分离的髓样细胞群及其治疗方法.pdf

本发明提供一种分离髓样细胞群，所述细胞群包含大部分为谱系阴性并且同时表达CD44抗原、CD11b抗原和低氧诱导因子1α(HIF-1α)的细胞。这些细胞当经眼内给予哺乳动物眼睛时，特别是给予患有眼部变性疾病的哺乳动物时，具有有益的血管营养活性和神经营养活性。通过用抗CD44(透明质酸受体)、抗CD11b、CD14、CD33或抗其组合的抗体处理骨髓细胞、外周血细胞或脐带细胞来分离出髓样细胞，并采用流式细胞术从中正向选出表达CD44和/或CD11b的细胞。本发明的分离髓样骨髓细胞可以用编码治疗上有益的蛋白质的基因转染，以将该基因递送到视网膜。

1.  一种分离髓样细胞群，所述细胞群包含大多数表达CD44抗原、CD11b抗原和低氧诱导因子1α(HIF-1α)的细胞。

2.  权利要求1的分离髓样细胞群，其中所述细胞群通过包括以下步骤的方法产生：从哺乳动物中分离出骨髓，从骨髓中正向选出与选自抗CD44抗体、抗CD11b抗体及其组合的抗体发生免疫反应的细胞。

3.  权利要求1的分离髓样骨髓细胞群，其中所述细胞还表达CD204、CD114、CD33和CD115。

4.  权利要求1的分离髓样细胞群，其中在所述细胞群中至少约75％的细胞表达CD44。

5.  权利要求1的分离髓样骨髓细胞群，其中在所述细胞群中至少约90％的细胞表达CD44。

6.  权利要求1的分离髓样细胞群，其中所述细胞是鼠细胞。

7.  权利要求6的分离髓样细胞群，其中所述细胞群基本上不含TER-119表达细胞。

8.  权利要求1的分离髓样骨髓细胞群，其中所述细胞是人细胞。

9.  一种在低氧视网膜组织中重建和稳定功能性血管系统的方法，该方法包括使低氧视网膜组织与有效量的权利要求1的分离髓样细胞群的细胞接触。

10.  一种在抑制异常视网膜前血管形成的同时促进低氧视网膜组织的生理性视网膜内血管形成的方法，该方法包括使低氧视网膜组织与有效量的权利要求1的分离髓样细胞群的细胞接触。

11.  一种在低氧视网膜组织中促进小胶质细胞形成的方法，该方法包括使低氧视网膜组织与有效量的权利要求1的分离髓样细胞群的细胞接触。

12.  一种分离的转染髓样细胞群，所述细胞群包含大多数表达CD44抗原、CD11b抗原和低氧诱导因子1α(HIF-1α)的细胞，所述细胞被有效编码抗血管生成肽的基因转染。

13.  权利要求12的分离髓样细胞群，其中所述细胞群通过包括以下步骤的方法产生：从哺乳动物中分离出骨髓，从骨髓中正向选出与选自抗CD44抗体、抗CD11b抗体、抗CD33抗体及其组合的抗体发生免疫反应的细胞。

14.  权利要求12的分离髓样细胞群，其中所述细胞还表达CD204、CD114、CD33和CD115。

15.  权利要求12的分离髓样细胞群，其中在所述细胞群中至少约75％的细胞表达CD44。

16.  权利要求12的分离髓样骨髓细胞群，其中在所述细胞群中至少约90％的细胞表达CD44。

17.  一种分离的转染髓样细胞群，所述细胞群包含大多数表达CD44抗原、CD11b抗原和低氧诱导因子1α(HIF-1α的细胞，所述细胞被有效编码神经营养成分的基因转染。

18.  权利要求17的分离的转染髓样细胞群，其中所述神经营养成分选自神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5、睫状神经营养因子、视网膜色素上皮衍生神经营养因子、胰岛素样生长因子、神经胶质细胞系衍生神经营养因子和脑衍生神经营养因子。

19.  权利要求17的分离髓样细胞群，其中所述细胞群通过包括以下步骤的方法产生：从哺乳动物中分离出骨髓，从骨髓中正向选出与选自抗CD44抗体、抗CD11b抗体及其组合的抗体发生免疫反应的细胞。

20.  权利要求17的分离髓样细胞群，其中所述细胞还表达CD204、CD114、CD33和CD115。

21.  权利要求17的分离髓样细胞群，其中在所述细胞群中至少约75％的细胞表达CD44。

22.  权利要求17的分离髓样细胞群，其中在所述细胞群中至少约90％的细胞表达CD44。

23.  权利要求1的髓样细胞群，其中所述细胞还表达CD14。

24.  权利要求1的髓样细胞群，其中所述细胞是人骨髓细胞。

25.  权利要求1的髓样细胞群，其中所述细胞是人外周血细胞。

26.  权利要求1的髓样细胞群，其中所述细胞是人脐带血细胞。

27.  一种制备权利要求1的分离髓样细胞群的方法，该方法包括从骨髓中正向选出与选自抗CD44抗原的抗体、抗CD11b抗体、抗CD33抗体及其组合的抗体发生免疫反应的细胞。

28.  一种制备权利要求1的分离髓样细胞群的方法，该方法包括从人外周血中正向选出与选自抗CD44抗原的抗体、抗CD11b抗体、抗CD33抗体及其组合的抗体发生免疫反应的细胞。

29.  一种制备权利要求1的分离髓样细胞群的方法，该方法包括从人脐带血中正向选出与选自抗CD44抗原的抗体、抗CD11b抗体、抗CD33抗体及其组合的抗体发生免疫反应的细胞。

分离的髓样细胞群及其治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请是2006年2月24日申请的专利顺序号PCT/US2006/06411的部分继续国际申请，所述专利申请要求2005年2月24日申请的美国临时专利申请号60/656,037的权益，所述专利申请通过引用结合到本文中。
政府权益的声明
本文所披露的部分研究得到美国国立卫生研究院国立眼科研究所(National Eye Institute of the National Institutes of Health)资助号EY11254、EY12598、EY13916和EY14174的支持。美国联邦政府在本发明中可享有一定的权利。
发明领域
本发明涉及分离的哺乳动物细胞。更具体地讲，本发明涉及具有髓样细胞特征以及当经玻璃体腔注射到眼睛时能够掺入视网膜血管系统的分离细胞群。本发明还涉及通过给予哺乳动物眼部髓样细胞以治疗眼部变性疾病的方法。
发明背景
年龄相关性黄斑变性(ARMD)和糖尿病性视网膜病(DR)是工业化国家中视力丧失的最主要的原因，而且这些疾病均由视网膜新血管形成异常所致。由于视网膜由层次分界清晰的神经元、神经胶质和血管组分组成，相对较小的干扰(例如见于血管增生或水肿的干扰)都可导致严重的视功能丧失。遗传性视网膜变性(例如色素性视网膜炎(RP))也与血管异常有关，例如小动脉狭窄和血管萎缩。大多数人类遗传性视网膜变性特别影响视杆细胞光感受器，但也伴有视锥细胞丧失，视锥细胞是黄斑(macula)的主要细胞组分，而黄斑是人类视网膜中负责中心精准视敏度的区域。最近有报道披露了视锥细胞特异性存活因子(Cone-specific survival factor)(Mohand-Said等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：8357-8362)，它可促进视网膜变性小鼠模型中视锥细胞的存活。
遗传性视网膜变性影响多达1/3500的个体，其特征是进行性夜盲、视野缺损、视神经萎缩、小动脉缩窄、血管通透性改变和常常发展成完全失明的中心视力丧失(Heckenlively，J.R.主编，1988；RetinitisPigmentosa，Philadelphia：JB Lippincott Co.)。这些疾病的分子遗传分析已经在仅占已知受累个体相对较小百分比的110多个不同的基因中鉴定出突变(Humphries等，1992，Science 256：804-808；Farrar等，2002，EMBO J.21：857-864)。这些突变中许多与光转导机器的酶组分和结构组分有关，这些组分包括视紫红质、cGMP磷酸二酯酶、rds外周蛋白和RPE65。尽管观察到这些结果，但是仍然没有减缓或逆转这些视网膜变性疾病发展的有效治疗方法。基因疗法的最新进展是当将野生型转基因递送到具有特定突变的动物的光感受器或视网膜色素上皮(RPE)时，成功地逆转了小鼠的rds(Ali等，2000，Nat.Genet.25：306-310)和rd(Takahashi等，1999，J.Virol.73：7812-7816)表型以及狗的RPE65表型(Acland等，2001，Nat.Genet.28：92-95)。
多年来就已了解到正常成体循环和骨髓中存在干细胞群。这些细胞的不同亚群可沿造血细胞谱系阳性(Lin⁺)或造血细胞谱系阴性(Lin^-)谱系进行分化。此外，最新报道指出，谱系阴性造血干细胞(HSC)群含有能够在体外和体内形成血管的内皮祖细胞(EPC)(参见Asahara等，1997，Science 275：964-7)。这些细胞可参与正常的出生后血管生成和病理性出生后血管生成(postnatal angiogenesis)(参见Lyden等，2001，Nat.Med.7，1194-201；Kalka等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：3422-7；及Kocher等，2001，Nat.Med.7：430-6)，并分化成多种非内皮细胞类型，包括肝细胞(参见Lagasse等，2000，Nat.Med.6：1229-34)、小胶质细胞(参见Priller等，2002，Nat.Med.7：1356-61)、心肌细胞(参见Orlic等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：10344-9)和上皮细胞(参见Lyden等，2001，Nat.Med.7：1194-1201)。尽管这些细胞曾被用于若干血管生成实验模型中，但是尚不清楚靶向新血管系统的EPC的机制，也没有确定可有效增加有助于特定血管系统的细胞数的策略。
目前，得自骨髓的造血干细胞是常用于治疗应用的唯一的干细胞类型。40多年来，骨髓HSC一直用于移植。目前，正在研究收获纯干细胞的先进方法，以研发用于治疗白血病、淋巴瘤和遗传性血液疾病的疗法。已经在有限人数的患者中对干细胞的人体临床应用以治疗糖尿病和晚期肾癌进行了研究。
发明概述
本发明提供分离髓样细胞群，所述细胞群是通过从哺乳动物骨髓中正向选出表达CD44、CD11b和低氧诱导因子1α(HIF-1α)的细胞而产生的。当给予哺乳动物、特别是患有眼部变性疾病的哺乳动物眼内时，这些细胞具有有益的血管营养活性和神经营养活性。本发明的髓样细胞群可以如此分离，即通过用抗CD44(透明质酸受体)抗体、抗CD11b抗体、抗CD33、CD14抗体或抗这些抗原组合的抗体处理骨髓细胞(例如人骨髓细胞)，根据具体情况正向选出与一种或多种抗体发生免疫反应的细胞(例如采用流式细胞术或者抗体包被微珠或抗体结合微珠以分离细胞)。这类骨髓衍生细胞本文称为髓样骨髓(myeloid-like bone marrow，MLBM)细胞。或者，可由外周血(例如人外周血)或脐带血(例如人脐带血)中分离本发明的髓样细胞群。本发明髓样细胞群的大多数细胞表达CD44抗原、CD11b抗原和低氧诱导因子1α(HIF-1α)。
本发明还提供治疗哺乳动物的血管营养性和神经营养性视网膜疾病的方法。该方法包括给予哺乳动物患病眼分离髓样细胞群的细胞，优选通过眼内注射。优选髓样细胞群是待治疗的哺乳动物自体的(即髓样细胞群分离自各待治疗哺乳动物的骨髓、外周血或脐带血)。本发明的治疗方法改善患有眼病的哺乳动物视网膜的血管变性和光感受器神经元(photoreceptor neuron)变性。所给予的细胞的量足以延迟视网膜的血管变性和神经变性。髓样细胞群的细胞在掺入神经元网络的同时，有益地掺入视网膜的血管系统，并改善视网膜的视锥细胞变性。分离的哺乳动物髓样细胞群包括当经玻璃体腔注射到眼睛时选择性靶向活化视网膜星形细胞并保持稳定地掺入眼部新血管系统和神经元网络的细胞。优选哺乳动物为人。
在一个优选的实施方案中，在分离髓样细胞群中至少约75％的细胞表达CD44，更优选至少约90％。
在一个优选的实施方案中，髓样细胞群的细胞用治疗上有益的基因转染。例如，该细胞可用有效编码神经营养药或抗血管生成药的多核苷酸转染，所述药物通过基于细胞的基因疗法形式选择性靶向新血管系统并抑制新血管形成而又不影响已建立的血管。在一个实施方案中，本发明的分离髓样细胞群包含编码血管生成抑制肽的基因。髓样细胞群的血管生成抑制细胞可用于调节ARMD、DR和与血管系统异常有关的某些视网膜变性等疾病的血管异常生长。在另一个优选的实施方案中，本发明的分离髓样细胞群的细胞被转染以包含编码神经营养肽的基因。神经营养肽转染的髓样细胞可用于促进涉及视网膜神经变性的眼病(例如青光眼、色素性视网膜炎等)的神经元拯救(neuronalrescue)。
用本发明的分离髓样细胞群治疗眼睛的特别优势是在用髓样细胞群的细胞经玻璃体腔治疗的眼中观察到的血管营养和神经营养拯救效果(rescue effect)。用本发明的髓样细胞群的细胞治疗的眼内，视网膜神经元和光感受器(特别是视锥细胞)受到保护，一些视功能测量值可保持不变。
本发明还提供从骨髓中通过阴性细胞标记筛选出分离髓样骨髓细胞群的方法。该方法包括使大量骨髓细胞与对Ter119、CD45RB220和CD3e有特异性的抗体接触，从大量骨髓细胞中除去与Ter119、CD45RB220和CD3e抗体发生免疫反应的细胞，回收缺失Ter119、CD45RB220和CD3e表达细胞的髓样骨髓细胞。利用该方法，回收其中90％以上细胞表达CD44的细胞群。
可通过本发明髓样细胞群和本发明方法治疗的患病视网膜优选包含活化星形细胞。这可当发生有关神经胶质增生时通过早期眼部治疗或者利用激光刺激活化星形细胞局部增殖来实现。
除治疗应用以外，本发明的分离髓样骨髓细胞群可用作研究眼部血管发育生理学和将特定基因递送到眼内特定部位(例如星形细胞)的研究工具。这类应用为研究基因功能和可能的治疗机制提供了有价值的工具。

