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本发明涉及的技术领域，是将核黄素酯类衍生物及含有上述成分的组合物用于制备治疗糖尿病及其并发症药物中的用途。本发明所述的核黄素酯类衍生物加入辅料后可制成胶囊、片剂、颗粒剂和针剂等剂型。核黄素酯类衍生物具有促进前脂肪细胞葡萄糖消耗，激活过氧化物酶体增殖体激活受体γ，降低糖尿病动物模型的血糖，增加对胰岛素的敏感性，改善胰岛功能及形态，减轻糖尿病性神经、视网膜、肾脏和足的病变。

1、  下式(I)的核黄素酯类衍生物用于制备治疗I型糖尿病和II型糖尿病药物的应用。

其中R₁、R₂、R₃、R₄分别为氢、C2-C12的直链脂肪酸、C2-C12的支链脂肪酸、C2-C12的芳香酸、金刚烷酸、烟酸或无机酸。

2、  如权利要求1所述的核黄素酯类的应用，所述的无机酸为磷酸或硫酸。

3、  如权利要求1的核黄素酯类衍生物(I)在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。

4、  权利要求3中所述的糖尿病并发症是指其慢性并发症，包括糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病足。

5、  一种用于治疗糖尿病和糖尿病并发症药物的组合物，其包括作为活性成份的权利要求1的核黄素酯类衍生物及药用赋形剂或载体。

6、  权利要求5的药物组合物，其中所述药物组合物可被制成片剂、胶囊、注射液。

核黄素酯类衍生物用于制备治疗糖尿病及其并发症药物的用途
技术领域
本发明涉及核黄素酯类衍生物用于制备治疗糖尿病及其并发症药物的用途。
背景技术
糖尿病是一种全球性的临床常见的代谢性疾病。近年来随着经济的发展和人们饮食结构的改变，糖尿病的患病率正在世界范围内迅速上升。据统计，全球糖尿病患者总数达到1.9亿，每年新出现的糖尿病患者达到700万人到800万人。糖尿病在亚洲已经成为一种流行病。我国糖尿病患者估计约有三千多万。非胰岛素依赖型即II型糖尿病约占90％。国外资料预计到2025年，全球将有超过2.5亿名糖尿病患者，到2030年糖尿病患者达3.66亿。可见糖尿病已成为继心脑血管、恶性肿瘤之后的又一严重危害人类健康的严重疾病。
糖尿病的病程长，如血糖控制不好，常很快有并发症发生，如眼网膜病变、神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病足等。糖尿病并发症会严重影响中老年人的生活质量，严重的导致死亡。因此，糖尿病及其并发症的防治已成为全世界新药研究开发者的重大课题。国内外制药企业均投入巨资研究和开发新的抗糖尿病药物，相继开发出了品种多样的糖尿病及其并发症的防治药物。
目前抗糖尿病药物有促胰岛素分泌剂、双胍类药物、α-糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂、胰岛素类。促胰岛素分泌剂分磺脲类(如第一代磺脲类药物甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、醋磺己脲、妥拉磺脲等；第二代药物有格列本脲、格列吡嗪、格列齐特、格列波脲、格列喹酮和格列美脲等)和非磺脲类促胰岛素分泌剂(如瑞格列奈和那格列奈等)。双胍类药物主要作用机制包括提高外周组织(如肌肉、脂肪)对葡萄糖的摄取和利用、抑制糖异生和糖原分解、降低过高的肝葡萄糖输出、降低脂肪酸氧化率、提高葡萄糖的运转能力、改善胰岛素敏感性、减轻胰岛素抵抗等，对血糖正常者无降血糖作用，主要有二甲双胍和苯乙双胍。α-糖苷酶抑制剂可延迟碳水化合物吸收，降低餐后高血糖，尤其适用于空腹血糖正常(或不太高)而餐后血糖明显升高者，制剂包括阿卡波糖和伏格列波糖。