具有杀狄斯瓦螨活性的几丁质酶CHIC1及其应用.pdf

本发明公开了一种具有杀狄斯瓦螨活性的几丁质酶ChiC1及其应用。本发明从粘质沙雷氏菌Serratia marcescens GEI的基因组DNA中克隆出一段基因碱基序列，应用原核表达载体pET-32a(+)，在大肠杆菌中表达该基因，对该基因的编码蛋白进行纯化、复性、生物测定表明，该蛋白对狄斯瓦螨具有毒性，几丁质酶ChiC1活力为14.7U/mL的条件下，沾染该蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率为25％，经过测序分析表明，该基因是一个几丁质酶基因chiC1类的新序列。本发明可用于蜜蜂的螨害防治方面。

1.  一种具有杀狄斯瓦螨(Varroa destructor Anderson&Trueman)活性的几丁质酶ChiC1，其特征在于编码所述几丁质酶ChiC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.  权利要求1所述几丁质酶ChiC1在杀狄斯瓦螨中的应用。

具有杀狄斯瓦螨活性的几丁质酶ChiC1及其应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及具有杀狄斯瓦螨活性的几丁质酶ChiC1及其在杀狄斯瓦螨中的应用。
背景技术：
蜜蜂寄生螨一直是世界养蜂业最主要的危害之一，在全球范围危害，目前除澳大利亚、非洲部分地区尚未发现蜂螨外，其它洲的蜂群都受到蜂螨的危害。蜜蜂的外寄生螨狄斯瓦螨(俗称大蜂螨)(Varroa destructor Anderson & Trueman)吸食蜜蜂成蜂或幼虫的体液，造成蜜蜂体质下降，蜂群群势衰弱；此外，蜂螨还传播蜜蜂细菌和病毒病害。据报道，最近在美国等国出现的蜜蜂蜂群崩溃失调病(CCD)也与蜂螨的危害有关。每年我国养蜂业仅蜂螨造成的直接损失就达到几个亿人民币，而且因防治蜂螨使用药物造成蜂产品污染的间接损失更是不可估量。
目前主要用于防治蜜蜂螨害的方法有以下3种：(1)物理机械法：如蜂群的热处理；(2)化学防治法：如使用杀螨剂如有机酸和香精等；(3)生物技术防治法：包括蜜蜂饲养管理技术。但是目前使用最广泛的主要还是用药物来防治大蜂螨，其中使用最为普遍的是一种以拟除虫菊酯类农药-氟胺氰菊酯为主要原料的杀螨剂“螨扑”(Apistan)。不可否认，药物治螨起了一定的积极作用。但是，连续和大范围使用导致的污染和抗药性问题越来越严重。显然单靠药物治螨是不够的，还必须寻找其它途径来防治蜂螨。
一些生物防治技术已应用于防治蜂螨，如(1)割除雄蜂房法：自从西方蜜蜂身体上发现蜂螨，也发现蜜蜂对于蜂螨有清除行为，并可减轻蜂螨对蜂群所造成的危害。与此同时，养蜂工作者在实践中发现，割除雄蜂房也能降低蜂群中蜂螨的寄生密度，减弱蜂螨对蜂群所造成的危害。(2)使用抗螨除虫多功能巢础：利用蜂螨繁殖于封盖房，寄生于蜂体上这一生物学特性，直接把杀螨药物藏于蜂房中，阻断蜂螨幼虫在雄蜂房中正常羽化成成螨，从而达到杀灭蜂螨这一目的。(3)人工选育抗螨新品种：中华蜜蜂对于大蜂螨具有一定的抗性，蜂群内虽曾发现蜂螨，但未给蜂群造成危害。而且西方蜜蜂对于蜂螨也有一定的清理形为，养蜂工作者可以在蜂群中选择对蜂螨有较强清理行为的蜜蜂为种群，定向培育抗螨性强的蜂群，包括蜜蜂营养杂交(又称为蜜蜂无性杂交)。(4)利用病原真菌：绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)和Hirsutella thompsonii对大蜂螨具有一定的防治效果。
但是，这些措施对蜂螨的控制效果并不令人满意，如割除雄蜂房法很难彻底消除螨害；由于长期以来自养自繁的养蜂模式导致的蜜蜂严重混杂退化和近亲繁殖衰退现象，培育抗螨品系的稳定性也不尽人意；病原真菌的应用仍受制于更有效品系的筛选、蜂巢温湿度、贮存方法和施用技术。因此，养蜂界仍在严重依赖业已产生抗性和引起残留的化学农药防治蜜蜂害螨。抗生素和化学农药的滥用，已经对我们的食品安全和国际贸易造成巨大的威胁。因此，养蜂业急需安全防治蜂螨的替代防治方法，热切期待环境友好的蜜蜂螨害防治新技术。
几丁质酶能够催化水解几丁质，产生几丁寡糖或几丁二糖。在自然界中很多微生物可以产生几丁质酶。几丁质酶具有广泛的生理功能，在生物防治方面得到了普遍应用；几丁质酶对杀虫剂具有增效作用，可加速害虫的致病过程；几丁质酶还可抑制病原真菌的生长。但是，到目前为止，未发现利用几丁质酶控制蜜蜂狄斯瓦螨的报道。
发明内容：
本发明提供了一种具有杀狄斯瓦螨活性的几丁质酶ChiC1及其在杀狄斯瓦螨中的应用。
本发明通过以下技术方案实施的：
本发明从粘质沙雷氏菌Serratia marcescens GEI的基因组DNA中克隆出一段基因碱基序列，应用原核表达载体pET-32a(+)，在大肠杆菌中表达该基因，对该基因的编码蛋白进行纯化、复性、生物测定表明，该基因的编码蛋白对狄斯瓦螨具有比较强的毒性，该编码蛋白的酶活力为14.7U/mL的条件下，沾染该蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率为25％。经过测序分析表明，该基因的开放读码框含有1443个碱基，序列如SEQ ID NO.1所示，BLAST分析表明该基因与登录号为AB019238.1的粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiC1的相似性为95％，由此认为该基因属于几丁质酶chiC1基因类别，是一个几丁质酶chiC1基因的新序列。