附图简述
附图中：
图1表示发育中的小鼠视网膜的示意图。(a)初生网(primary plexus)的发育。(b)第二期视网膜血管形成。GCL，神经节细胞层；IPL，内网层(inner plexus layer)；INL，内核层(inner nuclear layer)；OPL，外网层；ONL，外核层；RPE，视网膜色素上皮；ON，视神经；P，周边(periphery)。图(c)表示骨髓衍生的Lin⁺HSC和骨髓衍生的Lin^-HSC分离细胞的流式细胞术表征。上排：非抗体标记细胞的散点分布，其中R1限定了阳性PE染色的可测量设门区(quantifiable-gated area)；R2表示GFP阳性；中排：Lin^-HSC(C57B/6)；下排：Lin⁺HSC(C57B/6)细胞，各细胞系用PE缀合的Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31抗体标记。从Tie-2-GFP小鼠获取Tie-2数据。百分比表示阳性标记细胞占总Lin^-HSC群或Lin⁺HSC群的百分比。
图2表示Lin^-HSC移入发育中的小鼠视网膜。(a)注射后4天(P6)，经玻璃体腔注射的eGFP⁺Lin^-HSC细胞附着在视网膜上并进行分化。(b)Lin^-HSC(B6.129S7-Gtrosa26小鼠，用β-gal抗体染色)自身建立在血管系统用胶原IV抗体(星号表示血管系统末端)染色的前头。(c)大多数Lin⁺HSC细胞(eGFP⁺)在注射后4天(P6)无法分化。(d)注射后4天(P6)的肠系膜eGFP⁺鼠EC。(e)将Lin^-HSC(eGFP⁺)注射到成年小鼠眼内。(f)GFAP-GFP转基因小鼠中，低放大倍数下的eGFP⁺Lin^-HSC(箭头)归巢至预先存在的星形细胞模板并沿该模板分化。(g)较高放大倍数下的Lin^-细胞(eGFP)与处于下层的(underlying)星形细胞(箭头)之间的缔合。(h)未注射GFAP-GFP转基因对照。(I)注射后4天(P6)，eGFP⁺Lin^-HSC迁移至更深网层区并在该区进行分化。左图拍摄到完整铺片视网膜(whole mounted retina)中的Lin^-HSC活性；右图表示Lin^-细胞(箭头)在视网膜(上部是玻璃体侧，底部是巩膜侧)中的位置。(j)用α-CD31-PE和α-GFP-alexa 488抗体进行双标记。注射后7天，注入的Lin^-HSC(eGFP，红色)掺入血管系统(CD31)。箭头表示掺入区域。(k)注射后14天(P17)，eGFP⁺Lin^-HSC细胞形成血管。(l)和(m)心脏内注射罗丹明-葡聚糖表明，初生网(l)和深层网(m)两者中的血管是完整并具有功能。
图3显示eGFP⁺Lin^-HSC细胞归巢至由激光(a)和机械(b)两者引起成体视网膜损伤(星号表示损伤部位)而诱导的神经胶质增生(用表达GFAP的星形细胞表示，最左边的图像)。最右边的图像为较高放大倍数，表明Lin^-HSC和星形细胞紧密缔合。标准比例尺＝20μM。
图4显示Lin^-HSC细胞拯救视网膜变性小鼠的血管系统。(a-d)注射后27天(P33)用胶原IV染色的视网膜；(a)和(b)，注射Lin⁺HSC细胞(Balb/c)的视网膜显示与正常FVB小鼠的血管系统没有差异；(c)和(d)，注射Lin^-HSC(Balb/c)的视网膜具有丰富的血管网，与野生型小鼠相似；(a)和(c)，用DAPI染色的整个视网膜(上部为玻璃体侧，底部为巩膜侧)的冷冻切片；(b)和(d)，视网膜完整铺片的深网层；(e)柱状图表明在注射Lin^-HSC细胞的视网膜中所形成的深血管网的血管供应增加(n＝6)。通过计算每张图像内血管的总长度，来定量测定深层视网膜血管形成的程度。对Lin^-HSC、Lin⁺HSC或对照视网膜血管的平均总长度/高倍视野(单位微米)进行了比较。(f)注射得自rd/rd小鼠的Lin^-HSC(R，右眼)或Lin⁺HSC(L，左眼)细胞后深血管网长度的比较。显示6只独立小鼠的结果(各种颜色代表各只小鼠)。(g)和(h)当注射到P15眼时，Lin^-HSC细胞(Balb/c)还拯救rd/rd血管系统。显示了Lin^-HSC(G)或Lin⁺HSC(H)细胞注射视网膜的中间血管网和深血管网(注射后1个月)。
图5是小鼠视网膜组织的显微照片：(a)视网膜完整铺片的深层(rd/rd小鼠)，eGFP⁺Lin^-HSC注射后5天(P11)可见(灰色)。(b)和(c)在P6时接受Balb/c Lin^-细胞(b)或Lin⁺HSC细胞(c)注射的Tie-2-GFP(rd/rd)小鼠P60的视网膜血管系统。(b)和(c)左图中仅可观察到内源内皮细胞(GFP染色)。(b)和(c)中图用CD31抗体染色；箭头表示用CD31但不是用GFP染色的血管，(b)和(c)右图显示用GFP和CD31两者染色。(d)注射Lin^-HSC(左图)和对照视网膜(右图)的α-SMA染色。
图6显示T2-TrpRS转染的Lin^-HSC抑制小鼠视网膜血管系统的发育。(a)在氨基端上具有Igk信号序列的人TrpRS、T2-TrpRS和T2-TrpRS的示意图。(b)注射T2-TrpRS转染的Lin^-HSC视网膜体内表达T2-TrpRS蛋白。(1)在大肠杆菌(E.coli)中产生的重组T2-TrpRS；(2)在大肠杆菌中产生的重组T2-TrpRS；(3)在大肠杆菌中产生的重组T2-TrpRS；(4)对照视网膜；(5)注射Lin^-HSC+pSecTag2A(仅载体)的视网膜；(6)注射Lin^-HSC+pKLe135(Igk-T2-TrpRS/pSecTag)的视网膜。(a)内源TrpRS。(b)重组T2-TrpRS。(c)Lin^-HSC注射视网膜的T2-TrpRS。(c-f)注射后7天，注射视网膜的代表性初生(浅层)网和次生(深层)网；(c)和(d)注射空载体质粒转染的Lin^-HSC的眼发育正常；(e)和(f)T2-TrpRS转染的Lin^-HSC注射眼大多数显示抑制深层网；(c)和(e)初生(浅层)网；(d)和(f)次生(深层)网。(f)中观察到的血管模糊轮廓是(e)中所示初生网血管的“渗色(bleed-through)”图像。
图7显示编码带His₆标签的T2-TrpRS的DNA序列，SEQ IDNO：1。
图8显示带His₆标签的T2-TrpRS的氨基酸序列，SEQ ID NO：2。
图9表示用Lin^-HSC和用Lin⁺HSC(对照)注射小鼠眼的视网膜显微照片和视网膜电位图(ERG)。
图10统计图表明用Lin^-HSC治疗的rd/rd小鼠眼中间(Int.)血管层和深血管层两者的神经元拯救(y轴)与血管拯救(x轴)之间的相关性。
图11统计图表明用Lin⁺HSC治疗的rd/rd小鼠眼的神经元拯救(y轴)与血管拯救(x轴)之间没有相关性。
图12柱状图是在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)时间点上用Lin^-HSC(深色条形柱)治疗的rd/rd小鼠眼和未治疗(浅色条形柱)rd/rd小鼠眼的血管长度(y轴)，单位为任意相对单位。
图13包括注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的rd/rd小鼠外神经层(outer neural layer，ONR)核数的3个柱状图，证实了相对于用Lin⁺HSC治疗的对照眼(浅色条形柱)，用Lin^-HSC治疗眼(深色条形柱)的核数显著增加。
图14表示在1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的时间点(注射后)上，右眼(R，用Lin^-HSC治疗)与左眼(L，用Lin⁺HSC治疗的对照眼睛)相比较时，每只rd/rd小鼠外神经层中的核数图；给定图中每条直线是将每只小鼠的眼睛进行比较。
图15表示rd1/rd1(C3H/HeJ，左图)或野生型小鼠(C57BL/6，右图)中视网膜血管系统和神经细胞的变化。所显示的是完整铺片视网膜中视网膜血管系统的中间血管网层(上图)或深血管网层(中图)(红色：胶原IV，绿色：CD31)以及同一视网膜的切片(红色：DAPI，绿色：CD31，下图)(P：出生后天数)。(GCL：神经节细胞层，INL：内核层，ONL：外核层)。
图16显示Lin^-HSC注射拯救rd1/rd1小鼠的变性神经细胞。(A)、(B)和(C)，在P30(A)、P60(B)和P180(C)时，Lin^-HSC注射眼(右图)和对侧对照细胞(CD31^-)注射眼(左图)的视网膜血管系统中网层(Int.)或深网层(deep)以及切片。(D)，在P30(左，n＝10)、P60(中，n＝10)和P180(右，n＝6)时，Lin^-HSC注射视网膜或对照细胞(CD31^-)注射视网膜的血管系统平均总长度(+或-平均值的标准误差)。分别显示出中间血管网层(Int.)和深血管网层(deep)的数据(Y轴：血管系统的相对长度)。(E)，在P30(左，n＝10)、P60(中，n＝10)或P180(右，n＝6)时，对照细胞(CD31^-)或Lin^-HSC注射视网膜ONL中细胞核的平均数(Y轴：ONL中细胞核的相对数)。(F)，在P30(左)、P60(中)和P180(右)时，Lin^-HSC或对照细胞注射视网膜血管系统的长度(X轴)与ONL中细胞核数(Y轴)的线性相关性。
图17表明通过Lin^-HSC注射拯救视网膜功能。采用视网膜电描记(ERG)记录测量Lin^-HSC或对照细胞(CD31^-)注射视网膜的功能。(A)和(B)，注射后2个月，代表性拯救和未拯救的视网膜实例。图中显示同一动物Lin^-HSC注射右眼(A)和CD31^-对照细胞注射左眼(B)的视网膜切片(绿色：CD31染色的血管系统，红色：DAPI染色的核)。(C)，同一动物的ERG结果见(A)和(B)。
图18显示人骨髓细胞群可以拯救rd1小鼠的退行性视网膜(A-C)。在另一个视网膜变性模型rd10中同样观察到这类拯救(D-K)。A，用绿色染料标记的人Lin^-HSC(hLin^-HSC)在注射到C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠玻璃体腔后，可以分化成视网膜血管细胞。(B)和(C)，注射后1.5个月，hLin^-HSC注射眼(B)或对侧对照眼(C)的视网膜血管系统(左图；上：中网层(Int.)，下：深网层(deep))和神经细胞(右图)。(D)-(K)，用Lin^-HSC(P6时注射)拯救rd10小鼠。图中显示在P21(D：Lin^-HSC，H：对照细胞)、P30(E：Lin^-HSC，I：对照细胞)、P60(F：Lin^-HSC，J：对照细胞)和P105(G：Lin^-HSC，K：对照细胞)时的代表性视网膜(在每一时间点治疗眼和对照眼来自同一动物)。视网膜血管系统(各组照片上为中网层；各组照片中为深网层)用CD31(绿色)和胶原IV(红色)染色。各组照片下表示从同一视网膜上切取的横切片(红色：DAPI，绿色：CD31)。
图19表明用Lin^-HSC治疗后，晶体蛋白αA在被拯救的外核层细胞中上调，但是用对照细胞治疗的对侧眼中没有上调。左照片；拯救视网膜中的IgG对照，中照片；拯救视网膜中的晶体蛋白αA，右照片；未拯救视网膜中的晶体蛋白αA。
图20表格包括用本发明Lin^-HSC治疗后，鼠视网膜中被上调的基因。(A)在用鼠Lin^-HSC治疗的小鼠视网膜中表达增加3倍的基因。(B)在用鼠Lin^-HSC治疗的小鼠视网膜中上调的晶体蛋白基因。(C)在用人Lin^-HSC治疗的小鼠视网膜中表达增加2倍的基因。(D)在用人Lin^-HSC治疗的小鼠视网膜中表达上调的神经营养因子或生长因子的基因。
图21说明CD31和整联蛋白α6表面抗原在CD133阳性(DC133⁺)和CD133阴性(CD133^-)人Lin^-HSC群中的分布。左图显示流式细胞术散点图。中图和右图是显示细胞群中特定抗体表达水平的峰图(histogram)。Y轴代表事件次数，X轴表示信号强度。偏移向轮廓线峰图(对照)右侧的实心峰图表示荧光信号和抗体表达增加超出本底水平。
图22说明在正常含氧水平(常氧(normoxia))下饲养的野生型C57/B16小鼠在出生后P0天至P30天之间的出生后视网膜发育。
图23说明在P7和P12之间在高含氧水平(高氧(hyperoxia)；含氧量75％)、随后从P12到P17在常氧下饲养的C57/B16小鼠的氧诱导的视网膜病模型。
图24表明氧诱导的视网膜病(OIR)模型中用Lin^-HSC群治疗的血管拯救。
图25显示在经玻璃体腔注射Lin^-HSC后，rd1小鼠外核层(ONL)中被拯救的光感受器主要为视锥细胞。野生型小鼠视网膜(上组图)中较小百分比的光感受器为视锥细胞，如红色/绿色视锥视蛋白表达所证实(A)，而大多数的ONL细胞对视杆特异性视紫红质呈阳性(B)。视网膜血管系统由于免疫前血清(pre-immune serum)而自身发出荧光(C)，但是核层对于用视杆或视锥特异性视蛋白染色完全呈阴性。rd/rd小鼠视网膜(下组图)内核层减小，几乎成完全萎缩的ONL，这两者对视锥视蛋白(D)或视杆视蛋白(图G)均呈阴性。对照CD31^-HSC治疗眼与未注射的rd/rd视网膜相同，无视锥视蛋白(E)或视杆视蛋白(H)的任何染色。Lin^-HSC治疗的对侧眼显示显著减少但却明显存在的ONL，它主要由视锥细胞组成，如视锥红/绿色视蛋白的阳性免疫反应性所证实(F)。还观察到少量视杆细胞(I)。
图26表示用流式细胞术表征的谱系阴性和谱系阳性干细胞群的散点图(分别为左上图和左下图)，显示表达CD44抗原的细胞的百分比(红色数据点)；以及CD31阴性和CD31阳性细胞群的散点图(分别为右上图和右下图)，显示表达CD44抗原的细胞的百分比(红色数据点)。
图27表示用流式细胞术表征的表达显著水平的CD44抗原的谱系阴性细胞群(左组图)和不表达显著水平的CD44抗原的骨髓细胞亚群(右组图)的散点图，说明了表达其它各种细胞表面抗原的细胞的相对百分比。
图28显微照片显示经玻璃体腔注射本发明的MLBM细胞群的细胞的小鼠的视网膜(左图)与经玻璃体腔注射CD44^LO细胞的小鼠的视网膜的比较。
图29显微照片显示注射了MLBM细胞群的细胞(CD44^HI)的眼睛的视网膜和注射了CD44^LO细胞的眼睛的视网膜。
图30柱状图表明在氧诱导的早产儿视网膜病的视网膜病模型中MLBM细胞群对于改善小鼠视网膜致病性血管生成和促进生理上有益的血管重建(revascularization)的有益效果。上图对对照视网膜(第1条形柱)、用CD44^LO细胞治疗的视网膜(中间条形柱)和用MLBM细胞群的细胞治疗的视网膜(右条形柱)的视网膜前新血管簇(tuft)面积进行了比较。下图对对照视网膜(第1条形柱)、用CD44^LO细胞治疗的视网膜(中间条形柱)和用MLBM细胞群的细胞治疗的视网膜(右条形柱)的血管消失面积进行了比较。
图31显微照片表明一旦MLBM细胞群的细胞掺入视网膜的血管系统，则所述细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)，如照片下部细胞的绿色染色所示。
图32是表明本发明的CD11b⁺MLBM细胞群的细胞选择性靶向视网膜血管系统的显微照片。
图33是表明CD44^-CD11b^-骨髓细胞未选择性靶向视网膜血管系统的显微照片。
图34显示TrpRS的T2片段的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：3)及其T2-TrpRS-GD变异的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：4)。
图35显示mini-TrpRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：5)。
图36显示T1-TrpRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：6)。
图37显示氧诱导的视网膜病(OIR)模型小鼠的正常视网膜血管发育和经玻璃体腔移植Lin^-骨髓衍生细胞后的拯救效果。小鼠出生时视网膜很大程度上无血管，如出生后2天(P2)所示(图a，视网膜完整铺片)，其中血管存在于占据如图b所示单一平面的浅层视网膜中。图b、图d和图f是从旋转90度的en face共焦z系列数据组3D图像拍摄的照片。出生后第一周内，浅层视网膜血管系统自视神经头按辐射方式生长，到P10时几乎达到周边(c)。然后在第二周内，从浅层分支建立深层视网膜血管系统(d)。最后在头两层之间形成第三层血管网(thirdplexus of vessel)，在P30前后建立成熟的视网膜血管系统(e、f)。图g显示OIR模型暴露于高氧引起中心血管消失(central vaso-obliteration)，如所本文在P10时所示。图h显示在P12时，在移至常氧后，中心视网膜开始重建血管，并在血管化(周边)和无血管(中心)视网膜之间的界面形成特有的视网膜前新血管簇。这些簇被同工凝集素强染色。图I-n显示在OIR模型中Lin^-造血祖细胞促进血管修复。在P17时，当与溶媒治疗的另侧眼相比时，在高氧暴露之前经玻璃体腔注射Lin^-细胞显著加快中心视网膜的血管重建。而用溶媒治疗的视网膜显示部分缺乏浅层血管系统(I)，并完全缺乏深层视网膜血管系统(k、m)，Lin^-细胞治疗的另侧眼显示视网膜血管系统相对正常(j)，具有所有3个网层都存在(k、m)。图o显示在P17时，比起未注射眼或溶媒注射眼，用Lin^-细胞治疗的OIR眼明显更常常充分地重建血管。通过心脏灌注荧光素-葡聚糖(如图a-f、i、j所示)和GS凝集素(图g、h、k-n)对血管进行了观测。图k-n中的核用DAPI标记。