胰岛素增敏剂主要通过结合和活化过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)起作用，PPARγ受体被激活后通过诱导脂肪生成酶和与糖代谢调节相关蛋白的表达，促进脂肪细胞和其他细胞的分化，并提高细胞对胰岛素作用的敏感性，减轻胰岛素抵抗，主要品种为罗格列酮。DPP-IV抑制剂主要通过与DPP-IV活性部位的205位和206位谷氨酸形成盐桥而抑制DPP-IV的活性、使血清GLP-1水平升高、导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌增加。胰岛素是糖尿病患者胰岛功能丧失的最终选择，按起效作用快慢和维持时间长短分为短(速)效、中效和长效三类。还有胰岛素类似物，包括赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素等。除上述临床常用治疗糖尿病药物外，国内外正在开发的药物还有糖异生抑制剂、胰岛素样生长因子-1、胰高血糖素-受体拮抗剂、促胰岛分泌活化蛋白质、AMP蛋白激酶(AMPK)激动剂等。
比较理想的抗糖尿病药物的标准有：(1)显著的降低血糖作用、但不易引起低血糖反应；(2)有胰岛素增敏作用；(3)对胰岛β细胞有保护作用、或促进胰岛β细胞功能恢复；(4)口服给药，使用方便；(5)对糖尿病并发症有预防或治疗作用。已上市的抗糖尿病药物，各有优缺点，离比较理想的抗糖尿病药物还存在一定距离。如长期使用促胰岛素分泌剂，反而可导致胰岛β细胞衰竭，患者最终需要注射胰岛素。目前市场上销售的胰岛素增敏剂如马来酸罗格列酮，临床长期使用能引发骨质疏松导致骨折或诱发心肌梗塞。胰岛素是晚期糖尿病的必然选择，但需要注射给药，且对给药剂量要求严格，否则极易引起低血糖反应。总之，目前多数临床上使用的抗糖尿病药物实际上是降糖药物，而非真正意义上的抗糖尿病药物，对改善患者的胰岛β细胞功能无益，甚或加重损害。因此，发现和开发新类型的、具有显著优点的抗糖尿病药物意义重大。
核黄素，即维生素B2，它是一种水溶性B族维生具有一个核糖醇侧链的异咯嗪的衍生物。核黄素的生物活性形式是黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)两种黄素辅酶。这两种辅酶与多种蛋白结合形成黄素蛋白。核黄素的主要生理功能是参与生物氧化及能量的代谢，维持皮肤黏膜完整性，参与药物代谢、抗氧化和视觉感光过程，影响肾上腺素产生和红细胞形成等。
核黄素还具有不少药理作用，可用于肿瘤的辅助治疗、心脑血管疾病等。但单独服用只有15％的吸收率，核黄素在生物体储存量不多，多余的在尿液中排出。因此，临床上主要用于维生素B2缺乏症。
核黄素衍生物在临床上也有很多用途，核黄素四丁酸酯用于防止血栓形成、动脉粥样硬化，也可用于维生素B2缺乏、口腔溃疡、阴囊炎、脂溢性皮炎。核黄素月桂酸酯用于病后恢复期及因缺乏核黄素而引起的各种疾病，还试用于放疗化疗引起的消化道粘膜炎。
发明内容
本发明的目的是在于提供核黄素酯类衍生物的新用途，具体涉及核黄素酯类衍生物在制备治疗糖尿病及其并发症新型药物中的应用。
本发明经过广泛深入的研究，在筛选治疗糖尿病及其并发症的药物中出人意料地发现核黄素酯类衍生物在体外具有明显的促进前脂肪细胞葡萄糖消耗，利用PPARγ激动剂筛选模型，发现这些酯类生物具有显著的PPARγ激动作用，从而提示可能有胰岛素增敏作用。进一步在糖尿病的动物模型上研究，发现其显著降糖作用、胰岛素增敏作用、对胰岛β细胞保护作用和治疗糖尿病并发症(眼网膜病变、神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病足等)的作用。由此，核黄素酯类衍生物可用作制备防治I型、II型糖尿病及其并发症的药物。本发明基于上述发现得以完成。
本发明第一方面目的是提供通式(I)的核黄素酯类衍生物用于防治糖尿病及其并发症的应用；

