表达谷氨酰胺转胺酶的重组菌及其应用 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及表达谷氨酰胺转胺酶的重组菌及其应用。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，又称转谷氨酰胺酶，EC 2.3.2.13，简称TG)广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，能够催化蛋白质分子之间或之内的酰基转移反应，通过这些反应，可在各种蛋白质分子之间或者之内引起聚合和交联。其中微生物来源的谷氨酰胺转胺酶因其对Ca2+无依赖性、广泛的底物范围和相对低廉的生产成本，成为谷氨酰胺转胺酶研究和应用的热点。
谷氨酰胺转胺酶在食品加工中有广泛的应用：①通过催化蛋白质分子之间发生的交联，改善蛋白质的溶解性、起泡性和乳化性等重要性能；②将某些人体必需氨基酸(如赖氨酸)共价交联到蛋白质上，防止美拉德反应对氨基酸的破坏，提高蛋白质的营养价值；③用该酶交联过的酪蛋白脱水后可形成耐热、耐水性的薄膜，能够用作食品包装材料；④用于包埋脂类或脂溶性物质，催化蛋白质分子的去酰胺化。谷氨酰胺转胺酶在医药领域也有很好的应用前景：谷氨酰胺转胺酶(即人体凝血因子XIII)在凝血过程中能够加固纤维结构；在表皮角质化过程中形成角化层；加速伤口愈合；参与受体介导的蛋白质和多肽激素的胞吞作用等。这些生理功能也说明谷氨酰胺转胺酶已成为医药工业研究者所瞩目的焦点。最近在化妆品、纺织工业和组织工程等领域也不断有新的应用出现。
谷氨酰胺转胺酶的原产菌株主要有茂原链霉菌、吸水链霉菌等。为了发挥模式微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)等易培养、发酵工艺成熟和生产周期短的优点，近些年不断有用模式宿主异源表达谷氨酰胺转胺酶的报道，如大肠杆菌、乳酸链乳球菌(Lactococcus lactis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。但大肠杆菌生产的谷氨酰胺转胺酶没有活性，仍需体外折叠复性。乳酸链乳球菌和谷氨酸棒状杆菌的谷氨酰胺转胺酶产量太低，无法与原产链霉菌株相比。
甲醇营养型酵母毕赤酵母是近二十年发展起来的一种高效异源蛋白表达系统，它具有以下优良特点：①具有真核表达系统所具有的翻译后修饰功能，特别适于真核来源蛋白的表达；②成熟的载体和启动子系统，可根据需要选择相应的启动子，其中醇氧化酶基因启动子应用最多，它启动强度大且受甲醇严格调控；③成熟的高密度培养技术，过程易放大；④高效的蛋白分泌，菌株自身分泌胞外蛋白量少，易于外源蛋白的分离纯化；5)外源基因整合到酵母染色体中，因而基因遗传稳定性高，无需添加抗性压力。基于上述优点，目前已有近600种蛋白在该系统中成功表达，毕赤酵母已成为蛋白分泌表达的首选系统之一。Hiroya Yurimoto等曾报道用毕赤酵母表达系统分泌表达茂原链霉菌来源的谷氨酰胺转胺酶，无论是直接表达成熟谷氨酰胺转胺酶、谷氨酰胺转胺酶前体还是在pro序列和成熟谷氨酰胺转胺酶之间加入赖氨酸-精氨酸间隔子，其摇瓶酶活都小于0.025u/ml。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种重组菌。
本发明提供的重组菌是含有谷氨酰胺转胺酶前体基因和枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因SAM-P45的重组甲醇营养型酵母菌。
上述谷氨酰胺转胺酶前体基因的编码序列如GenBank号为AF531437的自5’端的第671-1798位所示；所述枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因SAM-P45的编码序列是GenBank号为D83672的自5’端的第14-3322位所示。
上述枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因SAM-P45是通过重组表达载体A导入甲醇营养型酵母菌中，得到重组甲醇营养型酵母菌A；
