一种仿细胞外层膜结构修饰涂层的制备方法 【技术领域】
本发明涉及使用仿细胞膜外层结构共聚物制备仿细胞外层膜结构涂层的方法，属于高分子化学与物理及生物医用材料技术领域。
背景技术
随着现代医学的飞速发展，血管支架、传感器、心脏辅助设备等各种微创介入医疗装置已广泛应用到各种医疗技术中，极大地丰富了现代医学诊疗手段。然而在临床应用中，现有的装置依然不同程度地存在感染、凝血、术后组织增生以及其它的免疫副反应，给患者带来极大的痛苦，同时增加了医疗费用，有时还需要再次手术。目前用于改善植入材料血液相容性的主要方法有血管内皮化、白蛋白钝化和磷酰胆碱化三种。磷酰胆碱是组成细胞外层膜基本单元(如卵磷脂、鞘磷脂分子)的亲水端基。细胞生物学研究表明，细胞外层膜带有等量正、负电荷的卵磷脂，不会激活内源性凝血途径。因而，人们用各种方法将含磷酰胆碱基团的分子构建在材料表面，来改善材料的血液相容性。表面接枝方法虽可获得牢固结合的磷酰胆碱表面，但因接枝过程复杂，接枝密度不高而难以应用；相对而言，涂覆方法工艺简单、实用性强。然而，这种以物理吸附结合的聚合物涂层，在体内复杂环境中可能发生溶解、降解等作用而流失；另外，两亲性(亲水、亲油)聚合物涂层表面通常形成与细胞外层膜结构相反的结构，加之表面结构性能随自组装过程的条件及组装后的保存环境等因素而衰退，均会影响此类材料表面性能及相关产品的开发和应用。这些不稳定因素使得仿细胞膜表面改性方法目前还存在安全隐患。
考虑涂层的血液相容性以及与基底材料结合的稳定性，本发明使用含磷酰胆碱基团的可聚合单体与有机硅丙烯酸酯可交联单体通过自由基溶液聚合，合成可交联的仿细胞膜二元共聚物。以此聚合物对金属氧化物及含活性氢的基材表面进行涂覆，与片基反应后形成共价结合、高表面密度的磷酰胆碱基团表面。这种新型仿细胞外层膜结构的表面改性方法及技术，制备工艺简单，涂层的生物相容性良好，对发展我国的生物医用材料产业将会起到高技术支撑作用。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种仿细胞外层膜结构涂层的制备方法，以解决通常的两亲性聚合物涂层不稳定以及形成反细胞外层膜结构的问题，得到亲水性更强、交联更稳定的仿细胞外层膜结构表面。
利用可交联基团的水解、缩合反应，将含磷酰胆碱基团和烷氧基硅基团的二元共聚物在含水条件下交联处理，形成仿细胞外层膜结构表面，获得稳定的亲水性表面，达到对材料进行生物相容性表面改性的目的。
本发明的实现过程如下：
一种仿细胞外层膜结构涂层的制备方法，包括如下步骤：
(1)将结构通式(I)表示的二元共聚物溶于无水极性有机溶剂，得到浓度为1～10mg/mL的溶液，所述无水极性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其混合溶剂；
其中，m和n对应单元的摩尔百分数分别为50～95％和5～50％；R1、R2为H或CH3；R3为甲氧基或乙氧基；
(2)用喷涂或浸涂的方法使聚合物在被修饰基材表面形成均匀的涂层；
(3)涂层真空干燥之后，在重量百分浓度为0.5～5.0％的氨水或挥发性有机胺水溶液的饱和蒸汽中处理1～72小时，处理温度为20～120℃，得到交联固定的仿细胞外层膜结构亲水表面，所述的挥发性有机胺选自三乙胺、三甲胺、乙二胺。
含氨(胺)水溶液的饱和气氛不仅提供了涂层中烷氧基硅基团之间发生水解反应必须的水分，气氛中的氨(胺)类碱性分子对水解后的硅羟基之间的缩合交联反应有显著促进作用。相比只在水汽中处理，在含氨(胺)水溶液的饱和气氛中处理得到交联更彻底的仿细胞外层膜结构表面。含氨(胺)水溶液浓度过高时，饱和气氛凝结在聚合物涂层表面产生较强碱性，在加热条件下聚合物易分解，可能失去仿细胞膜结构。因而，氨(胺)水溶液浓度最好保持在0.5～5.0％。
本发明制备工艺简单、方便，成本低，涂层的血液相容性和稳定性都良好。在氨水或挥发性有机胺水溶液饱和的蒸汽中处理后得到亲水性更强、交联稳定的仿细胞外层膜结构表面。
【附图说明】
图1为本发明的聚合物P(MPC-co-TSMA)涂层湿热处理之后，表面血小板黏附结果的扫描电镜图，图1a为盖玻片，图1b为P(MPC-co-TSMA)涂层；
图2为本发明的聚合物P(MPC-co-TSMA)涂层湿热处理之后，表面牛血清白蛋白(BSA)和牛血清纤维蛋白原(Fg)的吸附结果。
【具体实施方式】
(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱按照文献[Ishihara K，Ueda T，Nakabayashi N.Polym.J.，1990，22，355]的方法合成及纯化，丙烯酰氧丙基烷氧基硅及偶氮二异丁腈(AIBN)从国内试剂公司或Sigma公司购得，AIBN使用前用乙醇重结晶。共聚物改性后材料表面的亲、疏水性能使用DCAT 21型表面界面张力仪测定接触角来衡量。
实施例1：
