O)₂-R₁₁、-S(O)₂-NR₁₁R₁₂、-NR₁₁-S(O)₂-R₁₂、S-C₁-C₁₀烷基、芳基-C₁-C₄烷基、杂环-C₁-C₄烷基(其中上述烷基、环烷基、杂环和芳基是未取代的或取代的)、-SO₂-C₁-C₂烷基、-SO₂-C₁-C₂烷基苯基、-O-C₁-C₄烷基，或
Rg和Rf形成选自杂环或芳基的环，并且
D为-CO-；-C(O)-或C₁-C₇亚烷基或亚芳基；-CF₂-；-O-；或-S(O)_mr，其中m为0-2；1，3-二氧五环；或C₁-C₇烷基-OH，其中烷基、亚烷基或亚芳基可以是未取代的或被一或多个下列基团取代：卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃，或者
D为-N(Rh)，其中Rh为H、C₁-C₇烷基(未取代的或取代的)、芳基、-O(C₁-C₇环烷基)(未取代的或取代的)、C(O)-C₁₀-C₁₀烷基、C(O)-C₀-C₁₀烷基-芳基、C-O-C₁-C₁₀烷基、C-O-C₀-C₁₀烷基-芳基或SO₂-C₁₀-C₁₀-烷基、SO₂-(C₀-C₁₀-烷基芳基)；
R₆、R₇、R’₆和R’₇各自独立为H、-C₁-C₁₀烷基、-C₁-C₁₀烷氧基、芳基-C₁-C₁₀烷氧基、-OH、-O-C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-O-(CH₂)_0-6-芳基、苯基、-(CH₂)_1-6-杂环、-O-(CH₂)_1-6-杂环、-OR₁₁、-C(O)-R₁₁、-C(O)-N(R₁₁)(R₁₂)、-N(R₁₁)(R₁₂)、-S-R₁₁、-S(O)-R₁₁、-S(O)₂-R₁₁、-S(O)₂-NR₁₁R₁₂、-NR₁₁-S(O)₂-R₁₂，其中烷基、环烷基和芳基是未取代的或取代的；并且R₆、R₇、R’₆和R’₇可以结合形成环系；
R₁₁和R₁₂独立为H、C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-(CH)_0-1(芳基)_1-2、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(O)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(S)-C₁-C₁₀烷基、-C(S)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(S)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(S)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_1-6-杂环，其中烷基、环烷基和芳基是未取代的或取代的，或者
R₁₁和R₁₂为有助于转运分子通过细胞膜的取代基，或者
R₁₁和R₁₂与氮原子一起形成杂环，
其中R₁₁和R₁₂的烷基取代基可以是未取代的或被一或多个选自下列基团的取代基取代：C₁-C₁₀烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃；
R₁₁和R₁₂的取代的环烷基取代基可以被一或多个选自下列的取代基取代：C₁-C₁₀亚烷基、C₁-C₆烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基或-CF₃；
R₁₁和R₁₂的取代的苯基或芳基可以被一或多个选自下列的取代基取代：卤素、羟基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、硝基、-CN、-O-C(O)-C₁-C₄烷基和-C(O)-O-C₁-C₄芳基，
或式Ia化合物或其可药用盐：

其中：
R₁为H、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，其中R₁是未取代的或取代的；
R₂为H、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基或C₃-C₁₀环烷基，其中R₂是未取代的或取代的；
R₃为H、-CF₃、-C₂F₅、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基、-CH₂-Z，或者
R₂和R₃与它们所连接的氮原子一起形成杂环，所述烷基、链烯基、炔基或杂环可以是未取代的或取代的；
Z为H、-OH、F、Cl、-CH₃、-CH₂Cl、-CH₂F或-CH₂OH；
R₄为C₀-C₁₀烷基、C₀-C₁₀链烯基、C₀-C₁₀炔基、-C₃-C₁₀环烷基，其中C₀-C₁₀烷基或环烷基是未取代的或取代的；
A为杂环，它可以是未取代的或取代的；
D为C₁-C₇亚烷基或C₂-C₉亚烯基、C(O)、O、NR₇、S(O))_r、C(O)-C₁-C₁₀烷基、O-C₁-C₁₀烷基、S(O)_r-C₁-C₁₀烷基、C(O)C₀-C₁₀芳烷基、OC₀-C₁₀芳烷基或S(O)_rC₀-C₁₀芳烷基，其中烷基和芳基可以是未取代的或取代的；
r为0、1或2；
A₁为取代的或未取代的芳基或未取代的或取代的杂环，芳基或杂环上的取代基为卤素、烷基、低级烷氧基、NR₅R₆、CN、NO₂或SR₅；
每一个Q独立为H、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、芳基C₁-C₁₀烷氧基、OH、OC₁-C₁₀烷基、(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、芳基、芳基C₁-C₁₀烷基、O-(CH₂)_0-6芳基、(CH₂)_1-6杂环、杂环、O(CH₂)_1-6杂环、-OR₁₁、-C(O)R₁₁-、C(O)N(R₁₁)(R₁₂)、N(R₁₁)(R₁₂)、SR₁₁、S(O)R₁₁、S(O)₂R₁₁、S(O)₂-N(R₁₁)(R₁₂)或NR₁₁-S(O)₂(R₁₂)，其中烷基、环烷基和芳基为未取代的或取代的；