上述重组表达载体A是将所述枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因SAM-P45插入pPICZα的多克隆位点得到的重组表达载体。
上述谷氨酰胺转胺酶前体基因是通过重组表达载体B导入重组甲醇营养型酵母菌A中，得到本发明保护的重组菌；
上述重组表达载体B是将所述谷氨酰胺转胺酶前体基因插入载体pAO815alpha的多克隆位点得到的重组表达载体；
所述载体pAO815alpha是将pPICZα用SacI和EcoRI双酶切得到的小片段与经同样双酶切过的pAO815连接得到的重组载体。
任一上述甲醇营养型酵母菌是巴斯德毕赤酵母菌。
所述巴斯德毕赤酵母菌是巴斯德毕赤酵母菌GS115。
上述重组菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GSMTGB，已于2009年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3249。
上述的重组菌在产谷氨酰胺转胺酶中的应用也属于本发明的保护范围之内。
上述应用是指将任一所述的重组菌在BMMY培养基中发酵培养；所述发酵培养条件是28-30℃，pH为4-5，转速为200r/min。
任一所述的重组菌在食品加工中的应用也属于本发明的保护范围之内。
本发明采用毕赤酵母作为宿主菌株分泌表达谷氨酰胺转胺酶。由于pro序列是谷氨酰胺转胺酶成熟并产生活性所必须的，因此将谷氨酰胺转胺酶前体蛋白序列序列置于强启动子AOX1的调控之下，并与分泌信号肽α-mating因子的序列连接，使酵母细胞首先能大量分泌表达谷氨酰胺转胺酶前体。前体蛋白还需要在酵母胞外通过水解酶作用下，将自身的pro序列切割掉，最终转化为有活性的成熟的酶。虽然毕赤酵母自身分泌水解酶，但专一性切割pro序列的酶活性很低。为了提高毕赤酵母体外(发酵液中)谷氨酰胺转胺酶前体的切割效率，本发明将能够高效酶切pro序列的枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因SAM-P45连接到分泌表达载体，并将载体转化毕赤酵母，使之与谷氨酰胺转胺酶前体同时表达。这样，谷氨酰胺转胺酶前体在发酵液中被同时分泌表达地SAM-P45水解酶切割，从而可高效表达成熟的谷氨酰胺转胺酶。实验证明：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GSMTGB在诱导发酵72h时，谷氨酰胺转胺酶的酶活达0.43u/ml。
【附图说明】
图1为分泌型表达载体pAO815alpha的构建示意图。
图2为重组表达载体pAOα-promtg的构建示意图。
图3为重组表达载体pPICZ-SAMP45的构建示意图。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、表达谷氨酰胺转胺酶的酵母菌株的制备及其功能检测
一、表达谷氨酰胺转胺酶的菌株的制备
1、含有谷氨酰胺转胺酶前体基因的重组表达载体的构建
1)茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)染色体DNA的抽提
将-70℃保存的茂原链霉菌CPCC 200365(购自中国药用微生物菌种保藏管理中心)孢子悬液或斜面菌丝体接种至5mlTSB培养基中(20g/L可溶性淀粉、20g/L蛋白胨、2g/L酵母粉、2g/L硫酸镁、2g/L磷酸二氢钾、2g/L磷酸氢二钾)，30℃震荡培养48小时。取3ml菌液离心收集菌丝体，并用500μlSTE缓冲液(10mM Tris-Cl，pH8.0、0.1mM NaCl、1mM EDTA，pH8.0)洗涤两次。用500μlSTE使菌丝体充分悬浮，加溶菌酶使其终浓度为2mg/ml，此时菌体悬浮液变为半透明胶状，加入250μl2％SDS，震荡混匀。然后加入250μl中性苯酚/氯仿(苯酚∶氯仿＝25∶24)充分混匀。10000rpm离心5分钟，将上清液转移至新的Eppendorf管中，加Rnase使其终浓度为20-40μg/ml，37℃保温30分钟。重复用中性苯酚/氯仿抽提3-4次，直到两相界面不再有变性蛋白存在，再用氯仿抽提两次除去苯酚。向水溶液中加入1/10体积3mol/LNaAC和等体积的异丙醇，混匀后室温放置30分钟。10000rpm离心5分钟，70％乙醇洗涤一次，真空抽干后溶于100-200μlTE缓冲液(10mM Tris-Cl，pH8.0、0.1mM NaCl、1mM EDTA，pH8.0)备用。