按照一定比例取单体2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)和γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅(TSMA)，用异丙醇溶解，称取单体总质量1％的引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，用少量THF溶解，并与单体溶液混匀，装入滴液漏斗中。在N2保护、80℃恒温搅拌下，滴加单体及引发剂的混合液，在3h内滴完。滴加完毕，密封体系反应，反应进行10h后补加单体总质量0.02％的AIBN的THF溶液，反应进行24h后停止加热搅拌。反应液在N2保护下过滤，滤液旋蒸浓缩后用冷无水乙醚沉淀，沉淀用甲醇溶解、乙醚再次沉淀，所得沉淀真空干燥，通过1H核磁共振测定聚合物P(MPC-co-TSMA)各组分含量。1H NMR，δ(CDCl3∶CD3OD＝1∶1(v/v)，ppm)：0.7(CH2Si)，0.9(CCH3)，1.3(SiCH2CH2)，1.9(CCH2)，3.3(N+(CH3)3)，3.6(Si(OCH3)3)，3.7(NCH2)，4.0-4.4(OCH2)。由3.3ppm和0.7ppm处两个峰对MPC组分和TSMA组分分别计量。当MPC和TSMA的投料比分别为9∶1、8∶2、7∶3和6∶4(mol％)时，聚合物中两种组分地物质的量比分别为95∶5、80∶20、77∶23、67∶33。
实施例2：
取实施例1合成的MPC和TSMA配比为80∶20的可交联聚合物，配成1mg/mL的乙腈溶液。将溶液喷涂或浸涂到干燥、洁净的盖玻片表面，真空干燥后在90℃下2％三乙胺水溶液的饱和气氛中处理1h，得到不溶于水的交联涂层。以纯水为润湿介质，测试温度20℃，前进角和后退角的测试速率皆为0.05mm/s，表面张力测定阈值5.00mg，浸入深度10.00mm，测试取点频率5.00Hz，测得前进角为45±2°，后退角为5±1°。
对比试验是真空干燥后，在90℃纯水的饱和气氛中处理1h，涂层仍然有溶解，说明交联不完全。再于120℃处理1h，涂层不再溶解，测得前进角为52±2°，后退角为6±2°。
实施例3：
取实施例1合成的MPC和TSMA配比为90∶10的可交联聚合物，配成2mg/mL的异丙醇溶液。将溶液浸涂到干燥、洁净的盖玻片表面，真空干燥后50℃在0.8％三甲胺水溶液的饱和气氛中处理10h，得到交联的仿细胞外层膜结构涂层。以纯水为润湿介质，测试温度20℃，前进角和后退角的测试速率皆为0.05mm/s，表面张力测定阈值5.00mg，浸入深度10.00mm，测试取点频率5.00Hz，测得前进角为41±2°，后退角为4±2°。
对比试验是真空干燥后，在50℃纯水的饱和气氛中处理10h，涂层仍然有溶解，说明交联不完全。再于100℃处理2h，涂层不再溶解，测得前进角为45±2°，后退角为5±2°。
实施例4：
取实施例1合成的MPC和TSMA配比为60∶40的可交联聚合物，配成4mg/mL的甲醇溶液。将溶液浸涂到干燥、洁净的盖玻片表面，真空干燥后在含4％氨水溶液的饱和气氛中于20℃处理70h，得到交联的仿细胞外层膜结构涂层。以纯水为润湿介质，测试温度20℃，前进角和后退角的测试速率皆为0.05mm/s，表面张力测定阈值5.00mg，浸入深度10.00mm，测试取点频率5.00Hz，测得前进角为52±2°，后退角为8±2°。
对比试验是真空干燥后，在20℃纯水的饱和气氛中处理70h，涂层仍然有溶解，说明交联不完全。
实施例5：
取实施例2所制备的仿细胞外层膜结构涂层，测试静态条件下的血小板黏附。涂层在PBS缓冲溶液(称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.0g，KH2PO4 0.2g，加蒸馏水溶解，定容到1000mL，摇匀，调节pH＝7.4)中浸泡2h，滴加20μL新制富血小板血浆到涂层中央，37℃下孵育2h，用PBS缓慢淋洗掉黏附不牢固的血小板，然后浸入2.5％的戊二醛溶液中固定1h，蒸馏水淋洗4～5次，自然晾干，喷金，用扫描电子显微镜(SEM)观察涂层表面黏附血小板黏附的数量和形态。如图1所示，盖玻片表面大量黏附血小板，且血小板被激活和凝聚；涂覆实施例2所述仿生涂层的盖玻片表面未见到血小板黏附。
实施例6：
取实施例2所制备的仿生涂层，测试涂层表面的蛋白质吸附状况。测试不同磷酰胆碱基团密度的涂层表面分别对牛血清白蛋白(BSA)和牛血清纤维蛋白原(Fg)的吸附状况，用微量BCA法[Smith P K，Krohn R I，Hermanson G T，et al.Anal.Biochem.，1985，150，76]进行测试。如图2所示，盖玻片表面对两种蛋白的吸附量都很大，涂覆仿生涂层的表面能够大大抑制两种蛋白质的吸附，涂层表面磷酰胆碱基团的密度越大，抑制程度越强。盖玻片表面BSA和Fg的吸附量分别为0.76μg/cm2和1.11μg/cm2；而MPC和TSMA组分比例为80∶20(mol％)的聚合物涂层表面BSA和Fg的吸附量分别为0.09μg/cm2和0.04μg/cm2。