其中R₁、R₂、R₃、R₄分别为氢、C2-C12的直链脂肪酸、C2-C12的支链脂肪酸、C2-C12的芳香酸、金刚烷酸、烟酸、无机酸。其中R₁、R₂、R₃、R₄不能同时为氢，所述的无机酸为磷酸或硫酸。
本发明的另一个目的是提供核黄素酯类衍生物(I)在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。所述的糖尿病并发症是指其慢性并发症，包括糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病足。
本发明进一步的目的是提供一种用于治疗糖尿病和糖尿病并发症药物的组合物，其包括作为活性成份的核黄素酯类衍生物及药用赋形剂或载体。其中所述的药物组合物可被制成片剂、胶囊、注射液。
根据本发明，核黄素酯类衍生物可以从核黄素酯化反应得到，方法简便，产率高，反应产物通过结晶法可得到。
为了更好的理解本发明的实质，下面将介绍核黄素酯类衍生物的合成过程和药理试验的结果来说明其在制备防治糖尿病及其并发症的新型药物中的应用。
具体实施方式
实施例1：核黄素月桂酸酯的制备
称取核黄素(购自湖北广济药业有限公司，以下同)28.8g置于三口反应瓶内，加入吡啶192ml，搅拌油浴加热至100℃，滴加月桂酰氯18.6ml并在15-20分钟内滴加完毕，继续加热升温至118℃回流1.5小时后，再慢慢滴加18.6ml月桂酰氯至反应液透明，冷却过滤，滤液经减压浓缩后，加入240ml甲醇回流，析出结晶，过滤，在75℃干燥，可得核黄素月桂酸酯18g，熔点为23-245℃，溶于180mlDMF(二甲基甲酰胺)中，采用15×150cm LH₂₀层柱，经2-3次分离和重结晶，可分别获得核黄素-5’-月桂酸单酯，核黄素-5’，4’-月桂酸双酯及核黄素-5’，4’-3’-月桂酸三酯和核黄素-5’，4’，3’，2’-月桂酸四酯，如下图：