n为0、1、2或3、4、5、6或7；
所述杂环为含有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-7元单环杂环，或者为8-12元稠合环系，该环系包括至少一个含有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的5-7元单环杂环，该杂环是未取代的或者取代的；
R₁₁和R₁₂独立为H、C₁-C₁₀烷基、-(CH₂)_0-6-C₃-C₇环烷基、-(CH₂)_0-6-(CH)_0-1(芳基)_1-2、-C(O)-C₁-C₁₀烷基、-C(O)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(O)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(O)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_0-6-芳基、-C(O)-(CH₂)_1-6-杂环、-C(S)-C₁-C₁₀烷基、-C(S)-(CH₂)_1-6-C₃-C₇环烷基、-C(S)-O-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-O-芴基、-C(S)-NH-(CH₂)_0-6-芳基、-C(S)-(CH₂)_0-6-芳基或-C(S)-(CH₂)_1-6-杂环、、C(O)R₁₁、C(O)NR₁₁R₁₂、C(O)OR₁₁、S(O)_nR₁₁、S(O)_m-NR₁₁R₁₂(m＝1或2)、C(S)R₁₁、C(S)NR₁₁R₁₂、C(S)OR₁₁，其中烷基、环烷基和芳基为未取代的或取代的；或R₁₁和R₁₂为有助于转运分子通过细胞膜的取代基，或者
R₁₁和R₁₂与氮原子一起形成杂环，
其中
R₁₁和R₁₂的烷基取代基可以是未取代的或被一或多个选自下列基团的取代基取代：C₁-C₁₀烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基、-CF₃或NR₁₁R₁₂；
R₁₁和R₁₂的取代的环烷基取代基可以被一或多个选自下列的取代基取代：C₂-C₁₀亚烷基、C₁-C₆烷基、卤素、OH、-O-C₁-C₆烷基、-S-C₁-C₆烷基、-CF₃或NR₁₁R₁₂；并且
R₁₁和R₁₂的取代的杂环或取代的芳基可以被一或多个选自下列的取代基取代：卤素、羟基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、硝基、CNO-C(O)-C₁-C₄烷基和C(O)-O-C₁-C₄芳基；
R₅、R₆和R₇独立为氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、环烷基或环烷基低级烷基、C(O)R₅、S(O)R₅、C(O)OR₅、C(O)NR₅R₆，并且
R₁、R₂、R₃、R₄、Q、A和A₁基团上的取代基独立为卤素、羟基、低级烷基、低级链烯基、低级炔基、低级烷氧基、芳基、芳基低级烷基、氨基、氨基低级烷基、二低级烷基氨基、低级烷酰基、氨基低级烷氧基、硝基、氰基、氰基低级烷基、羧基、低级烷氧羰基、低级烷酰基、芳酰基、低级芳烷酰基、氨基甲酰基、N-单或N，N-二低级烷基氨基甲酰基、低级烷基氨基甲酸酯、脒基、胍基、脲基、巯基、磺基、低级烷硫基、硫代氨基、磺酰胺、苯磺酰胺、磺酸酯、硫烷基低级烷基、芳基磺酰胺、卤素取代的芳基磺酸酯、低级烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、低级烷基芳基亚磺酰基、低级烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基低级烷基磺酰基、低级芳基烷基低级烷基芳基磺酰基、卤素-低级烷基巯基、卤素-低级烷基磺酰基、膦酰基(phosphono)(-P(＝O)(OH)₂)、羟基低级烷氧基磷酰基或二低级烷氧基磷酰基、(R₉)NC(O)-NR₁₀R₁₃、低级烷基氨基甲酸酯或氨基甲酸酯或-NR₈R₁₄，
其中：
R₈和R₁₄可以相同或不同，独立为氢或低级烷基，或者
R₈和R₁₄与N原子一起形成含有氮杂环原子的3-8元杂环，可以任选含有1或2个选自氮、氧和硫的其它杂环原子，所述杂环可以是未取代的或被下列基团取代：低级烷基、卤素、低级烯基、低级炔基、羟基、低级烷氧基、硝基、氨基、低级烷基、氨基、二低级烷基氨基、氰基、羧基、低级烷基羰基、甲酰基、低级烷酰基、氧代、氨基甲酰基、N-低级烷基或N，N-二低级烷基氨基甲酰基、巯基或低级烷硫基；并且
R₉、R₁₀和R₁₃独立为氢、低级烷基、卤素取代的低级烷基、芳基、芳基低级烷基、卤素取代的芳基、卤素取代的芳基低级烷基，
上述化合物可以与一或多个下列化合物组合：
(b)式(II)化合物或其盐：

(c)多柔比星；和
(d)阿糖胞苷。
另一方面，本发明提供了包含化合物(I)和化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷的组合产品。化合物(I)可以是N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺。
