抗微生物制剂及其筛选方法 本发明涉及一筛选抗微生物制剂的方法、由此方法确认的抗微生物制剂以及一种抑制微生物生长的方法。
更具体地,本发明的方法涉及利用一公认的核糖核酸(RNA)解旋酶来筛选抗微生物制剂。
无论在原核还是真核生物中,核糖核酸(RNA)都是细胞存活所需的基本分子。最熟知的RNA是信使RNA(mRNA),它是蛋白质生成所必需的,正是通过它细胞核中的基因组所编码的遗传信息才得以转运到细胞质中以翻译成蛋白质。然而,其它类型的RNA也是蛋白质生所必需的,如转运RNA(tRAN)和核糖体RNA(rRNA)。核糖体是蛋白质事实上生成的场所,通过特异tRNA(携带一特异氨基酸)与mRNA上相应的密码子(碱基三联体)相连接而实现。已知核糖体是复杂的分子,包括rRNA和几个多肽。此rRNA为核糖体的功能所必需,并在不同的生物体间高度保守,虽然原核生物和真核生物地rRNA间存在明显差异。
在许多RNA分子中,其功能不仅依赖于核酸碱基的实际序列(初级结构),还依赖于此分子折叠形成精确的三维构型(二级结构)的方式。
RNA二级结构的控制是细胞中许多关键过程的一个基本步骤,这些关键过程包括RNA拼接,核糖体组装和将RNA翻译成蛋白质。因此,影响RNA二级结构的RNA解旋酶是细胞存活所必需的。
一大族具有已知或公认的依赖ATP的RNA解旋酶活性的蛋白质的发现引起了人们对RNA二级结构的极大兴趣(Linder等,1989;Schmid和Linder,1992;Fuller-Pace& Lane,1992).此家族的成员构成了另一更大的蛋白质超级家族的一部分,此超级家族的蛋白质可与多聚核苷酸和核苷酸三磷酸相互作用,并共有七个高度保守的区段。在几个事例中,这些蛋白包含一个特征性的Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)区段,并由此被命名为“DEAD盒”蛋白(Linder,1989)。而随着越来越多的蛋白质被归于此家族中(通过序列上的同源性和在一些情形中生化功能上的相似性),人们已清楚地看到它至少包含两个亚群:DEAD亚群和DEXH亚群(Fuller-Pace,1992)。
DEAD盒家族的个别成员在整个进化过程中一直高度保守(Linder等,1989;Iggo等,1991)。DbpA基因是通过用一来自非洲粟酿酒酵母的p68基因的对应物做探针杂交而得,P68蛋白是典型的DEAD盒蛋白之一(Iggo等,1990)。然而对预测的氨基酸序列的分析表明,虽然DbpA蛋白含有DEAD盒蛋白家族的特征性保守区段,但事实上它与P68的关系并不比与本家族其它成员的关系更近。在大肠杆菌中已发现了五个类似的基因(Kalman等,1991),其中的二个:srmB(Nishi等,1988)和deaD(Toone等,1991)被认为涉及到了核糖体的生物发生。第三个,rhlB,看起来在一些遗传背景中是一个必需的基因(Kalman等,1991),但互补实验表明,rhlB与srmB基因间没有功能上的互补,这表明这些基因有不同功能。然而对rhlB或另外两个到目前为止在大肠杆菌中被确认的基因:rhlE(Kalman等,1991)和dbpA(Iggo等,1990)的生物学功用还所知甚少。
到目前为止,关于大肠杆菌DEAD盒蛋白的唯一已报道的生化研究是关于SrmB蛋白的,该蛋白在核酸存在下可水解ATP,但对核酸并无特异性的要求。此ATP酶活性可被Poly(U),Poly(A),tRNA,rRNA所诱导,单链和双链的DNA只能诱导到一个较低的程度(Nishi等,1988)。到目前为止,生化上检测过的其它DEAD盒蛋白,包括该家族的典型成员真核生物转译起始因子eIF-4A(Grifo等,1984),也显示了对RNA的类似要求,即体外ATP酶活性测验中对任何特殊的RNA都无特异性。
RNA解旋酶高度保守的特性证实了其功能的重要性,因此它们为抗微生物治疗制剂的作用提供了一个有吸引力的靶位点。
然而对这些制剂的确认一直较为困难,虽然使感染病人的微生物的某一特殊的RNA解旋酶失活的治疗药物在理论上是可能的,但毕竟存在一种同时使病人的RNA解旋酶失活并由此导致依赖RNA解旋酶的生命过程停止的危险。
成为本发明基础的惊人发现是:虽然纯化的DbpA有DEAD盒蛋白的依赖RNA的ATP酶活性特征,但与其它的DEAD盒蛋白不同,DbpA的活性仅依赖于单一的特殊RNA,即原核生物的核糖体23SrRNA。刚开始时用于这些观察的23S rRNA来源于大肠杆菌。真核生物的核糖体RNA存在下DbpA没有活性。
影响RNA的酶(如DbpA)在通过将rRNA的二级结构处理成核糖体活性所需要的构型,以产生一个有功能的核糖体中是必需的。现在看来DbpA很可能是选择性地作用于原核生物的高度保守的23S rRNA。对DbpA的抑制将阻碍原核生物核糖体的功能,而由于真核生物的rRNA不会受到影响,从而可能提供选择性地抗微生物的活性。
DbpA的ATP酶活性绝对需要原核生物23SrRNA这一发现意味着使一个正在感染宿主的微生物的DbpA失活不会影响宿主细胞的进程,因为DbpA不影响宿主细胞的RNA。因此本发明的完成就依赖于在检测抗微生物物质的方法中DbpA的底物特异性。
在其正常功能中,DbpA在表现出可观察到的影响RNA结构的活性前,要求核苷磷酸(一般是ATP)的存在。在DbpA表现活性的过程中,核苷磷酸被降解。例如:当核苷磷酸是ATP时,它被转变为ADP和磷酸。降解的量提供了测量DbpA活性的有用方法。因此DbpA和其它类似的RNA解旋酶可被视为核苷酸磷酸酶或特殊的ATP酶。
根据本发明,提供了一种用于确定一种物质抗微生物活性的方法,所述的方法包括:
(i)将一微生物所必需的核苷酸磷酸酶,被测物质和一核苷磷酸混合;
(ii)估价被所述的磷酸酶所影响的核苷磷酸的量,从而估价所述的物质对所述的磷酸酶的作用效果。
此处术语“核苷”指仅含一个碱基和一个糖基的分子。术语“核苷磷酸”指一个核苷通过化学键联结一个或多个磷酸基团,从而“核苷磷酸”包括核苷单磷酸(仅有一个磷酸基团),核苷二磷酸(有二个磷酸基团)和核苷三磷酸(有三个磷酸基团)。术语“核苷酸”在现有技术中是与“核苷磷酸”等效的术语,在此用于指如上所述含有一个,二个或三个磷酸基团的核苷分子。
术语“核苷酸磷酸酶”指一种能使核苷酸(核苷磷酸)分子部分或全部脱去磷酸的酶。例如,核苷三磷酸能够被核苷酸磷酸转变为核苷二磷酸,并伴随产生一磷酸组分,也可被转变为核苷单磷酸,同时伴有一焦磷酸组分的产生。同样,核苷二磷酸可被转变为核苷单磷酸或核苷。在一定的条件下,一种酶可以朝相反的方向起作用,因此,核苷酸磷酸酶能够催化核苷到核苷磷酸的转变,或在核苷磷酸底物上增加另外一个磷酸组分。“核苷酸磷酸酶”另一可选择的命名为“核苷磷酸磷酸酶”。
