3’—氮丙啶基蒽环衍生物 本发明涉及具有抗肿瘤活性的新蒽环糖甙，它们的制备方法和含有它们的药物组合物。
本发明提供与柔红霉素和阿霉素相关的其中糖基3’—氨基包含在一氮丙啶环中且糖的4’—羟基以磺酸酯形式被任意保护的蒽环糖甙。本发明还提供其水溶性衍生物和药用酸加成盐。
本发明涉及式1或2的蒽环糖甙化合物：其中R1为氢或甲氧基；R2为氢、羟基，或代表式3的酰氧残基：
—O—COR5 (3)其中R5为直链或支链C1—8烷基，优选为苯基的单环或双环芳基，或优选为吡啶基的杂合单环或双环，每个基团可被(a)氨基—NR6R7，其中R6和R7独立地为氢或C1—4烷基，或(b)羧基任意取代；R3和R4均代表氢或R3和R4之一为氢而另一个为羟基或式—OSO2R8基团，其中R8为C1—6直链或支链烷基，如C1—4烷基；R8特别为甲基、乙基、正丙基或异丙基。
另外，R8可为芳基如苯基，其可被1—3个取代基取代或不取代，取代基可独立地为C1—6直链或支链烷基或烷氧基，如C1—3烷基或烷氧基，卤原子或硝基。卤原子的实例包括氟、氯、溴和碘，优选氟或氯，更优选氯。
在本发明中，芳基为C6—10单环或双环芳烃，例如苯基或萘基。杂环为含有选自O、S和N的至少一个杂原子的5元或6元饱和或不饱和杂环，其任选地与第二个5元或6元饱和或不饱和杂环稠合。
饱和和不饱和杂环的实例包括吡唑基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吗啉代基、硫代吗啉代基、呋喃基和噻吩基。
R2优选为羟基或O—烟酰基，R3为羟基或—SO2R8，其中R8为C1—4烷基，R4为氢。
本发明化合物的实例包括：(1a)3’—脱氨基—3’—[氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—柔红霉素(R1＝OCH3，R4＝H，R3＝OSO2CH3)(1b)4—脱甲氧基—3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—柔红霉素(R1＝R4＝H，R3＝OSO3CH3)(1c)3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—柔红霉素(R1＝OCH3，R4＝H，R3＝OH)(1d)4—脱甲氧基—3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—柔红霉素(R1＝R4＝H，R3＝OH)(2a)3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—14—烟酸酯—阿霉素(R1＝OCH3，R2＝O—烟酰基，R4＝H，R3＝OSO2CH3)(2b)3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—14—烟酸酯—阿霉素(R1＝OCH3，R2＝O—烟酰，R4＝H，R3＝OH)(2c)3—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—阿霉素(R1＝OCH3，R2＝OH，R4＝H，R3＝OSO2CH3)(2d)4—脱甲氧基—3’—脱氨基—3’—(1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—阿霉素(R1＝R4＝H，R2＝OH，R3＝OSO2CH3)(2e)3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—阿霉素(R1＝OCH3，R4＝H，R2＝R3＝OH)(2f)4—脱甲氧基—3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—阿霉素(R1＝R4＝H，R2＝R3＝OH)(2g)3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—碘—阿霉素(R1＝OCH3，R2＝OH，R4＝H，R3＝I)(2h)3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—脱氧阿霉素(R1＝OCH3，R2＝OH，R3＝R4＝H)。以及它们的药用盐，如盐酸盐。