核黄素-5′-单月桂酸酯              核黄素-5′，4′-双月桂酸酯

核黄素-5′，4′，3′-三月桂酸酯    核黄素-5′，4′，3′，2′-四月桂酸酯
其中核黄素-5-月桂酸单酯，mp 249-250℃，元素分析，计算值(％)：C62.34，H7.58，N10.03；实测值(％)：C62.08，H7.74，N9.68。比旋度[a]²⁵＝-8.4(C0.5，CH₂Cl₂∶CH₃OH1∶1)；UV(max，CH₃OH)225.8nm，269.2nm，361.4nm，444.2nm：IR(cm^-1)，3420(Br，2OH)，3178(OH)，1728(Br，2C＝O)，1661(C＝O)。MS(m/Z)分子离子峰与目标化合物分子量相同。¹H-NMR(C₅D₅N)，δ(ppm)，8.19(s，1H，Ar)，7.89(s，1H，Ar)，5.55(m，1H，HOCH)，5.35(m，2H，OCH₂)，5.10(m，1H，HOCH)，4.90(m，2H，NCH₂)，4.60(Br，1H，HOCH)，2.31(t，2H，COCH₂)，1.4(s，3H，ArCH₃)，2.15(s，3H，ArCH₃)，1.59(m，2H，CH₃CH₂)，0.83(t，3H，CH₃CH₂；³C-NMR(C₅D₅N)(ppm)，173.9(C＝O)，160.91(C)，159.9(C)，146.6(C)，137.6(C)，136.2(C)，135.0(C)，133.0(C)，131.7(CH)，118.1(CH)，71.5(CH)，71.3(CH)，70.9(CH)；67.6(CH₂)，49.0(CH₂)，48.99(CH₂)，32.1(CH₂)，29.8(CH₂)，29.7(CH₂)；(ppm)，173.9(C＝O)，160.91(C)，159.9(C)，146.6(C)，137.6(C)，136.2(C)，135.O(C)，133.0(C)，131.7(CH)，118.1(CH)，71.5(CH)，71.3(CH)，70.9(CH)；67.6(CH₂)，49.0(CH₂)，48.99(CH₂)，32.1(CH₂)，29.8(CH₂)，29.7(CH₂)，29.5(CH₂)，29.4(CH₂)，25.3(CH₂)，22.9(CH₂)，20.8(CH₂)，19.8(CH₃)，14.4(CH₃)；(ppm)，173.9(C＝O)，160.91(C)，159.9(C)，146.6(C)，137.6(C)，136.2(C)；(ppm)，173.9(C＝O)，160.91(C)，159.9(C)，146.6(C)，137.6(C)，136.2(C)，135.0(C)，133.0(C)，131.7(CH)，118.1(CH)，71.5(CH)，71.3(CH)，70.9(CH)；67.6(CH₂)，49.0(CH₂)，48.99(CH₂)，32.1(CH₂)，29.8(CH₂)，29.7(CH₂)；(ppm)，173.9(C＝O)，160.91(C)，159.9(C)，146.6(C)，137.6(C)，136.2(C)，135.0(C)，133.0(C)，131.7(CH)，118.1(CH)，71.5(CH)，71.3(CH)，70.9(CH)；67.6(CH₂)，49.0(CH₂)，48.99(CH₂)，32.1(CH₂)，29.8(CH₂)，29.7(CH₂)，29.5(CH₂)，29.4(CH₂)，25.3(CH₂)，22.9(CH₂)，20.8(CH₂)，19.8(CH₃)，14.4(CH₃)。
实施例2：核黄素异丁酸酯的合成
将核黄素5g悬浮于50g异丁酸酐(购自ACROS公司)中，搅拌加热至40℃时，慢慢滴加浓硫酸6ml，加毕后于50-60℃继续搅拌反应7小时，反应液呈透明，冷却过滤，滤液倒入冰水中搅拌析出沉淀，过滤，用水多次洗涤，然后用40ml甲醇加热溶解并用少量活性碳过滤，冷却结晶，再用甲醇精制一次，即可得到核黄素-四异丁酸酯。mp 125-128℃。元素分析，计算值(％)N8.53；实测值N8.32。
实施例3：核黄素-2，6-二甲氧基苯甲酸酯的制备
称取核黄素5g，2，6-二甲氧基苯甲酰氯11g(购自ACROS公司)，投入三角瓶中，加热搅拌在80-90℃反应1小时，冷却下加入10ml甲醇，倒入2L水中析出黄色结晶，过滤，水洗，干燥，约定11.4g粗品。粗品溶于80ml吡啶中过滤，滤液倒入2L水中析出结晶，过滤干燥，再用甲醇重结晶即得核黄素-2，6-二甲氧基苯甲酸酯，mp162-166℃元素分析，计算值(％)：C61.58，H5.07，N5.42；实测值C61.41，H5.24，N5.29。