微生物所需要的磷酸酶优选是一种ATP酶如RNA解旋酶,譬如核糖体RNA(rRNA)解旋酶。本文提到了此种磷酸酶的几个例子,尽管DbpA仍是优选的。
上述方法中所要求的核苷磷酸可为能被磷酸酶分解的任何一种物质。适用于上述方法的核苷磷酸的例子包括ATP,脱氧ATP(dATP),ADP,GTP,GDP,AMP,CTP,TTP等或其类似物。通常使用的是ATP。
任选地也提供了一种激活核苷酸磷酸酶活性的制剂,在测定过程的步骤(i)中加入到核苷酸磷酸酶、被测物质和核苷磷酸中。
核苷酸磷酸酶的活性可依赖于RNA,在这种情况下,一种合适的激活制剂是RNA。优选地,核苷酸磷酸酶的活性专一依赖于微生物的RNA,最优选是仅仅依赖于一种存在于一些微生物中的可明显区分的RNA,如核糖体RNA或其一特殊片断或序列。
RNA可来源于微生物或人类,但优选能激活核苷酸磷酸酶对核苷磷酸的降解。
最优选地,为了RNA能够专一地激活核苷酸磷酸酶水解核苷磷酸而选择核苷酸磷酸酶和RNA。
一方面,本发明提供了一种确定一种物质的抗微生物活性的方法,该方法包括:
(i)将所述的物质与影响原核生物rRNA二级结构的酶和该酶的必需底物相混合;
(ii)估价所述的物质对所述的酶活性的作用。
上述所指的酶最好是DbpA,其必需底物为原核生物23SRNA,或其片段或其功能类似物,和一核苷磷酸,如ATP或其功能类似物。
因此,本发明提供了一种确定一种物质抗微生物活性的方法,所述的方法包括:
(i)将所述的物质与DbpA,原核生物23SrRNA或其一片段,或其功能类似物以及ATP或其功能类似物混合;
(ii)估价所述的物质对DbpA活性的作用。
此方法也可便利地在体外完成。
优选以纯化的形式提供核苷酸磷酸酶,例如大致纯化的形式。
被测物质对酶(或核苷酸磷酸酶)的作用优选通过测量反应混合物中磷酸的量而定量。通常核苷磷酸被降解释放磷酸,被释放的磷酸的量可被测定。作为一种替代的方法,也可将磷酸加到核苷或核苷磷酸上,从而可测定所吸收的磷酸(或形成的核苷酸磷)的量。被测物质存在时所释放的磷酸的量的变化优选与该物质不存在时所释放的磷酸的量相比较,二者之比可以表明被测物质影响核苷酸磷酸酶活性的程度。
核苷磷酸可包括一个标记如放射性的、发光的、发荧光的或发色的标记,该标记最好位于核苷磷酸的γ磷酸部分。
进一步根据本发明,提供了一种抗微生物制剂,该制剂可降低微生物必需的核苷酸磷酸酶的活性。
优选地,当微生物为原核生物,如大肠杆菌时,核苷酸磷酸酶为DbpA,尽管其他细菌和病毒及相应的酶也可成为目标。
制剂优选为抗生素,尽管本发明也包括用作治疗制剂的抗体。
抗微生物制剂可为任何可以结合于核苷酸磷酸酶和/或降低核苷酸磷酸酶活性的制剂。例如,抗微生物制可包括一ATP类似物,它不能被核苷酸磷酸酶水解。
其他抗微生物制剂的例子包括核苷酸磷酸酶(如RNA解旋酶)的天然底物的类似物或针对该酶的至少一部分有特异性的抗体。
其他抗微生物制剂包括核苷磷酸的不可水解类似物或能结合到核苷酸磷酸酶或能降低核苷酸磷酸酶活性的蛋白质。这些抗微生物制剂的作用机制通常是通过结合到核苷酸磷酸酶上的核苷磷酸结合位点上,从而通过对核苷磷酸结合的防止或竞争来实现。被考虑的具体的抗微生物制剂为:5’-p-氟磺酰苯甲酰腺苷,腺苷5’-〔B,γ-亚氨〕三磷酸,腺苷5’-〔γ-硫代〕三磷酸或腺苷5’〔B,γ-亚甲基〕三磷酸。
RNA解旋酶的天然底物包括核苷酸多聚物(如RNA)和核苷磷酸(如ATP)。这些底物的类似物众所周知并且容易地被本领域技术人员制备。
尤其有用的抗微生物剂包括仍能结合到RNA解旋酶上的微生物23SrRNA的非功能类似物。
本发明还提供了利用任何上述抗微生物制剂抑制微生物生长的方法。
在另一方面,本发明还提供了一种抑制微生物生长的方法,所述方法包括运用一种物质,该物质可抑制微生物必需的核苷酸磷酸酶,如微生物所需的RNA解旋酶,优选是一种特异地作用于原核生物rRNA的RNA解旋酶,如DbpA。
在导致本发明的实验工作中,发现可以运用一个较以前被Iggo等人公认的更上游的起始位点表达DbpA一个额外的N末端部分。发明人发现该DbpA额外的N末端部分是维持活性所必需的,并且发现通过使用上游起始位点会增加DbpA的表达。在DbpA额外的N-末端部分存在的情况下,从相应遗传物质的翻译在位于曾被确认为DbpA起始位点的ATG的上游的GTG起始位点起始。
据此,本发明提供了编码DbpA或其部分或其有功能的衍生物的重组遗传物质,该遗传物质至少包括自然发生的DbpA基因或其功能等价物的第一个ATG位点上游的天然序列的一部分,其中,有一个ATG密码子存在于该上游序列。
优选地,从ATG起始位点上游直到并包括GTG起始位点的所有天然上游序列(或其功能等价物或衍生物)或其功能等价物都包括进去。将DNA中天然存在的GTG起始位点转变为一个ATG密码子也是值得一做的。可以通过同源重组将一个ATG密码子掺入到上游序列中,例如通过化学合成寡核苷酸或应用其他的已知技术。也可通过例如定点突变改变或取代一个已存在的密码子或核苷酸。将一个化学合成的上游序列接到dbPA基因或其一部分或其功能等价物上也是可行的。DNA中ATG的转录降在RNA中产生AUG,AUG将被转译成相应的氨基酸(如蛋氨酸)。同样DNA中的GTG转录成RNA中的GUG并将相应转录到蛋白质中。
现在已经发现上游序列的存在会在被表达的DbpA蛋白中造成活性的提高,原先并未了解到上游序列的存在会有此效果。据信dbpA基因的体内表达发生于上游序列的GTG密码子,此GTG密码子突变成ATG密码子会增强有较高活性的(即含有上游序列的)DbpA变体的翻译。
以前Iggo等所用的编码序列已示出并存入EMBL资料库,编号为X52647。Iggo等的dbpA序列包括一个距Iggo确认的ATG起始密码子上游75到73个碱基的GTG密码子。此GTG密码子被发明人转变为ATG,由此所得的序列被称为SEQ.ID.NO:2并在本文中列出来。其中的经改变而产生的ATG被命名为ATG1。
SEQ.ID.NO:1显示了从修饰的转译起始密码子ATG1到位于第1372-1374碱基的TAA终止密码子的编码DbpA蛋白的DNA序列。
SEQ.ID.NO:2的序列(包括SEQ.ID.NO:1及其外围序列)在1994年3月22日作为一个大肠杆菌DH5α所含的一个质粒的一部分被保藏在国家典型培养物保藏中心(NCTC)地址为Central Public Health Laboratory,61 Colindale Avenue,London,NW9 5HT,编号为NCTC 12867。
在此所用术语“遗传物质”包括单链或双链形式的RNA或DNA及其功能性等价物。此遗传物质可用任何适当的手段产生,包括化学合成。“功能性等价物”指任何编码有所要求的活性的多肽的遗传物质。