另外，本发明提供如上所定义的式1或2的氮丙啶基蒽环糖甙或其药用盐的制备方法，该方法包括：
(a)将通式4的蒽环糖甙转化为式1的蒽环糖甙：其中R1、R3和R4如上所定义，R9代表磺酸酯基或卤原子，优选氯原子，优选将式4化合物在无水碱金属盐和弱碱存在下溶解在无水有机溶剂中；及需要时，
(b)将式5衍生物水解：其中R1、R3、R4如上所定义(可按美国专利3,803,124中所述的方法从式I化合物制得)，得到其中R2为羟基的式2地氮丙啶基蒽环衍生物；及需要时，
(c)如上所定义的式5化合物与式3’的盐衍生物反应：
X+-OCOR5 3’其中R5同上所定义，条件是R5不代表含伯氨基的残基，X+代表离子，优选钠或钾离子，及必要时，将这样得到的式2化合物转化成其药用盐；或
(d)如上所定义的式5化合物与式3’盐衍生物反应，其中R5为用酸敏感性保护基保护的伯氨基，然后脱保护基，并且需要时，将这样得到的式2化合物转化为其药用盐。
本发明还提供如上所定义的式2的氮丙啶基蒽环糖甙或其药用盐的另一制备方法，该方法包括：
(a)用硅胶处理通式6的蒽环糖甙：其中R1、R2、R3、R4和R9如上所定义[化合物还公开在WO93/01201中]，如果需要，将如此得到的式2化合物转化成其药用盐。
值得注意的是式4或6的蒽环化合物用硅胶处理时也能够形成氮丙啶基环。这种处理使用温和条件就可从碱敏感性酯衍生物如式6化合物制备式2化合物。
根据本发明，制备式1氮丙啶基蒽环化合物的优选反应条件包括：在例如无水碳酸钠或钾或碳酸氢钠或钾存的无水碱金属盐存在下，搅拌下于0—30℃，优选室温，将如上所定义的式4化合物溶解在无水有机溶剂如无水二氯甲烷中，计15分钟到2小时，优选约30分钟。
在另一方法中，式4化合物溶解在混合有机溶剂中，如干燥二氯甲烷和甲醇体积比1∶1到1∶3，然后用硅胶(优选230—400目)在搅拌下于0—30℃(优选室温)处理此溶液计15分钟到2小时，优选约30分钟。
在一相似方法中，如上定义的式6化合物转化为式2氮丙啶基蒽环化合物的反应条件优选包括：将式6化合物溶解在无水有机溶剂如干燥二氯甲烷和甲醇中，然后用优选230—400目的硅胶在搅拌下于0—30℃(优选室温)，处理所形成的溶液计15分钟到2小时，优选约30分钟。
在硅胶方法中使用极性有机溶剂如甲醇，以从硅胶中去除蒽环化合物。
在其中R2为式3基团，R5不代表带伯氨基的残基的式2氮丙啶基蒽环糖甙或其药用盐的另一制备方法中，优选的反应条件包括：式5化合物与如上所定义的式3’的酸盐衍生物在优选的酮或二甲基甲酰胺的无水极性溶剂中，于20—60℃(优选室温)反应4—15小时，优选5—12小时。
制备其中R2代表式3基团，且R5为伯氨基的式2氮丙啶基蒽环糖甙的反应条件包括：如上所定义的式5化合物与氨基用酸敏感性基团如Schiff’s碱保护的式3’酸盐衍生物，在极性溶剂如丙酮或二甲基甲酰胺中，于20—60℃(优选室温)的温度下，反应4—15小时，优选5—12小时，然后将形成的(N—保护的)酯衍生物溶解在如二氯甲烷中，并加入蒸馏水和盐酸水溶液，将其脱保护，优选水的体积大约与二氯甲烷体积相等，而盐酸的量相当于约3当量的0.1N HCl。在0—20℃，优选约15℃下，剧烈搅拌此混合物30分钟到2小时，优选45—90分钟，分层，水层冷干后得到式2的C—15酯衍生物的可溶性盐酸铵盐。优选用二苯基亚甲基保护伯氨基。
另一方面，本发明提供含有式1或2的蒽环糖甙或其药用盐并与药用稀释剂或载体结合的药物组合物。
可使用常规的载体和稀释剂，用常规方法配制和施用这些组合物。
适当的给药途径包括非胃道内给药。对此，可用活性成分和无菌稀释剂或载体制备液态制剂，稀释剂或载体要么溶解活性化合物，要么将其制成悬液。可将非胃肠制剂制备成无菌固体形式，用于在给药前用适当赋形剂如生理盐水、无菌水或其它无菌赋形剂再配制。
本发明化合物在治疗人体和动物体的方法中有用。它们可用作抗肿瘤药，特别是用于治疗白血病或结肠腺癌。给予患肿瘤的病人治疗有效量化合物以改善病人的状况。可施用足以抑制肿瘤生长的量。
用已知的阿霉素和柔红霉素的剂量范围，并根据本发明化合物在体外和体内抗肿瘤试验中所显示的活性进行修正，可以确定所给剂量。适当剂量一般在1—200mg/m2体表面，优选1—100mg/m2范围内，根据要治疗疾病的性质和严重性以及病人的一般状况而变化。