另一方面，本发明提供了包含化合物(Ia)和化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷的组合产品。化合物(Ia)可以是(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
另一方面，本发明提供了药用组合物，它包含化合物(I)或(Ia)和化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷。化合物(I)可以是N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺，化合物(Ia)可以是(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
另一方面，本发明提供了包含化合物(I)或(Ia)的药用组合物与含有化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷的药用组合物的组合。化合物(I)可以是N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺，化合物(Ia)可以是(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
当与PKC412或标准细胞毒药物(多柔比星和Ara-c)在体外和体内组合应用时，促凋亡的(proapoptotic)IAP抑制剂N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺有助于表达突变FLT3的PKC412-敏感性和抗性细胞系的杀灭。
另外，N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺和PKC412的组合使用能够对抗基质介导的赋予PKC412抗性的生存信号。
N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺也能够增强标准化疗药物的抗增生作用，所述药物例如拓扑异构酶抑制剂(包括多柔比星)和抗代谢药物(包括阿糖胞苷，也称为Ara-c)。
N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺在体外能够增强多柔比星或Ara-c对PKC412-敏感性和抗性细胞的抗增生作用。
术语“拓扑异构酶抑制剂”包括拓扑异构酶I抑制剂和拓扑异构酶II抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂的实例包括但不限于拓扑替康、吉马替康、伊立替康、喜树碱(camptothecian)及其类似物、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱共轭物PNU-166148、10-羟基喜树碱乙酸盐、依托泊甙、依达比星盐酸盐、伊立替康盐酸盐、替尼泊甙、盐酸拓扑替康、多柔比星、盐酸表柔比星、米托蒽醌盐酸盐和盐酸柔红霉素。伊立替康可以例如以上市产品形式给药，例如，商标CAMPTOSAR。拓扑替康可以例如以上市产品形式给药，例如，商标HYCAMTIN。本文中所用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不限于蒽环类，例如多柔比星(包括脂质体剂型，例如CAELYX)、柔红霉素(包括脂质体剂型，例如，DAUNOSOME)、表柔比星、依达比星和奈莫柔比星；蒽醌类，米托蒽醌和洛索蒽醌；鬼臼毒素类，依托泊甙和替尼泊甙。依托泊甙以ETOPOPHOS上市；替尼泊甙以VM 26-BRISTOL上市；多柔比星以ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN上市；表柔比星以FARMORUBICIN上市；依达比星以ZAVEDOS上市；米托蒽醌以NOVANTRON上市。
本文中使用的术语“抗代谢药物”是指能够抑制或干扰DNA合成从而导致细胞死亡的化合物。抗代谢药的实例包括但不限于6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、氟尿苷(flexuridine)、氟尿嘧啶、卡培他滨、雷替曲塞、甲氨蝶呤、克拉屈滨、吉西他滨、盐酸吉西他滨、硫鸟嘌呤、羟基脲、DNA脱甲基化试剂(例如5-氮杂胞苷和地西他滨)、依达曲沙、叶酸拮抗剂(例如但不限于培美曲塞)。卡培他滨可以以上市产品的形式给药，例如XELODA，吉西他滨可以以上市产品的形式给药，例如GEMZAR。阿糖胞苷为胞嘧啶阿拉伯糖苷的缩写，主要是治疗白血病和非霍奇金淋巴瘤的常规化疗药物。它也称为Ara-C、-U、PFS或其它地域性商品名。
术语“治疗”是指预防或优选治疗，包括但不限于所述疾病(特别是下面所述的疾病)的保守治疗、治愈治疗、症状缓解治疗、症状减轻治疗、调节和/或抑制。
本文中使用的术语“AML”是指骨髓细胞(例如粒细胞以及红系细胞和巨核细胞)和祖细胞的失控、快速生长。在AML患者中，未成熟骨髓细胞、红系细胞或巨核细胞的数量远远超过红细胞(红血细胞)的数量，导致疲劳和出血，也使得受感染的敏感性增加。在儿童以及成人中，即使采用积极的化疗方案，AML也难以预后。总存活率为40-60％。自体同源骨髓移植前进行的清髓性化疗不能改变存活率，但是异源骨髓移植前进行的积极化疗可能增加存活率多至70％。不幸的是，能够配型的兄弟姐妹供体有限。因此，研发AML的新的治疗策略是必须的。
温血动物(或患者)优选为哺乳动物，特别是人类或青少年人类。