实施例4：核黄素金刚烷酸(Adamantanecarboxylic acid)酯的合成
在备有金刚烷酸酰氯(购自ACROS公司)20g的反应瓶中，加入核黄素5g，吡啶40ml，搅拌下慢慢加热至回流，核黄素逐渐全溶，再继续回流2小时，冷却过夜，过滤，以除去未反应的部分核黄素，将滤液减压蒸馏除去吡啶，残渣用甲醇溶解，加活性碳回流脱色过滤，滤液倒入水中即析出结晶，冷却过滤，得粗品，将粗品用少量甲醇溶解，冷冻结晶析出，过滤，干燥，所得化合物的mp 118-120℃元，元素分析，计算值(％)：C71.46，H7.47，N5.46；实测值(％)：C70.52，H7.20，N5.45。
实施例5：核黄素四乙酸酯的合成
称取5g核黄素于100ml反应瓶中，加入50g醋酐(北京化工厂)，搅拌加热到40℃，再缓慢滴加6ml硫酸，控制温度在48-50℃反应3小时，冷却到室温后，倒入800ml冰水中析出沉淀，过滤，水洗，抽干将滤饼溶于100ml甲醇，加热使其全溶并加少量活性碳，趁热过滤，冷却结晶，再过滤，甲醇洗涤，收获结晶，干燥即得，测得mp246-248℃。
实施例6：核黄素戊酸酯的制备
称取5g核黄素于100ml反应瓶中，加入80g戊酐(购自ACROS公司)，搅拌加热到40℃，再缓慢滴加6ml硫酸，控制温度在48-50℃反应6小时，冷却到室温后，倒入800ml冰水中析出油状物，加6N氢氧化钠调pH至中性，使沉淀完全，除去水，再用1N氢氧化钠洗涤粘稠物沉淀2-3次，最后用水反复洗涤多次后过滤获得固体，再用甲醇100ml加热溶解，活性碳脱色过滤，冷却结晶，再过滤，甲醇洗涤，收结晶干燥即得，测得mp94-96℃。
实施例7：核黄素烟酸酯的制备
于三口反应瓶内，先后投入4g核黄素和15g烟酰氯盐酸盐(购自ACROS公司)，再加入30ml吡啶，搅拌油浴加热至100-120℃回流反应两小时，反应呈均相，冷却至室温，加入80ml甲醇，搅拌下倒入200ml水中析出沉淀，过滤，水洗，抽干，并经P₂O₅真空干燥后用40ml氯仿溶解，过滤除去不溶物，滤液倒入800ml己烷中析出结晶，再重结晶一次，可得3.5g核黄素烟酸酯，测得mp148-151℃。元素分析，计算值(％)：C61.81，H4.05，N14.06；实测值(％)：C60.99，H4.25，N13.84。
实施例8：核黄素酯类衍生物促进前脂肪细胞葡萄糖消耗
3T3-L1前脂肪细胞株是一种从小鼠胚胎中分离克隆获得，广泛用于药物对脂肪细胞摄取葡萄糖的研究，是常用的抗糖尿病药物的体外研究模型。
3T3-L1细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库。实验所需的核黄素酯类衍生物包括核黄素四月桂酸酯(简称核黄素月桂酸酯)、核黄素-5’-月桂酸单酯、核黄素-5’，4’-双月桂酸酯、核黄素-5’，4’，3’-三月桂酸酯、核黄素异丁酸酯、核黄素-2，6-二甲氧基苯甲酸酯、核黄素金刚烷酸酯、核黄素四乙酸酯、核黄素戊酸酯和核黄素烟酸酯，均为发明者实验室合成，纯度≥98％。核黄素四丁酸酯(重庆大新药业股份有限公司)，核黄素磷酸钠(武汉市宝源医药有限公司)，核黄素(湖北广济药业有限公司)。胰岛素、1-异丁基-3-甲基-黄嘌呤(Sigma公司)，地塞米松磷酸钠注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，葡萄糖试剂盒(葡萄糖氧化酶法，购自中生北控生物科技股份有限公司)。
3T3-L1细胞用含10％胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM高糖培养液，37℃、5％CO₂培养箱中培养。首先要将3T3-L1细胞诱导分化成脂肪细胞，诱导液采用DMEM培养基配制，其中含1-异丁基-3-甲基-黄嘌呤0.5mmol/L、地塞米松0.25nmol/L和胰岛素1mg/L。诱导6天后换成普通培养液，加入不同浓度的待测样品(核黄素及其酯类衍生物)和阳性药物胰岛素。作用2天后，取细胞上清培养液150μL，用葡萄糖试剂盒测培养液中葡萄糖的浓度。计算葡萄糖消耗率，公式为：葡萄糖消耗率(％)＝[(空白孔葡萄糖浓度-给药孔葡萄糖浓度)/空白孔葡萄糖浓度]×100％。
结果表明，核黄素酯类衍生物均能促进分化后的3T3-L1前脂肪细胞的葡萄糖消耗，与阳性对照品胰岛素比较，作用相当，而核黄素的作用不明显(见表1)。
表1样品对诱导分化后3T3-L1细胞葡萄糖(GLU)消耗的影响