任选地,此遗传物质作为克隆或表达载体的一部分被包括。根据本发明,含此遗传物质的重组载体形成了本发明的另外一个方面。这些载体可包括选择标记,复制起始区或增强或控制表达的部分,如启动子和/或增强子。
本发明也提供了一种产生重组载体的方法,所述的方法包括将根据本发明的遗传物质连接到一个合适的载体序列上。
本发明还提供了一种含有上述遗传物质(任选地可以作为重组载体的一部分存在)的被转染的宿主细胞。
本发明也提供了一种产生一种被转染的宿主细胞的方法,该方法包括用一个根据本发明的载体去转染一种细胞。
本发明也提供了一种生产DbpA的方法,所述的方法包括从本发明的遗传物质表达DbpA。优选地,此遗传物质存在于载体中,和/或存在于被转染的宿主细胞中。
一些修改或改进可以加进去而不会背离本发明的范围,以下通过附图和实施例描述本发明的一个实施方案。
附图说明:
图1显示了序列已知的大肠杆菌DEAD盒蛋白氨基末端的氨基酸序列的比较(Kalman等,1991)。eIF-4A相应区域也列于图中。图中标出了保守的氨基酸和保守的取代物(*).DbpA的第一个氨基酸(由GTG编码)被列为缬氨酸(图中),但也可以为蛋氨酸。因为tRNAf met会识别GUG并将之译成蛋氨酸(见结果)。
图2展示了一个显示DbpA在bluescript和pT7·7质粒上表达情况的Western杂交。所用质粒及其起始位点和每种情况下的密码子已列于图中,并说明如下:1:以GTG为翻译起始密码子编码全长DbpA的bluescript质粒;2:以ATG取代GTG起始密码子的编码全长DbpA的bluescript质粒;3:基因的5’端已作缺失,从而使内部的ATG作为翻译起始密码子的pT7·7质粒;4:GTG起始位点被突变为ATG,以利于在T7系统中翻译起始的编码全长DbpA的pT7·7质粒。在pT7·7质粒的情形中,IpTG被加入以诱导蛋白表达。DbpA是用DbpA特异性的抗多肽抗体来检测的(见下述“材料和方法”部分)。
图3为Coomassie染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶,显示了被IpTG诱导前(-)和诱导后(+)的细菌裂解物(可溶部分)的蛋白情况。A:含有以内部的ATG为翻译起始位点的表达DbpA蛋白的pT7·7质粒的细菌(图2中3)。B:含有以在原来的GTG位置上的ATG为起始位点表达DbpA蛋白的pT7·7质粒(图2中4)的细菌。分子量标记物(M)的大小以千道尔顿为单位。
图4为Coomassie染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶,显示了DbpA的纯化方法。Total.sol.表示细菌裂解物中全部的可溶性蛋白。PEI表示聚乙烯亚胺。Sup.12表示FPLCsuperose12柱。DNA cell表示单链DNA纤维素柱。分子量标记物(M)的大小以千道尔顿为单位。
图5为聚乙烯亚胺薄层层析板的放射自显影,显示了在一个标准ATP水解测验中,从〔γ-32P〕ATP上释放的放射性磷酸的分离情况(从左向右迁移)。图中标出了反应中DbpA和RNA的存在与否情况;DbpA和大肠杆菌总RNA的用量分别为200ng和800ng。
图6显示了在不同的大肠杆菌RNA浓度下,ATP被各种浓度的DbpA的水解。反应时间均为一小时,所释放的磷酸(cpm-Cerenkov)按“材料和方法”中所述进行测量。
图7显示了在限制RNA(A)和DbpA(B)的量的条件下,ATP水解的时间过程。A:400mg DbpA,100ng RNA;反应20分钟以后又另外加入100ng RNA;B:100ngDbpA,800ng RNA;反应20分钟以后又另加入100ng DbpA。所释放的磷酸(cpm-Cerenkov)按“材料和方法”中所述进行测量。每种情况下的数据均为两次实验的平均计数。
图8为聚乙烯亚胺薄层层析板的放射自显影,显示了在各种RNA存在下,在用DbpA水解ATP的测验中,从〔γ-32P〕ATP释放的放射性磷酸的分离(从左向右迁移)。每种情况下DbpA和RNA的用量均分别为200ng和800ng。
图9:为聚乙烯gog亚胺薄层层析板的放射自显影,显示了在体外合成的大肠杆菌16S和23S核糖体RNA存在下,在用DbpA水解ATP的测验中,从〔γ-32P〕ATP释放的放射性磷酸的分离(从左向右迁移)。体外转录RNA的方法见“材料与方法”部分。在每次测验中,DbpA和RNA的用量均分别为100ng和400ng。
材料与方法:
质粒和菌株:编码DbpA的bluescript克隆见Iggo等所述(Iggo等,1990)。pT7.7表达载体和BL21(DE3)细胞(Tabor,1985;Studier,1990)由C.A.Middley赠送。编码大肠杆菌16S和23SrRNA(Brosivs,1981)的pKK3535质粒由H.F.Noller和A.Huttenhofer赠送。
DNA和RNA的制备:参见Sambrook等(Sambrook,1989)。
DbpA的定点突变用Amersham寡核苷酸指导的突变试剂盒完成。
16S和23S rRNA的亚克隆和RNA的体外合成:编码16S和23S rRNA的DNA片段被分别克隆到体外转录载体pGEM3和pGM4上,以便这些RNA可被分开合成。RNA是据Promega公司的指示用T7和sp6多聚酶合成的。
DbpA表达菌的生长和诱导:将含有编码受控于IpTG可诱导的17启动子(Tabar,1985)的dpPA基因的pT7.7质粒的BL21(DE3)细胞的新鲜过夜培养培养物稀释30倍,在37℃培养到O.D.(650nm)0.3-0.4,用0.5mMIpTG进行诱导。培养物移至26℃继续培养4小时,然后离心收集细胞。用50mM Tris-HUpH7.5洗涤细胞沉淀物,离心,回收,存入-70℃直到用于DbpA纯化。
细菌裂解物中蛋白质的分离和免疫杂交:
细菌裂解物中的蛋白(或按下述制备可溶性蛋白的方法制备,或通过直接向细菌沉淀物中加入十二烷基磺酸钠(SDS)缓冲液制备总蛋白)用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,然后转移到硝酸纤维素膜上,如Harlow;1988所述。DbpA用针对DbpA C末端的七个氨基酸的抗体和Amersham ECL试剂盒进行测定。
DbpA的纯化:
