猪用弱毒疫苗气雾免疫方法.pdf

本发明公开了一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法。将猪用疫苗经稀释介质按说明书要求稀释成疫苗溶液，或比说明书要求稀释浓度高2～5倍，通过喷雾器，用抛射剂，控制喷射压力≤0.3MPa；气溶胶输出量为1-10mL/min气流温度≤50℃；空气相对湿度≥50％，将疫苗溶液制备成符合粒径分布1～10微米、雾粒浓度达80％以上及微生物学活性达到疫苗免疫要求的液相气溶胶，在气雾箱中以雾化方式对猪进行免疫。该方法可操作性强，可以标准化推广，用于猪的弱毒疫苗，尤其是针对猪呼吸道疾病疫苗的喷雾免疫。

1.  一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法，其特征在于，
将猪用疫苗经稀释介质按说明书要求稀释成疫苗溶液，或比说明书要求稀释浓度高2～5倍，通过喷雾器，用抛射剂，控制喷射压力≤0.3Mpa；气溶胶输出量为1-10mL/min；气流温度≤50℃；空气相对湿度≥50％，将疫苗溶液制备成符合粒径分布1～10微米、雾粒浓度达80％以上及微生物学活性达到疫苗免疫要求的液相气溶胶，在气雾箱中以雾化方式对猪进行免疫。

2.  如权利要求1所述的一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法，其特征在于，对于非冻干猪用疫苗，稀释介质为蒸馏水或去离子水，其中需添加质量体积比0.1％的脱脂奶粉或体积比3％～5％的中性甘油、质量体积比1％的明胶、质量体积比10％的葡萄糖、质量体积比10％的蔗糖和质量体积比5％的糊精作为保护剂；或者对于冻干的猪用疫苗稀释介质直接选择蒸馏水或去离子水，不需再加入保护剂。

3.  如权利要求1或2所述的一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法，其特征在于，所述的喷雾器要求喷出气溶胶粒径需达到1～10微米。

4.  如权利要求1或2所述的一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法，其特征在于，所述的抛射剂为压缩空气、二氧化氮、氧化亚氮、氮气、液化气体碳氢化合物或氟氮代烷化合物。

5.  如权利要求3所述的一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法，其特征在于，所述的抛射剂为压缩空气、二氧化氮、氧化亚氮、氮气、液化气体碳氢化合物或氟氮代烷化合物。

6.  如权利要求1或2所述的一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法，其特征在于，所述的喷雾箱容积应小于3立方米，气雾箱大小需根据一次免疫猪数量及免疫疫苗剂量等因素确定，具体计算公式如下：Ft=CNt-CVN2H(1-e-NHVt)]]>
Ft：t时间内的个体吸入剂量；
C：每分钟喷出之疫苗量；
V：气雾箱之容积；
N：被免疫个体数；
H：被免疫个体每分钟吸入空气量；
e：自然对数的底数，e＝2.718。

7.  如权利要求3所述的一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法，其特征在于，用仔猪保温箱代替所述的气雾箱。