N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺能够协同增强PKC412对抗突变FLT3-表达细胞的抗增生作用。在N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺和PKC412组合使用的实验中，观察到了两种化合物之间的协同作用，它们能够在体外组合对抗多种PKC412敏感性和抗性细胞系。当小鼠采用N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺和PKC412的组合治疗时，在急性白血病体内成像模型中观察到了确切的协同作用；与载体或单一药物相比，经药物组合治疗的采用FLT3-ITD-Ba/F3-luc+表达细胞进行IV-注射的NCr裸鼠中观察到肿瘤负荷为最小。
经过伊马替尼的数年治疗后，少量的白血病CD34+细胞仍然会坚持存在于CML患者的骨髓微环境中。同样，接受FLT3激酶抑制剂治疗的晚期AML患者的临床研究表明：常见响应模式为幼稚细胞的循环量急剧下降，同时骨髓幼稚细胞极少减少或者延缓减少，它说明存在保护的环境。这些观察说明：基质细胞与白血病细胞之间的相互作用是必不可少的。基质介导的表达突变体FLT3的细胞对PKC412的药物抗性可以通过采用IAP抑制剂对细胞进行处理而加以克服，这说明了IAP在导致PKC412抗性产生的生长因子介导的信号中可能起作用。
对一组细胞凋亡信号蛋白(包括Bcl-2、Bcl-XL和强N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺IAP底物、XIAP以及CIAP1)的FLT3调节作用进行了研究。与母细胞相比，FLT3-转化细胞中的XIAP、Bcl-2和Bcl-XL只有轻微的变化。蛋白表达中的这些小的变化可能在FLT3-转化细胞对蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如PKC412)或IAP抑制剂的细胞毒作用以及两种药物组合的增强的细胞毒作用的敏感性中具有某些重要的作用，所述IAP抑制剂例如N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
综上所述，N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺在生理学可实现的并在体内可良好耐受的剂量下能够有效地对抗突变体FLT3。通过在体外以协同作用模式对抗突变体FLT3表达细胞，N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺也能够增强PKC412以及标准化疗药物(例如多柔比星和Ara-c)的抑制作用。N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺和PKC412(或多柔比星或Ara-c)组合在PKC412抗性突变体FLT3表达细胞中的加成或协同作用性能显示：通过抑制药物抗性FLT3突变的出现，IAP抑制剂如N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺能够与其它药物有效地组合使用从而获得较高程度的患者响应。
因此，另一方面，本发明提供了治疗患有急性髓性白血病(AML)或对常规化疗有抗性的急性髓性白血病(AML)温血动物的方法，该方法包括给于所述动物治疗有效量的化合物(I)或(Ia)和化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷的组合。化合物(I)可以是N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺，化合物(Ia)可以是(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
另一方面，本发明提供了包含化合物(I)或(Ia)和化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷的组合产品或药用组合物的用途，用于治疗急性髓性白血病(AML)或对常规化疗有抗性的急性髓性白血病(AML)。化合物(I)可以是N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺，化合物(Ia)可以是(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
另一方面，本发明提供了包含化合物(I)或(Ia)和化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷的组合产品或药用组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗急性髓性白血病(AML)或对常规化疗有抗性的急性髓性白血病。化合物(I)可以是N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺，化合物(Ia)可以是(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
另一方面，本发明提供了包含化合物(I)或(Ia)和化合物(II)、多柔比星或阿糖胞苷的组合产品或药用组合物以及说明书的商业包装产品，该说明书用于指导所述化合物在AML治疗中的同时、分别或顺序使用。化合物(I)可以是N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺，化合物(Ia)可以是(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺。