将细菌沉淀物重悬于冷的含50mM Tris-HCl pH7.5,10%蔗糖,1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF),1mM氨基苯,2μg/ml抑肽酶,2μg/ml抑(蛋白)酶醛肽的溶液中(每升细菌培养物加0.5ml),置于冰-盐水浴中,氯化钠和溶菌酶分别加至终浓度100mM和150μg/ml。细胞在冰-盐水浴中放置30分钟,然后在37℃保温1分钟,再重新放回冰中。重复此步骤直至细胞裂解,悬浮液用超声波探头处理以切碎DNA,然后通过离心沉淀不溶性物质。(2700G,15分钟)。可溶性的部分置于冰上,边搅拌边缓慢加入聚乙烯亚胺(PEI,Sigma)至终浓度0.2%。10%的PEI贮备液按Gegenheimer(Gegenheimer,1990)所述通过透析50%的商品溶液(Sigma)制得。通过离心(12000G,15分钟)除去沉淀的核酸,上清液中的蛋白用60%的硫酸铵沉淀,然后27000G,15分钟离心收集。蛋白沉淀重悬于含50mM Tris-Hcl pH7.5,1mM PMSF,1mM氨基苯,2μg/ml抑肽酶,2μg/ml抑(蛋白)酶醛肽的溶液中(每升细菌培养物加0.5ml),12000G离心15分钟以除去任何颗粒物质。含DbpA的可溶性部分在50mM Tris-HCl pH7.5,50mM NaCl,10%甘油,1mM氨基苯溶液中,在pharmacia FPLC12柱(商标)上进一步纯化。然后通过在50mM Tris-HCl pH7.5,50mM NaCl 1mM氨基苯溶液中结合到单链DNA硝酸纤维素上,再用250mM NaCl洗脱,将DbpA纯化到均一程度。纯的蛋白存放在液氮中,活性可保持几个月。
ATP水解实验:
ATP酶活性实验在50mM Tris-HClpH7.5,5mM MgCl2,1mM DTT,含1μci〔γ-32p〕ATP的终浓度为0.1mM的ATP溶液中完成。除非特别说明,反应均包含纯的DbpA和大肠杆菌总RNA,总体积为20μl。除非有特别说明,反应混合物均在37℃保温1小时,通过加入3μl 0.5M EDTA终止反应。通过测量放射性磷酸的释放以测定ATP的水解;磷酸用薄层层析(TLC)从剩余ATP中分离。每个样品取2μl加入到聚乙烯亚胺薄层层析板上(Camlab),层析在1M甲酸,0.5M氯化锂溶液中室温放置三小时完成。反应产物用富士RX胶片通过放射自显影可看到。通过在液体闪烁计数器中计数薄层层板的相关区域可测得释放出的磷酸的量(如Cerenkov计数)。
估价一种物质影响微生物存活力的能力的一种更好的方法是利用依赖于RNA的ATP酶和公认的RNA解旋酶DbpA,此解旋酶对于许多细菌正常的RNA操作功能是必需的。此方法利用了DbpA的依赖于RNA的ATP酶活性。因此,一种更好的DbpA依赖于RNA的ATP水解实验包括在缓冲液中(例如,50mM Tris-HCl pH7.5,5mMMgCl2,1mM DTT)将DbpA蛋白与细菌RNA或核糖体RNA(rRNA),或特异的RNA底物(23S rRNA),和0.1mM ATP一起保温。通过测定从〔γ-32P〕ATP上释放的放射性磷酸的量可检测ATP的水解,从ATP释放出的放射性磷酸可以被分离,例如,在1M甲酸和0.5M Lice溶液中,用聚乙烯亚胺薄层层析板进行层析,或用其他的常规方法进行分离。放射量(对应于自由磷酸的量)可用Sambrook等所述的常规技术测定。也可用常规的ATP生物发光实验测量ATP的水解。这将使用96孔微量滴定板进行抑制剂的半自动筛选成为可能。
本实验测定了来源于某些细菌家族,包括人类致病菌在内的一系列革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的总RNA。这些菌包括:鼠伤寒沙门氏菌,弗莱斯纳氏志贺氏杆菌,克莱勃士肺炎杆菌,支气管败血性鲍台氏菌和枯草杆菌。这些RNA均能激活大肠杆菌DbpA对ATP的水解。
下表列出了一些抗微生物制剂的例子。如不可被水解的类似物,同时也列出了当抗微生物制剂加入到反应混合物中时所测得的核苷酸磷酸酶(DbpA)的ATP酶活性。ATP酶活性的百分值是与对照样相比后两次实验的平均值。抗微生物制剂均过量10倍。
(表)
抗微生物制剂 ATP酶活性的百分值5’-p-氟磺酰苯甲酰腺苷 2%腺苷5’〔B,γ-亚氨〕三磷酸 52%腺苷5’-〔γ-硫代〕三磷酸 57%腺苷5’-〔B,γ-亚甲基〕三磷酸 90%
结果:
DbpA的转译起始:
所预测的DbpA氨基酸序列与其他大肠杆菌DEAD盒蛋白基因的产物序列的对比表明,DbpA基因在5’端明显地更短一些。然而,dbpA DNA序列中存在一个符合读框的上游GTG密码子,它若被用为翻译起始码子,该基因将编码一个蛋白质,其“额外”的N端序列会与其他的大肠杆菌DEAD盒蛋白一起分享几个关键的保守氨基酸(或保守性替代物)(图1)。大约10%的大肠杆菌mRNA在GUG处转译起始,起始子tRNAfmet能与GUG相互作用而在起始位点给出一个蛋氨酸(Hershey,1987)。从真正的大肠杆菌启动子处表达DbpA蛋白的质粒中的原始dbpA分离物包含上游序列(包括推测的GTG起始密码子)。此质粒不能产生足够量的蛋白用于直接进行氨基酸测序,因此,为了确定哪一个密码子被正常用于转译起始,用可被IpTG诱导的pT7.7系统(Tabor,1985)构建了二个过量表达质粒。在其一,DbpA的转译起始于被原先认为是真正的起始密码子的ATG处,而在另一个中,转译起始于上游的GTG位点。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳将此二质粒产生的蛋白与初级克隆产生的蛋白作了比较。为了使pT7.7质粒在GTG处起始,此密码子被用寡核苷酸的指导的突变技术突变为ATG,以便在pT7.7体系中进行最适转译(见图2),从而这二个质粒具有相同的核糖体结合位点和转译起始密码子。
如图2所示,由bluescript克隆所产生的蛋白(泳道1)与在GTG处起始的pT7.7质粒所产生的蛋白(泳道4)有相同的大小,而且在bluescript克隆中未产生与起始于下游的ATG位点有相对的大小的蛋白(泳道3),这表明,对DbpA而言,当其自动启动子和核糖体结合位点被应用时,GTG为唯一的转译起始密码子,也表明,真实的全长DbpA蛋白包括AUG上游的序列。pT7.7质粒中全长蛋白的表达量比起始于内部AUG位点的蛋白表达量高许多(20-50倍,数据未列出)。因此初始的bluescript克隆的GTG密码子被突变为ATG(用寡核苷酸指导的突变)以确定这是否对转译效率有影响。事实上此突变消除了DbpA从其天然启动子处的表达(图2,泳道2)。这有些令人吃惊,因为通常GTG是比ATG转译起始效率低的密码子(Gold,1988)。有趣的是,在体外转录/转译反应中,未观察到这两个bluescript质粒在转译效率上有差异(数据未列出)。