图38显示在OIR中Lin^-细胞加快视网膜血管重建，减少视网膜前新血管簇形成。图a-d显示采用计算机图像分析方法计算在出生后第17天得自OIR眼的视网膜完整铺片中视网膜血管消失以及视网膜前新血管簇形成(红色)的面积。图e显示在高氧前用Lin-细胞治疗的视网膜的消失面积减少几乎是未注射对照的6倍，与仅用溶媒治疗的眼睛相比减少约5倍。图f显示与未注射眼和溶媒治疗眼相比，Lin^-细胞治疗显著减少新血管簇的二维面积。图g显示Lin^-细胞移植不仅在高氧之前给予时有效减少消失面积，而且在P9-P12的高氧期间以及刚刚恢复常氧后也有效减少消失面积。(柱形图表示平均值±SEM；^*p＜0.001)。
图39显示骨髓细胞治疗几乎没有或没有长期毒性作用。在接受Lin^-细胞治疗后5或6个月进行评价的视网膜具有正常出现的视网膜血管系统，神经视网膜从横切片看来在组织上受到保护(a-f，未注射与移植后6个月的Lin^-细胞注射视网膜)。未观察到肿瘤，神经视网膜中偶见“玫瑰花结(rosette)”异常，这同样可能存在对照非注射眼内(g、h)。
图40显示CD44^HI细胞普遍存在于Lin^-群中，并有效促进OIR模型的血管修复。图a显示骨髓含有CD44^HI和CD44^LO部分，与对照CD细胞相比，Lin^-群富含CD44^HI细胞。插图显示是单核细胞和粒细胞特有的CD44^HI细胞的光散射特性，而CD44^LO细胞的光散射特性是淋巴细胞特有的。图b显示得自在氧暴露之前用CD44^LO和CD44^HI骨髓细胞治疗的眼睛的代表性P17视网膜。下图说明在P17时定量测定的消失面积和新血管形成面积用来产生图c中所示的数据。图c显示用CD44^HI细胞治疗的眼睛中血管消失和视网膜前新血管形成减少，功效与用Lin^-细胞治疗的眼睛相似。与用溶媒注射或未注射相比，CD44^HI和Lin^-注射眼中血管消失面积(*)和视网膜前新血管形成面积(**)显著减小(所有情况下p＜10^-5)。与CD44^HI相比，Lin^-细胞治疗眼的消失面积也减少(p＝0.03)，但是减至更小程度。视网膜前新血管形成的面积在Lin^-和CD44^HI治疗眼之间没有显著不同(p＝0.25)。
图41显示CD44^HI亚群表达骨髓标记。图a中，采用双色流式细胞术进一步表征CD44群。所有细胞都用抗CD44抗体标记，并用所示不同的抗体共标记。对于CD11a、CD11b和Ly6GC，CD44^HI群显示呈强标记。CD44hi细胞组分对于CD14、F4/80、cKit和CD115呈阳性。这些抗原的大多数存在于骨髓谱系细胞中。CD44^LO细胞被Ter119和CD45R B220强标记，它们分别是成红血细胞和B细胞的标记。
图42显示CD44^HI细胞在视网膜中呈现血管周围定位(perivascularlocalization)。采用共焦成像生成一系列z维图像，然后再以3D表示出来。图a中，显示了表示CD31标记的血管内皮和自引入的骨髓细胞表达的GFP的图像。骨髓细胞似乎具有假定的血管周围位置。3D数据表明，观测到血管腔和GFP⁺骨髓细胞的相对位置。图(b)中所列数字与图(a)标明的横切片位置相对应。除了图b第3号以外的所有情况下，在所述腔外都检测到GFP信号，第3号是通过具有强荧光的细胞体的切片，此处信号被渗色是显而易见的。
图43显示OIR模型中注射CD44^HI骨髓细胞的原位分析。未接受细胞治疗的对照视网膜的标记显示，存在内源F4/80+血管周围细胞(a-c)。注射的CD44^HI细胞靶向视网膜血管系统，具有与内源细胞类似的定位、形态和F4/80表达模式(d-i)。移植的血管周围骨髓细胞缺乏CD44表达，而未与视网膜血管缔合的细胞保持CD44表达(j-o)。
图44表示表达阵列分析，该分析显示CD44^HI群中高表达的骨髓相关基因，而CD44^LO细胞表达与淋巴细胞有关的基因。采用阵列对这两种骨髓细胞群之间的基因表达谱进行了比较。所示基因在表达上具有最低5倍的差异。观察到与CD44^LO细胞相比，CD44^HI群中CD44表达的水平显著较高。
图45表明CD44^HI细胞可以分化成具有小胶质细胞特征的细胞。图A和图B显示CD44^HI注射细胞表达CD11b和F4/80，并具有与内源小胶质细胞类似的形态和血管周围定位。图C提供CD44^HI注射细胞血管周围定位的3d图像。图D显示高放大倍数视野的CD44^HI注射细胞的形态。
图46表明可以通过负选择法分离出CD44^HI细胞。图A显示使用对CD45R/B220、TER119和CD3e有选择性的抗体通过MACS耗尽小鼠骨髓产生CD44^HI细胞超过90％的细胞群。图B显示阴性部分(CD44^HI群)基本上不含CD45R/B220、TER119和CD3e细胞。图C显示通过负选择法选出的CD44^HI细胞保持视网膜的寻靶和分化能力。
图47表明HIF-1表达在OIR模型中对介导修复的骨髓祖细胞十分重要。图a和图b显示用得自骨髓特异性HIF-1α敲出小鼠的CD44^HI细胞(a)或得自野生型小鼠的CD44^HI细胞(b)治疗的眼睛的代表性GS凝集素染色的视网膜完整铺片。图c和图d是显示血管消失(浅色区)和新血管簇(深色区)测量面积的图a和图b的视网膜图像。图(e)提供汇编数据，显示用得自HIF-1α敲出小鼠的CD44^HI细胞治疗的眼睛的修复活性显著丧失。^*p≤0.0003，^**p＝0.024，n＝15，这些值表示平均值±SEM。统计数据用配对眼产生。
图48提供C57BL/6J和BALB/cByJ品系的对比，显示在OIR模型缺血期，CD11b⁺小胶质细胞数可测量的差异。图(a)显示视网膜完整铺片，其中两个品系显示在出生后第12天(P12)，中心视网膜血管消失的程度大致相同；P17的视网膜血管系统有显著差异，其中C57BL/6J视网膜显示中心视网膜中有丰富的新血管簇，几乎没有血管重建。相比之下，BALB/cByJ视网膜显示此时几乎没有或者没有视网膜前新血管形成，并且血管重建基本完成。图(b)显示经48小时缺血过程后，与BALB/cByJ视网膜(右)相比，C57BL/6J视网膜(左)含有较少的CD11b⁺小胶质细胞。视神经头定位于所有图像的右下方。图(c)提供两个品系中随时间测定的CD11b⁺小胶质细胞，图中表明C57BL/6J视网膜在P12(缺血0小时)回复到常氧时具有较少的小胶质细胞，是在P14时(缺血48小时)BALB/cByJ小鼠视网膜存在的小胶质细胞数的一半以下。在所有时间点，对于BALB/cByJ与C57BL/6J，p≤0.02，n＝8-11。图(d)说明在视网膜发育期间，C57BL/6J中小胶质细胞耗尽诱导预先存在的微血管系统显著丧失。注射氯膦酸盐脂质体在P5时导致CD11b⁺小胶质细胞显著丧失，在P8时导致毛细血管消失。所示图像都位于中心视网膜的相似位置，视神经头位于右下方。图(e)显示当与对照PBS脂质体治疗的另侧眼相比时，P2时给C57BL/6J注射氯膦酸盐脂质体引起CD11b⁺小胶质细胞的显著消耗，并且在P6时明显抑制和破坏视网膜血管系统；插图显示带标记的脂质体制剂(红色)专被CD11b⁺小胶质细胞(绿色)吸收，而不被GS凝集素标记的血管细胞(蓝色)吸收，也不被任何CD11b^-细胞吸收。
图49显示从人骨髓中分离的细胞的FACS分析数据图，鉴定出在各细胞中表达的多种细胞标记。
图50显示从人骨髓中分离的CD44^HI细胞的FACS分析数据图。
图51显示从人骨髓中分离的细胞的FACS分析数据图，鉴定出细胞标记CD11a、CD11b、CD33和CD114。
图52柱状图显示对用人和小鼠CD44^HI细胞治疗以及PBS对照治疗的小鼠视网膜的簇面积和消失面积的比较。
图53显示从人外周血中分离的细胞的FACS分析数据图，鉴定出各种细胞标记。
图54柱状图显示与CD14^-细胞和用PBS处理的细胞(对照)相比，对用CD44^HI细胞治疗的小鼠视网膜的簇面积和消失面积进行比较，所述CD44^HI细胞通过用CD14和CD33进行正选择而获得。
图55显示从人外周血中分离的细胞的FACS分析数据图。
图56柱状图显示与PBS对照治疗相比较时，对得自用本发明各种细胞群治疗的小鼠视网膜的簇面积和消失面积进行比较。
图57显示人脐带血单核细胞分化成内皮细胞。
图58显示人脐带血单核细胞用抗KDR(VEGFR2)抗体的免疫染色。
图59显示人脐带血单核细胞用抗PECAM(CD31)抗体的免疫染色。
图60柱状图显示与仅用PBS治疗的视网膜相比，用本发明的人脐带髓样细胞治疗的小鼠视网膜的簇面积和消失面积。
图61柱状图显示与仅用PBS治疗的视网膜相比，用本发明的人脐带髓样细胞治疗的小鼠视网膜的簇面积和消失面积。
图62显示用eGFP慢病毒表达(lentiviral expression)鉴定的新鲜脐带血单核细胞的显微照片。
图63上图显示FACS数据，柱状图(下图)显示与仅用PBS或CD14^-细胞治疗的视网膜相比，用人脐带髓样细胞治疗的小鼠视网膜的簇面积和消失面积，所述人脐带髓样细胞用CD14进行正选择而分离出来。
优选实施方案详述
骨髓、外周血和脐带血分别包含表达CD44抗原(即透明质酸受体)和CD11b(整联蛋白αM)的髓样细胞亚群。可通过用抗CD44抗原的抗体(抗CD44抗体)和/或抗CD11b抗原的抗体(抗CD11b抗体)处理骨髓细胞后，从中选出与抗体发生免疫反应的细胞，从而从骨髓中分离出富含CD44和CD11b表达细胞的骨髓细胞髓样群。然后可通过本领域众所周知的方法从细胞中分离出抗体。例如可以应用流式细胞术，用结合微珠或包被在微珠上的抗体然后过滤选出细胞，或者通过本领域众所周知的其它分离方法选出细胞。大部分选出的细胞为谱系阴性，并同时表达CD44抗原和CD11b抗原，无论哪一个抗体均可用于分离。
除骨髓以外，还可从外周血和从脐带血分离出表达CD44和CD11b的髓样细胞群。优选髓样细胞群从人骨髓、人外周血或人脐带血中分离。
骨髓包含干细胞。通常，干细胞通过在细胞表面上分布的抗原进行鉴定(有关详细论述参见美国国立卫生研究院科学政策处(NationalInstitutes of Health，Office of Science Policy)撰写的报告Stem Cells：Scientific Progress and Future Directions(干细胞：科学进展与未来方向)，2001年6月，附录E：Stem Cell Markers(干细胞标记)，该报告通过引用有关内容结合到本文中)。大约75％从骨髓分离的谱系阴性造血干细胞也呈CD44阳性。在一个优选的实施方案中，MLBM细胞群的大部分细胞是谱系阴性造血干细胞(即CD44⁺Lin^-HSC)。
本发明提供改善患有眼病的哺乳动物的视网膜血管变性和神经元变性的方法。将本发明的分离髓样细胞群给予哺乳动物的视网膜，优选通过玻璃体腔注射。所给予的细胞的量足以改善视网膜的血管变性和/或神经元变性。优选分离髓样细胞群是待治疗的哺乳动物自体的。优选给予生理上可耐受的介质(例如磷酸缓冲盐溶液(PBS))中的髓样细胞群的细胞。
一种优选的方法包括从待治疗的哺乳动物骨髓中分离出髓样细胞群，然后以足以改善视网膜血管变性和/或神经元变性的量将所述细胞给予哺乳动物。所述细胞可从患有眼部变性疾病的哺乳动物中分离，优选在眼病早期或者从已知易患眼部变性疾病(即通过遗传体质)的健康哺乳动物中分离。在后一种情况下，分离髓样细胞群可在分离后保存，然后在后来发生眼病的早期进行预防性注射。优选患病视网膜包含活化星形细胞，髓样细胞群的细胞将靶向该类细胞。因此，当与神经胶质增生有关时，眼睛的早期治疗是有益的。或者，可以在给予自体髓样细胞群之前，用激光刺激视网膜中活化星形细胞局部增殖，从而治疗视网膜。
造血干细胞是能够发育成各种血细胞类型(例如B细胞、T细胞、粒细胞、血小板和红细胞)的干细胞。谱系表面抗原是一组细胞表面蛋白，细胞表面蛋白是成熟血细胞谱系的标记，包括CD2、CD3、CD11、CD11a、Mac-1(CD11b：CD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER-119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白细胞抗原DR(HLA-DR)和CD235a(血型糖蛋白A)。不表达高水平的这些抗原的造血干细胞一般称为谱系阴性(Lin^-)。人造血干细胞一般表达其它表面抗原，例如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133。鼠造血干细胞一般表达其它表面抗原，例如CD34、CD117(c-kit)、Thy-1和/或Sca-1。
本发明的这些CD44⁺CD11b髓样细胞能够掺入发育中的血管系统，然后分化成为血管内皮细胞。
本文和所附权利要求书中所使用的表述“成年/成体”当涉及骨髓和骨髓细胞时，包括出生后，即从幼年个体和成年个体分离的骨髓，与胚胎相对应。因此，术语“成年哺乳动物”是指幼年(出生后)和完全成熟的哺乳动物，与胚胎或出生前个体相对应。
本发明的分离髓样细胞群当经玻璃体腔注射到哺乳动物种类(例如小鼠或人，所述细胞从其中分离)的眼内时，选择性靶向星形细胞并掺入视网膜新血管系统。
本发明的分离髓样细胞群包括掺入视网膜血管系统，并可用于治疗视网膜新血管和视网膜血管变性疾病以及修复视网膜血管损伤的细胞。本发明的髓样细胞群还促进视网膜的神经元拯救，并促进抗凋亡基因上调。另外，可以使用本发明的髓样细胞群治疗新生哺乳动物眼的视网膜缺陷，例如患有氧诱导的视网膜病或早产儿视网膜病的哺乳动物。
研究发现，不表达CD44的骨髓细胞(CD44^LO细胞)一般表达一种或多种下列细胞标记：Ter119、CD45RB220和CD3e。利用这一事实，可通过包括阴性细胞标记筛选在内的方法来分离本发明的CD44^HI髓样细胞。该方法包括使大量骨髓细胞、外周血细胞或脐带细胞与对Ter119、CD45RB220和CD3e有特异性的抗体接触，从大量骨髓细胞中除去与Ter119、CD45RB220和CD3e抗体发生免疫反应的细胞，回收缺失Ter119、CD45RB220和CD3e表达细胞的髓样骨髓细胞。采用这种方法，可回收其中90％以上的细胞表达CD44的髓样细胞群。
本发明还提供治疗哺乳动物眼病的方法，该方法包括从哺乳动物骨髓中分离出髓样细胞群，按足以抑制该病的量经玻璃体腔将髓样细胞群的细胞注射到哺乳动物眼内。可采用本发明的方法治疗眼病，例如新生、幼年或完全成熟的哺乳动物的视网膜变性疾病、视网膜血管变性疾病、缺血性视网膜病、血管出血、血管渗漏和脉络膜病。这类疾病的实例包括年龄相关性黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病(DR)、拟眼组织胞浆菌病(POHS)、早产儿视网膜病(ROP)、镰状细胞性贫血和色素性视网膜炎以及视网膜损伤。
注射到眼睛的髓样细胞群的细胞数足以抑制眼病病况。例如，注射细胞的量可有效用于修复眼睛的视网膜损伤，稳定视网膜新血管系统，使视网膜新血管系统成熟，并防止或修复血管渗漏和血管出血。
本发明髓样细胞群的细胞可以用治疗上有益的基因转染，例如编码抗血管生成蛋白的基因以用于眼科基于细胞的基因疗法，以及编码神经营养成分的基因以提高神经元拯救效果。
转染细胞可以包含在治疗上有益的治疗视网膜疾病的任何基因。在一个优选的实施方案中，本发明的髓样细胞群的转染细胞包含有效编码抗血管生成肽的基因，所述肽包括蛋白质或蛋白质片段，例如TrpRS或其抗血管生成(即血管抑制)片段，例如TrpRS片段，称为T2-TrpRS(图34中的SEQ ID NO：3)、T2-TrpRS-GD(图34中的SEQ IDNO：4)(这两个是优选的血管抑制肽)，以及mini-TrpRS(图35中的SEQID NO：5)和T1-TrpRS(图36中的SEQ ID NO：6)。本发明的编码抗血管生成肽的髓样细胞群的转染细胞可用于治疗包括血管发育异常在内的视网膜疾病，例如糖尿病性视网膜病等疾病。优选髓样细胞群的细胞是人细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明的MLBM细胞群的转染细胞包含有效编码神经营养成分(neurotrophic agent)的基因，神经营养成分例如神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5、睫状神经营养因子、视网膜色素上皮衍生神经营养因子、胰岛素样生长因子、神经胶质细胞系衍生神经营养因子、脑衍生神经营养因子等。这类得自髓样细胞群的神经营养细胞可用于在视网膜神经元变性疾病(例如青光眼和色素性视网膜炎)、在治疗视网膜神经损伤等疾病中促进神经元拯救。有报道指出，睫状神经营养因子的植入用于治疗色素性视网膜炎(参见Kirby等，2001，Mol Ther.3(2)：241-8；Farrar等，2002，EMBO Journal 21：857-864)。据报道，脑衍生神经营养因子调节受损视网膜神经节中与生长有关的基因(参见Fournier等，1997，J.Neurosci.Res.47：561-572)。据报道，神经胶质细胞系衍生神经营养因子延迟色素性视网膜炎的光感受器变性(参见McGee等，2001，Mol Ther.4(6)：622-9)。