对于下列实施例而言，PKC412和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺或(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺可以根据Novartis Pharma AG，Basel，瑞士，合成，将其溶于DMSO以制备10mM的储备溶液。然后在DMSO中制备系列稀释液从而获得用于细胞分析的最终稀释液。
实施例1：细胞系和细胞培养物的制备
IL-3依赖性鼠造血细胞系Ba/F3采用FLT3-ITD或含有FLT3-D835Y的MSCV逆转录酶病毒转染，所述病毒携有新霉素可选择性标记并根据对新霉素的抗性进行选择。参见Kelly等(2002)。选择FLT3-ITD转导的细胞用于在G418(1mg/mL)中的生长。如前所述培养PKC412抗性Ba/F3细胞系，该细胞系表达在ATP结合袋中产生突变的FLT3-ITD(F691L，A627T，G697R，N676D)。参见Cools等(2004)。人AML-衍生的、FLT3-ITD-表达细胞系，MV4；11[参见Quentmeier等(2003)]由Dr.Scott Armstrong，DanaFarber Cancer Institute，Boston，MA提供。将人AML衍生的、FLT3-ITD-表达细胞系MOLM-13进行修饰以表达荧光素酶，作为MOLM13-luc+由Dr.Andrew Kung，Dana Farber Cancer Institute，Boston，MA提供。所有的细胞系均采用5％CO₂于37℃培养，浓度为2×10⁵至5×10⁵，培养介质为含有10％胎牛血清并补充有1％谷氨酰胺的RPMI(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)。母Ba/F3细胞表达的野生型FLT3采用作为IL-3来源的15％WEHI调整的培养基进行类似培养。所有转染的细胞系在补充有1mg/mL G418的介质中培养。
实施例2：抗体和免疫印迹
XIAP(克隆28？)抗体(BD Sciences，Franklin Lakes，NJ)、CIAP1抗体(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)、Bcl-2(c-2)抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)和Bcl-XL(H-5)抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)各自以1∶200的稀释倍数使用。单克隆抗β-肌动蛋白抗体(克隆AC-15)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，以1∶2000的稀释倍数使用。α-微管蛋白(克隆DM1A)抗体购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)，以1∶2000的稀释倍数使用。蛋白裂解物制备和免疫印迹如前所述进行。参见Weisberg等(2002)。
实施例3：细胞存活能力和细胞凋亡分析
台盼蓝排阻分析(trypan blue exclusion assay)已有描述[参见Weisberg等(2002)]，用于评价在有或无PKC412和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)情况下培养的细胞的增生性。细胞的存活能力以对照(未处理)细胞的百分比表示。误差线代表每一个数据点的平均值的标准差。根据已有报道，药物处理的细胞的凋亡采用Annexin-V-Fluos Staining Kit(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)测定。参见Weisberg等(2002)。
实施例4：人基质实验
在接种MOLM13-luc+细胞(40,000个/孔)之前24小时接种HS-5人基质细胞(10,000个/孔)，随后采用多个浓度的N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412单独或组合处理。然后采用Xenogen成像仪对细胞进行荧光素酶表达分析。
实施例5：药物组合实验
为了进行药物组合实验，将PKC412和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)以固定的比例同时添加至FLT3-ITD-Ba/F3细胞和PKC412抗性突变FLT3表达细胞中。采用台盼蓝排阻分析测定细胞存活能力，以相对于对照细胞，药物处理对细胞生长的影响(FA)的函数表示；根据Chou-Talalay方法，通过Calcusyn软件(Biosoft，Ferguson，MO和Cambridge，UK)对数据进行分析。参见Chou和Talalay等(1984)。组合指数＝[D]₁[D_x]₁+[D]₂/[D_x]₂，其中[D]₁和[D]₂为组合中每一个药物欲获得与每一个药物以浓度[D_x]₁和[D_x]₂单独使用时的相同作用所需要的浓度。当值低于1时表示协同，当值大于1时表示拮抗。
实施例6：小鼠实验和体内成像
FLT3-ITD-Ba/F3细胞采用逆转录酶编码的萤火虫荧光素酶(MSCV-Luc)转染，采用新霉素筛选以产生FLT3-ITD-Ba/F3-荧光素酶(luc+)细胞系。将不含支原体以及无病毒感染的细胞悬浮于Hank平衡盐溶液(HBSS；Mediatech，Inc.，VA)，然后IV给药于小鼠。将44/14(Gattefosse，法国)中的6％w/w PKC412采用1×PBS稀释，在42℃的水浴中温热直到变为液体。然后将溶液于4℃储存直到用于对小鼠进行管饲处理。通过首先将10mg粉末储存物用30μL水润湿，然后溶于2当量的6.0N HCl中(化合物浓度为0.73μL/mg)，制备N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)。将获得的(澄清)溶液置于1mL的pH4.6乙酸盐缓冲液中，将获得的储备液于-20℃冷冻存放直到用于对小鼠进行管饲处理。
