稳定的药用肽组合物 本发明涉及经鼻、口或非胃肠道给药的小肽和中等大小肽(≤二十肽)如去氨加压素(1—去氨—8—D—精氨酸加压素；DDAVP)的稳定的水性药用组合物。
本说明书所用的术语“稳定的组合物”指治疗用的水溶液，含至少一种生物活性小肽或中等大小的肽。这种稳定应使组合物能长期贮存于室温下而不失去生物活性。
已知大量生物活性肽，它们的衍生物和类似物(下面称作“肽类”)在治疗上是有用的。因各种原因，它们常以水性组合物即含已知量肽的灭菌水溶液的形式给药。
拟给药的肽类的生物活性通常极高，因此，单剂量仅需很少量地肽。这种稀的肽溶液通常在室温下不能长期稳定，即使保存在密闭容器中也同样。治疗活性肽激素类似物去氨加压素即此种肽，其水溶液必须贮存在不超过8℃的温度下。贮存在较高温度，如室温下，因水解和/或氧化过程而导致去氨加压素的降解，它不会因保存剂，如氯代丁醇(1，1，1—三氯—2—甲丙基—2—醇)的加入而终止降解，然而，氯代丁醇有效地保护去氨加压素免受微生物攻击。
肽的稀水溶液的另一问题是微量肽吸附在装溶液的容器壁上。因为这种肽溶液是非常稀的，甚至微量吸附实际上就可能降低可用来给药的肽的量。
溶液中小肽和中等大小肽的特别引人注目的给药方式是以滴剂或喷雾剂形式经鼻粘膜给药，这甚至更方便和更容易重复使用。例如，去氨加压素可在0.9％氯化钠水溶液(生理盐水)中用此途径给药。
各种鼻内喷雾给药装置是本专业领域所共知的。通常，水溶液中的肽借助诸如Ing.Erich Pfeiffer KG，Radolfzell，Germany制造的计量喷雾泵给药。另一途径是经称作“rhinyle”的特殊设计的刻度塑料管给药，该管部分充填含肽水溶液。将rhinyle一端放在口中，另一端放在所需的鼻孔中，然后将溶液吹送入鼻孔。
经鼻给药的肽常有极高的生物活性，单剂量仅需极小量肽。但是，为了有好的重现性，特定给药形式可要求最小液体量。因此，经鼻给药，肽的有效浓度范围通常是很低的。例如，经鼻给药的单剂量去氨加压素典型地在10～40μg之间，但甚至可少至2.5μg和高至300μg。典型的剂量容积为100～400μl(4×100μl)。这些剂量在正常情况下是按规则摄取的，例如至少每天一次。
本发明的描述是克服已知的小肽和中等大小肽的水溶液、特别是含去氨加压素的水溶液所伴有的上述稳定性和贮存问题。
另一个目的是提供经鼻、口或非胃肠道给药用的含肽稳定水溶液，它能方便地在室温下长期贮存，其中所含肽无部分或全部降解或微生物污染的危险。
进一步的目的是保护溶液中的肽不粘附在容器壁上，而不必为此而使用特别是设计额外的添加剂。
还有一个目的是提供鼻用或滴式喷雾水性组合物，通常给予生物活性小肽和中等大小肽而治疗疾病和缓解异常情况。
本发明是用于小肽和中等大小肽，特别是去氨加压素，给药的水性组合物，它可在室温下保持长时间的稳定性，其中所指的生物活性成分为诸如肽、肽的类似物或肽的混合物和/或它们的类似物。溶液含缓冲液、季铵保存剂或消毒剂及渗透压控制剂。
季铵保存剂或消毒剂除其同名的功能外，还具有防止小肽和中等大小肽成分吸附于容器壁(特别是聚合物材料制的容器)的意想不到的能力。
较好的肽或肽类似物为缩宫素或加压素，或它们的类似物和衍生物，例如特别好的是去氨加压素(下文也称作“DDAVP”)。还有较好的是特利加压素[(N—α—三甘氨酰—8—赖氨酸)—加压素]、阿托西平(atosiban)((MPa′，D—Tyr(Et)2，Thr4，Orn8)—缩宫素)、卡贝缩宫素[(1—去氨—1—单甲基—2(O—甲基)—酪氨酸]和曲普瑞林[(D—Trp6)—LHRH]。
较好的缓冲液是能维持pH在4.0—6.0之间的，特别好的是pH约5.0的缓冲液。
在一个实施例中，所用的缓冲液是乙酸/乙酸钠。对于按本发明的稳定的肽溶液而言，较好的是含柠檬酸和/或磷酸盐。按本发明的较好的缓冲系统是柠檬酸/磷酸氢二钠、磷酸二氢钠/磷酸氢二钠和柠檬酸/柠檬酸钠。特别好的缓冲液含柠檬酸盐—磷酸盐—钠离子，摩尔比为约1∶3∶3至1∶1∶2。
季铵保存剂或消毒剂较好的是氯化苯甲烃铵，(NR1R2R3R4)+Cl-，其中R1、R2＝甲基，R3＝苄基，R4＝C8H17－C18H37。按本发明的组合物以含浓度为约0.05～0.2mg/ml的季铵保护剂或消毒剂为宜，浓度约0.1mg/ml为特别适宜。
渗透压控制剂较好的为氯化钠。缓冲液对渗透压控制也有实质性贡献。
按本发明的较好的方面，组合物另外还可含至少一种粘膜吸收促进剂，如胆盐、聚乙二醇的单月桂基醚、磷脂和褐酶酸衍生物。
按本发明的较佳实施例，包含0.025～1.5mg去氨加压素乙酸酯、1.35～1.75mg柠檬酸，2.25～2.65mg磷酸氢二钠，0.05～0.20mg氯化甲苯烃铵和其量足以使整个溶液具有与人血浆渗透压相当的氯化钠。