本发明还提供用于治疗眼血管生成疾病的方法，该方法通过本发明的髓样细胞群的转染细胞经玻璃体腔注射到眼睛来给予所述细胞。这类髓样细胞群的转染细胞包括用在治疗上有益的基因转染的MLBM细胞群的细胞，所述基因例如编码抗血管生成或神经营养基因产物的基因。优选髓样细胞群的转染细胞是人细胞。
优选至少约1×10⁵个MLBM细胞群的细胞或髓样细胞群的转染细胞通过玻璃体腔注射给予患有视网膜变性疾病的哺乳动物眼睛。待注射的细胞数可取决于视网膜变性的严重程度、哺乳动物的年龄和对治疗视网膜疾病领域普通技术人员十分显而易见的其它因素。可以单剂量或一定时间内的多剂量给药给予髓样细胞群的细胞，由主治临床医生决定。
本发明的髓样细胞群可用于治疗视网膜损伤和视网膜缺陷，包括中止或减轻视网膜血管系统或视网膜神经元变性。人髓样细胞群还可用于产生遗传上一致的细胞系即克隆，以用于再生性或修复性治疗视网膜血管系统，以及用于治疗或改善视网膜神经元变性。此外，本发明的髓样细胞群可用作研究视网膜血管发育和将基因递送到选定细胞靶标(例如星形细胞)的研究工具。
鼠视网膜血管发育。
眼血管生成的模型。小鼠眼为研究哺乳动物视网膜血管发育(例如人视网膜血管发育)提供了公认的模型。在鼠视网膜血管系统发育期间，缺血驱动的视网膜血管发育成与星形细胞紧密缔合。这些神经胶质组分从视盘沿神经节细胞层迁移至第三个三个月的人胎儿或新生啮齿动物的视网膜上并放射状扩展。当鼠视网膜血管系统发育时，内皮细胞利用这个已建立的星形细胞模板来确立视网膜血管模式(参见图1(a和b))。图1(a和b)表示发育中的小鼠视网膜的示意图。图(a)表示叠合在星形细胞模板(浅色线条)之上的初生网(图中左上方的深色线条)的发育，(b)表示第二期视网膜血管形成。图1中，GCL代表神经节细胞层；IPL代表内网层；INL代表内核层；OPL代表外网层；ONL代表外核层；RPE代表视网膜色素上皮；ON代表视神经；P代表周边。
出生时，视网膜血管系统实际上不存在。在出生后第14天(P14)，视网膜已发育出与视觉出现同时发生的复杂的初生(浅)层和次生(深)层视网膜血管。最初，辐条样视乳头周的血管在预先存在的星形细胞网上向周边呈放射状生长，经形成毛细血管网层而逐渐相互连接起来。直到P10，这些血管在神经纤维内生长成单层(图1(a))。在P7-P8之间，侧枝开始从这个初生网萌发，并穿透到视网膜直到外网状层，在此形成次生或深层视网膜网。到P21时，整个网进行广泛重塑，并在内核层的内表面上形成第三层即中间层网(图1(b))。
出于数种理由，新生小鼠视网膜血管生成模型可用于研究在眼血管生成期间HSC的作用。在这个生理相关的模型中，在内源血管出现之前，大的星形细胞模板已经存在，这使得在新血管过程中可对细胞间寻靶的作用进行评价。此外，已知这种一致且可再现的新生期视网膜血管过程是低氧驱动的，就这点而言，与其中已知缺血起作用的许多视网膜疾病具有相似性。
从骨髓富集内皮祖细胞(EPC)。
虽然对HSC制备物中存在的EPC群的细胞表面标记表达进行了广泛地评价，但是仍未清楚地确定唯一鉴定EPC的标记。为了富集EPC，从小鼠骨髓单核细胞中耗尽造血细胞谱系标记阳性细胞(Lin⁺)，即B淋巴细胞(CD45)、T淋巴细胞(CD3)、粒细胞(Ly-6G)、单核细胞(CD11)和红细胞(TER-119)。使用Sca-1抗原进一步富集EPC。在玻璃体腔注射相同数目的Lin^-Sca-1⁺细胞或Lin^-细胞后对所得到的结果进行比较，在两组中未发现差异。实际上，当只注射Lin^-Sca-1^-细胞时，观察到掺入发育中血管的细胞要多得多。
根据功能实验，Lin^-HSC群富含EPC。此外，Lin⁺HSC群在功能上的作用完全不同于Lin^-HSC群。还对常用来鉴定EPC每个组分的表位(基于之前报道的体外特征研究)进行了评价。虽然这些标记无一是唯一与Lin^-组分有关的，但是与Lin⁺HSC组分相比，Lin^-HSC中的所有标记都增加约70％至约1800％(图1(c))。图1中，图(c)表示骨髓衍生Lin⁺HSC和Lin^-HSC分离细胞的流式细胞术表征。图(c)上排显示非抗体标记细胞的造血干细胞散点分布。R1限定阳性PE染色的可测量设门区；R2表示GFP-阳性。Lin^-HSC的散点图见中排，Lin⁺HSC的散点图见下排。C57B/6细胞用PE缀合的Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的抗体标记。从Tie-2-GFP小鼠获得Tie-2数据。散点图角落的百分比表示阳性标记细胞点总Lin^-HSC群或Lin⁺HSC群的百分比。有趣的是，公认的EPC标记如Flk-1/KDR、Tie-2和Sca-1的表达较弱，因此，不用于进一步分级分离。
可如下分离Lin^-HSC：(a)从成年哺乳动物中提取骨髓；(b)从骨髓中分离出大量单核细胞；(c)单核细胞用生物素缀合的谱系组抗体(biotin-conjugated lineage panel antibodies)标记，所述抗体为一种或多种谱系表面抗原、优选选自以下的谱系表面抗原的抗体：CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G(鼠)、TER-119(鼠)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白细胞抗原DR(HLA-DR)和CD235a(血型糖蛋白A)；(d)从大量单核细胞中除去对所述一种或多种谱系表面抗原呈阳性的单核细胞；和(e)从中回收谱系阴性造血干细胞群。
当从成人骨髓中分离Lin^-HSC时，优选单核细胞用生物素缀合的谱系组抗体标记，所述抗体为以下谱系表面抗原的抗体：CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)和CD235a。当从成年鼠骨髓分离Lin^-HSC时，优选单核细胞用生物素缀合的谱系组抗体标记，所述抗体为以下谱系表面抗原的抗体：CD3、CD11、CD45、Ly-6G和TER-119。
经玻璃体腔注射的HSC Lin^-细胞含有靶向星形细胞并掺入发育中的视网膜血管系统的EPC。
为了确定经玻璃体腔注射Lin^-HSC是否可以靶向视网膜的特定细胞类型、利用星形细胞模板并参与视网膜血管生成，将大约10⁵个从成年(GFP或LacZ转基因)小鼠骨髓分离出的本发明Lin^-HSC组成成分(Lin^-HSC composition)的细胞或Lin⁺HSC细胞(对照，约10⁵个细胞)注射到出生后第2天(P2)的小鼠眼内。注射后4天(P6)，衍生自GFP或LacZ转基因小鼠的本发明Lin^-HSC组成成分的大多数细胞黏附到视网膜上，并具有内皮细胞特有的伸长外观(图2(a))。图2说明Lin^-细胞移入发育中的小鼠视网膜。如图2中的图(a)所示，注射后4天(P6)，经玻璃体腔注射的eGFP+Lin^-HSC附着在视网膜上并进行分化。
在视网膜的许多区域中，GFP表达细胞按与处于下层的星形细胞一致的模式排列并且类似血管。在内源发育的血管网之前就观察到这些荧光细胞(图2(b))。相反地，只有少数Lin⁺HSC(图2(c))或成年小鼠肠系膜内皮细胞(图2(d))附着在视网膜表面。为了确定得自注射Lin^-HSC群的细胞是否也附着到已建立血管的视网膜上，将Lin^-HSC组成成分注射到成熟眼中。有趣的是，没有观察到细胞附着到视网膜上或掺入已建立的正常视网膜血管(图2(e))。这就表明本发明的Lin^-HSC组成成分不会干扰正常发育的血管系统，并且不会在正常发育的视网膜中启动异常的血管形成。
为了确定注射的本发明的Lin^-HSC组成成分与视网膜星形细胞之间的关系，使用了表达胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP，星形细胞的标记)和启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠。对注射得自eGFP转基因小鼠的Lin^-HSC的这些GFAP-GFP转基因小鼠视网膜进行的检查证实，注射的eGFP EPC与已存在的星形细胞共定位(图2(f-h)，箭头)。观察到与处于下层的星形细胞网一致的eGFP+Lin^-HSC过程(箭头，图2(g))。对这些眼的检查证实，注射的标记细胞只附着在星形细胞上；在P6小鼠视网膜中，其中视网膜周边仍没有内源血管，观察到注射细胞黏附到这些仍未血管化区域的星形细胞上。预料不到的是，在视网膜的较深层观察到注射的标记细胞，此处为正常视网膜血管后续发育的确切位置(图2(I)，箭头)。
为了确定注射的Lin^-HSC是否稳定掺入发育中的视网膜血管系统，在稍后的若干时间点对视网膜血管进行了检查。早在P9(注射后7天)，Lin^-HSC便掺入CD31⁺结构(图2(j))。到P16(注射后14天)，细胞已广泛掺入视网膜血管样结构(图2(k))。当在处死动物之前经血管内注射罗丹明-葡聚糖(以鉴定功能性视网膜血管)时，大多数的Lin^-HSC与未闭的血管排列在一起(图2(l))。观察到标记细胞分布的两种模式：(1)在一种模式中，细胞沿血管散布在未标记内皮细胞之间；和(2)另一种模式显示血管完全由标记细胞组成。注射细胞还掺入深血管网的血管中(图2(m))。虽然以前曾报道了零星掺入新血管系统的Lin^-HSC衍生EPC，但是这是第一个血管网完全由这些细胞组成的报道。这就证实了经玻璃体腔注射的骨髓衍生Lin^-HSC群的细胞，可以有效地掺入形成中的视网膜血管网的任一层中。
当在经玻璃体腔注射后长达5天或10天进行检查时，非视网膜组织(例如脑、肝脏、心脏、肺、骨髓)的组织学检查表明不存在任何GFP阳性细胞。这就表明Lin^-HSC组分内的细胞亚群选择性靶向视网膜星形细胞，并稳定掺入发育中的视网膜血管系统。由于这些细胞具有内皮细胞的许多特征(与视网膜星形细胞缔合、伸长的形态、稳定掺入未闭的血管、不存在于血管外位置)，因此这些细胞代表了存在于Lin^-HSC群中的EPC。所靶向的星形细胞与在许多低氧性视网膜病中观察到的是同一类型。已经清楚了解到，神经胶质细胞是在DR和其它形式的视网膜损伤中所观察到的新血管簇叶(neovascular fronds oftufts)的重要组分。在反应性神经胶质增生和缺血诱导的新血管形成的条件下，活化星形细胞增殖，产生细胞因子并上调GFAP，与在许多哺乳动物种类(包括人)的新生期视网膜血管模板形成期间观察到的类似。
将Lin^-HSC细胞注射到具有通过光凝固(图3(a))或针尖(图3(b))损伤的视网膜的成年小鼠成熟眼中，Lin^-HSC群将靶向成年小鼠眼的活化星形细胞，正如它们在新生眼睛所进行的一样。在两个模型中，仅在损伤部位周围观察到具有明显GFAP染色的细胞群(图3(a和b))。注射的Lin^-HSC组成成分的细胞局限在损伤部位，并保持与GFAP-阳性星形细胞的特异性缔合(图3(a和b))。在这些部位，还观察到Lin^-HSC细胞迁移到视网膜的较深层，水平与在深层视网膜血管系统新生形成期间观察到的相似。视网膜未损伤部分不包含Lin^-HSC细胞，这与当Lin^-HSC注射到正常的未损伤成体视网膜时所观察到的一致(图2(e))。这些数据表明，在具有神经胶质增生的损伤成体视网膜以及正进行血管形成的新生期视网膜中，Lin^-HSC组成成分可以选择性靶向活化神经胶质细胞。
经玻璃体腔注射Lin^-HSC可拯救和稳定变性的血管系统。
由于经玻璃体腔注射的Lin^-HSC组成成分靶向星形细胞并掺入正常视网膜血管系统，因此这些细胞还可在伴有神经胶质增生和血管变性的缺血性或变性性视网膜疾病中稳定变性的血管系统。rd/rd小鼠是出生后一个月显示光感受器和视网膜血管层严重变性的视网膜变性模型。在这些小鼠中，视网膜血管系统发育正常直到P16，届时较深的血管网退化；到P30时，大多数小鼠中，深层网和中间层网几乎完全变性。
为了确定HSC能否拯救退化中的血管，P6时，将Lin⁺HSC或Lin^-HSC(得自Balb/c小鼠)注射到rd/rd小鼠玻璃体腔。P33时，注射Lin⁺细胞后，最深视网膜层的血管几乎完全不存在(图4(a和b))。相比之下，P33时，大多数Lin^-HSC注射视网膜具有几乎正常的视网膜血管系统，有三层成形良好的平行血管层(图4(a和d))。这个作用的定量测定证实，Lin^-注射rd/rd眼的深血管网层的血管平均长度比未治疗或Lin⁺细胞治疗眼的长几乎3倍(图4(e))。预料不到的是，注射得自rd/rd成年小鼠(FVB/N)骨髓的Lin^-HSC组成成分还拯救了rd/rd新生小鼠变性的视网膜血管系统(图4(f))。早至出生后2-3周就观察到rd/rd小鼠眼的血管系统变性。一直到P15才注射Lin^-HSC，同样部分导致使rd/rd小鼠变性的血管系统稳定至少1个月(图4(g和h))。
注射到更幼小的(例如P2)rd/rd小鼠的Lin^-HSC组成成分也掺入发育中的浅层血管系统。P11时，观察到这些细胞迁移至深水平的血管网层，并形成与野生型外视网膜血管层所观察到的模式相同的模式(图5(a))。为了更清楚的描述rd/rd小鼠中注射Lin^-HSC组成成分的细胞掺入及稳定变性的视网膜血管系统的方式，将得自Balb/c小鼠的Lin^-HSC组成成分注射到Tie-2-GFP FVB小鼠眼内。FVB小鼠具有rd/rd基因型，而且因为它们表达融合蛋白Tie-2-GFP，所以所有的内源血管都发出荧光。
当Lin^-HSC组成成分的未标记细胞注射到新生期Tie-2-GFP FVB眼中，并随即掺入发育中的血管系统时，可能在内源Tie-2-GFP标记血管中存在未标记的间隙(gap)，这相当于掺入的经注射的未标记Lin^-HSC。随后用另一种血管标记(例如CD-31)染色后勾画出完整血管，使得有关非内源内皮细胞是否是血管系统的组成部分得到确定。注射2个月后，注射Lin^-HSC组成成分的眼睛的视网膜中观察到CD31阳性、Tie-2-GFP阴性的血管(图5(b))。有趣的是，大多数被拯救的血管含有Tie-2-GFP阳性细胞(图5(c))。周细胞分布(如通过平滑肌肌动蛋白染色确定)没有因Lin^-HSC注射而改变，不论是否发生血管拯救(图5(d))。这些数据清楚证实了在遗传缺陷型小鼠中，经玻璃体腔注射的Lin^-HSC细胞迁移到的视网膜中，参与正常视网膜血管的形成，并稳定内源变性的血管系统。
通过得自Lin^-HSC的转染细胞抑制视网膜血管生成。
大多数视网膜血管疾病都涉及异常血管增生胜于变性。靶向星形细胞的转基因细胞可以用来递送抗血管生成蛋白，抑制血管生成。Lin^-HSC组成成分的细胞用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)转染。T2-TrpRS是TrpRS的43kD片段，有效抑制视网膜血管生成(图6(a))。在P2时注射用对照质粒转染的Lin^-HSC组成成分(无T2-TrpRS基因)的眼睛视网膜，在P12时具有正常的初生视网膜血管网层(图6(c))和次生视网膜血管网层(图6(d))。当将本发明的T2-TrpRS转染的Lin^-HSC组成成分注射到P2眼内、并在10天后进行评价时，初生网明显出现异常(图6(e))，而且深层视网膜血管系统的形成几乎被完全抑制(图6(f))。在这些眼内观察到的少量血管明显变细，血管间有很大间隙。被分泌T2-TrpRS的Lin^-HSC抑制的程度详见表1。
T2-TrpRS是由Lin^-HSC组成成分的细胞在体外产生和分泌的，将这些转染细胞注射到玻璃体后，观察到视网膜中T2-TrpRS的30kD片段(图6(b))。准确地讲，只在注射转染的Lin^-HSC的视网膜中观察到这一30kD片段，这种相对于重组或体外合成的蛋白质的表观分子量的降低可能是T2-TrpRS体内加工或降解所引起的。这些数据表明Lin^-HSC组成成分可用于通过靶向活化星形细胞，而将有功能活性的基因(例如表达血管抑制分子的基因)递送到视网膜血管系统。虽然所观察到的血管抑制作用大概是由细胞介导的活性所致，但是这是根本不可能的，因为用相同但非T2转染的Lin^-HSC组成成分治疗的眼睛具有正常的视网膜血管系统。
表1.分泌T2-TrpRS的Lin^-HSC的血管抑制