猪用弱毒疫苗气雾免疫方法
技术领域
本发明属于将猪用活疫苗以气雾免疫的方式从呼吸道进行直接免疫的方法。特别涉及到猪呼吸道疾病相关疫苗的免疫方法。
背景技术
目前，在动物疫苗免疫方面，气雾免疫作为一种省时省力而高效的新型免疫方式常用于禽活疫苗的免疫。疫苗以气雾粒子的形式进入体内后，一方面被吞噬细胞吞噬后转运到淋巴器官或血液，产生体液免疫；另一方面，在呼吸道黏膜局部也可刺激吞噬细胞分化浆细胞，产生局部抗体和干扰素的作用，增强呼吸道黏膜的保护力，所以气雾免疫可以刺激全身性的广泛免疫保护作用。另外，气雾免疫最大的优点还在于可以引起呼吸道黏膜的局部细胞免疫与黏膜免疫(SIgA-分泌型免疫球蛋白A)，黏膜免疫是一种机体针对外源性病原产生的一种非特异的免疫保护机制，对所有的细菌性病原或病毒性病原均能产生清除和杀灭作用。黏膜免疫对于抵挡从呼吸道入侵的病原来说是非常重要的免疫屏障。但由于猪鼻甲骨与气管解剖结构的特点，只有粒径为1～10μm的微粒经气雾以适当的角度可以进入下呼吸道。较粗的颗粒大部分落在上呼吸道鼻腔黏膜上，无法对疫苗起到靶向作用。如果微粒太细(＜0.5μm)，则进入肺泡囊后又随呼气排出，所以必须将微粒大小控制在1～10μm内。影响气溶胶中微粒粒径大小的因素主要与气溶胶的发生方式、抛射剂压力，喷头的种类以及空气中的温湿度有关。
气溶胶常用的发生方法总体上分为物理凝集法、化学凝集法、机械分散法和气流分散法。对于微生物气溶胶，具有严格的选择性，一般常用气流分散法进行。而液相气流分散法又可细分为水力式、吹气式、离心式、振动式和超声波法等等。考虑到本发明既需要在单位时间内喷出较多量的疫苗气溶胶，而且气溶胶粒子谱范围不能太大，我们最终选择吹气式气流分散法作为活疫苗气溶胶的制备方法。吹气式气流分散法其原理是以高速气流产生的负压使液体从喷液管吸出，再经高速气流的碎裂作用形成气溶胶。而且它可利用喷雾器内部的结构阻留其较大的粒子，从而使粒谱分布范围变窄。另外在抛射剂压力，喷头的种类以及空气中的温湿度方面本发明也作了相应的规定。
考虑到本发明所用的疫苗为活疫苗，因此喷出的疫苗气溶胶须保证其中菌株的活力。然而，控制气溶胶微粒大小和疫苗株活力本身又是一种矛盾。气溶胶生成过程中的切削力越大，雾化粒子越小，但疫苗株的活力也越低。除了切削力，影响气溶胶微生物活力的因素还有在高湿环境下，布朗运动的撞击使分散度降低，粒子凝集并沉降；由于水份蒸发使盐代谢失调和急剧的干燥作用、氧化作用以及微生物本身的特点等。因此，为保持疫苗菌株的微生物学活性，本发明综合考虑了抛射剂的喷射压力、气流温度、环境湿度等影响因素，并在疫苗稀释介质中加入保护剂等方法来保证菌株的活力。
发明内容
技术问题
针对上述领域中的缺陷，本发明提供了一种能用于猪用活疫苗对猪进行气雾免疫的方法，该方法省时省力，适合于大规模免疫。
技术方案
一种适用于猪用活疫苗气雾免疫的方法，其特征在于，
将猪用疫苗经稀释介质按说明书要求稀释成疫苗溶液，或比说明书要求稀释浓度高2～5倍，通过喷雾器，选取抛射剂，控制喷射压力≤0.3Mpa；气溶胶输出量为1-10mL/min；气流温度≤50℃；空气相对湿度≥50％，将疫苗溶液制备成符合粒径分布1～10微米、雾粒浓度达80％以上及微生物学活性达到疫苗免疫要求的液相气溶胶，在气雾箱中以雾化方式对猪进行免疫。
对于非冻干猪用疫苗稀释介质为蒸馏水或去离子水，其中需添加质量体积比0.1％的脱脂奶粉或体积比3％～5％的中性甘油、质量体积比1％明胶、质量体积比10％葡萄糖、质量体积比10％蔗糖和质量体积比5％糊精作为保护剂；或者
对于冻干疫苗稀释介质直接选择蒸馏水或去离子水，不需再加入保护剂。