目前尚不清楚为什么在pT7.7质粒中起始于GTG的全长蛋白的表达量比起始于内部ATG的蛋白的量高如此之多。虽二种蛋白的脉冲追踪分析表明,二者的稳定性无明显差别,另然全长蛋白处于稳定状态的水平反而更高一些(数据未列出)。细菌细胞总RNA制备物的Northern杂交不能确定二种质粒的dbpA RNA的相对水平是否有明显差异(数据未列出)。然而当细胞中其他RNA的水平也明显不同时,去比较二个质粒的dbpA转录水平是很困难的。当来自二种pT7.7表达质粒的细菌裂解物进行比较时,明显看到,在表达全长蛋白的质粒中,细胞中其他蛋白质的表达水平即使在IpTG诱导前也是很低的(图3)。而且DbpA常常得到一个高的本底表达水平(图3)。但在大规模制备物中,IpTG会导致DbpA产量的增加(数据未列出)。
DbpA的纯化和DbpA的ATP酶活性:
除非特别说明,均用从T7启动子(即GTG起始位点)表达完整DbpA基因的质粒进行蛋白质的生产。按“材料和方法”所述之方法培养DbpA表达细胞并用IpTG诱导且将蛋白质纯化至均一程度(图4)。DbpA粗提物含有高浓度的核酸(RNA和DNA),它会结合到DbpA蛋白质上,用常规方法不能去掉(例如高的盐浓度,DNA酶和RNA酶)。因此要用聚乙烯亚胺(PEI)从制备物中除去核酸。PEI可沉淀核酸,并经常在低盐浓度下沉淀结合了蛋白的核酸;随后用高盐可将蛋白从沉淀物中洗脱(Gegenheimer,1990)。然而对于50mM NaCl中的DbpA粗提物,当核酸被沉淀时,大部分的DbpA蛋白仍存在于溶液中,而且此步骤基本上完成了DbpA的纯化(见图4)。通过在硫酸铵中沉淀蛋白将PEI除去,经凝胶过滤(FPLC Superose12)和在单链DNA纤维素膜上层析即可得高纯度的DbpA制备物。常规情况下用此纯化方法可从每升细菌培养物中获得2-3mg的均一DbpA蛋白(终产物)。
通过测量DbpA水解ATP的能力以及确定比活性是否依赖于RNA的存在-DEAD盒蛋白家族的成员的功能特点-可以检测纯化的DbpA的生化功能。按“材料和方法”所述,纯蛋白的ATP酶活性可通过测定其从γ-32P标记的ATP上释放磷酸的能力而判定。如图5所示,在大肠杆菌总RNA存在下DbpA可水解ATP。在无RNA存在下,DbpA不表现此活性,而且当RNA酶加入反应物中时此ATP酶的活性将消失,表明此活性依赖于所加的RNA。因此,DbpA表现了DEAD盒蛋白家族的成员的特征性的RNA依赖性ATP酶活性,而且象家族中典型成员一样,其活性不被单链或双链DNA所激活。
DbpA水解ATP反应的Km值被确定为150μm,此值处于所报道的eIF-4A(50μm)(Grifo等,1984)和p68(100-1000μm)(Iggo&Lane,1989)的同样范围内。
也做了确定DbpA是否水解其它核苷三磷酸的实验。在用于表明DbpA水解ATP实验条件下,没有观察到放射性磷酸从γ-32P标记的GTP(所余仅有的商业上可获得的γ标记的核苷三磷酸)上释放出来,这表明该蛋白不水解GTP(数据未列出)。然后通过检查在标准的ATP酶测定中加入其它核苷酸是否与[γ-32P]ATP竞争,以确定DbpA是否水解其他的核苷酸。在每种情况下,未标记的核苷酸磷酸都过量10倍,只发现dATP与ATP存在竞争,但这是因为原先已证明dATP是DbpA的一个底物。在本发明范围内仍可能存在其他的核苷酸磷酸酶能水解其他的核苷酸磷酸。
对起始于原先被认为是真正的起始密码子的内部ATG位点的DbpA蛋白的生化活性也进行了测量。此蛋白含有DEAD盒蛋白特征性的七个保守区段(Iggo等,1990;Kalman等,1991;Fuller-Pace,1992)。虽然此蛋白可以象全长蛋白一样以相同方式结合到尿嘧啶多聚物琼脂糖(poly(U)Sepharose),ATP琼脂糖和单链DNA纤维素膜上,但是在纯的制备物中不能检测到任何ATP酶活性(数据未列出)。
ATP酶活性对RNA和蛋白质浓度的依赖性:
我们检查了DbpA水解ATP对大肠杆菌总RNA和DbpA蛋白浓度的依赖。在各种RNA浓度下,完成了在蛋白质浓度不断提高时的ATP水解实验。按“材料和方法”所述保温一小时后,测定了释放出的自由磷酸的量(图6)。在50ngRNA下,当DbpA浓度从50ng提高到200ng时,磷酸的释放不断增加;在更高的浓度下,未观察到产物进一步增加,这表明反应可能受到了RNA浓度的限制。(在每种情况下,只有一部分ATP参与了反应(数据未列出了))。当RNA浓度提高到400ng时,磷酸的释放量也随之增加。然而,每种情况都有一个十分相似的动力学模式,即当DbpA浓度大于200ng时,磷酸的释放不会进一步增加。这再次表明,虽然RNA浓度提高了,其水平仍是有限的(图6)。这意味着或者RNA在与DbpA反应后来恢复原来的构型,或者DbpA与RNA结合形成了一个复合物。为了区别这两种可能性,做了两个平行实验,其一限制DbpA浓度,另一限制RNA浓度(由图6确定)。在每个实验中,ATP水解按时间进程完成,反应分别在0,20,40和60分钟后被终止。20分钟后,更多的被限制了浓度的成分(DbpA或RNA)被加入到一组样品中,以确定是否会影响ATP水解的最终水平。图7A证实在限制RNA浓度条件下,加入更多的RNA促进了放射性磷酸从ATP的释放;在图7B中,DbpA的量被限制,反应中另外加入100ngDbpA导致释放出大约两倍的磷酸。
用更长的时间过程(120分钟),并在80分钟时额外加γ100ngDbpA或500ngRNA,重复了该实验,结果相同,这是一个非常有趣的结果。如果DbpA正在进行催化,应释放出相同总量的磷酸,但应更快达到反应终点。然而,增加DbpA量导致产物形成平行增加的结果表明,DbpA未从反应中释放出来以进行下一轮催化,而是与RNA一起存在于一复合物中。
DbpA的特异性RNA底物的确认:
为了确定在ATP水解反应中对RNA的需求是否存在任何特异性,利用了各种RNA制备物,包括大肠杆菌、酵母和Hela细胞的总RNA,大肠杆菌的转运RNA,以及大肠杆菌和兔子的核糖体RNA。引人注意的是,只有大肠杆菌总RNA和大肠杆菌核糖体RNA激活了ATP酶的水解作用。用任何真核生物的RAN或tRNA都不能观察到水解(图8)。同样,象大肠杆菌DNA和M13单链DNA一样,polyURNA不能激活ATP的水解(数据未列出)。这表明,不同于到目前为止被检测过的其他DEAD盒蛋白,DbpA在底物要求上显示了一个与众不同的特异程度。例如,真核生物转译起始因子eIF-4A,大肠杆菌的SrmB,酵母拼接因子PRP16和梅树痘病毒的CI蛋白的ATP酶活性可被几种RNA激活,包括polyA或polyU(Grifo等,1984;Nishi等,1988;Schwer & Guthne,1991;Lain等,1991)。