通过尾静脉注射给于雄性NCr-裸鼠(5-6周龄；Taconic，NY)总量为800,000的FLT3-ITD-Ba/F3-luc+细胞。将小鼠成像，全身荧光定量如前所述。参见Armstrong等(2003)。肿瘤细胞接种后一天的基线成像用于确定相似肿瘤负荷的治疗分组。各组小鼠分别采用下列方式口服给药：载体，40mg/kg/日PKC412(如上所述配制)，50mg/kg N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)(如上所述配制)，或PKC412和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)的组合。在不同的间隔进行重复成像。在实验的计划的终点(最初IV注射FLT3-ITD-Ba/F3-luc+细胞后约一周)，将小鼠处死，记录体重和脾重，将组织在10％福尔马林中保存用于组织病理学分析。
实施例7：N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412对抗PKC412敏感性和抗性细胞的组合作用
N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)与PKC412组合进行对抗FLT3-ITD-Ba/F3细胞的实验。在两种药物之间观察到确切的增强作用，参见图1以及下面的表I，它表示了图1和2中所示的剂量-响应曲线计算的组合指数。采用Calcusyn软件进行的N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)与PKC412的组合作用分析显示了如表I中所示的剂量范围(ED50-ED90)的协同作用。对N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412的组合也进行了对抗人类急性白血病、FLT3-ITD-表达细胞系、MV4；11细胞系的实验，实验发现：如表I所示，与较高剂量的每一个药物单独使用相比，两种药物均能够增强细胞增生性的抑制。N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412的组合作用的Calcusyn分析显示：如表I所示，较高剂量时出现温和的协同作用(ED75-ED90)，较低剂量时出现拮抗作用(ED50)。对N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412对抗下列细胞系的组合作用也进行了研究：PKC412-抗性、突变体FLT3表达细胞系，A627T-FLT3-Ba/F3，F691I-FLT3-Ba/F3，G697R-FLT3-Ba/F3和N676D-FLT3-Ba/F3。如图2和表I所示，N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412对抗A627T-FLT3-Ba/F3和F691I-FLT3-Ba/F3系观察到协同作用(ED50-ED90)，N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412对抗G697R-FLT3-Ba/F3系也观察到协同作用(ED50-ED90)。对于N676D-FLT3-Ba/F3细胞系，如表I所示，组合的结果显示了N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412之间的加成作用(ED50-ED90)。
表I

实施例8：增生性实验分别显示了N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和多柔比星或Ara-c对抗PKC412敏感性和抗性突变体FLT3-表达细胞的组合作用
PKC412和标准化疗药物(例如多柔比星和Ara-c)对抗FLT3-ITD-Ba/F3细胞的组合作用显示了多个剂量范围(ED50-ED90)的PKC412和多柔比星组合的协同作用，参见图3和表II，它表示了图3和4中所示的剂量-响应曲线计算的组合指数。N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和多柔比星对抗FLT3-ITD-Ba/F3细胞的Calcusyn分析显示了多个剂量范围(ED50-ED90)的协同作用，参见图4和表II。N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和多柔比星对抗F691I-FLT3-Ba/F3细胞的组合作用的Calcusyn分析的结果显示：只有较高的剂量范围(ED75-ED90)具有加成至协同作用，参见表II。对于A627T-FLT3-Ba/F3细胞而言，发现N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和多柔比星具有协同作用(ED50-ED90)，参见表II。观察到N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和Ara-c对FLT3-ITD-Ba/F3细胞的协同作用(ED50-ED90)参见图5和表II，对于F691I-FLT3-Ba/F3细胞和A627T-FLT3-Ba/F3细胞(ED50-ED90)的协同作用参见表II。