所述的喷雾器要求喷出气溶胶粒径需达到1～10微米，如德国PARI BOY公司的LCD型简易喷雾器。所述的抛射剂为压缩空气、二氧化氮、氧化亚氮、氮气、液化气体碳氢化合物或氟氮代烷化合物。所述的喷雾箱容积应小于3立方米，可以用仔猪保温箱代替所述的气雾箱。气雾箱大小需根据一次免疫猪数量及免疫疫苗剂量等因素确定。具体计算公式如下：
Ft=CNt-CVN2H(1-eNHVt)]]>
Ft：t时间内的个体吸入剂量；
C：每分钟喷出之疫苗量；
V：气雾箱之容积；
N：被免疫个体数；
H：被免疫个体每分钟吸入空气量；
e：自然对数的底数，e＝2.718。
有益效果
该方法将疫苗通过雾化形式免疫猪，省时少力，可操作性强，可以标准化推广，由于该方法通过对喷雾压力、室内温湿度及稀释液保护剂等因素的调节可保证疫苗的微生物学活力，因此该方法可广泛用于猪的弱毒疫苗。另外，由于通过喷雾吸入可将疫苗直接送至呼吸道，引起呼吸道局部的免疫反应，因此该方法尤其适用于猪呼吸道疾病疫苗的喷雾免疫。
附图说明
图1、猪气雾免疫猪支原体肺炎活疫苗(168株)后不同时间血液中T淋巴细胞增殖结果
图2、猪气雾免疫猪支原体肺炎活疫苗(168株)后不同时间呼吸道产生的特异性SIgA变化
图3、猪气雾免疫猪支原体肺炎活疫苗(168株)后在肺脏灌洗液中疫苗株的PCR检测
M.DL-2000Plus Maker 1.1号猪样品  2.2号猪样品  3.阳性对照  4.阴性对照
具体实施例
猪肺炎支原体活疫苗(168株)的气雾免疫
(一)材料与设备的准备
1.疫苗溶液的配制
取一瓶猪肺炎支原体活疫苗(168株)(冻干苗，10头份/瓶，南京天邦生物科技有限公司)用2mL灭菌去离子水溶解，备用。
2.喷雾设备
选择德国PARI BOY公司的LCD型简易喷雾器，另配备星豹牌空气压缩机(HP2.5，广州星豹空压机有限公司)。将喷雾器与空气压缩泵连接，组成以压缩空气为抛射剂的喷雾设备。
3.喷雾箱
选择产房中仔猪保温箱(北京慧怡工贸有限责任公司)作为喷雾箱，密闭保温箱仔猪的出入口，以保温箱顶部的通气口作为喷雾入口。
4.免疫猪
选择10头5-8日龄苏中猪作为免疫猪。
(二)气雾免疫操作方法
通过喷水的方式，控制室内相对湿度≥50％。将10头仔猪赶入保温箱，密闭保温箱仔猪的出入口。取2mL猪肺炎支原体活疫苗(168株)溶液灌入喷雾器，调节空气压缩泵输出压力为0.1MPa，通过保温箱顶部的通气口向保温箱内进行喷雾。控制气雾流速为1-2mL/min。喷雾结束后，盖住保温箱顶部通气口，让所有免疫猪于保温箱内停留5min后恢复自由。
(三)检测方法
1.疫苗气溶胶粒径检测方法
方法一：软垫法。将2份石腊油加1份凡士林研磨均匀，涂于带凹槽的载玻片上，加热除去其中气泡，即成软垫。将软垫置喷雾器喷口作冲击采样，软垫距离喷雾器喷口15cm。迅速用盖玻片盖住载玻片凹槽，于显微镜上观察。将收集有疫苗气溶胶的载玻片于油镜(×100)下测量。目镜中标尺实际最小刻度为0.1mm，经油镜放大，检测最小刻度为1nm。任意选取气溶胶颗粒分布较多的三个视野。对视野中每个颗粒进行粒径测量与分布统计。(车凤翔.消毒剂气溶胶粒子大小测定法.消毒与灭菌.1984.1(4)：226)
结果：在0.1MPa的喷雾压力下，80％的气溶胶粒径为4微米。
方法二：喷雾激光粒度仪(JL-3000，成都精新)。
2.疫苗气溶胶微生物学活性检测方法
在3升三角烧瓶中灌入1L无菌生理盐水，收集喷出的疫苗气溶胶溶于三角烧瓶内的生理盐水中。分别比较测定喷雾前疫苗溶液的滴度与喷雾后收集于三角烧瓶中疫苗溶液的滴度。结果如下：