下列实施例说明本发明。实施例1制备3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—柔红霉素(R1＝OCH3，R4＝H，R3＝OSO2CH3)
将如WO/93012001中所述制得的3’—N—(2—氯乙烯)—4’—O—甲磺酰基—柔红霉素(4a，R1＝OCH3，R4＝H，R3＝OSO2CH3，R9＝Cl)(0.33g，0.05mmol)溶解在无水二氯甲烷(10ml)和甲醇(20ml)的混合物中，与硅胶(Merk，200-400目，2g)一起在室温下搅拌30分钟。过滤溶液，将滤液浓缩至干，粗品在硅胶柱上快速层析，用二氯甲烷和甲醇的混合物(体积比95∶5)作为洗脱系统，得到标题化合物1a(0.22g)。
用二氯甲烷和甲醇(体积比98∶2)展开系统，在KieselgelPlates F254(Merck)上的TLC，Rf＝0.65。FD-MS：m/z[M+]631.2H-NMR(400MHz，CDCl3)δ；1.16，1.25(m，2H，氮丙啶氢)；1.36(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-5′)；1.52(m，1H，H-3′)；1.73(m，2H，氮丙啶氢)；1.80(m，1H，H-2′eq)；2.09(m，1H，H-2′ax)；2.12(m，1H，H-8ax)；2，31(m，1H，H-8eq)；2.39(s，3H，COCH3)；2.98(d，J＝19.2Hz，1H，H-10ax)；3.21(dd，J＝1.7，19.2Hz，1H，H-10eq)；3.22(s，3H，CH3SO2)；4.09(q，J＝6.4Hz，1H，H-5′)；4.10(s，3H，OCH3)；4.44(s，1H，OH-9)；4.75(s，1H，H-4 ′)；5.28(m，1H，H-7)；5.55(d，J＝3.4Hz，1H，H-1′)；7.41(d，J＝8.1Hz，1H，H-3)；7.80(dd，J＝7.7，8.1Hz，1H，H-2)；8.05(d，J＝7.7Hz，1H，H-1)；13.30(s，1H，OH-11)；14.00(s，1H，OH-6)。实施例2制备4—脱甲氧基—3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基柔红霉素(1b：R1＝R4＝H，R3＝OSO2CH3)
将4—脱甲氧基—N—(2—羟乙基)柔红霉素(4b：R1＝R4＝H，R3＝OSO2CH3，R9＝OH，0.3g，0.5mmol)溶解在二氯甲烷(10ml)和甲醇(5ml)的混合物中，在室温与硅胶(3g)一起振摇30分钟。过滤此有机溶液，减压除去溶剂。残余物在硅胶柱上用二氯甲烷和甲醇(95∶5，体积)作为洗脱系统进行快速层析，得到标题化合物1b/0.18g。用二氯甲烷和甲醇(20∶1，体积)作为展开系统，在Kieselgel Plates F254(Merck)上的TLC：Ff＝0.42。FD—MS：m/g[M+]601。实施例3制备3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—14—烟酸酯—阿霉素(2a：R1＝OCH3，R2＝O—烟酰基，R4＝H，R3＝OSO2CH3)。
将如实施例1中所述制备的3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—柔红霉素(1a，0.63g，1mmol)溶解在无水甲醇(6ml)和二噁烷(13ml)的混合物中，加入原甲酸乙酯(0.5ml)，然后此混合物用溴(1g)的无水二氯甲烷(15ml)溶液于10℃处理1.5小时。反应混合物用乙醚(100ml)和石油醚(50ml)的混合物沉淀。收集沉淀，再溶解在丙酮(15ml)和0.25N溴化氢水溶液(15ml)中。此混合物在30℃保持20小时，然后用正丁醇(50ml)萃取。减压除去有机溶剂，残余物溶解在无水丙酮(200ml)中，用烟酸钾回流处理1小时。减压除去溶剂，粗品在硅胶柱上用二氯甲烷/甲醇(95/5，体积)作为洗脱系统进行快速层析，得到标题化合物2a(0.35g)。m.p.148—149℃(分解)。用二氯甲烷/甲醇(10/1，体积)展开系统，KieselgelPlates F254(Merck)上TLC：Rf＝0.37。FD—MS：m/g[M+]752。实施例4制备3’—脱氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—阿霉素(2c：R1＝OCH3，R2＝OH，R4＝H，R3＝OSO2CH3)