(续上表)

实施例9：核黄素酯类衍生物对PPARγ的激动作用
配体与过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)结合后，与靶基因上相应的结合序列(PPRE)结合诱导靶基因表达，从而调节糖和血脂代谢，用于治疗糖尿病。本试验将pCMX-PPARγ质粒和pTAL-PPRE-Luc质粒共转染至293T细胞株，筛选出稳定表达细胞株。这样可能通过检测细胞株中报告基因(荧光素酶Luc.)表达产物的化学发光值来确定样品是否对PPARγ有激活作用(参考文献：基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立，中国药理学通报，2005，21(4)：504-507)。
试验所用阳性对照品马来酸罗格列酮(商品名为文迪雅)为市售产品，培养液溶解后过滤除菌使用。核黄素及其酯类衍生物来源同实施例8。无酚红RPMI-1640培养基(Gibco公司)、活性炭-Dextran处理的无雌活性的胎牛血清(Hyclone公司)、荧光素酶化学发光检测试剂盒(Promega公司)、潮霉素B(Solarbio公司)。
将稳定转染的293T细胞接种于24孔板(无酚红RPMI-1640培养液，10％无雌血清，200g/ml潮霉素B)，完全贴壁后加入样品(10、1、0.1μg/ml)和马来酸罗格列酮(10、1μg/ml)诱导表达报告基因Luc.，24h后测Luc.活性，样品孔的化学发光值/培养液对照孔的化学发光值作为样品通过PPARγ诱导报告基因表达的倍数，反映样品对PPARγ的转录激活强度。
结果发现，阳性对照品马来酸罗格列酮能诱导报告基因表达，诱导表达倍数为3.6倍。在核黄素酯类衍生物中，核黄素四乙酸酯、核黄素四丁酸酯、核黄素戊酸酯、核黄素月桂酸酯类、核黄素异丁酸酯、核黄素金刚烷酸酯、核黄素烟酸酯、核黄素磷酸钠和核黄素均具有一定的诱导报告基因表达的活性，以核黄素四乙酸酯、核黄素四丁酸酯等诱导表达倍数较高，表明这些衍生物具有明显的胰岛素增敏作用(见表2)。
表2样品对PPRE介导的Luc.诱导表达倍数的影响

(续上表)

实施例10：核黄素酯类衍生物拮抗四氧嘧啶(ALX)致小鼠糖尿病
ALX损伤动物胰岛β细胞导致胰岛素分泌减少，引起实验性糖尿病。此糖尿病模型具有发病率高、造模时间短、发病时间和病情严重程度较为统一等特点，是抗糖尿病药物研究的常用动物模型。四氧嘧啶(ALX)(Sigma公司)，阳性对照药盐酸二甲双胍片(MET)(双鹤药业)，核黄素及其酯类衍生物来源同实施例8。One Touch Ultra血糖检测仪和试纸条(强生公司)。雄性KM种小鼠(北京维通利华公司)。禁食16～18h后，小鼠按体重先分出正常对照组和ALX模型组，ALX模型组小鼠尾静脉注射ALX，剂量为80mg/Kg。2天后尾静脉取血测血糖，按血糖值进行分组，每组血糖值相差不大于20mg/dl。糖尿病小鼠分组如下：模型对照组、阳性对照MET组(200mg/kg)、核黄素酯类衍生物(见下表)高剂量和低剂量组(剂量分别为100mg/kg或10mg/kg)，每组10只。灌胃给药，每天上午给药1次。给药7天后，禁食16～18h，尾静脉取血测血糖。
结果表明，与模型对照组比较，阳性药MET能明显降低小鼠的血糖。核黄素酯类衍生物也有不同程度的降血糖作用，以核黄素四丁酸酯、核黄素四戊酸酯等降血糖作用明显，核黄素也有一定程度的降糖作用，但降糖幅度不大，作用显著弱于核黄素四丁酸酯、核黄素四戊酸酯等几个核黄素酯类衍生物(见表3)。
表3核黄素酯类衍生物对ALX所致小鼠糖尿病模型血糖的影响

(续上表)