本发明所述的几丁质酶ChiC1，由于具有杀狄斯瓦螨的活性，可以作为一种制剂使用，或者将该几丁质酶基因转入对环境无害的工程菌中，或者转入蜜蜂中，来防治蜜蜂的螨害。
从本发明分离的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens GEI中克隆得到的新的几丁质酶chiC1基因，该基因的编码蛋白几丁质酶ChiC1对狄斯瓦螨具有较高的毒性，几丁质酶活力为14.7U/mL的条件下，沾染该蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率为25％。本发明的实现为实现对环境友好的蜜蜂螨害防治新技术提供了途径，本发明所述的几丁质酶ChiC1，可以作为一种制剂使用，或者将该几丁质酶基因转入对环境无害的工程菌中，或者转入蜜蜂中，从而为实现安全、无毒的生物防治蜜蜂的螨害提供了途径。
本发明所述的沙雷氏菌GEI Serratia marcescens GEI是本发明人从蜜蜂工蜂中肠中分离得到，于2009年5月6日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学)，其保藏编号为CCTCC M 209097。
附图说明：
图1：从粘质沙雷氏菌株基因组中扩增得到chiC1基因，1.chiC1 PCR产物；M.DL2000 DNAMarker。
图2：SDS-PAGE分析几丁质酶ChiC1重组蛋白的诱导表达：1.未诱导的BL21(DE3)/pET-32a(+)重组菌；2.IPTG诱导的BL21(DE3)/pET-32a(+)重组菌；3.未诱导的BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiC1；4.IPTG诱导的BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiC1重组菌。
图3：SDS-PAGE分析复性后的几丁质酶ChiC1重组蛋白，1.IPTG诱导的BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiC1重组菌的包涵体蛋白的复性蛋白；2.IPTG诱导的BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiC1重组菌。
图4是不同浓度的NGA在A＝550nm条件下的吸光度值的标准曲线。
图5是不同浓度的BSA在A＝595nm条件下的吸光度值的标准曲线。
图6几丁质酶ChiC1对狄斯瓦螨的生物测定结果，A.几丁质酶ChiC1；B.蛋白溶解液；C.透析液。
具体实施例子：
在下面的实施例中进一步说明本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例1
本发明所述的粘质沙雷氏菌株Serratia marcescens GEI是本发明人从从化中蜂工蜂中肠中分离得到，此菌于2009年5月6日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学)，保藏编号为CCTCC M 209097。
一、几丁质酶ChiC1的编码基因的克隆和测序。
1.粘质沙雷氏菌Serratia marcescens GEI的培养
从LB平板上挑取粘质沙雷氏菌Serratia marcescens GEI单菌落接种至4mL LB液体培养基中，常规振荡培养过夜(28℃，200r/min)；培养物按3％接种量转接至含10mL培养基的100mL锥形瓶，培养至OD620≈2。
2.细菌基因组DNA的提取
应用常规试剂盒(TIANGEN细菌基因组提取试剂盒，北京TIANGEN公司)提取粘质沙雷氏菌株GEI基因组DNA。
3.引物的设计
根据国外已克隆的粘质沙雷氏菌的几丁质酶基因：chiC1(登录号：AB019238.1)序列，以粘质沙雷氏菌菌株GEI基因组DNA为模板，以Primer Premier 5.0和DNASTAR软件辅助，分别设计的引物。
引物C：For：5’-GGATCCATGAGCACAAATAACA-3’
Rev：5’-GAGCTCTTAGGCGATGAGCTGCCACAGGGTG-3’
注：划线标注的分别是限制性酶切位点BamHI，Sac I
4.PCR扩增几丁质酶chiC1基因
以粘质沙雷氏菌基因组为模板，用上述引物C，进行PCR扩增，PCR反应体系及循环设定如下：
ddH₂O                                   18.7μL
10×PCR buffer                          2.5μL
dNTP Mix(10mmol/L)                      0.5μL
Primer-for(20μmol/L)                   1μL
Primer-rev(20μmol/L)                   1μL
DNA模板                                 1μL
Easy-A high fidelity cloning enzyme     0.3μL
                                                            