为了确定是否是一个特殊的大肠杆菌核糖体RNA激活ATP水解,测试了商业上可得到的5SRNA和16S与23SrRNA的混合物(Boehringer)。5SrRNA未观察到活性)而16S和23SrRNA的混合物激活了ATP酶的活性(图8)。这表明激活DbpA水解ATP或同时需要16S和23SrRNA,或只需其一。有趣的是,通过煮沸和冰上快速冷却变性RNA并不影响它激活DbpA水解ATP的能力,这表明被DbpA识别的序列或二级序列是稳定的。
为了确定16S或23SrRNA中哪一个是DbpA的底物,这两种RNA被分别体外合成,并被直接用于ATP水解反应。为了获得合适的体外合成这些RNA的质粒,编码16S和23SrRNA的基因被从含所有大肠杆菌rRNA基因(作为rrnB操纵子)(Brosius,1981)pKK3535质粒亚克隆到体外转录载体上,如“材料和方法”所述,16S和23SrRNA分开合成,对16S和23SrRNA都分别合成了各自的正义和反义RNA。随后这些RNA被用作ATP水解反应中的底物。在这些实验中,只有23S正义RNA激活了ATP的水解;而23S反义和16S正义及反义RNA不能作为DbpA的底物(图9)。即使用更高浓度的RNA(1μg),16S RNA和23S反义RNA仍不能激活ATP的水解(数据未列出)。这些发现表明,在生理环境中DbpA特异地与23S rRNA反应,且不同于目前研究过的其他DEAD盒蛋白,DbpA在反应中对RNA底物表现了与众不同的特异性要求。
已经确定,DbpA所作用的23S rRNA分子的特异位点位于2418-2605碱基区内。一个包含此区域的RNA片段可激活DbpA的全部ATP酶活性。
讨论:
以前未被描述特征的大肠杆菌DEAD盒蛋白DbpA已被高水平表达,并在此描述了一个快速制备毫克量的均一DbpA蛋白的方法。重组DbpA生化特征的确定导致了以下有意义的发现。1DbpA以依赖RNA的方式水解ATP,此活性是DEAD盒蛋白家族典型成员的特点;2在限定RNA或蛋白量的条件下的ATP水解实验表明,在ATP水解反应中DbpA和其RNA底物之间形成了一复合物;3DbpA特异地与原核生物23S rRNA相互作用,只有此RNA能激活DbpA对ATP的水解;(4)虽然DbpA可结合到各种RNA分子上,但只有在原核生物23SrRNA存在下才能水解ATP。
ATP水解反应中DbpA所表现的对RNA的这种特异性要求的发现是极为令人感兴趣的,这是DEAD盒蛋白表现此种序列特异性的首次记录。到目前为止,在生化上研究过的其他DEAD盒蛋白都未表现出此种特异性要求。例如,真核生物翻译起始因子eIF-4A和梅树痘病毒的CI蛋白不仅将在各种RNA底物(分别包括poly U和poly A)存在时水解ATP(Grifo等,1984;Lain等,1991),而且将解旋一定范围的合成的RNA底物(Rozen等,1990;Lain等,1990)。未检测到类似的小的合成RNA分子的解旋(数据未列出)。这也许并不奇怪,因为在RNA相互作用水解ATP时,DbpA表现出如此的特异性,同时所使用的底物并不激活ATP水解。23S rRNA分子的大小(2904个碱基)和其相当重要的二级结构(Noller,1984)使得很难使用常规的凝胶移动方法(Hirling等,1989;Rozen等,1990)确定DbpA是否解旋此RNA的某些特异区段。
DbpA和23S rRNA相互作用的特异性可能起源于一种序列和二级或三级结构上的结合,虽然煮沸过的RNA仍是合适的底物的发现意味着某一个特殊序列可能是此特异性的决定因素。对能够激活DbpA的全部ATP酶活性的在23S rRNA上位于2418-2685碱基间区域的确认证实了此观点。DEAD盒蛋白的底物中的此种序列特异性可能解释了如下发现:即使在具有相对小的基因组的有机物中,也存在几种DEAD盒蛋白(Linder,1989),而且大肠杆菌的五个DEAD盒蛋白间的互补实验表明这些蛋白质彼此不能互补(Kalman等,1991),这表明它们担负不同的功能,可能作用于不同的RNA底物。
23S rRNA与5S rRNA和34个核糖体蛋白一起形成了大肠杆菌核糖体的大亚基(50S)。无论在体外还是在体内,50S大亚基的组装包括三个可详细说明的阶段(Dohme,1976;Niehaus,1982)。在体外,一半核糖体蛋白与RNA结合后需要加热以进一步进行反应的发现表明此阶段需要一个构型的改变,而且,当核糖体的体内组装只需要在37℃几分钟即可完成时,50S亚基的体外重新组装的二步途径却需要在高温下保温很长时间(Dohme 1976;Herold & Niehaus,1987)。因此,核糖体RNA的构型可能需要精微的修饰(可能通过部分解链)以便正确地组装成核糖体亚单位。在体内此步可能由RNA解旋酶完成,而在体外重新组装实验中可能缺少此酶。也有一些遗传证据表明,在大肠杆菌中其他的DEAD盒蛋白也与核糖体的装配有关,这些基因包括srmB和deaD基因,二者在高水平表达时,可分别抑制编码核糖体蛋白L24和S2的基因中的温度敏感突变(Nishi等;1988;Tooen等,1991),因此核糖体的正确组装可能也需要DbpA。目前已经发现,tRNA与16S和23S rRNA相互作用(Moazed等,1988;Moazed & noller,1989),也发现转录延长因子EF-G和EF-Tu可与23S rRNA的一个保守的环形结构相互作用(Moazed等,1988)。这些发现强调了核糖体内的这些RNA的正确构型对实现正确转译的重要性。因此此处所述的DbpA,即公认的RNA解旋酶,特异性地与23S rRNA相互作用的观察意味着此蛋白可能在翻译中起着另外的作用,这对DbpA在核糖体的结构、组装或功能上的作用的认识可能有深刻的启示。
DbpA的ATP酶活性的激活特异地需要23SrRNA的发现引起了一个有趣的问题。DbpA可与poly U(数据未列出)和单链DNA结合。事实上单链DNA纤维素膜也被用为一个最后的纯化步骤(见上)。因此这表明在DbpA与RNA的仅仅结合和DbpA与导致ATP水解的RNA底物的特异性相互作用间存在着差异。
此处已经表明,在dbpA基因中翻译起始并不发生在原先预测的AUG(或DNA中的ATG)密码子处(Iggo等,1990),而是发生在一个上游的符合读框结构的GUG(或DNA中的GTG)密码子处。即使在内源的dbpA启动子和核糖体结合位点都被利用的质粒结构中,转译仍然起始于GTG处,而不是在ATG处。而且,当此质粒中的GTG被突变为ATG时,DbpA的表达事实上也不存在了。这表明存在一个要求GTG作为起始密码子的非同寻常的转译起始机制。大约10%的大肠杆菌mRNA使用GTG作为起始密码子(Hershey,1987)。