2)谷氨酰胺转胺酶前体基因的PCR扩增
根据GenBank中茂原链霉菌来源的谷氨酰胺转胺酶前体基因(核苷酸序列如GenBank号为AF531437的自5’端的第671-1798位所示)，设计PCR引物：
引物1：5’CTCGAGAAAAGAGACAATGGCGCGGGGGAAGA 3’
引物2：5’TCTAGAATTCACGGCCAGCCCTGCTTTACC 3’
在α-mating因子信号肽编码序列下游有一个XhoI酶切位点(CTCGAG，对应氨基酸为Leu-Glu)，其后紧跟一个Kex2蛋白酶识别位点(AAAAGA，对应氨基酸序列Lys-Arg)，因此，引物1的设计是在谷氨酰胺转胺酶基因之前引入XhoI位点和Kex2蛋白酶识别位点序列。通过该设计，即可将谷氨酰胺转胺酶基因直接连接在信号肽序列之后，这样蛋白翻译后，在毕赤酵母自身Kex2蛋白酶的作用下，即可切表达出氨基酸不变的目的蛋白(而不会因酶切位点的原因引入额外的氨基酸残基)。引物2包含终止密码子TGA，并引入一个EcoRI酶切位点。
以步骤1)提取的茂原链霉菌染色体DNA为模板，加入引物1、引物2、Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，进行降落PCR(touchdown PCR)，反应条件如下：94℃5min；94℃30s，65-55℃30s，72℃50s，每个循环降1℃，共10个循环；94℃30s，60℃30s，72℃50s，共25个循环。
PCR扩增得到1.1kb的片段，命名为promtg，用Omega纯化试剂盒纯化后，连接入pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，得到重组载体pMD18-promtg，将pMD18-promtg送北京奥科进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有GenBank号为AF531437的自5’端的第671-1798位所示的核苷酸序列。
3)中间载体的构建
将pPICZα(购自Invitrogen公司)用SacI/EcoRI双酶切，得到小片段，将小片段与同样用SacI/EcoRI消化过的pAO815载体(购自Invitrogen公司)连接，即得到基于pAO815的分泌型载体pAO815alpha(构建过程如图1所示)。
4)含有谷氨酰胺转胺酶前体基因的重组表达载体的构建
将步骤2)验证正确的pMD18-promtg用XhoI/EcoRI酶切后，与步骤3)得到的分泌型载体pAO815alpha连接，即可得到含有谷氨酰胺转胺酶前体基因的重组表达载体pAOα-promtg(图2)。将得到的重组表达载体pAOα-promtg转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有10μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基筛选出所需重组子并进行测序分析，经过测序鉴定，证明重组表达载体pAOα-promtg的序列和结构正确。
2、含有枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因SAM-P45的重组表达载体的构建
1)白色浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)染色体DNA的抽提
提取自白色浅灰链霉菌染色体DNA，提取方法同步骤1中茂原链霉菌染色体DNA的抽提。
2)枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因SAM-P45的PCR扩增
根据GenBank中白色浅灰链霉菌来源的枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因(GenBank号为D83672的自5’端的第14-3322位所示)，设计PCR引物：
引物1：5’CTCGAGAAAAGAAACGGGGAGAACAGCACG 3’