表II


实施例9：N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412在体内单独使用和组合使用的作用研究
对急性白血病的小鼠模型进行研究，从而直接评价N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)单独使用、PKC412单独使用以及N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412的组合使用的体内抗肿瘤效能，其中肿瘤负荷通过荧光肿瘤细胞的非侵入性成像定量测定，参见图6。
将鼠FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理以稳定地表达萤火虫荧光素酶，然后将这些细胞接种到NCr裸鼠中。采用非侵入性成像连续评价肿瘤负荷，将确定白血病的小鼠根据相似的肿瘤负荷分组。
然后将PKC412、N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)或PKC412与N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)的组合通过口服管饲法给药，同样给于载体。两种药物的一起给药可以通过管饲给于一种药物后20-30分钟管饲给于另一种药物来进行。
小鼠单独给于载体、N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)(50mg/kg)、PKC412(40mg/kg)或者给于N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412的组合，参见图6。
最小肿瘤负荷(通过生物荧光方法评价)出现在药物组合应用的组中，出现时间为IV注射FLT3-ITD-Ba/F3-luc+细胞后的第5和7天(分别相应于药物治疗的4和6天)，参见图6和7。采用Student t-检验用于对IV注射后第7天所获得的生物荧光结果进行统计学评价：p＜0.056247(载体相对于N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)单独使用)；p＜0.04825(载体相对于PKC412单独使用)；p＜0.04329(载体相对于N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412组合使用)。IV注射后第5天的统计学评价(通过Student t-检验)：p＜0.077299(载体相对于N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)单独使用)；p＜0.075852(载体相对于PKC412单独使用)；p＜0.06826(载体相对于N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412组合使用)。最小脾重百分比出现在采用N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412组合使用治疗的小鼠中，出现时间为第8天处死后的最后成像，参见图8。
实施例10：N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)对基质介导的突变体FLT3表达细胞对PKC412的抗性的作用
研究了在有或无WEHI(用作IL-3的来源)存在下培养的Ba/F3-FLT3-ITD细胞对PKC412细胞毒作用的应答，发现IL-3的存在完全保护了细胞，使其免于细胞增生的PKC412抑制(补充数据)。
与PKC412相比，IAP抑制剂N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)在两者均不存在以及IL-3存在的情况下均能够抑制Ba/F3-FLT3-ITD细胞的增生。有趣的是，同时给于N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)和PKC412能够协同抑制在IL-3存在下培养的Ba/F3-FLT3-ITD细胞的生长；该抑制的程度与两种药物在IL-3不存在下共同给于所获得的抑制程度相似，这说明IAP抑制剂能够增强FLT3抑制剂的作用，克服由生存信号存在而导致的药物抗性。
人基质细胞系HS-5与突变FLT3AML系MOLM-13结合使用。为了只测定白血病成分，将荧光素酶引入白血病细胞，从而可以采用光发射特别定量测定存活细胞数目。在图9所示的研究中，在有或无接近融合的单层HS-5基质细胞存在下，将MOLM-13-luc+细胞(40,000/孔)暴露于PKC412。该基质细胞系能够增强生长，部分保护性地对抗PKC412的抑制作用，参见图9。当采用Ba/F3-FLT3-ITD时也可以看到，在有或无生长因子存在下，PKC412和N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)在杀灭人FLT3-ITD-表达细胞系MOLM13-luc+中存在确切的合作作用。在有或无HS-5人基质细胞存在下，N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)同样能够增强PKC412对抗MOLM13-luc+细胞的细胞毒作用(参见图6B)。这些结果支持下了观点：基质介导的存活信号可以有助于在骨髓中所观察到的对FLT3抑制剂(例如PKC412)的药物抗性，该抗性可以通过包含IAP抑制剂的治疗而克服。