然而有趣的是,在真正的DbpA启动子和核糖体结合位点都被利用的质粒中,当GTG被突变成ATG时,DbpA基本上不再表达。(ATG通常是比GTG更有效的转译起始密码子)。因此这表明对于DbpA,看来存在一个非同寻常的转译起始机制,此机制只识别GTG,而非ATG作为转译起始密码子。另外。DbpA的高表达导致细胞中其他蛋白正常转译的明显减少的发现是富有启发性的,暗示了DbpA可能行使了某些普遍的转译反馈抑制的功能。今后可溶性的均一且稳定的有酶促活性的高水平的DbpA的生产将允许详细分析此蛋白在细胞中的生化功能。
许多抗生素类药物是通过抑制细菌中蛋白质的生成起作用的。然而一些对这些抗生素有抗性的菌株已经出现。DbpA对RNA底物以及与23S rRNA相互作用的高度特异性为新一代治疗药物,如抗生素的生产提供了可能。
用于治疗药物如抗生素、抗体生产的常规技术已被描述。不被此特殊RNA解旋酶水解的ATP类似物可以作为一种有效的抗生素。这种情况下此RNA解旋酶将失去能力来源,从而停止行使功能。这对微生物是有害的,而对真核宿主是无害的,因为RNA解旋酶(如DbpA)对真核细胞的转译是无效且不必要的。参考文献
下面列出本论文的参考文献:Brosius,J,Ullrieh,A,Baker,M A,Gray,A,Dull,TJ,Gutell,RR,and Noller,H F(1981).Plasmid 6,112-118.Chang,T H,Arenas,J and Abelson,J(1990).Proc Natl Acad Sci U S A 87,1571-5.Dohme,F and Nierhaus,K H(1976).J Mol Biol 107,585-590.Fuller-Pace,F V and Lane D P.(1992).In Nucleic Acids and Molecular Biology F Eckstein and DM J Lilley,eds(Berlin:Springer-Verlag),6,159-173.Gegenheimer,P(1990).Methods Enzymol.182,174-193.Gold,L.(1988).Ann Rev.Biochem.57,199-223.Grifo,J A,Abramson,R D,Satler,C A and Merrick,W C(1984).J Biol.Chem.259,8648-8654.Harlow,E and Lane,D(1988).in Antibodies,ALaboratory Manual.(Cold Spring Harbor,New York:ColdSpring Harbor Laboratory).Herold,M and Nierhaus,K H(1987).J Biol Chem 262,8826-33.Hershey,J W B(1987).In Escherichia coli andSalmonella typhimurium,Cellular and Molecular Biology.F C Neidhardt,ed.(Washington,DC,American Society ofMicrobiology).Hirling,H,Scheffner,M,Restle,T andStahl,H.(1989).Nature 339,562-4.Iggo,R,Picksley,S,Southgate,J,McPheat J and Lane D P(1990).Mucleic Acids Res 18,5413-7.Iggo,R D,Jamieson,D J 7 MacNeill,S A,Southgate,J,McPheat,J and Lane,D P(1991).Mol Cell Biol 11,1326-33.Iggo,R D and Lane,D P(1989).Embo J.8 1827-31.Kalman,M,Murphy,H and Cashel,M(1991).New Biol 3;886-95.Lain,S,Martin,M T,Riechmann,J L andGarcia,J A(1991).J Virol 65,1-6.Lain,S,Riechmann,J L and Garcia,J A(1990).NucleicAcids Res 18,7003-6.Linder,P,Lasko,P F,Leroy,P,Melsen,P J,Nishi,K,Schnier,J,Slominski,P P(1989).Nature 337,121-122.Moazed,D and Noller,H F(19S9).Cell 57,585-97.Moazed,D,Robertson,J M and Noller,H F(1988).Nature 334,362-4.Nierhaus,K H(1982).Curr.Top.Microbiol.Immunol.97,82-155.Nishi,K,Morel,D F,Hershey,J W,Leighton,T andSchnier,J(1988).[published erratum appears in Nature1989 Jul 20;340(6230):246].Nature 336,496-8.Noller,H P(1984).Ann.Rev.Biochem.53,119-162.Rozen,F,Edery,I,Meerovitch,K,Dever,T E,Merrick,W.C.and Sonenberg,N.(1990).Mol Cell Biol 10,1134-44.Sambrook,J,Fritsch,E.F,Maniatis,T(1989).Molecular Cloning A laboratory ManualSecond Edition.Second Edition,(Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory)Schmid,S R and Linder,P(1992).Mol Microbiol 6,283-91.Schwer,B and Guthrie,C(1991).Nature 349,494-9.Studier,F W.,Rosenberg,A H.,Dunn,J J,Dubendorff,J W(1990).Methods Enzymol.185,60-89.Tabor,S and Richardson,C C(1985).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,1074-1078.Toone,W M,Rudd,K E and Friesen,J D(1991).J Bacteriol 173,3291-3302.