经玻璃体腔注射的Lin^-HSC群定位于视网膜星形细胞，掺入血管，并可用于治疗多种视网膜疾病。虽然注射的HSC组成成分的大部分细胞附着在星形细胞模板上，但是少部分纵深迁移到视网膜内，归巢至深层血管网随后将发育的区域。即使在出生后42天以前，在该区域也未观察到GFAP阳性星形细胞，但是这并不排除GFAP阴性神经胶质细胞已经存在并提供用于Lin^-HSC定位的信号的可能性。现有的研究表明，多种疾病与反应性神经胶质增生有关。特别是在DR中，神经胶质细胞及其胞外基质与病理性血管生成有关。
由于不论损伤类型，注射的Lin^-HSC组成成分的细胞都特异性附着在表达GFAP的神经胶质细胞上，因此本发明的Lin^-HSC组成成分可用于靶向视网膜的血管生成前病变(pre-angiogenic lesion)。例如，在缺血性视网膜病(例如糖尿病)中，新血管形成是对低氧的响应。通过Lin^-HSC组成成分靶向病理性新血管形成的部位，可使发育中的新血管系统稳定，防止了新血管系统异常，例如出血或水肿(与DR相关的视力丧失的原因)，并且可能减轻最初刺激新血管形成的低氧。异常血管可能恢复到正常状况。此外，可通过使用转染的Lin^-HSC组成成分和激光诱导的星形细胞活化，将血管抑制蛋白(例如T2-TrpRS)递送到病理性血管生成的部位。由于激光凝固通常用于临床眼科，因此该方法适用于多种视网膜疾病。虽然在癌症疗法中一直都在研究这类基于细胞的方法，但是它们在眼病中的应用更为有利，因为眼内注射使得将大量细胞直接递送到患病部位成为可能。
经由Lin^-HSC的神经营养和血管营养性拯救。
按照上述方法，采用MACS从C3H(rd/rd)、FVB(rd/rd)小鼠的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)骨髓中分离出Lin^-HSC。将得自这些小鼠的含有EPC的Lin^-HSC经玻璃体腔注射到P6 C3H或FVB小鼠眼内。在注射后不同的时间点(1个月、2个月和6个月)，收集视网膜。用抗CD31抗体染色后通过扫描激光共焦显微镜(scanning laser confocalmicroscope)，以及核用DAPI染色后的视网膜组织学，对血管系统进行了分析。还采用在不同的时间点上，对视网膜的mRNA进行微阵列基因表达分析，来鉴定可能参与该作用的基因。
P21时，rd/rd小鼠眼视网膜神经感觉层(neurosensory retina)和视网膜血管系统出现严重变性。P6时，用Lin^-HSC治疗的rd/rd小鼠眼维持正常视网膜血管系统长达6个月；当在所有时间点(1个月、2个月和6个月)上与对照相比时，深层和中间层两者都有显著改善(参见图12)。此外，我们观察到，相对于用Lin⁺HSC治疗作为对照的眼，用Lin^-HSC治疗的视网膜还比较厚(1个月；1.2倍，2个月；1.3倍，6个月；1.4倍)，并且外核层的细胞数较多(1个月；2.2倍，2个月；3.7倍，6个月；5.7倍)。与对照(未治疗或非Lin^-治疗)rd/rd视网膜相比，“被拯救”(例如Lin^-HSC)的大规模基因组分析证实，编码sHSP(小热激蛋白)及与血管和神经拯救相关的特定生长因子的基因，包括编码图20中的图A和图B所列蛋白质的基因显著上调。
rd/rd小鼠中，骨髓衍生的Lin^-HSC群显著并可再现地引起正常血管系统的维持，并且显著地增加光感受器和其它神经元细胞层。这种神经营养性拯救效果与小热激蛋白和生长因子的显著上调相关，并可供对目前尚无法治疗的视网膜变性性疾病的治疗方法进行深入了解。
rd1/rd1小鼠视网膜显示严重的血管变性和神经元变性。
文献中大量记载了小鼠出生后视网膜血管和神经元的正常发育，它与第三个三个月的人胎儿中所观察到的变化类似(Dorrell等，2002，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43：3500-3510)。rd1基因纯合的小鼠与人视网膜变性有许多共同的特征(Frasson等，1999，Nat.Med.5：1183-1187)，由于编码PR cGMP磷酸二酯酶的基因突变，而出现光感受器(PR)快速丧失，并伴有严重血管萎缩(Bowes等，1990，Nature 347：677-680)。为了检查在视网膜发育及其后续变性期间的血管系统，使用了抗胶原IV(CIV)(一种成熟血管系统的胞外基质(ECM)蛋白)和CD31(PECAM-1)(一种内皮细胞标记)的抗体(图15)。rd1/rd1(C3H/HeJ)的视网膜正常发育直到大约出生后第8天(P8)，这时含有光感受器的外核层(ONL)开始变性。ONL快速变性，细胞经凋亡而死亡，使得到P20时，只保留了单层核。完整铺片的视网膜用抗CIV和抗CD31抗体的双重染色显示了rd1/rd1小鼠血管变性的详情与其它研究披露的类似(Blanks等，1986，J.Comp.Neurol.254：543-553)。初生视网膜血管层和深层视网膜血管层似乎直到P12时都发育正常，之后出现内皮细胞快速丧失，正如CD31染色不存在时所证实的一样。CD31阳性内皮细胞直到P12都按正常分布存在，但之后便快速消失。有趣的是，在所有检查的时间点上，CIV阳性染色一直保持存在，这就表明血管和相关的ECM正常形成，但是P13后，仅基质保留，此时未观察到CD31阳性细胞(图15，中图)。中间血管网层同样在P21后变性，但是进程比在深网层中观察到的慢(图15，上图)。还对正常小鼠的视网膜血管和神经细胞层与rd1/rd1小鼠的进行了比较(图15，右图)。
rd1/rd1小鼠中骨髓衍生细胞的神经保护作用。
经玻璃体腔注射的Lin^-HSC掺入内源视网膜血管系统的所有三层血管网中，并且防止血管变性。有趣的是，在外核层中实际上从未观察到注射的细胞。这些细胞或掺入正在形成的视网膜血管中，或观察到与这些血管紧密相邻。P6时，刚好在开始变性之前，将鼠Lin^-HSC(得自C3H/HeJ)经玻璃体腔注射到C3H/HeJ(rd1/rd1)小鼠眼内。P30时，对照细胞(CD31^-)注射眼显示出典型的rd1/rd1表型，即在每个所检查的视网膜中，观察到深血管网层和ONL几乎完全变性。用Lin^-HSC注射的眼维持正常-出现中间血管网层和深血管网层。预料不到的是，与对照细胞注射眼相比，Lin^-HSC注射眼的内核层(INL)和ONL的细胞明显多得多(图16(A))。可在注射后2个月(图16(B))以及长达6个月(图16(C))时观察到Lin^-HSC的这种拯救效果。当对拯救眼和未拯救眼进行比较时，Lin^-HSC注射眼中网层的深网层血管系统的差异，以及含有神经元细胞的INL与ONL的差异，在所测量的所有时间点上都非常显著(图16(B和C))。可通过测量血管系统的总长度(图16(D))以及统计ONL中所观察到的DAPI阳性细胞核的数目(图16(E))来量化这种作用。对所有时间点上的数据进行了简单线性回归分析。
Lin^-HSC注射眼中，在P30(p＜0.024)和P60(p＜0.034)时，观察到在血管拯救和神经元(例如ONL厚度)拯救之间在统计上有显著相关性(图16(F))。P180时，当将Lin^-HSC注射视网膜与对照细胞注射视网膜相比时，虽然没有统计显著性(p＜0.14)，但却保持很高的相关性(图16(F))。相比之下，在任何时间点上，对照细胞注射视网膜显示，血管系统维护与ONL之间都无显著相关性(图16(F))。这些数据证实，经玻璃体腔注射Lin^-HSC导致rd1/rd1小鼠视网膜中同时发生视网膜血管拯救和神经元拯救。在ONL中或者在视网膜血管内或紧邻视网膜血管以外的任何位置都未观察到注射的细胞。
Lin^-HSC注射的rd/rd视网膜的功能拯救。
对注射对照细胞或鼠Lin^-HSC后2个月的小鼠进行了视网膜电位图(ERG)记录(图17)。在ERG记录后，对每只眼进行了免疫组织化学分析和显微镜分析，以证实发生了血管拯救和神经元拯救。经治疗的拯救眼和对照未拯救眼的代表性ERG记录显示，拯救眼中，数字经扣减的信号(治疗眼减去未治疗眼)产生了振幅大约8-10微伏的明显可检测的信号(图17)。显然，两类眼的信号十分异常。然而，从Lin^-HSC治疗眼记录到一致且可检测的ERG。在所有情况下，检测不到对照眼的ERG。虽然在拯救眼中信号振幅比正常的低得多，但是只要在组织学上出现拯救就始终可观察到信号，并且大致相当于基于基因的其它拯救研究。总的来讲，这些结果是Lin^-HSC治疗眼在某种程度上的功能拯救的证据。
拯救的rd/rd视网膜细胞类型主要是视锥细胞。
用对视杆视蛋白或视锥视蛋白有特异性的抗体对拯救视网膜和未拯救视网膜进行了免疫组织化学分析。对用于ERG记录的相同眼(见图17)的视杆或视锥视蛋白进行了分析。在野生型小鼠视网膜中，存在的不超过约5％的光感受器为视锥细胞(Soucy等，1998，Neuron21：481-493)，用红/绿色视锥视蛋白(见图25(A))或视杆视紫红质(见图25(B))所观察到的免疫组织化学染色模式，与视锥细胞的这一百分比一致。当野生型视网膜用免疫前IgG(pre-immune IgG)染色时，除了血管自身荧光外，视网膜神经感觉层中任何位置都未观察到染色(图25(C))。出生后2个月，未注射rd/rd小鼠的视网膜的外核层基本上萎缩，外核层不显示与抗红绿色视锥视蛋白(图25(D))或视紫红质(图25(G))抗体的任何染色。对照、CD31^-HSC注射眼也没有表示视锥视蛋白(图25(E)))或视杆视蛋白(图25(H))存在的阳性染色。相比之下，注射Lin^-HSC的对侧眼在受保护的外核层中有约3至约8排核；这些细胞大多是视锥视蛋白阳性(图25(F))，大约1-3％为视杆视蛋白阳性(图25(I))。显然，这与通常在正常小鼠视网膜(视杆细胞占主导)中观察到的几乎相反。这些数据证实，注射Lin^-HSC在通常可能变性的长时间内保护视锥细胞。
人骨髓(hBM)衍生的Lin^-HSC同样拯救变性的视网膜。
由人骨髓分离出的Lin^-HSC的作用与鼠Lin^-HSC的类似。由人供体采集骨髓，耗尽Lin⁺HSC，得到人Lin^-HSC(hLin^-HSC)群。这些细胞用荧光染料进行离体标记，并注射到C3SnSmn.CB17-PrkdcSCID小鼠眼内。注射的hLin^-HSC以注射鼠Lin^-HSC时所观察到的相同方式，迁移至并靶向视网膜血管生成部位(图18(A))。除了血管寻靶外，人Lin^-HSC同样同时对rd1/rd1小鼠血管和神经元细胞层提供加强的拯救效果(图18(B和C))。这个观察结果证实，人骨髓中存在靶向视网膜血管系统并且可以防止视网膜变性的细胞。
Lin^-HSC在rd10/rd10小鼠中具有血管营养作用和神经营养作用。
虽然rd1/rd1小鼠是视网膜变性中使用最普遍和表征最充分的模型(Chang等，2002，Vision Res.42：517-525)，但是变性却非常迅速，在这一方面不同于该人类疾病中所观察到的通常较慢的时程。在该品系中，光感受器细胞变性大约在P8时开始，此时视网膜血管系统还在放射状扩展(图15)。深层视网膜血管系统的后续变性甚至在中网层仍在形成时发生，因此，rd1/rd1小鼠视网膜从未完全发育，与患有该病的大多数人不同。采用变性时程较慢并与人视网膜变性性疾病更相像的rd10小鼠模型来研究Lin^-HSC介导的血管拯救。rd10小鼠中，光感受器细胞变性大约在P21时开始，随后不久开始血管变性。
由于正常视网膜神经感觉层发育主要到P21时才完成，在视网膜已经完成分化后才观察到变性开始，这样比起rd1/rd1小鼠模型，与人视网膜变性更为相似。将得自rd10小鼠的Lin^-HSC或对照细胞在P6时注射到眼内，在不同时间点对视网膜进行了评价。在P21时，Lin^-HSC和对照细胞注射眼两者的视网膜似乎均正常，具有完全发育的所有血管层和正常发育的INL和ONL(图18(D和H))。大致在P21时，视网膜变性便开始，并随年龄发展。到P30时，对照细胞注射视网膜显示严重的血管变性和神经元变性(图18(I))，而Lin^-HSC注射视网膜维持几乎正常的血管层和光感受器细胞(图18(E))。拯救眼和未拯救眼之间的差异在随后的时间点更为明显(对图18(F和G)与图18(J和K)进行比较)。在对照治疗眼中，通过CD31和胶原IV的免疫组织化学染色，十分清楚地观察到血管变性的发展(图18(I-K))。对照治疗眼对于CD31几乎完全呈阴性，而胶原IV阳性血管“轨迹(track)”保留得很明显，这就表明发生了血管消退，而不是不完全血管形成。相比之下，Lin^-HSC治疗眼同时具有CD31和胶原IV阳性血管，这似乎与正常的野生型眼非常相似(比较图18(F和I))。
Lin^-HSC治疗后rd/rd小鼠视网膜的基因表达分析。
使用大规模基因组(微阵列分析)对拯救和未拯救视网膜进行了分析以鉴定推定的神经营养性拯救介质。将Lin^-HSC治疗的rd1/rd1小鼠视网膜中的基因表达与未注射视网膜和注射对照细胞(CD31^-)的视网膜进行了比较。这些比较各按一式三份进行。在所有三个一式三份的比较中，基因的表达水平必需比本底水平高至少2倍，才被视为存在。与对照细胞注射和未注射rd/rd小鼠视网膜相比，Lin^-HSC保护的视网膜中上调3倍的基因见图20中的图A和图B。将标准差除以各cRNA复制物的平均表达水平，计算出已表达基因的变异系数(COV)水平。此外，通过使平均值与标准差(SD)相互关联，计算出表达水平与噪声方差(noise variance)之间的相关性。得到了各基因的基因表达水平与标准差之间的相关性，可供确定本底水平和可靠的表达水平阈值之用。总之，数据很好地落入可接受的极限值内(Tu等，2002，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 99：14031-14036)。下面分别论述的基因的表达水平超出这些临界表达水平。还测定了所述基因的配对“t-检验”值。在所有情况下，p值都是理想的(接近或低于0.05)，这表明复制物之间存在相似性，并且不同检验组之间可能存在显著差异。多种显著上调的基因，包括MAD和Ying Yang-1(YY-1)(Austen等，1997，Curr.Top.Microbiol.Immunol.224：123-130)，编码具有涉及保护细胞免于凋亡的功能的蛋白质。与已知参与保护细胞免于应激的热激蛋白有序列同源性和类似功能的多种晶体蛋白基因，通过Lin^-HSC治疗也被上调。根据免疫组织化学分析，α-晶体蛋白的表达局限于ONL(图19)。图19显示晶体蛋白αA在Lin^-HSC治疗后经拯救的外核层细胞中上调，但在对照细胞治疗的对侧眼中却未上调。左图显示拯救视网膜中的IgG染色(对照)。中图显示拯救视网膜中的晶体蛋白αA。右图显示未拯救视网膜中的晶体蛋白αA。
将得自用人Lin^-HSC拯救的rd1/rd1小鼠视网膜的信使RNA与人特异性Affymetrix U133A微阵列芯片杂交。进行严格性分析后，发现其mRNA表达是人类特有的多个基因超出本底，并且与鼠Lin^-HSC拯救视网膜和人对照细胞注射未拯救视网膜相比，这些基因在人Lin^-HSC拯救视网膜中显著较高(图20中的图C)。由微阵列生物信息学技术发现，CD6(一种在原始和最新分化的CD34+造血干细胞表面表达的细胞黏着分子)和干扰素α13(由造血干细胞表达的另一种基因)两者都是有效的评价方案。此外，根据人Lin^-HSC拯救的小鼠视网膜样品，若干生长因子和神经营养因子的表达超过本底(图20中的图D)。
采用谱系定型的造血细胞(lineage-committed hematopoietic cell)标记对含有EPC的骨髓衍生Lin^-HSC群进行负选择。虽然通过常用的细胞表面标记无法表征可用作EPC的骨髓衍生的Lin^-HSC亚群，但是这些细胞在发育中或受损视网膜血管系统中的作用方式完全不同于Lin⁺或成体内皮细胞群所观察到的作用方式。这些细胞选择性靶向视网膜血管生成的部位，并参与未闭血管的形成。
遗传性视网膜变性性疾病常常伴有视网膜血管系统丧失。这类疾病的有效治疗需要恢复功能以及维持复杂的组织结构。虽然若干最新研究对基于细胞递送营养因子或干细胞本身的用法进行了探索，但这两种的某种组合可以是必需的。例如，使用生长因子疗法治疗视网膜变性疾病导致血管不受控制的过度生长，从而引起了正常视网膜组织结构受到严重破坏。使用神经或视网膜干细胞治疗视网膜变性疾病可能重建神经元功能，但是同样需要功能性血管系统来维持视网膜功能的完整性。将Lin^-HSC群的细胞掺入rd/rd小鼠视网膜血管稳定了变性的血管系统而又不破坏视网膜结构。当给P15时的rd/rd小鼠注射该细胞时，同样观察到这种拯救效果。由于rd/rd小鼠的血管变性自P16开始，对于有效的Lin^-HSC治疗，这一观察延伸至治疗窗。在Lin^-HSC细胞注射眼内，视网膜神经元和光感受器受到保护，视功能得到维持。
当经玻璃体腔给患有视网膜变性疾病的小鼠注射时，成体骨髓衍生Lin^-HSC发挥重要的血管营养作用和神经营养作用。这种拯救效果在治疗后持续长达6个月，并且当Lin^-HSC在完全视网膜变性(小鼠出生后直到16天，该小鼠通常在出生后30天出现完全视网膜变性)之前注射时是最有效的。在两个视网膜变性小鼠模型中观察到这种拯救，而且引人注目的是，接受者是患有视网膜变性的免疫缺陷型啮齿动物(例如SCID小鼠)，或者当供体为患有视网膜变性的小鼠时，用成人骨髓衍生HSC也可实现这种拯救。虽然若干最新报道披露了在用野生型基因在基于病毒的基因拯救后，患视网膜变性的小鼠或狗出现部分表型拯救(Ali等2000，Nat Genet 25：306-310；Takahashi等，1999，J.Virol.73：7812-7816；Acland等，2001，Nat.Genet.28：92-95)，但是本发明仍是第一例通过血管拯救实现基于普通细胞的治疗效果。因此，这类治疗具有100个以上已知相关突变的一组疾病(例如色素性视网膜炎)的方法的潜在应用，比研发治疗每个已知突变的独立基因疗法更为实际。
尚不清楚神经营养性拯救效果确切的分子基础，但是只观察到同时存在的血管稳定/拯救。注射干细胞的存在本身并不足以产生神经营养性拯救，而且外核层中完全不存在干细胞衍生的神经元排除了注射细胞转化成光感受器的可能性。通过微阵列基因表达分析所获得的数据证实，已知具有抗凋亡作用的基因显著上调。由于视网膜变性中观察到的大多数神经元死亡是因细胞凋亡引起的，因此这类保护可能在延长光感受器以及在这些疾病中对视功能十分关键的其它神经元的寿命方面具有重大的治疗益处。C-myc是通过上调各种下游细胞凋亡诱导因子来参与细胞凋亡的转录因子。rd/rd小鼠中的C-myc表达比野生型增加4.5倍，这表明可能参与rd1/rd1小鼠中观察到的光感受器变性。已知在Lin^-HSC保护的视网膜中大幅上调Mad1和YY-1这2个基因(图20中的图A)抑制c-myc的活性，因此抑制c-myc诱导的细胞凋亡。研究表明，Mad1的过量表达抑制Fas诱导的胱天蛋白酶-8(凋亡途径的另一个关键组分)的活化。这两种分子的上调通过防止引发rd/rd小鼠中通常导致变性的细胞凋亡，在视网膜不受血管变性和神经变性的保护中起作用。
在Lin^-HSC保护的视网膜中大幅上调的另一组基因包括晶体蛋白家族成员(图20中的图B)。与热激蛋白和其它应激诱导的蛋白质类似，晶体蛋白可以被视网膜应激激活，并提供针对细胞凋亡的保护作用。晶体蛋白αA异常低的表达与视网膜营养不良大鼠模型中光感受器的丧失有关，rd/rd小鼠视网膜的最新蛋白组学分析证实，在响应视网膜变性时诱导晶体蛋白上调。根据我们的EPC拯救的rd/rd小鼠视网膜的微阵列数据，晶体蛋白上调似乎在EPC介导的视网膜神经保护中起关键作用。
基因例如c-myc、Mad1、Yx-1和晶体蛋白很可能是神经元拯救的下游介质。神经营养成分可以调节抗凋亡基因表达，虽然我们用小鼠干细胞拯救视网膜的微阵列分析无法证明引起已知神经营养因子水平增加。另一方面，用人特异性芯片分析人骨髓衍生干细胞介导的拯救则表明，多个生长因子基因的表达低但显著地增加。
上调的基因包括成纤维细胞生长因子家族的若干个成员和otoferlin。otoferlin基因的突变与由听神经病致聋的遗传疾病有关。很可能通过注射Lin^-HSC引起的otoferlin产生也是预防视网膜神经病的原因之一。过去以来一直认为，在患视网膜变性的患者和动物中所观察到的血管变化是因为光感受器死亡而继发的代谢需求降低。本发明的数据表明，至少对于患遗传性视网膜变性的小鼠，保护正常血管系统同样可有助于维持外核层的组分。最新的文献报道支持组织特异性血管系统具有超出预期单纯提供血管“营养物”以外的营养作用的观点。例如，在面临肝损伤时对肝细胞再生和维持十分关键的生长因子VEGFR1活化之后，可诱导产生肝脏内皮细胞(LeCouter等，2003，Science 299：890-893)。
据报道，血管内皮细胞与邻近的肝实质细胞之间类似的标志性相互作用远在功能性血管形成之前就参与了肝脏器官发生。患视网膜变性个体中的内源视网膜血管系统可能不促进如此显著的拯救，但是如果该血管系统得到衍生自骨髓造血干细胞群的内皮祖细胞的支持，则它们可使血管系统更能抵抗变性，同时有助于视网膜神经元以及血管存活。在患视网膜变性的人中，延缓完全视网膜变性的发生可额外提供数年的视力。用Lin^-HSC治疗的动物的ERG得到明显保护，这可能足以支持视力。
在临床上普遍发现，可能基本丧失光感受器和其它神经元而仍然保存功能性视力。在某一点上，临界阈值交叉，视力丧失。因为几乎所有人类遗传性视网膜变性都是早期但缓慢发作的，因此可以鉴定出患视网膜变性的个体，并且可以通过玻璃体腔移植本发明的自体骨髓干细胞来治疗，以延缓视网膜变性和伴发的视力丧失。为了促进本发明干细胞的寻靶和掺入，需要活化星形细胞的存在(Otani等，2002，Nat.Med.8：1004-1010)；当存在相关神经胶质增生时可通过早期治疗，或者可通过用激光刺激活化星形细胞局部增生来实现。任选在眼内注射之前，干细胞离体用一种或多种神经营养物质转染，这可用来提高拯救效果。该方法可应用于治疗其它视神经元变性性疾病，例如青光眼，其中存在视网膜神经节细胞变性。
得自成体骨髓的Lin^-HSC群含有EPC群，该EPC群可通过靶向反应性星形细胞并掺入已建立的模板来促进血管生成而不会破坏视网膜结构。Lin^-HSC还在患有视网膜变性眼中提供长期神经营养性拯救效果。此外，经遗传修饰的含有EPC的自体Lin^-HSC组成成分可被移植到缺血或血管化异常眼内，并可以稳定地掺入新血管和神经元层中，并在长时间内局部连续递送治疗分子。这类按生理上有益的剂量局部递送表达药物的基因代表了用于治疗目前尚不能治疗的眼病的新模式。
例如，正常小鼠视网膜中的光感受器主要是视杆细胞，但用本发明Lin^-HSC拯救之后观察到的外核层主要含视锥细胞。我们认为，由于原发性视杆细胞特异性缺陷而产生了大多数人类遗传性视网膜变性，视锥细胞丧失是继视杆细胞功能障碍而发生的，这可能与由视杆细胞表达的某些营养因子的丧失有关。
实施例
实施例1.细胞分离和富集；鼠Lin^-HSC A群和B群的制备。
通用方法。所有体内评价均遵照NIH实验动物管理及使用指南(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)进行，所有评价方法都经过斯克里普斯研究学院(The Scripps Research Institute)(TSRI，La Jolla，CA)动物管理和使用委员会(Animal Care and UseCommittee)批准。从B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rd小鼠)或Balb/cBYJ成年小鼠(The Jackson Laboratory，ME)提取骨髓细胞。
然后采用水溶性聚蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)，通过密度梯度分离，分离出单核细胞，用生物素缀合的谱系组抗体(CD45、CD3、Ly-6G、CD11、TER-119，Pharmingen，San Diego，CA)标记用于小鼠的Lin^-筛选。利用磁分离装置(AUTOMACS^TM分选仪，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)，从Lin^-HSC中分离并除去谱系阳性(Lin⁺)细胞。使用下列抗体：PE缀合的Sca-1、c-kit、KDR和CD31(Pharmingen，San Diego，CA)，采用FACS^TM Calibur流式细胞仪(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)对所得的含有内皮祖细胞的Lin^-HSC群进行进一步表征。Tie-2-GFP骨髓细胞用于表征Tie-2。
为了收获成年小鼠内皮细胞，经手术从ACTbEGFP小鼠摘取肠系膜组织，并置于胶原酶(Worthington，Lakewood，NJ)中以消化组织，随后用45μm滤器过滤。收集滤出液后，与内皮生长培养基(Clonetics，San Diego，CA)一起孵育。通过观察形态上的鹅卵石外观、用CD31mAb(Pharmingen)染色并检查MATRIGEL^TM基质(Beckton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)培养物中形成的管样结构，以证实内皮细胞特征。
鼠Lin^-HSC A群。通过上述通用方法，从ACTbEGFP小鼠中提取骨髓细胞。通过FACS流式细胞术，对Lin^-HSC细胞的CD31、c-kit、Sca-1、Flk-1和Tie-2细胞表面抗原标记进行表征。结果见图1(c)。约81％的Lin^-HSC具有CD31标记，约70.5％的Lin^-HSC具有c-kit标记，约4％的Lin^-HSC具有Sca-1标记，约2.2％的Lin^-HSC具有Flk-1标记，约0.91％的Lin^-HSC细胞具有Tie-2标记。相比之下，从这些骨髓细胞分离出的Lin⁺HSC具有显著不同的细胞标记谱(即CD31：37.4％；c-kit：20％；Sca-1：2.8％；Flk-：0.05％)。
鼠Lin^-HSC B群。通过上述通用方法，从Balb/C、ACTbEGFP和C3H小鼠提取骨髓细胞。分析了Lin^-HSC细胞存在的细胞表面标记(Sca-1、Flk-1/KDR、c-kit(CD117)、CD34、CD31和各种整联蛋白：α1、α2、α3、α4、α5、α6、α_L、α_M α_V、α_X、α_IIb、β₁、β₂、β₃、β₄、β₅和β₇)。结果见表2。
表2.Lin^-HSC B群的表征