引物2：5’CTACTTGCCGTAGTAGGCGTTGTGG 3’
引物1的设计原理同步骤1，通过该设计，即可将谷氨酰胺转胺酶基因直接连接在信号肽序列之后，这样蛋白翻译后，在毕赤酵母自身Kex2蛋白酶的作用下，即可切表达出氨基酸不变的目的蛋白(而不会因酶切位点的原因引入额外的氨基酸残基)。引物2包含终止密码子TAG。
以白色浅灰链霉菌CGMCC 4.565(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)染色体DNA为模板，加入引物1、引物2、Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，进行降落PCR(touchdown PCR)，反应条件如下：94℃5min；94℃30s，65-55℃30s，72℃50s，每个循环降1℃，共10个循环；94℃30s，60℃30s，72℃50s，共25个循环。
PCR扩增得到3.2kb的片段，命名为SAM-P45，用Omega纯化试剂盒纯化后，连接入pMD18-T载体，得到重组载体pMD18-SAM-P45，将pMD18-SAM-P45送北京奥科进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有GenBank号为D83672的自5’端的第14-3322位所示的核苷酸序列。
3)含有枯草杆菌蛋白酶类水解酶基因SAM-P45的重组表达载体的构建
将步骤2)中验证正确的pMD18-SAM-P45用XhoI/XbalI酶切后(由pMD18-T载体引入目的片段的XbaI位点)，与经同样酶切过的pPICZα连接，即可得重组表达载体pPICZ-SAMP45(图3)。将得到的重组表达载体pPICZ-SAMP45转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有25μg/ml Zeocin的LB培养基筛选出所需重组子并进行测序分析，经过测序鉴定，证明重组表达载体pPICZ-SAMP45的序列和结构正确。
3、表达谷氨酰胺转胺酶的酵母菌株的获得
1)电转化巴斯德毕赤酵母细胞的制备
接种毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen，Ca.18100)于500ml YPD培养基(10克/升酵母膏、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、15克/升琼脂糖)，30℃，200r/min培养至OD600＝1.3-1.5。4℃，1,500g离心5min收集菌体，分别用500ml、250ml预冷的灭菌水和20ml预冷的1mol/L山梨醇各洗一次。每次洗后均在4℃，1,500g下离心5min收集菌体，最后用1ml预冷的1mol/L山梨醇悬浮，即获得电击感受态细胞。
2)重组表达质粒pPICZ-SAMP45电转化酵母细胞
将步骤2中构建正确的重组表达质粒pPICZ-SAMP45约10ug用BstXI酶切线性化，乙醇沉淀回收线性DNA并溶解于10ul无菌水中。将上述线性化DNA与80ul GS115感受态细胞混合，转入预冷的0.2cm电转杯中。采用美国BIO-RAD公司电转化仪，根据所使用电转化仪预设的毕赤酵母参数进行电击。电击结束后立即加入1ml预冷的1M山梨醇至电击杯中，然后将电击杯中的溶液全部转移至一无菌离心管中，37℃孵育1-2h，取500ul涂布加有100μg/ml抗生素Zeocin的YPD平板，于30℃倒置培养2-4天直至菌落出现。至此，得到含pPICZ-SAMP45的重组毕赤酵母。
3)重组表达载体pAOα-promtg的电转化酵母细胞获得单拷贝菌株
将步骤1中构建正确的重组表达载体pAOα-promtg约以10ug用StuI酶切线性化，乙醇沉淀回收线性DNA并溶解于10ul无菌水中。以步骤2)得到的含pPICZ-SAMP45的重组毕赤酵母为出发菌株制备感受态。将上述线性化的DNA与含pPICZ-SAMP45的重组毕赤酵母感受态细胞混合，电转操作同上。电击后立即加入1ml预冷的1M山梨醇至电击杯中，然后将电击杯中的溶液全部转移至一无菌离心管中，直接取200-300ul菌液涂布MD平板(13.4克/升YNB、4×10-4克/升生物素、10克/升葡萄糖、15克/升琼脂糖)。30℃倒置培养2-4天直至菌落出现。至此，获得表达谷氨酰胺转胺酶的单拷贝promtg的菌株。
