荧光假单胞杆菌防治烟草角斑病地应用 【技术领域】
本发明涉及一种荧光假单胞杆菌防治烟草角斑病的应用，属于微生物领域。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物之一。烟草角斑病是烟草主要的细菌性病害，在全国各烟区均有发生，每年均造成一定程度的危害和经济损失。
目前该病害的防治方法主要以化学农药为主，然而化学农药使用带来的农药残留、污染环境等问题正日益受到全世界的关注，发展绿色农业是农业可持续发展的需要，也是全球农业发展的趋势和走向。
“无公害烟叶”、“烟草可持续发展”等农业可持续发展战略的实施，引起了人们对化学农药的潜在危险和危害的重视。因此，符合环保、健康，可持续发展理念的高效、低毒、低残留、与环境相容的生物防治，就成为当前无公害农业生产研究的主题。
本申请人已经申请的中国专利，公开号为CN101372680A，发明名称为“一株防治烟草野火病的荧光假单胞杆菌”中公开了一株荧光假单胞杆菌PF7-5，其保藏登记号CGMCC No.2069，并且公开了该菌株在防治烟草野火病中的应用。通过试验发现该菌株还具有防治烟草其它病害的作用。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供荧光假单胞杆菌PF7-5CGMCC No.2069在制备防治烟草角斑病药物中的应用，该菌株对烟草生长无危害且对烟草角斑病具有有显著防效。
本发明所涉及的荧光假单胞杆菌PF7-5经鉴定确定为荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)的一个株系，定名为PF7-5，已于2007年5月31日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCC No.2069。保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
该菌株的形态特征如下：革兰氏阴性菌，极生鞭毛，可游动，大小0.5-1.0um×1.5-5.0um。LB培养基上菌落金黄色，氧化酶反应阳性，精氨酸双水解酶阳性，产生黄绿色荧光色素；对氨苄青霉素、氯霉素具有较强的抗性。在pH值低于4及大于10的条件下细菌几乎不能生长，最适pH值为7。最佳培养基成份：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10ml，琼脂15g。最适生长温度26-28℃。
本申请人已经申请的中国专利，公开号为CN101372680A，发明名称为“一株防治烟草野火病的荧光假单胞杆菌”中公开了荧光假单胞杆菌PF7-5，其保藏登记号CGMCCNo.2069，并且公开了该菌株在防治烟草野火病中的应用。通过试验发现该菌株还具有防治烟草角斑病的作用。
本发明所述的荧光假单孢杆菌PF7-5是从烟草根际土壤中分离得到。该菌株的代谢产物对烟草角斑病具有显著抑制作用。
培养条件：
(1)斜面培养：培养时间2-3天，培养基成分(1升)：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10ml，琼脂15g。pH值7.0，最适生长温度26-28℃。
(2)种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的但菌落接入种子培养液中，26℃摇菌16-18个小时，转速200rpm。种子培养液成分(1升)：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10ml。pH值7.0。
(3)发酵：按5％的的接种量接入种子培养基，振荡培养3天(72小时)，转速200rpm。培养液成分同上。
本发明的优点是：本发明所述的荧光假单胞杆菌PF7-5为一种生防细菌，它能够通过微生物发酵途径获得对烟草角斑病具有显著防效的代谢产物，具有良好的生物农药开发前景。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
【附图说明】
图1为本发明菌株的光镜照片，图中细胞为杆状，并具有一条或两条极生鞭毛。
【具体实施方式】
实施例1：荧光假单胞杆菌PF7-5(CGMCC No.2069)的培养
培养条件：
(1)斜面培养：培养时间2-3天，培养基成分(1升)：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10mL，琼脂15g。pH值7.0，温度26℃。
(2)种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的但菌落接入种子培养液中，26℃摇菌16-18个小时，转速200rpm。种子培养液成分(1升)：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10mL。pH值7.0。
(3)发酵：按5％的的接种量接入种子培养基，振荡培养3天(72小时)，转速200rpm。培养液成分同上。
实施例2：荧光假单胞杆菌PF7-5(CGMCC No.2069)对烟草角斑病室内拮抗试验
上述荧光假单胞杆菌PF7-5发酵液2000rpm离心后80℃15分钟灭活，同时对普通细菌LBA4404的代谢产物进行灭活。试验进行如下处理：
A：CGMCC No.2069(PF7-5)10mL+100μL角斑病(烟草病原细菌)+40mL液体LB；
B：普通细菌代10mL+100μL角斑病+40μL液体LB；
C：农用链霉素+100μL角斑病+50mL液体LB；
D：角斑净+100μL角斑病+50mL液体LB；
E：对照，100μL角斑病+50mL液体LB。
各处理25℃过夜振荡培养。次日测OD600的吸光值(用各处理的备用样进行调零)，计算抑菌率。抑菌率＝(1-(OD处理/OD对照)×100。
实验结果见下表1，结果表明荧光假单胞杆菌PF7-5发酵液对烟草角斑病的抑菌效果达到71％。
表1.荧光假单胞杆菌PF7-5发酵液对烟草角斑病的抑菌效果
A B C D E OD600 0.154 0.432 0.317 0.019 0.526 抑菌率％ 71 18 40 96
实施例3：荧光假单胞杆菌PF7-5(CGMCC No.2069)对烟草角斑病田间防效试验
试验于牡丹江烟草科学研究所试验场进行，品种为K326。试验处理如下：
A：CGMCC No.2069(P.fluorescens7-5)活菌(菌液8000rpm离心后，菌体溶于无菌水中)；B：CGMCC No.2069(P.fluorescens7-5)代谢产物(菌液8000rpm离心后上清液)；C：农用链霉素4000倍；D：角斑净1000倍；E：水。
烟草田间旺长期每隔4天分别喷施3次A、B处理，然后接种烟草角斑病菌菌液，接种烟草角斑病菌6小时后喷施进行C、D、E处理。跟踪调查烟草角斑病发病情况，每株烟由下至上调查10片叶。计算各处理病情指数以及抑菌效果。烟草角斑病病害严重度分级标准(以叶片为单位)：
0级：全叶无病。
0.5级：病斑面积占叶片面积的1％以下。
1级：病斑面积占叶片面积的1％～5.0％。
2级：病斑面积占叶片面积的5.0％～10％。
3级：病斑面积占叶片面积的10.0％～20％。
4级：病斑面积占叶片面积的20％以上。
病情指数＝∑(病害等级×该级叶数)/(调查叶数×最严重等级)×100；抑菌效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。
实验结果见表2，结果表明荧光假单胞杆菌PF7-5对烟草角斑病的抑菌效果达到89.4％。
表2.荧光假单胞杆菌PF7-5田间对烟草角斑病的抑菌试验结果
处理 调查株数 感病叶数 最高病级 发病率％ 病情指数 防效(％) A 12 15 1 5.6 2.8 89.4 B 12 26 2 9.8 6.7 74.6 C 12 59 3 22.3 19.5 26.1 D 12 12 1 4.5 1.9 92.8 E(CK) 12 70 3 26.5 26.4