实施例2.鼠模型中经玻璃体腔给予细胞。
用微小刀片(fine blade)在小鼠眼睑上切割出眼睑裂隙露出P2至P6时眼球。然后，用33号(Hamilton，Reno，NV)带针注射器，将本发明的谱系阴性HSC A群(约0.5μl至约1μl细胞培养基中约10⁵细胞)注射到玻璃体腔内。
实施例3.EPC转染。
按照生产商的方案，用FuGENE^TM6转染试剂(Roche，Indianapolis，IN)，鼠Lin^-HSC(A群)用编码TrpRS的T2片段还附加了His₆标签的DNA(SEQ ID NO：1，图7)转染。将Lin^-HSC细胞(约10⁶个细胞/ml)悬浮于含有干细胞因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的OPTI-培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。然后加入DNA(约1μg)和FuGENE试剂(约3μl)混合物，将混合物在大约37℃下孵育约18小时。孵育后，洗涤并收集细胞。该系统的转染率约为17％，通过FACS分析得到证实。通过蛋白质印迹法证实了T2-TrpRS的产生。加有His₆标签的T2-TrpRS的氨基酸序列见图8中的SEQ ID NO：2。
实施例4.免疫组织化学和共焦分析。
在不同时间点收获小鼠视网膜，并制备完整铺片或冷冻切片。对于完整铺片，视网膜用4％低聚甲醛固定，并在环境温度下，在50％胎牛血清(FBS)和20％正常山羊血清中封闭1小时。对视网膜用第一抗体处理，并用第二抗体检测。所用第一抗体为以下抗体：抗胶原IV(Chemicon，Temecula，CA)、抗β-gal(Promega，Madison，WI)、抗GFAP(Dako Cytomation，Carpenteria，CA)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，Dako Cytomation)。所用第二抗体与Alexa 488或594荧光标记(Molecular Probes，Eugene，OR)缀合。用MRC 1024共焦显微镜(Bio-Rad，Hercules，CA)拍摄照片。用软件(Bio-Rad)制成三维图像，以检查完整铺片视网膜中三层不同的血管发育层。利用通过共焦显微镜法分辨出来的增强型GFP(eGFP)小鼠与GFAP/wtGFP小鼠之间GFP像素强度(Pixel intensity)的差异，来制成三维图像。
实施例5.小鼠体内视网膜血管生成定量测定法。
对于T2-TrpRS分析，由小鼠视网膜三维图像重建初生网和深层网。初生网被分成两类：正常发育或停止血管进程。根据包括下列标准在内的血管抑制百分比解释深层血管发育抑制的类别：完全抑制的深层网形成被标为“完全”，正常血管发育(包括小于25％抑制)被标为“正常”，其余的被标为“部分”。对于rd/rd小鼠拯救数据，用10x透镜拍摄每张完整视网膜铺片内较深网层的4个独立区域。计算每张照片血管系统的总长度，汇总后进行组间比较。为了获得正确的信息，将Lin^-HSC注射到一只眼中，将Lin⁺HSC注射到同一只小鼠的另一只眼中。非注射对照视网膜取自同窝小鼠。
实施例6.成体视网膜损伤鼠模型。
采用二极管激光(150mW，1秒钟，50mm)或用27号针机械刺穿小鼠视网膜，来产生激光模型和瘢痕模型。损伤后5天，采用玻璃体腔方法注射细胞。5天后摘取小鼠眼睛。
实施例7.视网膜再生的神经营养性拯救。
成年鼠骨髓衍生的谱系阴性造血干细胞(Lin^-HSC)在视网膜变性小鼠模型中具有血管营养和神经营养性拯救效果。给10日龄小鼠的右眼玻璃体腔注射约0.5微升(含有约10⁵个本发明的Lin^-HSC)，2个月后，对视网膜存在的血管系统和神经元层核的统计数进行了评价。给同一小鼠的左眼注射大致相同数量的Lin⁺HSC作为对照，并进行了同样的评价。如图9所示，在Lin^-HSC治疗眼中，视网膜血管系统看起来几乎正常，内核层几乎正常，外核层(ONL)具有约3层至约4层的核。相比之下，对侧Lin⁺HSC治疗眼具有明显萎缩的视网膜血管中间层，完全萎缩的视网膜血管外层；内核层明显萎缩，外核层完全消失。这在3号小鼠和5号小鼠中得到充分说明。1号小鼠中没有拯救效果，对于约15％的注射小鼠也没有拯救效果。
当用视网膜电位图(ERG)对视功能进行评价时，在观察到血管拯救和神经元拯救的同时，也观察到阳性ERG的恢复(3和5号小鼠)。当无血管拯救或神经元拯救(1号小鼠)时，也未观察到阳性ERG。通过图10中所示的回归分析图，说明了由本发明Lin^-HSC引起的rd/rd小鼠眼血管营养性拯救和神经营养性拯救之间的这种关联性。对于中间层血管系统类型(r＝0.45)以及对于深层血管系统(r＝0.67)，都观察到神经元恢复(y轴)和血管恢复(x轴)之间的关联性。
图11显示由Lin⁺HSC引起的血管拯救和神经元拯救之间不存在任何统计显著相关性。对血管拯救进行了定量测定，数据见图12。注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)小鼠的数据见图12，数据表明特别在注射后1个月和2个月，相对于同一小鼠未治疗眼的血管长度(浅色条形柱)，本发明Lin^-HSC治疗眼的血管长度(黑色条形柱)显著加长。注射Lin^-HSC或Lin⁺HSC后约2个月，通过统计内核层和外核层的细胞核，对神经营养性拯救效果进行了定量测定。结果见图13和图14。
实施例8.人Lin^-HSC群。
通过上述通用方法，从健康成人志愿者中提取骨髓细胞。然后采用水溶性聚蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)，通过密度梯度分离，分离出单核细胞。为了从人骨髓单核细胞分离出Lin^-HSC群，连同磁分离系统(AUTOMACS^TM分选仪，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)一起使用了下列生物素缀合的谱系组抗体：CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)。
根据CD133表达，将人Lin^-HSC群进一步分成两个亚群。细胞用生物素缀合的CD133抗体标记，并分成CD133阳性亚群和CD133阴性亚群。
实施例9.视网膜变性鼠模型中经玻璃体腔给予人和鼠细胞。
C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID和rd10小鼠品系用作视网膜变性模型。C3H/HeJ和C3 SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠(The JacksonLaboratory，Maine)是视网膜变性1(rd1)突变的纯合体，这是引起早期发生严重视网膜变性的一种突变。该突变位于编码视杆细胞光感受器cGMP磷酸二酯酶β亚基的Pde6b基因外显子7上。一向在患有常染色体隐性色素性视网膜炎(RP)的人类患者中发现该基因的突变。C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠也是重症联合免疫缺陷自发性突变(Prkdc SCID)的纯合体，并用于人细胞转移实验。rd10小鼠的视网膜变性是由Pde6b基因的外显子13突变引起的。这也是临床上有关的视网膜变性比rd1/rd1的更晚发作并较轻微的RP模型。所有评价都遵照NIH实验动物管理及使用指南进行，所有方法都经过斯克里普斯研究学院动物管理和使用委员会批准。
用微小刀片在小鼠眼睑上切割出眼睑裂隙露出P2至P6时的眼球。然后用33号(Hamilton，Reno，NV)带针注射器，将谱系阴性HSC细胞的鼠A群或人C群(约0.5μl至约1μl细胞培养基中的约10⁵个细胞)注射到小鼠眼玻璃体腔。为了观测注射的人细胞，细胞在注射前用染料(细胞示踪物绿色CMFDA，Molecular Probes)标记。
在不同时间点收获视网膜，并用4％低聚甲醛(PFA)和甲醇固定后，在室温下，在50％FBS/20％NGS中封闭1小时。为了使视网膜血管系统染色，依次将视网膜与抗CD31抗体(Pharmingen)和抗胶原IV抗体(Chemicon)及Alexa 488或594缀合的第二抗体(MolecularProbes，Eugene，Oregon)一起孵育。将具有4个放射状松驰切口的视网膜铺平，以得到完整铺制片。应用Radiance MP2100共焦显微镜和软件(Biorad，Hercules，California)，获得视网膜血管中网层或深网层中血管系统的图像(参见Dorrell等，2002 InvestOphthalmol.Vis.Sci.43：3500-3510)。至于血管系统的定量测定，从血管中间层或血管深层的中部随机选择4个独立视野(900μmx900μm)，并应用分析软件(Biorad)测量出血管系统的总长度。同一网层的这4个视野的血管总长度被用作进一步分析。
将平铺的视网膜重新包埋用于恒冷箱切片。将视网膜置于4％PFA过夜后，与20％蔗糖一起孵育。将视网膜在最佳切片温度化合物(OCT：Tissue-Tek；Sakura FineTech，Torrance，CA)中包埋。将恒冷箱切片(10μm)在含有核染料DAPI(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)的PBS中重新水化。用共焦显微镜，在包含视神经头和整个周边视网膜的单一切片内的3个不同区域(宽280μg，无偏取样)内，拍摄DAPI标记的核照片。统计位于一个切片上3个独立视野内ONL的核数，汇总用于分析。进行了简单线性回归分析，以研究深层网血管系统长度与ONL细胞核数之间的关系。
避光适应过夜后，通过腹膜内注射15μg/gm氯胺酮和7μg/gm赛拉嗪，将小鼠麻醉。瞳孔放大(1％硫酸阿托品)后，用金环角膜电极连同口部参比电极和尾接地电极，从各眼角膜表面记录视网膜电位图(ERG)。用附在高反射性全视野穹面(highly reflective Ganzfeld dome)外的Grass光刺激器(Photic Stimulator)(PS33 Plus，Grass Instruments，Quincy，MA)产生刺激。记录强度高达光刺激器最大允许(0.668cd-s/m²)范围内的短波长(Wratten 47A；λmax＝470nm)闪光时的视杆细胞反应。将反应信号放大(CP511 AC放大器，Grass Instruments)，进行数字化处理(PCI-1200，National Instruments，Austin，TX)，并进行了计算机分析。在用ERG记录治疗和未治疗眼时，每只小鼠都用作其自身的内部对照。对于最弱信号，对多达100次扫描取平均值。得自未治疗眼的平均反应数值减去治疗眼的反应数值，用信号的这个差异表明功能拯救。
采用微阵列分析评价了Lin^-HSC靶向的视网膜基因表达。给P6rd/rd小鼠注射Lin^-或CD31^-HSC。注射后40天，在无RNA酶培养基中解剖出这些小鼠的视网膜(在注射后这个时间点，视网膜血管系统和光感受器层的拯救显而易见)。通过完整铺片对各视网膜的一个象限进行了分析，以确保已达到正常HSC寻靶以及血管系统和神经保护。用TRIzol(Life Technologies，Rockville，MD)、苯酚/氯仿RNA分离方案，对得自成功注射的视网膜的RNA进行纯化。将RNA与Affymetrix Mu74Av2芯片杂交，应用软件(SiliconGenetics，Redwood City，CA)，对基因表达进行了分析。将纯的人或小鼠HSC注射到P6小鼠玻璃体腔。在P45时，解剖出视网膜，并合并成以下部分用于RNA纯化，并与人特异性U133A Affymetrix芯片杂交：1)注射人HSC的被拯救的小鼠视网膜，2)注射人HSC的未拯救的小鼠视网膜，和3)注射小鼠HSC的被拯救的小鼠视网膜。应用软件鉴定表达超出本底和人HSC拯救的视网膜中表达较高的基因。然后对这些基因的每一种分别进行了探针对表达谱(probe-pair expression profile)的分析，并与采用dChip的正常人模型U133A微阵列实验进行了比较，以确定人的种特异性杂交，并消除因跨种杂交所致的假阳性。
图21表示流式细胞术数据，对本发明CD133阳性(CD133⁺)和CD133阴性(CD133^-)人Lin^-HSC群中的CD31和整联蛋白α6表面抗原表达进行了比较。左图表示流式细胞术散点图。中图和右图是表示在细胞群中表达的特异性抗体水平的峰图。Y轴代表事件次数，X轴表示信号强度。轮廓峰图为同种型IgG对照抗体，表示非特异性本底染色水平。实心峰图表示细胞群中的特异性抗体表达水平。偏移到轮廓(对照)峰图右侧的实心峰图代表荧光信号增强，抗体表达超出本底水平。两个细胞群之间实心峰图的峰位置的比较代表细胞中蛋白质表达的差异。例如，CD31在本发明CD133⁺和CD133^-细胞两者中的表达均超出本底；然而，比起在CD133^-群中，在CD133⁺细胞群中有较多细胞表达较低水平的CD31。从这一数据明显看出CD31表达在两个群之间不同，α6整联蛋白表达主要限于Lin^-群的细胞，因此可以用作具有血管营养性拯救功能和神经营养性拯救功能的细胞的标记。
当将CD133阳性和CD133阴性Lin^-HSC亚群经玻璃体腔注射到新生SCID小鼠眼内时，对于同时表达CD31和整联蛋白α6表面抗原的CD133阴性亚群，观察到掺入发育中的血管系统的最大程度(参见图21下)。不表达CD31或整联蛋白α6的CD133阳性亚群(图21上)似乎靶向周边缺血驱动的新血管形成的部位，但不是当注射到正在进行血管生成的眼睛时。
用对视杆或视锥视蛋白有特异性的抗体，对拯救和未拯救的视网膜进行了免疫组织化学分析。对用于图17中所示ERG记录的相同眼的视杆或视锥视蛋白进行了分析。在野生型小鼠视网膜中，存在的5％以下的光感受器为视锥细胞(Soucy等，1998，Neuron 21：481-493)，用红/绿色视锥视蛋白或视杆视紫红质观察到的免疫组织化学染色模式(分别如图25(A)和图25(B)所示)，与视锥细胞的这一百分比一致。对视杆视紫红质有特异性的抗体(rho4D2)由英属哥伦比亚大学(University of British Columbia)的Robert Molday博士提供，按照前述方法使用(Hicks等，1986，Exp.Eye Res.42：55-71)。对视锥红/绿色视蛋白有特异性的兔抗体购自Chemicon(AB5405)，按照生产商的说明书使用。
实施例10.氧诱导的视网膜变性鼠模型中经玻璃体腔给予鼠细胞。
在氧诱导的视网膜变性(OIR)模型中，在出生后P7天至P12天之间将新生野生型C57B16小鼠暴露于高氧(含氧量75％)。图22说明C57B16小鼠出生后自P0到P30血管发育正常。P0时，可在视盘周围观察到刚萌发的浅层血管。接着几天内，初生浅网层伸展到周边，出生后第10天(P10)时达到远周边。在P7和P12期间，次生(深层)网层发育。到P17时，存在广泛的浅层和深层血管网(图22插图)。在随后的几天内，随同第三层(中间层)血管的发育发生重建，直到大致在P21时达到成熟结构。
相比之下，在本文所述的OIR模型中，在P7-P12时暴露于含氧量75％后，事件的正常顺序被严重扰乱(图23)。P3时，将本发明的成年鼠Lin^-HSC群经玻璃体腔注射到随后患OIR的小鼠眼内，另一只眼注射PBS或CD31阴性细胞作为对照。图24说明Lin^-HSC群可以在发育中的小鼠视网膜内逆转高氧水平的变性作用。P17时，在治疗眼内观察到完全发育的浅层和深层视网膜血管系统，而对照眼显示大量无血管的区域实际上无深层血管(图24)。在OIR模型中观察了大约100只鼠眼。比起用CD31^-细胞治疗的对照眼(12％)和用PBS治疗的对照眼(3％)，用Lin^-HSC群治疗的眼中观察到58％的正常血管形成。
实施例11.通过CD44筛选从鼠骨髓中分离出髓样骨髓细胞。
从成年小鼠(The Jackson Laboratory，ME)中提取骨髓细胞。全部骨髓用鼠CD44抗体处理，采用流式细胞术从骨髓中分离出CD44表达细胞。将细胞与抗体分离开来，在缓冲液中保存备用。同样分离出不显著表达CD44的细胞群(CD44^LOBM)。
实施例12.通过CD44筛选从鼠骨髓分离出髓样骨髓细胞。
如实施例中11所述，采用抗CD11b抗体替代抗CD44抗体，正向选出骨髓细胞。分离出为CD44^HI和CD11b+的髓样骨髓细胞群，其具有与实施例11中用CD44分离出的CD44^HI群类似的活性特征。同样分离出CD44^LO CD11b^-群，发现它是无活性的。
实施例13.MLBM细胞群的表征。
尽管不清楚在这种情况下CD44的作用，但是有可能的是，在细胞注射到眼内后，该受体在富含透明质酸的玻璃体中介导细胞存活、细胞迁移和/或细胞分化。未分级分离的小鼠骨髓中存在独特的CD44^HI(即MLBM)和CD44^LO细胞群。MLBM细胞群占用于前述实施例的Lin^-群的76％，而分别只占得自CD44表达骨髓的Lin⁺和CD31^-/CD34^-/CD11b^-细胞群的约37％和4％(图26)。因此，在这3个群观察到的CD44表达与血管营养活性和神经营养活性之间存在显著的相关性，即Lin^-细胞最有效，而CD31^-/CD34^-/CD11b^-细胞始终是有效性最低。使用一组谱系特异性抗体，测定出大多数CD44^HI细胞具有较强的骨髓特征(图27)。同样，几乎所有CD44^HI骨髓细胞也都是CD11b⁺(图27)。
实施例12中用CD11b抗体正向选出的MLBM(CD44^HI CD11b⁺)得到的活性结果与血管寻靶实验中用CD44抗体筛选分离出的MLBM所得到的结果类似。
实施例12中MLBM细胞群的细胞表面抗原特征与实施例12中分离出的CD44^LO CD11b+细胞的表面抗原特征见下表3。表3中，加号(+)越多表明抗原表达相对越高。减号(-)表示未检测到表达。
表3