4)多拷贝菌株的构建
A、2拷贝promtg的菌株的获得
将步骤1中得到的重组表达载体pAOα-promtg用BamHI/BglII双酶切，回收BamHI-promtg-BglII片段，连接入表达载体pAOα-promtg的BamHI位点，即可得2拷贝promtg的表达载体pAOα-promtg2；将pAOα-promtg2按照步骤3中的步骤3)提供的方法电转化步骤2)得到的含pPICZ-SAMP45的重组毕赤酵母，至此，获得表达谷氨酰胺转胺酶的2拷贝promtg的菌株。
B、3拷贝promtg的菌株的获得
将步骤A得到的重组表达载体pAOα-promtg2用BamHI/BglII双酶切，回收BamHI-promtg-promtg-BglII片段，连接入表达载体pAOα-promtg的BamHI位点，即可得3拷贝promtg的表达载体pAOα-promtg3；将pAOα-promtg3按照步骤3中的步骤3)提供的方法电转化步骤2)得到的含pPICZ-SAMP45的重组毕赤酵母，至此，获得表达谷氨酰胺转胺酶的3拷贝promtg的菌株。
二、功能检测
1、重组菌的发酵培养
将步骤一中获得的表达谷氨酰胺转胺酶的单拷贝promtg的菌株、2拷贝promtg的菌株和3拷贝promtg的菌株接种于25ml BMGY液体培养基中(10克/升酵母精提物、20克/升蛋白胨，121℃灭菌20min后，温度降至室温时加入13.4克/升YNB、4×10-4克/升生物素、10克/升甘油)，于30℃，200r/min摇床培养48h，OD600达10-20，3000r/min离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体1-2次。将菌体用BMMY诱导培养基(10克/升酵母精提物、20克/升蛋白胨，121℃灭菌20min后，温度降至室温时加入13.4克/升YNB、4×10-4克/升生物素、0.5％甲醇)，稀释至OD600＝10，用4层纱布代替棉花塞，于30℃，200r/min摇床培养。每天补加甲醇至终浓度为0.5％(V/V)。
2、胞外酶活的测定
在30℃培养3天后，吸取发酵液1mL于离心管中，以10000r/min离心10min，吸取上清液于试管中。加入0.1ml样品溶液和0.4mL反应液(三羟甲基氨基甲烷12.110g、氯化羟胺3.475g、谷胱甘肽1.624g、CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)5.060g放入500ml烧杯中，加入350ml水，磁力搅拌混匀，然后用1mol/L盐酸调整pH值到6，然后定容到500ml)，37℃保温10min。加入0.5mL终止剂(3M HCL，12％TCA(三氯乙酸)，5％FeCl3·6H2O(溶于0.1N HCl中)，三种溶液以1∶1∶1等体积混合)，漩涡混匀，1500r/min离心10min。在加入终止液后30min时，取上清液在525nm处测定吸光值。以灭过活的酶液做空白对照，空白对照的处理方法与样品的处理一样。在37℃和pH＝6.0的条件下，每分钟形成1μmol CBZ-Glu-Gly氧肟酸产物所需的酶量定义为一个酶活单位。
结果如表1所示，诱导发酵72h后，1-3拷贝菌株摇瓶发酵液酶活最高分别可达0.12，0.28，0.43u/ml。将诱导72h酶活达0.43u/ml的3拷贝菌株命名为GSMTGB。
表1.不同拷贝菌株的酶活
发酵时间(h) 单拷贝菌株酶活 (u/ml) 2拷贝菌株 (u/ml) 3拷贝菌株 (u/ml) 72h 0.12 0.28 0.43
菌株GSMTGB已于2009年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC№.3249。对于保藏的菌株GSMTGB，继续培养，在96h和120h时取样测得酶活，实验重复3次，结果如表2所示，其中以巴斯德毕赤酵母GS115为对照进行同样条件的发酵培养，在72h、96h和120h时均没有酶活。
表2.菌株GSMTGB的谷氨酰胺转胺酶的酶活
发酵时间(h) 菌株GSMTGB(u/ml) 72 0.43 96 0.41 120 0.37