Total volume                            25μL
充分混匀，按以下程序进行PCR扩增：94℃变性5min进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环后于72℃继续延伸10min。反应完成后，以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如附图1所示，扩增得到了目的条带。
5.回收几丁质酶chiC1基因片段与克隆载体的体外连接。
将上一步骤扩增到的目的基因片段按照常规方法回收，然后与pMD18-T Vector连接，连接步骤如下。
(1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μL。
pMD18-T Vector                          1μL
DNA回收片段                             1μL
ddH₂O                                   3μL
                                                             
Total volume                            25μL
(2)加入5μL(等量)的Ligation Mix。
(3)16℃反应30分钟。
注)①室温(25℃)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
6.连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞
(1)取出1管感受态细胞50μL，于冰上缓慢旋转融化；
(2)加入全部(10μL)待转化质粒(连接产物)，轻轻旋转，将质粒与感受态细胞混合均匀，冰浴30min；
(3)42℃热休克45s，不要摇动离心管；
(4)立即将离心管转移到冰上，放置1min；
(5)加入450μL平衡到室温的无菌SOC培养基；
(6)于37℃，200r/min水平振荡1h；
(7)取25-100μL不同体积的菌液铺于预热的LB平板(含有常规浓度的Amp、IPTG、X-Gal)上，37℃倒置培养过夜。
7.几丁质酶chiC1基因阳性克隆鉴定和测序
在平板上对大肠杆菌转化子进行抗性筛选，挑取克隆，经应用引物C，进行PCR初步鉴定，其含有大小基本与目的片段几丁质酶chiC1基因符合的大肠杆菌阳性转化子命名为转化子pMD18-T-chiC1。将此转化子pMD18-T-chiC1的菌液1mL，委托上海英俊生物技术有限公司测序，得到编码几丁质酶ChiC1的核苷酸序列，该序列如SEQ ID No.1所示，大小为1443bp，推测蛋白为51.9kDa，BLAST分析表明该基因与登录号为AB019238.1的粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiC1的相似性为95％，由此认为该基因属于几丁质酶chiC1基因类别，是一个几丁质酶chiC1基因类的新序列。
二、几丁质酶chiC1基因的原核表达和表达蛋白的纯化、复性和酶活性测定。
1.几丁质酶基因在E.coli BL21(DE3)中的表达
(1)从重组的转化子pMD18-T-chiC1中提取重组质粒pMD18-T-chiC1。(应用TIANGEN质粒小提取试剂盒，北京TIANGEN公司，按照试剂盒上的操作步骤提取)。
(2)重组质粒pMD18-T-chiC1的酶切。
pMD18-chiC1建立如下酶切反应体系：
ddH₂O                   31μL
10×K Buffer            3μL
pMD18-T-chiC1           20μL
BamH I                  3μL
Sac I                   3μL
                                            