3.气雾免疫成功性检测方法
取1mL肺脏灌洗液，12000rpm离心15min，弃上清，用100μL无菌双蒸水重悬沉淀。悬液煮沸5min，瞬时离心后取5μL作为PCR模板，用刘茂军等(金陵科技学院学报，2008，24(3)，99-101)建立的PCR方法，检测免疫猪肺脏灌洗液中的猪肺炎支原体疫苗株。结果如图3：在两头免疫猪的肺脏灌洗液中均检测到了猪支原体肺炎活疫苗168株的基因。
4.免疫后不同时期血液中T淋巴细胞增殖检测
分别于气雾免疫后30天和60天无菌采集外周抗凝血，分离淋巴细胞，按1×10⁶细胞/孔接种到96孔板内，使每孔细胞悬液为100μL，37℃孵育1h，分别加入终浓度为25μg/mL的猪肺炎支原体全菌蛋白和生理盐水，各重复3孔，将细胞培养44h，然后取出，加MTT(原始浓度5mg/m L)20μL/孔，继续培养4h，取出后弃上清，加DMSO50μL/孔，使结晶溶解，测OD₅₇₀值，取其平均值计算刺激指数，即表示外周血中T淋巴细胞的增殖。刺激指数(Stimulation index，SI)＝实验组OD₅₇₀均值/相应对照组OD₅₇₀均值。结果如图1：在经过猪支原体肺炎活疫苗(168株)气雾免疫后30天和60天，外周血T淋巴细胞分别增殖了1.81倍和2.16倍，而未免疫对照组几乎没有增殖出现。免疫组与未免疫组中猪的外周血T淋巴细胞增殖差异显著。
5.免疫后不同时期呼吸道中猪肺炎支原体特异性SIgA分泌检测
分别于免疫前，免疫后2周、4周、6周和8周，采集免疫猪与未免疫猪的肺脏灌洗液，用ELISA方法检测抗猪肺炎支原体特异性SIgA的分泌。结果如图2：在经过猪支原体肺炎活疫苗(168株)气雾免疫后，肺脏灌洗液中抗猪肺炎支原体特异性SIgA持续增加，而未免疫对照组几乎没有特异性SIgA的分泌。
附：ELISA方法检测抗猪肺炎支原体特异性SIgA的分泌方法：
1)包被抗原P97R1蛋白(刘茂军，邵国青，张映，聂向庭.猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达.江苏农业学报.2005.21(3)：207-11)。
2)ELISA检测用试剂及溶液。
(1)羊抗猪IgA抗体                  美国BETHYL公司
(2)辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG    武汉博士德公司
(3)包被液(碳酸盐缓冲液)：NaCO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到9.6。
(4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到7.4。
(5)封闭液：1g牛血清白蛋白(BSA)用磷酸盐缓冲液，定容至100mL
(6)洗涤液：含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
(7)稀释液：0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液。
(8)底物缓冲液：
0.2mol/L Na₂HPO₄：取Na₂HPO₄·12H₂O 14.33g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL。
0.1mol/L柠檬酸：取柠檬酸0.84g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL。
(9)底物显色液：TMB(四甲基联苯胺)底物显色液。
(10)终止液(2M H₂SO₄)：21.7mL浓硫酸缓慢加入178.3mL蒸馏水中。
3)阴阳性标准品的采集
(1)以Mhp抗体阴性母猪(经美国IDEXX公司的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测Mhp抗体为阴性的母猪，购自江苏农林职业技术学院试验猪场)所产3-5日龄仔猪的肺脏灌洗液或鼻拭子为阴性标准品。
(2)以经猪支原体肺炎活疫苗168株(购自南京天邦生物科技有限公司)两次肺内免疫后的仔猪肺脏灌洗液或鼻拭子为阳性标准品。
(3)猪肺脏灌洗液的采集方法：将猪剖杀后，通过气管向肺脏内灌入50ml灭菌生理盐水，按摩肺脏15s，收集灌洗液约10ml，将灌洗液于低温2000rpm离心10min，收集上清作为检测样品，于-20℃冻存备用。
(4)猪鼻拭子样品的采集：用棉签采集猪两鼻孔拭子，将拭子于1mL灭菌生理盐水中于4℃浸泡过夜，挤干后取出，浸泡液于低温2000rpm离心10min，收集上清作为检测样品，于-20℃冻存备用。
4)检测样品的准备
检测样品主要为肺脏灌洗液或鼻拭子，具体采集方法同阴阳性标准品的采集。
5)ELISA操作方法
(1)包被：用紫外分光法测定纯化后的P97R1蛋白浓度，用包被液将之稀释成5μg/mL，包被ELISA板，每孔加100μL。于37℃温育2h后，再放入4℃过夜。倒出孔内液体，加入200μL/孔洗涤液，每次3min，拍干，重复洗涤3次。
(2)封闭：用每孔加入封闭液200μL，于37℃封闭2h。倒出孔内液体，洗涤3次。
(3)加检测样品：每孔加入100μL检测样品，另设两个阴性标准孔和两个阳性标准孔，于37℃温育2h，倒出孔内液体，洗涤3次。
(4)加二抗：每孔加入100μL经稀释液1∶5000稀释的羊抗猪IgA抗体，于37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。
(5)加酶标三抗：每孔加入经稀释液1∶8000稀释的100μL辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG，于37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤5次。
(6)加显色液：每孔加入100μL新鲜配制的TMB显色液，于37℃避光作用10min。
(7)终止：每孔加入50μL终止液，酶标仪检测450nm处OD值。
(8)结果判定：样品中SIgA效价用S/P值确定，S/P＝(检测样品OD值-阴性标准品OD值)/(阳性标准品OD值-阴性标准品OD值)，S/P值＞0.15判为阳性；S/P值＜0.1判为阴性；当0.1＜S/P＜0.15时，判为疑似。
注：上述实施例使用的是冻干疫苗。对于猪用非冻干疫苗，疫苗稀释介质仍为蒸馏水或去离子水，但需在其中添加质量体积比0.1％的脱脂奶粉或体积比3％～5％的中性甘油、质量体积比1％明胶、质量体积比10％葡萄糖、质量体积比10％蔗糖和质量体积比5％糊精作为保护剂，非冻干苗与冻干苗的气雾免疫方法相同。