按照本发明的另一较佳实施例，还揭示了水性喷雾组合物用于治疗疾病和异常情况，它们可通过小肽和中等大小肽经鼻给药加以治疗。
图1表示按本发明制备的组合物的稳定性试验结果。
参考下面的实验例将对本发明作更详细的阐述。实施例1试验组合物的制备
制备了含各种保存剂的喷雾或滴式鼻用组合物，5个含去氨加压素(DDAVP)的试验组合物，组合物A、B、C、D和E(见表1)。每个试验样品含DDAVP游离碱0.089mg/ml，表1表示在每个系统中所用的缓冲液种类。用经Millipore过滤的水作溶剂。
按本说明书制备组合物A和B，为对照试验其它保存剂而制备组合物C、D和E。
含NaCl和氯代丁醇的未缓冲Minirin(DDAVP)喷雾剂已知的稳定性为：保存在密封玻璃容器中时，在冷藏状态下有用的货架寿命为三年。长期贮存于室温下是不稳定的。请注意，组合物E含NaCl和氯代丁醇，但它是缓冲过的溶液。
表1
稳定化的去氨加压素组合物(每毫升的量)
组合物 NaCl mg BH mg(mmol) B-Na+ 保存剂 mg A 8.74 AcOH(mmol) 2.96·10-3 NaOAc 0.58 氯化甲苯烃铵 B 6.29 柠檬酸 1.56 Na2HPO4 2.43 氯化甲苯烃铵 C 5.24 柠檬酸 1.97 Na2HPO4 1.83 苄醇 10.0 D 6.30 柠檬酸 1.56 Na2HPO4 2.43 对羟基苯甲酸甲酯 0.80 对羟基苯甲酸丙酯 0.20 E 5.64 柠檬酸 1.97 Na2HPO4 1.83 氯代丁醇 5.00
A和B表示按本发明的组合物；C，D，E表示为对照而制备的组合物。实施例2检测肽降解的稳定性试验
将实施例1中制得的DDAVP组合物在10ml玻璃瓶(水解一级，有特氟隆塞子)中于65℃下贮存在黑暗中13周。1、2、3、5、7、9、11和13周后取样，用HPLC[Varian Star系统，LichrospherPR-185μm柱(50×4mm)；用各种比例的乙腈/0.0667M磷酸盐水缓冲液pH7]分析DDAVP。
结果绘图于图1，证明本发明组合物的优良稳定效应。图1中所含实验数据还用于下面表2所示一级速率常数的计算。
表2
去氨加压素降解的一级速率常数 组合物 K(s—1) 相关系数 A 4.6·10—8 0.98 B 8.0·10—8 0.98 C 1.6·10—7 0.97 D 8.8·10—8 0.96 E ～9·10—7 0.83实施例3有用的货架寿命的计算
从图1曲线的斜率和从在37℃、50℃和60℃进行的相应贮存试验，得到组合物A、B、C和D的阿里纽斯活化能(Ea)。组合物E不显示阿里纽斯型性质，因为它是最不稳定的组合物。
从Ea计算每个组合物的DDAVP总量在25℃和30℃时降低10％的贮存时间(t90)，即“有用的货架寿命”，列表显示于表3。
表3
稳定的去氨加压素组合物的有用的货架寿命(t90，以年计)组合物 活化能 t90
(Ea，kJ/mol) 25℃ 30℃A 123.5 27.0 11.9B 115.1 12.9 6.0C 115.5 5.7 2.7D 102.8 7.4 3.7
如表3所示，在室温下去氨加压素长期保存在组合物A和B中，从而证明本发明组合物可不加以冷藏而长期贮存和使用的能力。实施例4去氨加压素鼻内吸收的比较
24个健康禁食男性受试者经鼻内接受(随机)喷雾剂型(200μl)的去氨加压素(20μl)，采用的是组合物B或含氯代丁醇的市售未缓冲Minirin制剂。间隙取血样共12小时，用去氨加压素特异性RIA血浆检测法(Lundin，S.et al.，Acta Endocrinologica(Copen-hagen)108(1985)170—183)。两种组合物基本上呈现出相同形式的去氨加压素血浆水平曲线。这是意想不到的结果，因为H.A.Batts等(J.Pharm.Pharmacol.1989，156—159)发现氯代丁醇和氯化甲苯烃铵对硅腭粘膜转运率的效应明显不同，粘膜清除率影响肽类和其它经鼻给药的生物活性化合物相当慢的鼻内吸收。实施例5去氨加压素的吸收阻断效应
将含氯化甲苯烃铵＋生理盐水、氯代丁醇＋生理盐水或只含生理盐水的125I标记的去氨加压素的灭菌水溶液(约10,000cpm/ml)放在聚苯乙烯、聚丙烯和玻璃试管中，在室温下培育24小时。
在含氯化甲苯烃铵和氯代丁醇的溶液中，去氨加压素分别显示的吸收，而在无保存剂的溶液中的去氨加压素，仅一半量可从塑料试管中回收到。
本说明书描述了本发明的各种特征和实施例，而本领域技术人员可改变本发明的各个方面，达到同样的目的。本说明书考虑到这些修改在其精神和范围内。