Total volume            60μL
(3)基因片段chiC1与pET-32a(+)表达载体的连接。
胶回收酶切片段，将胶回收的目的基因片段与载体DNA以适当的比例建立连接反应，以达到最佳连接效果。T4DNA Ligase应最后加入，轻轻混匀反应体系，16℃连接过夜。反应体系如下：
10×T4DNA Ligase Buffer    18.5μL
pET-32a(+)                 0.5μL
基因片段chiC1              5μL
T4 DNA Ligase              1μL
                                            
Total volume               25μL
(4)连接产物常规转化E.coli BL21(DE3)。
(5)大肠杆菌转化子的阳性克隆鉴定。
对长出的转化子进行快速筛选，以引物C作为引物
ddH₂O                      18.7μL
10×PCR buffer             2.5μL
dNTP Mix(10mmol/L)         0.5μL
Primer-for(20μmol/L)      1μL
Primer-rev(20μmol/L)      1μL
菌液                       1μL
Taq DNA Polymerase         0.3μL
                                          
Total volume               25μL
充分混匀，按以下程序进行PCR扩增：94℃变性3min进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃继续延伸10min。反应完成后，以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在合适大小(1443bp)处出现特异性扩增条带的样品即为阳性克隆组合，保存阳性克隆并编号，命名为克隆子pET-32a(+)-chiC1。
(6)IPTG诱导目的蛋白的大量表达。
取活化后的重组大肠杆菌克隆子pET-32a(+)-chiC1的培养液，按体积比3％比例接种至新鲜LB(Car^r)培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，200r/min诱导培养8h。
(7)表达产物的SDS-PAGE分析。
重组大肠杆菌克隆子pET-32a(+)-chiC1的培养液，按3％比例接种至新鲜LB(Car^r)培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，200r/min诱导培养8h。分别取0.2mL克隆子pET-32a(+)-chiC1诱导液至1.5mL洁净离心管中，离心得菌体，加入50μL双蒸水与50μL 2×SDS-PAGE上样缓冲液等体积混合，沸水浴10min，进行SDS-PAGE电泳检测几丁质酶chiC1基因在大肠杆菌中的表达，对照为转入空载体pET-32a(+)的E.coli BL21(DE3)菌(未用IPTG诱导和用IPTG诱导)，以及未用IPTG诱导的克隆子pET-32a(+)-chiC1[BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiC1]，由于载体pET-32a(+)其自带编码一个20.4kDa的蛋白标签，因此经过IPTG的诱导的克隆子pET-32a(+)-chiC1的表达蛋白大概为72.3kDa，如图2所示，克隆子pET-32a(+)-chiC1经IPTG诱导后成功表达了几丁质酶ChiC1，而其他三个对照没有表达几丁质酶ChiC1。
2、重组表达几丁质酶ChiC1的纯化和复性
因为表达的重组蛋白几丁质酶ChiC1在大肠杆菌中是以不溶性的包涵体形式存在，而包涵体往往是没有生物活性的，所以需要对表达的重组蛋白进行复性。Invitrogen公司的蛋白复性试剂盒(Protein Refording Kit)能够在弱酸性条件下溶解大肠杆菌中的包涵体重组蛋白，并在中性的环境中对溶解的蛋白透析两次：第一次利用加入还原剂的透析液促使蛋白二硫键的正确形成，第二次除去多余的还原剂。蛋白复性试剂盒已经成功的应用于细菌的碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和葡糖苷酸酶的重组蛋白，是一个成熟的蛋白复性试剂盒。本实施例使用的就是invitrogen公司的蛋白复性试剂盒(Protein Refording Kit)，具体操作过程按照试剂盒的操作说明书操作，其操作步骤如下：
(1)制备包涵体
①取上述含目的蛋白菌液，4℃，6500rpm离心15min，弃上清；
②将沉淀完全重悬于0.1倍菌液体积的1×IB洗涤液，反复混匀；
③在细胞裂解的过程中将重悬的溶液置于冰上以防止蛋白受热裂解，可选择超声波裂解或French Press法裂解细胞。
④细胞裂解后在混和液中迅速加入蛋白酶抑制剂，每40mL混和液加入5mL的含有EDTA的蛋白酶抑制剂Cocktail Set II或1mL的蛋白酶抑制剂Cocktail Set III；
⑤10000rpm离心10min收集包涵体；
⑥弃上清，将沉淀(内有包涵体)用0.1倍菌液体积的1×IB洗涤液完全重悬；
⑦重复步骤5收集沉淀；
⑧将上述沉淀再次用0.1倍菌液体积的1×IB洗涤液完全重悬，并将重悬液转移至重量已知的干净的离心管中；
⑨10000rpm离心10min收集包涵体，弃上清，并将离心管倒置在纸巾上以完全除去多余的液体；
⑩离心管称重，减去管中以得到包涵体的净重。一般来说，OD600为3时收集的菌液，并且不溶性蛋白在细胞中的含量为10-40％时，每毫升菌液中有1-4mg的包涵体。
(2)蛋白的溶解和重新折叠
①根据包涵体的重量计算所需的溶解液量，溶解包涵体使其在溶解液中的浓度为10-20mg/ml，溶解液按如下配方在室温下配制：
10×IB Solubilization buffer    5mL
ddH₂O                           44.5mL
30％N-lauroylsarcosine          0.5mL
DTT                             50μL
                                                     