实施例14.MLBM细胞群的血管营养作用和神经营养作用。
在血管寻靶及血管和神经营养作用方面，实施例11的MLBM细胞群保留了Lin^-细胞的性质，而CD44^LOBM细胞几乎没有活性或者无活性。通过将GFP⁺MLBM细胞群的细胞注射到出生后7天(P7)小鼠的玻璃体腔，并在P14时对视网膜进行分析，证实了血管寻靶活性。血管用GS同工凝集素标记后，观察到GFP⁺细胞靶向视网膜血管系统，呈现血管周围定位，并无掺入的证据。当使用MLBM时，这些事件非常普遍，CD44^LOBM治疗眼中则很少发生或不发生(图28)。
用上述用于Lin^-HSC的视网膜变性小鼠模型，对实施例11中MLBM细胞群的血管和神经营养活性进行了评价。rd1/rd1小鼠显示出视网膜变性疾病特有的特征，包括光感受器死亡和深层视网膜血管系统萎缩。如上所述，Lin^-HSC骨髓细胞保护深层视网膜血管系统和部分拯救光感受器。本发明的MLBM细胞群同样执行相同的功能(图29)。
氧诱导的视网膜病模型与早产儿视网膜病有共同的特征。当用MLBM细胞群的细胞治疗眼睛时，与这一模型有关的病理显著减轻。MLBM细胞群的细胞在这个模型中的作用与使用上述Lin^-HSC所观察到的相同。用MLBM细胞群的细胞治疗的眼睛显示，用来量化这个模型病理程度的两个参数显著降低：血管消失面积和新血管簇面积。相比之下，比起溶媒对照治疗眼，CD44^LOBM细胞治疗眼未显示出改善(图30)。
除了靶向视网膜血管系统以外，MLBM细胞群的细胞分化成巨噬细胞样(F4/80⁺)细胞，穿透视网膜，并占据与视网膜色素上皮(RPE)紧密相对的位置。这个定位有利于观察到的MLBM细胞群的细胞的血管和光感受器拯救效果。此外，一旦位于RPE附近，MLBM细胞群的细胞便产生血管内皮生长因子(VEGF)，正如注射衍生自VEGF-GFP小鼠的MLBM细胞群的细胞所证实的一样，其中绿色荧光蛋白(GFP)在VEGF基因活化时进行表达(图31)。因此，MLBM细胞群的细胞似乎处于VEGF“活化”状态。引入的来自MLBM细胞群的细胞似乎募集相同类型的内源细胞，因为在RPE区都同时观察到GFP⁺(引入的)和GFP^-(内源的)细胞。在野生型小鼠的正常视网膜血管发育期间，在rd1/rd1小鼠拯救的视网膜中以及在氧诱导的视网膜病模型中都观察到这种定位。
同样的血管寻靶结果还存在于实施例12的MLBM细胞群。图32显示，当在P2注射时，直到P20时实施例12的CD44^HI CD11b⁺细胞(绿色)，以类似于实施例11的CD44hi群的方式，特异性靶向血管系统(红色)。图33显示实施例12的CD44^LO CD11b^-没有特异性靶向血管系统。
本发明的MLBM细胞群为眼病提供多方面的有效治疗。该细胞容易从自体骨髓中分离，因此使常在基于细胞疗法中观察到的可能的免疫原性最小化。此外，本发明的MLBM细胞群可以用将功能基因递送到视网膜的有用基因转染。
实施例15.骨髓细胞亚群的进一步表征。
如前述实施例中所述，所有实验均遵照NIH实验动物管理及使用指南进行，所有实验方法都获得TSRI动物管理和使用委员会批准。按照上述方案，在C57B16小鼠中诱导OIR。出生后第7天，将幼鼠及母鼠从室内空气中转移到含氧量75％的环境中5天，之后回复到室内空气中。采用FDA批准的含氧量分析仪(AX-300，TeledyneAnalytical Instruments，CA，USA)，监测含氧水平。在这些条件下，在高氧期间，在中心视网膜形成了大量血管发育不全的区域，在回复到常氧后，出现异常视网膜前新血管形成，在P17前后达到最高，最终消退(图37中的图g-i，图2中的图a和图c)。
细胞制备物：基本如下进行小鼠骨髓细胞提取：从actGFP小鼠股骨和胫骨收获骨髓细胞，并用两种不同的方法处理。在第一种方法中，用FICO/LITE(Atlanta Biologicals，Norcross，Georgia)通过密度梯度，并且用生物素缀合的谱系抗体(CD45R/B220、CD3e、Ly-6G/C、CD11b、TER119，Pharmingen，San Diego，CA)标记，来分离单核细胞。之后与链霉抗生物素或抗生物素磁珠一起孵育，并采用MACS细胞分选系统(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)进行分选以获得Lin^-HSC群。在第二种方法中，将全部骨髓与针对CD44的抗体一起孵育，所述抗体与荧光标记缀合。然后应用荧光激活细胞分选法(Fluorescence activated cell sorting，FACS)分离出CD44^HI细胞(即其中大多数细胞表达CD44的MLBM细胞群)和CD44^LO细胞(即其中少数细胞表达CD44的细胞群)。
骨髓细胞表征：采用以下两种方法，对通过上述方法获得的细胞亚群进行进一步分析：(1)双色流式细胞术结合抗各种谱系和祖细胞细胞表面标记的抗体，表面标记包括CD11a、CD11b、Ly6G/C、CD43、F4/80、CD14、cKit、CD34、α6整联蛋白和CD115(所有均得自Pharmingen，San Diego，CA)；(2)采用本领域已知标准方法用Mu430芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)对基因表达进行分析。用软件(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)对基因表达进行了分析。
玻璃体腔注射：P2-P7(高氧前)小鼠中，轻轻解剖切割出眼睑裂隙，暴露出眼球。用哈密顿注射器(Hamilton syringe)和33号针(Hamilton，Reno，Nevada)，将0.5μl溶媒(含有0.5％BSA和2mMEDTA的PBS)中的约1.5×10⁵至2.5×10⁵个骨髓衍生细胞注射到每只动物一只眼的玻璃体内。在对侧对照眼中仅注射大约相同数量的对照细胞或溶媒，在某些情况下，完全不进行注射以观察疾病的天然进程。在分组实验中，在P9和P12之间的较大龄期进行细胞移植。
视网膜血管系统的染色：在P17时收获视网膜用于血管系统成像、注射细胞定位和表征。在某些情况下，在解剖视网膜以观测未闭的血管之前，将动物麻醉，将荧光素标记的高分子量葡聚糖(FITC Dextran，Sigma)注射到心脏内。在其它情况下，采用使血管和GFP表达细胞染色的免疫组织学技术。将视网膜在4％全氟乙酸(PFA)和甲醇中固定，接着在室温下，在20％FBS/20％NGS中封闭1小时。随后与594缀合的同工凝集素GS-IB4孵育过夜以鉴定血管(Molecular Probes，Eugene，Oregon)。将具有放射状松驰切口的视网膜铺平，以获得完整铺制片，或者在OCT中包埋，并进行冷冻切片，得到在铺片前用DAPI复染的视网膜的横切片。
为了表征移植的细胞，采用免疫组织学技术鉴定分组眼中的下列细胞标记：F4/80(Caltag，Burlingame，CA)、CD44、CD31(Pharmingen，San Diego，CA)和NG2(Chemicon，Temecula，CA)。所有视网膜用凝集素、抗GFP和上述标记之一进行三重染色。
成像和图像分析：用2100MP激光扫描共焦显微镜(Biorad，Hercules，CA)获得视网膜血管系统的图像。如下进行血管消失和新血管形成的定量测定：通过在GS凝集素染色视网膜的中心视网膜上仔细勾画出无血管区带的轮廓，来测量血管消失的面积，用(Adobe)或软件(Improvision，LexingtonMA)计算出总面积。同样，通过采用在视网膜前平面聚焦的共焦图像，根据像素强度选出血管簇(簇标记比正常血管系统的更亮)，计算出视网膜前新血管(“簇”)形成面积。然后将所选区域汇总得到新血管形成的总面积。应用T-检验对不同实验组进行统计比较。
收集z系列的共焦图像，应用软件将其换算成以体积表示，从而产生视网膜血管系统和血管周围骨髓细胞的三维图像。然后可观察横切片的视网膜血管，并确定移植的骨髓细胞相对于血管腔的位置。
视网膜血管发育和氧诱导的视网膜病小鼠模型。出生后在正常含氧量条件生长的小鼠的正常视网膜血管发育见图37中的图a-f。在出生后2天(P2)，仅观察到萌发的浅层血管占据了视盘周围单一平面(图37中的图a和图b)。在接下来的一周进程中，初生浅网层延伸到周边，P12前后达到远周边(图37中的图c)。在P7-P12之间，次生(深层)网层发育(图37中的图d)。第1个月末时，随着第三层(中间层)血管的发育，在完全血管化视网膜中发生重建(图37中的图e)，达到成熟结构(图37中的图f)。
相比之下，在OIR模型中，自P7到P12暴露于含氧量75％中严重扰乱了事件正常顺序：已在中心视网膜形成的浅层血管网发生明显消退(尤其沿动脉)(图37中的图g(P10)和图h、图i(P17))，深层网的发育被严重延迟(图37中的图k和图m，P17时的视网膜横切片)。仅仅在P12回复到正常含氧量条件后，才再次按异常方式开始血管生长。实际上，对于严重血管发育不全的视网膜，这些现成为相对低氧的条件。P17时，可以在周边鉴定出一些深层血管，但是，在中周边内，在血管发育不全的中心视网膜与较多血管化的周边之间的边界上，可观察到与血管内染料渗漏有关的异常视网膜前新血管簇(图37中的图h)。接下来几天内，在无血管区，浅层和深层血管慢慢发育，但是新血管簇延伸到视网膜内界膜(ILM)以外进入玻璃体，通常持续直到P21或甚至更晚。到P25-P30时，视网膜血管系统已经重建，并与此时的正常血管系统相像。
高氧前注射造血祖细胞在氧诱导的血管消失后促进视网膜的血管修复。在P2-P7时注射本发明的Lin^-HSC显著改变视网膜血管系统在暴露于高含氧量后恢复的能力(图37中的图j、图l、图n、图o；和图38中的图b、图d、图e、图f、图g)。仅注射溶媒不会诱导这类变化。在50％以上情况下，在P17时，Lin^-HSC注射眼中观察到完全发育的浅层和深层视网膜血管系统，而对侧溶媒注射眼显示大量无血管区，并且几乎没有深层血管(图37中的图l、图n，与图h、图i、图k、图m和与图o进行比较)。在某些情况下，尤其当对侧对照眼损伤非常严重时，直到P17，Lin^-细胞注射眼中都未完全恢复，但是在大多数情况下明显好转。在同一动物两侧眼之间的这种比较为Lin^-HSC的功效提供了进一步的支持，有效平衡了大多数的其它遗传和环境因素。
在这一模型中，血管消失一直是未得到正确评价的特征，因为大多数研究只分析了连续视网膜切片中视网膜前新血管簇的形成。可以采用共焦显微镜法和数字图像分析，对同一视网膜的血管消失和血管簇形成进行评价(参见例如图38中的图a-d)。P17被选为分析的主要时间点，因为血管簇形成常常在此时最大，而对照眼中仍存在显著的血管消失。采用新的联合分析方法，鉴定出了治疗眼和对照眼之间的明显差异。与只接受溶媒眼或未注射眼相比，Lin^-治疗视网膜中，在P17时测定的血管消失显著降低(消失面积减少超过75％)(图38中的图e)。在这一方面，溶媒注射与未注射之间未观察到显著差异。同样，比起溶媒注射眼，Lin^-细胞治疗眼新血管簇面积减少约70％，比起未注射对照，减少超过80％(图38中的图f)。因此，Lin^-HSC治疗眼对小鼠OIR模型的两个主要血管损伤和修复参数具有重要作用，即降低新血管簇形成的同时，加快“生理性”内层视网膜血管重建。
当在高氧期间以及回复到常氧下进行治疗时，也观察到修复加速，但是效果减弱。至此所述实验涉及在暴露于高氧之前P2-P7日之间进行的注射。为了确定如果稍后在高氧周期和在回复到常氧下注射，注射Lin^-细胞是否也能够影响血管修复，为此在P9、P11或P12时进行了注射，并在随后不同的时间点对视网膜进行了评价。结果见图38中的图g，结果证实，即使在高氧期间和在P12时给予，注射Lin^-HSC也有效地加快血管修复和减少消失面积。然而，这种作用似乎有些减弱，这就表明在高氧暴露之前进行治疗，可达到最大功效。
用Lin^-造血祖细胞治疗后，长期的视网膜结构和功能得到充分保护。还研究了用Lin^-HSC治疗的长期效果和可能的副作用。为此，按照已建立的模型，从3-6月龄、经过Lin^-细胞注射和暴露于高氧的小鼠中取12个视网膜(图39)。所有情况下，都未观察到肿瘤，且神经视网膜组织看起来完好。唯一值得注意的异常是在视网膜内偶尔形成“玫瑰花结”，这一发现同样存在于对照眼中(图39中的图g和图h)。Lin^-HSC注射眼的视网膜血管系统具有正常外观，未发现与非注射对照视网膜有明显差异(图39中的图a-f)。
还研究了移植细胞的长期保持。只在小百分比的眼睛(10％)中观察到GFP⁺细胞，这表明大多数注射细胞数月后不再存活。如果存在，则存活细胞常常位于紧邻视网膜血管系统的位置。在移植后17天至6个月进行的视网膜电描记记录测量的视网膜功能显示，Lin^-HSC移植眼与龄期匹配的正常非OIR对照之间无区别。为了研究移植细胞可能离开眼睛并全身扩散的可能性，注射后大致7-10天，对15只小鼠的脾和/或肝脏存在的GFP⁺细胞进行了分析。未观察到眼外的GFP⁺细胞。
验证活性细胞类型：Lin^-群富含CD44^HI细胞。为了更好地理解在这些过程中具有活性的机制并且简化细胞筛选方法，对鉴定可用来从骨髓中分离活性HSC的单一标记进行了尝试。根据例如参与细胞迁移和分化等特征，集合了一大组候选骨髓祖细胞标记。采用流式细胞术，筛选出这些标记，将它们在活性Lin^-细胞中的表达与之前在多个实验系统中显示出无活性的对照BM细胞的表达进行了比较。证实CD44在以下这两个群中进行差异表达：比起对照BM细胞群(4％)，CD44^HI细胞存在显著较高比例的Lin^-细胞(76％)(图40中的图a)。如上所述，CD44是透明质酸的细胞表面受体，研究表明参与调节一般认为在介导包括存活、迁移和分化在内的拯救效果中是十分重要的若干细胞功能。在活性细胞群中非常普遍而在对照细胞则相当罕见且活性降低的CD44^HI细胞的这种分布，表明CD44实际上是有效的活性标志。
例如，CD44^HI细胞在OIR模型中促进血管修复，而CD44^LO细胞却不能。CD44^HI细胞在OIR模型有促进血管修复能力的功效已得到证实。采用Lin^-细胞注射中所述的相同实验设计，证实了CD44^HI细胞在该模型中促进视网膜血管修复的功效与用Lin^-细胞所观察到的类似(图40中的图b、图c)。相比之下，CD44^LO细胞对修复没有积极作用。值得指出的是，观察到CD44^LO治疗动物的视网膜内常常几乎没有或没有注射细胞，这就表明这些细胞在玻璃体内存活和/或迁移到视网膜中的能力降低。尚未得知CD44^HI细胞是唯一的活性骨髓亚群还是具有该活性的不同亚群之一。
CD44^HI细胞表达提示骨髓来源的基因和标记。通过大规模表达分析，并依次通过Lin^-和祖细胞特异性标记的抗体标记法及流式细胞术，对CD44^HI群进行了进一步表征(图41和图44)。两种方法都显示CD44^HI细胞具有提示骨髓来源的表达谱。在这些细胞中观察到CD11a、CD11b和Ly6G/C在蛋白质水平上的强表达，而通过流式细胞术检测到F4/80、CD14、cKit和CD115的强度较弱的阳性标记。在表达分析中，与CD44^LO细胞相比，包括CD204、CD114、CD33和CD115在内的若干骨髓特异性基因高表达(图44)。相比之下，在蛋白质水平上，CD44^LO群具有显著表达的Ter119和CD45R B220，它们分别为成红细胞/红细胞和B细胞的标记。在表达阵列中，与包括CD19、CD79a和CD22在内的CD44^HI细胞相比，与淋巴细胞有关的多个基因在CD44^LO中高表达(图44)。因此，在转录和蛋白质水平上的分析鉴定出活性CD44^HI群主要是骨髓来源的，而无活性CD44^LO细胞主要为淋巴来源的。
移植细胞原位分析-分化的证据：已对得自骨髓的活性细胞群进行了更明确地界定后，对这些细胞在引入眼睛后的命运进行了研究。为此，用各种标记通过免疫组织化学对得自OIR模型的CD44^HI注射视网膜进行了分析。绝大多数引入的细胞选择性靶向视网膜血管系统，并呈现血管周围定位，常常形成与主血管紧密缔合的伸长结构(图42中的图a)。采用抗CD31抗体和抗NG2抗体，在表达GFP的血管周围骨髓细胞上未检测到这些标记，这就表明，这些细胞没有分别分化成内皮细胞或周细胞。此外，移植细胞似乎没有形成血管腔的任何部分(图42中的图b)，从而证实这些细胞不可能分化成内皮细胞。相比之下，在CD44^HI治疗眼中，巨噬细胞/小胶质细胞标记F4/80标记许多但非全部的血管周围GFP⁺细胞(图43中的图d-I)。这些引入的F4/80⁺细胞的外观与同样是用F4/80标记的内源血管周围细胞非常相似(图43中的图a-c)，这就表明在OIR模型中，移植细胞具有与天然细胞相似的特性。
细胞疗法潜在的优势之一(特别是与常规药物治疗相比)是细胞响应局部信号(local cue)并在变化的环境下进行修饰的潜力。在P17(注射后10天)时，观察到已靶向视网膜血管系统并占据血管周围位置的移植细胞下调CD44到无法检测的水平(图43中的图j-o)。然而未与血管系统缔合的细胞继续表达CD44。因此，通过FACS根据CD44高表达最初选出的植入细胞亚群在体内下调该受体，这与细胞在视网膜中的定位有关。这就表明引入的细胞实际上正在眼环境内进行选择性变化(分化)。
上面的详细结果表明，基于细胞的疗法可以用来治疗ROP和其它缺血性视网膜病。在小鼠模型中观察到的结果表明该方法有效减轻与高氧暴露有关的血管病理，并且几乎无毒性或没有毒性。与单因素治疗相反，采用细胞疗法的优势可能在于细胞适应和响应变化的环境的能力。从单因素治疗发展到结合药物和介入，以选出并递送可以指挥和指引复杂反应顺序而同时与宿主组织相互作用的精致可适应细胞，是一个令人振奋的新构思。在这个方面，本发明在缺血性视网膜病/血管病变的治疗方法中提供“范式转变(paradigm shift)”，也就是说强调治愈和稳定，而不是抑制和消失。
靶向视网膜血管系统的本发明的分离髓样细胞群，可以用来递送血管抑制药，并在视网膜变性模型中具有血管营养作用和神经营养作用。在本研究中，MLBM细胞群的特定亚群在加快OIR修复中十分有效。有趣的是，活性细胞表达提示它们是骨髓来源的标记，并可能在移植后进行分化和修饰。
心脏病学领域已在应用细胞疗法促进血管形成方面充当先锋，其目的在于抵偿梗塞的动脉。有充分的证据证明，某些骨髓细胞在改善灌注和心脏功能方面是有效的。然而尚不清楚的是，哪一种细胞类型负责所观察到的效果。研究骨髓衍生内皮祖细胞(EPC)潜在作用的多项研究推断这些细胞存在于新血管或侧支血管，但是在某些这类研究中报道了少数掺入细胞，这引起了对它们的重要性的争议。另外，含有十分少量的干细胞和/或EPC的异源骨髓群，例如单核细胞或未分级细胞，同样可能显著促进侧支血管发育，这表明直接掺入血管以外的其它机制发生了作用。虽然无意受理论的束缚，但是有可能通过这些细胞分泌的因子起使宿主血管系统条件最佳化的作用，从而这些细胞发挥支持和旁分泌作用。研究表明，多个骨髓亚群是血管生成因子的来源，而且已知单核细胞分泌各种这类因子。因此，存在这样的可能性，即骨髓细胞以旁分泌方式起作用，在侧支血管形成时补充EPC的作用，并与宿主免疫系统相互作用。
虽然尚不清楚在该系统中运行的确切机制，但是就理解功能性骨髓细胞的性质而言，已经取得了显著的进步。对于鉴定如本发明细胞所提供的骨髓内的活性骨髓群，可就有关机制提出一些启示。髓样细胞，特别是单核细胞和巨噬细胞，建立了通过分泌血管生成生长因子来影响血管生长的能力。此外，巨噬细胞显示比其它细胞类型更耐受低氧，并通过分泌血管生成因子响应低氧条件。因此，将骨髓祖细胞引入缺血视网膜，可提供可以经得起低氧条件并可以旁分泌方式促进血管修复的细胞。在OIR视网膜中，宿主衍生的F4/80⁺血管周围细胞的存在表明这类细胞在该过程中具有作用，或许是通过直接移植到眼内递送大量同样的细胞(或其祖细胞)，加强了这一作用。这个设想突出了如本研究所观察的似是而非的结果，即注射本发明的细胞群促进视网膜的血管重建而抑制视网膜前新血管形成。虽然尚未完全了解其基础，但是很有可能是“生理性”血管重建加速可降低视网膜所经历的低氧，使得缺血刺激的新血管簇在同一程度上无法形成。
髓样细胞支持血管生长的设想可能与有关rd1和rd10视网膜变性小鼠模型的一些早期研究有关。注射骨髓祖细胞可能通过分泌的因子起维持深层视网膜血管系统的作用，并防止在这些模型中所观察到的血管变性。研究还证实，一些巨噬细胞分泌的血管生成因子(例如bFGF)也具有神经营养活性。因此，在rd小鼠中注射本发明的细胞群时观察到的光感受器死亡减少可能是通过旁分泌机制介导的，其中神经营养因子通过移植的骨髓衍生髓样细胞产生。为了支持这个机制，本研究表明本发明分离的MLBM细胞群能够有效地拯救rd模型的血管和神经元，其功效与注射分离MLBM细胞观察到的相似。
在用于ROP临床治疗时，在高危早产儿出生时收获胎脐带血细胞，然后分选出富含介导拯救效果的特定亚群的细胞，然后将这些自体祖细胞注射到婴儿眼内。
使用细胞疗法现时最主要的限制之一是在许多情况下尚不清楚其作用的确切分子机制的事实，实际上，这些机制在模型之间可以不相同。然而，这实际上可能是基于细胞疗法的最大优势，也就是说以不同的方式用大量组成成分对变化的条件和信号作出反应的能力。这不仅仅在不同实验系统和攻击之间属实，而且在一个系统内在时间上也如此。换句话说，这类细胞可能在一时间点上分泌某些因子，而在其它时间点上分泌不同的因子，最终，如果需要它们消退，则可完全停止起作用。这是现有基于化学的药物疗法无法做到的，而且根据的是细胞从根本上利用和响应反馈的事实。在本研究中观察到的移植细胞内细胞标记的体内修饰支持这个观点。
实施例16.MLBM细胞分化成具有小胶质细胞特征的细胞。
在注射CD44^HI细胞后对视网膜的分析表明，骨髓细胞CD44^HI群注射到眼睛后分化成小胶质细胞。小胶质细胞是视网膜中的定居骨髓群(resident myeloid population)，表达特有的标记，包括CD11b和F4/80。这些细胞还可通其分支形态并且呈现血管周围定位来加以区分。在注射到眼睛后的不同时间，对CD44^HI细胞的定位、形态和表面标记表达进行了分析。观察到注射的CD44^HI GFP⁺细胞具有所述的内源视网膜小胶质细胞的所有特征(图45)。图45中的图A和图B显示，注射的CD44^HI细胞表达CD11b和F4/80，具有与内源小胶质细胞相似的形态和血管周围定位。图C提供表明注射的CD44^HI细胞定位于血管周围区的3D成像分析。图D显示高放大倍数视野下观察的注射CD44^HI细胞的形态。
实施例17.通过负选择法分离MLBM细胞。
为了实验和临床应用，需要注射无表面结合的筛选成分(例如抗体和/或磁珠)的细胞。达到这个目的的一种方法是利用负选择策略来分离CD44^HI细胞。通过本文所述的CD44^HI和CD44^LO细胞群表面标记表达谱的表征，发现了CD44^LO细胞具有高表达的Ter119和CD45RB220，它们分别为类红细胞(erythroid cell)和B细胞的标记。抗这些标记的抗体，加上T细胞标记CD3e，有效地标记CD44^LO群，供通过磁分离或FACS分离将其除去，留下“未触及的(untouched)”CD44^HI细胞作为产物。用该策略通过FACS分离的细胞具有典型的本发明MLBM细胞群的功能特征(图46)。
图46中的图A显示使用对CD45R/B220、TER119和CD3e有选择性的抗体通过MACS耗尽小鼠骨髓产生CD44^HI细胞为90％以上的细胞群。图B显示阴性部分(CD44^HI群)基本上不含CD45R/B220、TER119和CD3e细胞。图C显示负选择法选出的CD44^HI细胞保留视网膜寻靶和分化能力。
实施例18.低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达对于低氧诱导的血管损伤的修复十分重要。
HIF-1α是经深入研究的细胞对低氧条件反应的调节剂和血管生成基因表达调节剂，它调节在血管修复中具有潜在作用的多个基因的转录，包括VEGF、IGF、TGF-α和其它基因。C57BL/6J小鼠中HIF-1α转录因子的定向缺失通过杂交形成由溶菌酶M启动子(lysMcre)驱动的cre表达本底而产生，这允许该因子在骨髓谱系中的特定缺失。我们按照本文所述方法，从这些小鼠的骨髓分离出CD44^HI骨髓祖细胞，并且当在P7时移植时，与得自野生型小鼠的CD44^HI细胞相比较，对它们在OIR模型中促进血管修复的能力进行了评价。重要的是，在表面标记表达或光散射特性方面，发现从骨髓特有HIF-1α敲出品系和野生型品系分离的CD44^HI细胞之间没有差异。然而，HIF-1α缺陷型细胞不能促进修复，而野生型细胞明显加快血管修复(图47)。该发现进一步表明，髓样细胞组成介导血管修复的活性细胞群，因为在该敲除品系中HIF-1α基因表达被抑制是骨髓谱系细胞特有的。预期所有其它骨髓衍生细胞均保留正常活性。
实施例19.小胶质细胞参与视网膜血管重建。
视网膜小胶质细胞在历史上一直被视作响应炎症和感染的免疫活性细胞，它吞噬正常发育重建或变性疾病期间所产生的碎片。小胶质细胞在促进视网膜血管形成中的作用一直没有清楚地描述过。本研究证实表达骨髓祖细胞表面标记的成体骨髓衍生细胞可以分化成小胶质细胞，并促进血管系统在低氧损伤后加快恢复。这个过程是HIF-1α依赖性的并且描述了骨髓祖细胞在调节血管生成中的新作用。
移植的骨髓衍生骨髓祖细胞在OIR模型中分化成小胶质细胞并促进中心视网膜血管重建和修复，根据这一发现，小胶质细胞在正常发育期间促进和维持视网膜血管形成中起重要作用是显而易见的。对于OIR小鼠模型，C57BL/6J小鼠是最普遍使用的品系，因为它可靠地提供显著的血管消失和视网膜前血管簇形成。相比之下，BALB/cByJ品系在相同条件下不形成可评价程度的视网膜前血管簇，而且在回复到常氧之后，在高氧期间观察到的中心血管消失非常迅速地重建血管(图48中的图a)。由于这些差异的根本原因不明，因此对这两个品系在视网膜小胶质细胞中的差异进行了研究。我们发现与C57BL/6J小鼠相比，在48小时缺血/缺氧期间，BALB/cByJ小鼠中血管消失的中心视网膜内保持有较大量的小胶质细胞(图48中的图b、图c)。这个结果表明BALB/cByJ品系通过在修复期内源视网膜小胶质细胞的存在增加而受部分保护免于视网膜病。虽然不希望受理论的束缚，但是骨髓衍生的骨髓祖细胞移植到C57BL/6J小鼠可替代和/或增强这个品系中存在的较少的内源小胶质细胞的功能，导致修复作用与未注射BALB/cByJ小鼠中观察到的类似。
为了进一步研究OIR模型中参与血管修复的机制，对小胶质细胞在正常视网膜血管发育中的作用进行了研究。这通过用荷载氯膦酸盐的脂质体操纵小胶质细胞数来实现，所述脂质体被吞噬细胞(例如巨噬细胞和小胶质细胞)选择性吸收并诱导吞噬细胞凋亡。采用标记的脂质体来证实这些实验中小胶质细胞摄取的特异性，注射后4天，唯独发现所述脂质体共定位于CD11b⁺小胶质细胞内(图48中的图e插图)。血管细胞或其它CD11b^-细胞内未发现标记物质。在P5时经玻璃体腔注射荷载氯膦酸盐的脂质体，在P8进行评价时，所述脂质体引起小胶质细胞数目显著减少，视网膜血管系统受到严重破坏。观察到在解剖方面与氯膦酸盐介导的小胶质细胞死亡面积相关的大量毛细血管消失，这就表明小胶质细胞是新血管发育和/或维持所必需的(图48中的图d)。
同样，在P2时注射荷载氯膦酸盐的脂质体，当在P6与接受对照荷载PBS的脂质体的另侧眼相比时，引起血管化视网膜面积减少28％(n＝6)(图48中的图e)。由于血管网层密度的明显差异，所以还比较了血管总面积，用氯膦酸盐脂质体治疗的总面积减少41％。这些结果表明小胶质细胞对于未成熟血管维持以及在视网膜发育期间新血管的生长都十分重要。
实施例20.人MLBM CD44^HI细胞。
涉及小鼠髓样骨髓细胞群的发现还可延伸到人细胞。
从人骨髓中分离出髓样细胞群。分离细胞是CD44^HI表达细胞并且还表达CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD33和CD46(图49和图51)。就流式细胞术的光散射而言，人CD44^HI细胞具有类似于小鼠CD44^HI细胞的物理性质(图50)。例如，细胞皆同时表达CD44和CD11b。人CD44^HI群不同于小鼠的是CD44^HI细胞的组分似乎为淋巴细胞，而在小鼠骨髓中，CD44^HI细胞全部是骨髓细胞。为了获得尽可能与之前研究的小鼠细胞十分相似的人细胞群，从耗尽淋巴细胞的人骨髓中分离出CD44^HI群。这些人骨髓细胞有效减轻小鼠OIR模型的血管病理(图52)。
然后，解决了活性细胞是否存在于外周血的问题。首先，采用抗CD14抗体从外周血中分离出单核细胞。从中选出这些细胞是因为得自骨髓的CD44^HI细胞含有单核细胞作为主要组分。采用抗CD33抗体从外周血选出髓样细胞。在红细胞(rbc)溶解后，对人外周血中与CD44共表达的抗原进行了分析(图53)。对于CD14是正选择的，以及对于CD33也是正选择的CD44^HI细胞群均在小鼠OIR模型中具有功效(图54)。这些细胞还表达CD11b。
根据细胞独特的物理性质采用细胞筛选方法。流式细胞术能够测量细胞大小和细胞粒度，可被用作筛选特殊细胞群的方法。在这种情况下，在红细胞用氧化铵溶解后，仅用光散射而无需使用任何选择剂(即抗体)便可选出单核细胞和粒细胞。类似于CD44^HI细胞的细胞群(它含有单核细胞和粒细胞作为主要组分)可按这种方式从外周血产生(图55)。发现在小鼠OIR模型中，这些细胞减少血管消失和新血管形成。同样发现单独分离的单核细胞和粒细胞在OIR模型中具有功效(图56)。
实施例21.CD14⁺人脐带血细胞。
人脐带血是造血集落形成细胞(hematopoietic colony-forming cell)或干细胞(HCFC或HSC)的丰富来源。若干临床研究证实了得自脐带和胎盘的血液含有足够量的干细胞以重建经辐射烧蚀的骨髓。
起源于骨髓的内皮祖细胞(EPC)在缺血组织的新血管形成中以及在损伤血管的再内皮化(re-endothelialization)中发挥作用。
我们发现人脐带血造血祖细胞包含能够在缺血和/或变性部位掺入视网膜血管系统的一个或多个细胞群，并且有助于拯救功能性血管。大部分细胞表达CD44，约97％的细胞表达CD11b。已将体外增殖的细胞和它们的内皮子代注射到经历氧诱导缺血的免疫缺陷型SCID小鼠玻璃体腔。应用菲可(Ficoll)密度离心法获得人脐带血单核细胞。将未经筛选的人脐带血的单核细胞接种到纤连蛋白包被的培养物中。
4天后在体外形成具有内皮细胞(EC)形态的集落。内皮祖细胞集落呈多层扁平的薄细胞，从中央圆形细胞团辐射出来。
第7天，在对照培养基中培养的EPC呈现内皮细胞集落形态，由具有扁平纺锤样形态的薄细胞组成，从圆形/多角形细胞团辐射出来。伸长的内皮细胞形成分散的集落或密实堆集的细胞束。第13天，培养的EPC同样分化成EC(图57)。
为了证实内皮特征，用针对血管内皮生长因子(VEGF)受体2(VEGFR2)和CD31的抗体进行了间接免疫染色。核用4′-6-二脒基-2-苯基吲哚-2HCl染色(图58、图59)。
将新鲜得到的置于培养物中7天的分化的脐带血或人脐带血细胞注射到OIR模型小鼠的玻璃体腔。注射新鲜脐带血单核(CBMN)细胞或置于培养物中7天的分化细胞后，对血管消失面积(黄色)和新血管簇形成面积进行了分析，并将血管拯救与注射PBS的血管拯救进行了比较(图60和图61)。新鲜CBMN细胞用eGFP慢病毒表达进行了鉴定(图62)。
在人脐带血单核细胞中鉴定出表达CD14的单核细胞群。将通过MACS分离的新鲜CD14阳性细胞(纯度98％)注射到OIR模型小鼠的玻璃体腔。我们对血管消失面积和簇形成面积进行了分析。如图63所示，与PBS注射相比，注射细胞明显诱导血管拯救。
在不偏离本发明新特征的精神和范围的情况下，可以对上述实施方案进行多种变动和修改。对于本文所说明的具体实施方案，不得或不应当推断出有任何限制。
序列表
<110>斯克里普斯研究学院(THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE)
FRIEDLANDER，Martin
RITTER，Matthew R.
MORENO，Stacey K.
<120>分离的髓样细胞群及其治疗方法
<130>TSRI 1103.2PCT
<150>US 11/600,895
<151>2006-11-16
<150>PCT/US2006/06411
<151>2006-02-24
<150>US 60/656,037
<151>2005-02-24
<160>6
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>4742
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带His6标签的T2 TrpRS
<400>1
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
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cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
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gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
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catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820
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tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