如实施例1中所述，将按GB9114549制得的3’—N—(2—氯乙基)—4’—甲磺酰基—阿霉素(6a：R1＝OCH3，R2＝OH，R9＝Cl，R3＝OSO2CH3，R4＝H)转化为标题化合物2C。用二氯甲烷/丙酮(8/2，体积)展开系统，Kieselgel Plates F254(Merck)上TLC：Rf＝0.35。FD—MS：m/g[M+]647。实施例5制备3’—去氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—碘阿霉素(2g：R1＝OCH3，R2＝OH，R4＝H，R3＝I)。
如实施例1中所述，将按GB9114549制得的3’—N—(2—氯乙基)—4’—碘代阿霉素(6a：R1＝OCH3，R2＝OH，R9＝Cl，R3＝I，R4＝H)转化为标题化合物2g。用二氯甲烷/丙酮(9/1)，体积)展开系统，Kieselgel Plates F254(Merck)上TLC：Rf＝0.45。FD—MS：m/g[M+]679。实施例6制备3’—去氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—碘阿霉素(2h：R1＝OCH3，R2＝OH，R3＝R4＝H，)。
如实施例1中所述，将按GB9114549制得的3’—N—(2—氯乙基)—4’—脱氧阿霉素(6a：R1＝OCH3，R2＝OH，R9＝Cl，R3＝R4＝H)转化为标题化合物2h。用二氯甲烷/丙酮(20/1，体积)展开系统，Kieselgel Plates F254(Merck)上TLC：Rf＝0.33。FD—MS：m/g[M+]553。生物活性
与阿霉素相比，用两个人细胞系，LOVO(结肠腺癌)和Lo-Vo/DX(耐阿霉素结肠腺癌)，在体外测试了3’—去氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—柔红霉素(1a)、4—去甲氧基—3’—去氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—柔红霉素(1b)、3’—去氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—14—烟酸酯—阿霉素(2a)和3’—去氨基—3’—[1—氮丙啶基]—4’—O—甲磺酰基—阿霉素(2c)。
细胞毒活性用IC50表示，即抑制50％的集落形成的浓度，用浓度反应曲线计算。耐性系数R.I.是对耐性细胞的IC50与对敏感细胞IC50之比。化合物1a，1b，2a和2c对两个细胞系都显示高活性，耐性系数小(表I)。
与阿霉素相比，还测定了化合物1a，1b，2a和2c对耐阿霉素的P388鼠白血病的活性(105个细胞/只鼠，在BD 2F1小鼠中i.v.移植)。
化合物1a、1b、2a和2c显示的活性明显高于阿霉素(表II)。
表1：化合物1a，1b，2a和2c对LoVo和LoVo/DX细胞的体外细胞毒活性(IC50)，阿霉素作对比。
IC50(ng/ml)(1)化合物 LoVo LoVo/DX R.I.(2)1a 13 22 1.71b 27 26 0.92a 14 40 2.92c 2.7 24 9.2阿霉素 82.5 4975 60.3
集落测定：处理4小时后
(1)IC50＝抑制50％集落形成的浓度
(2)R.I.＝耐性系数＝(IC50LoVo/DX)/(IC50LoVo)
表2：与阿霉素相比，化合物1a，1b，2a和2c对P388/DX白血病的抗肿瘤活性。
O.D.(1) T/C(2)化合物 (mg/kg) ％1a 2.2 1901b 3.8 2402a 2.5 2002c 1.8 195阿霉素 16.9 106
化合物悬浮在Tween 80中(10％)，肿瘤移植后一天i.v.注射。
(1)最佳剂量
(2)治疗组平均存活时间/对照组平均存活时间×100。