Total                           50mL
②将配制的溶解液加入收集有包涵体的离心管中，轻微混和。大的片断用枪头反复打碎；
③室温静置15min；
④室温10000rpm离心10min离心，转移上清(内有溶解蛋白)于干净的离心管中(避免碎片)。
(3)透析
①透析袋处理，过程如下：
a把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段；
b在大体积的含有2％(W/V，质量体积百分比浓度)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH 8.0)的液体中将透析袋煮沸10min；
c用蒸馏水彻底清洗透析袋；
d放在1mmol/LEDTA(pH 8.0)中将其煮沸10min。冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋必须戴手套；
e用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净；
②准备透析液(为样品的50倍，如样品量为15mL，则需透析液750mL，因透析两次故共需透析液1.5L)，按以下配方配制：
50×IB dialysis Buffer    30mL
ddH₂O                     1.5L+
(1M DTT)                  150μL
                                          
Total                     1.5L
③4℃透析至少3h以上，换新的透析液继续透析3h以上；
④按上步骤制备透析液，但不加DTT；
⑤用不加DTT的透析液再透析一次。
(4)氧化还原以促使二硫键的形成
为促使蛋白的二硫键的正确形成，可以在透析液中加入氧化剂和还原剂继续透析，经常用的氧化还原剂为氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽，比较经济的方法是使用CuSO₄或NaSeO₃，但使用这种方法所形成的不正确的二硫键比前者高。因此本发明中使用氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽。
①如上制备透析液，再加入氧化还原剂(其中所述的氧化还原剂含有还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽，其浓度分别为1mM和0.2mM)，于4℃保存；
②4℃透析蛋白过夜；
③如有必要，继续于室温或37℃透析蛋白以提高二硫键的形成率，最终得到复性蛋白。
另有一种替代的方法就是配制氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽的浓缩液，并直接加到目标蛋白中，反应后透析再除去多余的氧化还原剂。复性完成后对复性蛋白进行SDS-PAGE分析，如图3所示，表明复性蛋白是较纯的几丁质酶ChiC1。
3.酶活性的测定方法。
酶活力测定采用改良的还原糖法，其原理为可溶性壳聚糖酶解后释放出还原糖，还原糖与3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应变色，于分光光度计550nm处测定其光吸收值，以N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)为标准糖，制作标准曲线。
酶活力(单位U)定义为：在37℃反应条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。
(1)NAG标准曲线的绘制
取7支25mL刻度的试管，按表加入各种试剂，振荡混匀，在沸水浴加热10min，随即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加20mL水稀释，混匀，在550nm波长下测OD值。以OD550值为纵坐标，NAG量(mg)为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图4所示。