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cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
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tgacagcgac tgcattggga agatcagttt tcctgccatc caggctgctc cctccttcag 4020
caactcattc ccacagatct tccgagacag gacggatatc cagtgcctta tcccatgtgc 4080
cattgaccag gatccttact ttagaatgac aagggacgtc gcccccagga tcggctatcc 4140
taaaccagcc ctgttgcact ccaccttctt cccagccctg cagggcgccc agaccaaaat 4200
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cgacaagctc gagcagatca ggaaggatta caccagcgga gccatgctca ccggtgagct 4440
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ggaggtcacg gatgagatag tgaaagagtt catgactccc cggaagctgt ccttcgactt 4560
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caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 4680
ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 4740
at                                                                4742
<210>2
<211>392
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>带His6标签的T2 TrpRS
<400>2
Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly
 1               5                  10                  15
Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr
            20                  25                  30
Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His
        35                  40                  45
Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe
    50                  55                  60
Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly
65                  70                  75                  80
His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn
                85                  90                  95
Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys
            100                 105                 110
Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys
        115                 120                 125
Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser
    130                 135                 140
Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val
145                 150                 155                 160
Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly
                165                 170                 175
Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln
            180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg
        195                 200                 205
Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr
    210                 215                 220
Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro
225                 230                 235                 240
Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr
                245                 250                 255
Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr
            260                 265                 270
Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly
        275                 280                 285
Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val
    290                 295                 300
Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys
305                 310                 315                 320
Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly
                325                 330                 335
Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu
            340                 345                 350
His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe
        355                 360                 365
Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala
    370                 375                 380
Leu Glu His His His His His His
385                 390
<210>3
<211>378
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser
 1               5                  10                 15
Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly
            20                  25                  30
Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg
        35                  40                  45
Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr
    50                  55                  60
Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His
65                  70                  75                  80
Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Val
                85                  90                  95
Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp
            100                 105                 110
Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp
        115                 120                 125
Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp
    130                 135                 140
Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys
145                 150                 155                 160
Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe
                165                 170                 175
Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala
            180                 185                 190
Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr
        195                 200                 205
Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe
    210                 215                 220
Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys
                245                 250                 255
Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala
            260                 265                 270
Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg
        275                 280                 285
Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp
    290                 295                 300
Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu
305                 310                 315                 320
Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu
                325                 330                 335
Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His
            340                 345                 350
Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met
        355                 360                 365
Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln
    370                 375
<210>4
<211>378
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly
            20                  25                  30
Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg
        35                  40                  45
Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr
    50                  55                  60
Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His
65                  70                  75                  80
Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Val
                85                  90                  95
Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp
            100                 105                 110
Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp
        115                 120                 125
Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp
    130                 135                 140
Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys
145                 150                 155                 160
Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe
                165                 170                 175
Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala
            180                 185                 190
Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr
        195                 200                 205
Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe
    210                 215                 220
Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys
                245                 250                 255
Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala
            260                 265                 270
Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg
        275                 280                 285
Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp
    290                 295                 300
Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu
305                 310                 315                 320
Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu
                325                 330                 335
Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His
            340                 345                 350
Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met
        355                 360                 365
Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln
    370                 375
<210>5
<211>423
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
Ser Tyr Lys Ala Ala Ala Gly Glu Asp Tyr Lys Ala Asp Cys Pro Pro
 1               5                  10                  15
Gly Asn Pro Ala Pro Thr Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala
           20                  25                  30
Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys
        35                  40                  45
Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile
    50                  55                  60
Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro
65                  70                  75                  80
His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn
                85                  90                  95
Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr
            100                 105                 110
Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His Leu Ile Pro
        115                 120                 125
Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val
    130                 135                 140
Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu
145                 150                 155                 160
Asp Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala
                165                 170                 175
Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr
            180                 185                 190
Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys
        195                 200                 205
His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser
    210                 215                 220
Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser
225                 230                 235                 240
Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln
                245                 250                 255
Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr
            260                 265                 270
Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His
        275                 280                 285
Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala
    290                 295                 300
Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile
305                 310                 315                 320
Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile
                325                 330                 335
Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe
            340                 345                 350
Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile
        355                 360                 365
Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys
    370                 375                 380
Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg
385                 390                 395                 400
Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg
                405                 410                 415
Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln
            420
<210>6
<211>401
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala Glu Glu Asp Phe Val Asp
 1               5                  10                  15
Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys
            20                  25                  30
Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn
        35                  40                  45
Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg
    50                  55                  60
Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser
                85                  90                  95
Glu Ala Met His Val Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp
            100                 105                 110
Leu Gln Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp
        115                 120                 125
Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Ser Tyr
    130                 135                 140
Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn
145                 150                 155                 160
Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly
                165                 170                 175
Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln
            180                 185                 190
Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile
        195                 200                 205
Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro
    210                 215                 220
Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala
225                 230                 235                 240
Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg
                245                 250                 255
Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala
            260                 265                 270
Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser
        275                 280                 285
Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys
    290                 295                 300
His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe
305                 310                 315                 320
Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe
                325                 330                 335
Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser
            340                 345                 350
Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu
        355                 360                 365
Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp
    370                 375                 380
Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe
385                 390                 395                 400
Gln