注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。与核黄素组比较，#P＜0.05，##P＜0.01.
实施例11：核黄素酯类衍生物对KK^AY小鼠血糖的影响和胰岛的保护
KK^AY小鼠为典型的自发性遗传性糖尿病小鼠，体重36～40g，约9周龄，雄性，SPF级，采用特殊饲料，动物与饲料均购于中国医学科学院实验动物研究所。实验用阳性对照药马来酸罗格列酮、核黄素酯类来源同实施例8，速效胰岛素(批号：0704227，江苏万邦生化医药股份有限公司)。小鼠自由饮水，禁食16h以上，尾静脉采血测血糖。根据血糖值分组：溶媒对照组(A组)、马来酸罗格列酮(30mg/kg)组(B组)、核黄素四丁酸酯高剂量组(C组)、低剂量组(D组)、核黄素四戊酸酯高剂量组(E组)、低剂量组(F组)、核黄素磷酸钠高剂量组(G组)、低剂量组(H组)、核黄素高剂量组(I组)、低剂量组(J组)。高剂量组剂量为30mg/kg，低剂量组剂量为10mg/kg，每组均8只。各组均灌胃给药0.2ml/10g，溶媒对照组灌以同体积0.5％羧甲基纤维素钠，每天1次，连续给药35天。每周测1次血糖。在给药35天后，动物禁食16h以上，进行胰岛素耐量试验，测基础血糖后，腹腔注射速效胰岛素，剂量为0.5U/kg，给予胰岛素后30min，60min，120min采血测血糖值。上述实验结束后，处置动物取胰腺，用10％甲醛固定3天后，病理切片，HE染色，光镜下观察胰岛病变程度。
结果发现，各给药组的血糖较溶媒对照组低，以阳性药、核黄素四丁酸酯、核黄素四戊酸酯、核黄素磷酸钠(高剂量)降糖作用明显，核黄素高剂量组也有一定降糖作用，但作用相对较弱(见表4)。
各组动物注射胰岛素后血糖的变化也呈相似变化，阳性药和核黄素四丁酸酯等组的血糖下降更显著，表明其胰岛素的增敏作用，而核黄素无明显胰岛素增敏作用(表5)。光镜下检查发现溶媒对照组表现为胰岛体积变小，数量明显减少，部分动物胰腺泡上皮细胞发生脂肪变性；上述降糖明显的核黄素酯类衍生物剂量组小鼠的胰岛体积增大，数量增多。结果表明，核黄素酯类衍生物具有明显的降低血糖和胰岛素增敏作用，改善胰岛功能及形态。
表4核黄素酯类衍生物对KK^AY小鼠的降糖作用

注：与溶媒对照组(A)比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与核黄素组(I)比较，#P＜0.05.
表5核黄素酯类衍生物对KK^AY小鼠的胰岛素耐量的影响