实施例11：IAP对突变体FLT3的调节
在突变体FLT3-表达细胞中研究了一组抗凋亡信号因子的表达，所述因子包括N-[1-环己基-2-氧代-2-(6-苯乙基-八氢-吡咯并[2，3-c]吡啶-1-基-乙基]-2-甲基氨基-丙酰胺(LBW242)的IAP底物以及Bcl-2和BclxL。细胞暴露于生长因子2天后，与母Ba/F3细胞相比，在FLT3-ITD表达Ba/F3细胞中的XIAP、Bcl-2和BclxL蛋白表达只观察到轻微的变化，CIAP1表达没有产生可检测的改变，IL-3对蛋白水平没有作用，参见图10。采用0.1μMPKC412对FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理22小时导致BclxL和XIAP蛋白表达的部分降低，说明FLT3能够调节这些蛋白的表达，参见图10。
实施例12：细胞存活和凋亡分析
台盼蓝排阻分析先前已有描述[参见Weisberg等(2002)]，它被用于测定在有或无PKC412和(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺存在下培养的细胞的增生性。细胞存活以相对于对照(未处理)细胞的百分比表示。误差线代表每一个数据点的平均值的标准差。根据已有报道，药物处理的细胞的凋亡采用Annexin-V-Fluos Staining Kit(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)测定。参见Weisberg等(2002)。
实施例13：药物组合研究PKC412和(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)
为了进行药物组合研究，将PKC412和(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)以固定的比例同时加至FLT3-ITD-Ba/F3细胞或AML-衍生的MOLM13-luc+FLT3-表达细胞中。采用台盼蓝排阻分析测定细胞存活，以相对于对照细胞，药物处理对细胞生长影响(FA)的函数表示，参见图11。
实施例14：(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和PKC412对抗PKC412敏感性细胞的组合作用
对(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)与PKC412的组合对抗FLT3-ITD-Ba/F3细胞进行了研究。在两种药物之间观察到确切的增强作用，参见图12。
对(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和PKC412的组合对抗人急性白血病FLT3-ITD-表达细胞系MOLM13-luc+进行了研究，参见图11，发现：在较高的剂量下，与每一种药物单独使用相比，两种药物均能够增强细胞增生的抑制。
实施例15：增生性研究显示了(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和多柔比星或Ara-c对抗PKC412敏感性突变FLT3表达细胞的组合作用
PKC412和标准化疗药物(例如多柔比星和Ara-c)对抗FLT3-ITD-Ba/F3细胞的组合作用显示：PKC412和多柔比星在多个剂量范围(ED50-ED90)的组合均有确切的增强作用，参见图13-15。
实施例16：(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和PKC412单独使用以及组合使用的体内作用研究
对急性白血病的小鼠模型进行研究，从而直接评价(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)单独使用、PKC412单独使用以及(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和PKC412组合使用的体内抗肿瘤效能，其中肿瘤负荷通过荧光肿瘤细胞的非侵入性成像定量测定，参见图16。
将鼠FLT3-ITD-Ba/F3细胞处理以稳定地表达萤火虫荧光素酶，然后将这些细胞接种到NCr裸鼠中。采用非侵入性成像连续评价肿瘤负荷，将确定白血病的小鼠根据相似的肿瘤负荷分组。
然后将PKC412、(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺或PKC412与(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)的组合通过口服管饲法给药，同样给于载体。两种药物的一起给药可以通过管饲给于一种药物后20-30分钟管饲给于另一种药物来进行。小鼠单独给于载体、(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)(50mg/kg)、PKC412(40mg/kg)或者给于(S)-N-((S)-1-环己基-2-{(S)-2-[4-(4-氟-苯甲酰基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-基}-2-氧代-乙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(化合物Y)和PKC412的组合，参见图16。最小肿瘤负荷(通过生物荧光方法评价)(光子数/秒)出现在药物组合应用的组中，出现时间为IV注射FLT3-ITD-Ba/F3-luc+细胞后的第8天(分别相应于药物治疗的第8天)，参见图16。