注：与模型对照组(A)比较，*P＜0.05；与核黄素组(I)比较，#P＜0.05.
实施例12：核黄素酯类衍生物对糖尿病大鼠血糖的影响和肾脏等组织的保护
成年Wistar大鼠，北京维通利华公司繁殖，雄性，大鼠体重为180±20g，清洁级。实验用阳性对照药马来酸罗格列酮、核黄素酯类衍生物来源同实施例8。大鼠喂以高糖高脂饲料(其中含20％蔗糖，10％猪油，1％猪胆盐，2％胆固醇，67％基础饲料)4周，继以低剂量链脲菌素(STZ)(Sigma公司)30mg/kg，腹腔注射1次(注射前禁食16～18h，自由饮水)，并继续喂以高糖高脂饲料4周，使之产生高血糖症。同时另设8只大鼠喂以普通饲料作为正常对照组，动物室温度为18-22℃。尾静脉采血测血糖。根据血糖值均衡原则分组：模型对照组(A)、马来酸罗格列酮(30mg/kg)组(B)、核黄素四乙酸酯高剂量组(C)、核黄素四乙酸酯低剂量组(D)、核黄素四丁酸酯高剂量组(E)、核黄素四丁酸酯低剂量组(F)、核黄素四戊酸酯高剂量组(G)、核黄素四戊酸酯低剂量组(H)、核黄素磷酸钠高剂量组(I)、核黄素磷酸钠低剂量组(J)、核黄素高剂量组(K)、低剂量组(L)，高剂量组剂量为30mg/kg，低剂量组剂量为10mg/kg，每组均16只。另设同窝正常对照组(N)，8只。各组均灌胃给药0.2ml/100g体重，模型对照组灌以同体积0.5％羧甲基纤维素钠，每天1次，连续给药3周。动物禁食16h以上，测血糖后，处置动物取肾脏组织、眼球，用10％甲醛固定3天后，病理切片，HE染色，光镜下观察胰岛、肾脏、视网膜和晶状体病变程度。另取腓肠神经行常规HE染色和锇染色，然后用多功能真彩色病理图像分析系统进行有髓神经纤维计数，测定神经纤维总截面积、神经纤维密度和神经纤维平均截面积。实验结束时模型对照组动物已有不同程度的肢端病变，糖尿病足症状积分标准：1分：皮肤无开放性病灶，颜色发黑：2分：皮肤有轻度开放病灶，可见水泡、血泡，但病灶未涉及深部组织；3分：病灶已侵入深部肌肉组织，可见感染、溃疡及较多的脓性分泌物。用以上三个等级对糖尿病足大鼠的四肢进行评分，然后计算每只大鼠的总积分和每组的平均积分。
结果发现，各给药组的血糖较模型对照组低，以阳性药马来酸罗格列酮、核黄素四乙酸酯两剂量组、核黄素四丁酸酯两剂量组、核黄素四戊酸酯高剂量组和核黄素磷酸钠高剂量组降糖作用明显，其中核黄素四乙酸酯、核黄素四丁酸酯、核黄素四戊酸酯的三个高剂量组的降糖作用强于核黄素高剂量组(见表6)。
光镜下检查可见，正常对照组大鼠肾小球、肾小管结构正常；模型对照组肾小球基底膜增厚，胶原纤维增生明显，肾小球肥大，肾小管尤其是近曲小管上皮出现明显灶状空泡样变，呈现糖尿病肾病的典型病变。核黄素酯类衍生物给药组肾脏病变明显减轻，尤其是核黄素四丁酸酯高剂量组的肾小球、肾小管结构基本正常。
光镜下，模型对照组视网膜毛细血管迂曲怒张，形成钮结及血管绊，走行不规则。毛细血管管径不规则，管腔粗细不一，管壁边缘不规则。视网膜周细胞核肿胀，染色变浅，部分细胞核呈影细胞样改变，周细胞数量减少。核黄素酯类衍生物组动物视网膜在低倍镜下可见完整的血管网，血管管径粗细均一。高倍镜下可见核较大，核染色质疏松，一般位于毛细血管中央部位的内皮细胞及核染色质较致密，位于毛细血管一侧的周细胞。相对而言，核黄素组仍可见视网膜毛细血管迂曲，视网膜周细胞核肿胀，病变仍较明显，无明显改善。
结果发现，核黄素酯类衍生物组大鼠的神经纤维数量、神经纤维总截面积和神经纤维数密度较模型对照组明显增多或增大(表7)。
模型对照组大鼠四肢出现明显的糖尿病足症状，以皮肤颜色发黑、可见水泡和皮肤破损等为主，少量动物足病变严重，病灶已侵入深部肌肉组织，出现感染、溃疡及较多的脓性分泌物，而给药组的大鼠足症状相对较轻。通过对糖尿病大鼠足症状的评分，结果发现核黄素酯类衍生物(尤其是高剂量组)的积分明显低于模型对照组，而核黄素组的症状改善不明显(表8)。
结果表明，核黄素酯类衍生物具有明显的降低血糖作用，减轻糖尿病性肾脏、视网膜、周围神经和足的病变。
表6核黄素酯类衍生物对糖尿病大鼠的血糖影响

注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与核黄素组高剂量组比较，#P＜0.05.
表7核黄素酯类衍生物对糖尿病大鼠神经纤维病变的影响

注：与模型对照组(A)比较，*P＜0.05，**P＜0.01.
表8核黄素酯类衍生物对大鼠糖尿病足症状的影响

注：与模型对照组比较，*P＜0.05；与核黄素组高剂量组比较，#P＜0.05.