【序列表】
申请人:邓迪大学董事会
地址:Tower Building,D
undee,DD1 4HN
发明名称:抗微生物制剂及其筛选
序列数目:2
计算机可读形式:IBM PC兼容的MS-DO
S系统的3.5寸小盘
软件:Wordperfect 5.1
SEQ.ID.NO:1的信息
(i)序列特征
(A)长度:1374个碱基
(B)类型:核酸
(C)链型:双链(只列出了编码链)
(D)构型:线形
(ii)分子类型:从基因组DNA衍生的质粒
(iii)假说:无
(iv)反义:无
(v)片段类型:编码区
(vi)来源:大肠杆菌DH5α
(ix)特征:被改变了的起始密码子
(A)名称/关键:ATG1
(B)位置:1-3碱基
(ix)特征:原先被视为起始密码子
(A)名称/关键:ATG2
(B)位置:75-77碱基SEQ.ID.No:1ATG ACC GCT TTT TCT ACC CTG AAT GTT TTG CCT CCC GCC CAA CTC ACG 48AAC CTT AAT GAG TTG GGT TAT TTA ACC ATG ACG CCG GTG CAG GCC GCC 96GCG CTT CCG GCG ATC CTT GCC GGA AAA GAT GTT CGC GTG CAG GCG AAA 144ACC GGC AGC GGC AAA ACG GCG GCT TTT GGC CTC GGC TTG TTA CAG CAA 192ATT GAT GCG TCG CTA TTT CAA ACC CAG GCT TTA GTG CTG TGT CCT ACG 240CGT GAA CTG GCG GAT CAG GTG GCA GGT GAA TTG CGT CGG CTG GCG CGT 288TTT CTG CCA AAT ACC AAA ATT TTG ACG TTG TGC GGT GGT CAA CCG TTC 336GGT ATG CAG CGT GAT TCG TTG CAA CAT GCG CCG CAT ATT ATC GTG GCA 384ACG CCG GGG CGT TTG CTG GAT CAC CTG CAA AAA GGC ACG GTA TCA CTG 432GAT GCG TTG AAT ACG CTG GTG ATG GAT GAG GCC GAC CGC ATG CTG GAT 480ATG GGA TTT AGC GAT GCC ATT GAT GAT GTC ATC CGT TTT GCG CCT GCA 528TCT CGA CAG ACG CTT CTG TTT TCG GCA ACC TGG CCG GAA GCC ATC GCT 576GCA ATC AGC GGA CGA GTG CAA CGC GAT CCT TTG GCG ATT GAA ATT GAC 624TCA ACA GAT GCT TTG CCA CCC ATT GAA CAA CAA TTT TAT GAG ACA TCC 672AGC AAA GGC AAA ATT CCT CTG TTG CAA CGG TTA TTA AGC TTG CAT CAG 720CCA TCC TCT TGC GTG GTG TTT TGC AAT ACC AAA AAA GAT TGC CAG GCT 768GTC TGC GAC GCG CTG AAT GAA GTA GGG CAA AGT GCA TTG TCA TTA CAC 816GGC GAT TTG GAG CAA CGC GAT CGC GAT CAG ACC CTG GTA CGT TTT GCT 864AAC GGT AGC GCC CGT GTA CTG GTC GCG ACT GAT GTT GCT GCG CGT GGT 912CTG GAT ATT AAA TCG CTT GAG CTG GTG GTG AAC TTT GAG CTG GCG TGG 960GAC CCT GAA GTT CAT GTA CAT CGC ATC GGT CGT ACA GCT CGT GCA GGA 1008AAT AGC GGT CTG GCG ATC AGT TTC TGT GCT CCG GAA GAA GCA CAG CGG 1056GCC AAT ATC ATT TCT GAC ATG TTG CAG ATA AAA CTT AAC TGC CAA ACG 1104CCG CCA GCT AAT AGT TCC ATT GCG ACG CTG GAA GCA GAA ATG GCA ACG 1152TTG TGT ATC CAT GGC GGG AAA AAA GCC AAA ATG CGC CCG GGT GAT GTA 1200TTA GGT GCA CTG ACA GGA GAT ATC GGG CTT GAT GGC GCA GAT ATT GGC 1248AAA ATC GCC GTG CAT CCG GCG CAT GTC TAT GTC GCG GTC CGT CAG GCT 1296GTT GCT CAT AAA GCA TGG AAA CAG TTA CAG GGC GGG AAG ATT AAA GGA 1344AAA ACG TGC CGG GTG CGG TTA TTA AAA TAA 1374SEQ.ID.NO:2的信息 (i)序列特征
(A)长度:1614个碱基
(B)类型:核酸
(C)链型:双链(只列出了编码链)
(D)构型:线形 (ii)分子类型:从基因组DNA衍生的质粒 (iii)假说:无 (iv)反义:无 (vi)来源:大肠杆菌DH5α (ix)特征:被改变了的起始密码子
(A)名称/关键:ATG1
(B)位置:130-132碱基 (ix)特征:原先被视为起始密码子
(A)名称/关键:ATG2
(B)位置:205-207碱基SEQ.ID.NO:2GAT CCC TCG CCC GCA ACC CAT GCC TGA CCC ACC ACC CGA TGA AGA ACC 48GAT TAA ATT GTC GCA TCG TGA GCG TAG ATC TGC GAG GAT ACG CGC CTG 96CTA ACT TTG CGT CGA TGA CCA CGA GAA TAG ATT ATG ACC GCT TTT TCT 144ACC CTG AAT GTT TTG CCT CCC GCC CAA CTC ACG AAC CTT AAT GAG TTG 192GGT TAT TTA ACC ATG ACG CCG GTG CAG GCC GCC GCG CTT CCG GCG ATC 240CTT GCC GGA AAA GAT GTT CGC GTG CAG GCG AAA ACC GGC AGC GGC AAA 288ACG GCG GCT TTT GGC CTC GGC TTG TTA CAG CAA ATT GAT GCG TCG CTA 336TTT CAA ACC CAG GCT TTA GTG CTG TGT CCT ACG CGT GAA CTG GCG GAT 384CAG GTG GCA GGT GAA TTG CGT CGG CTG GCG CGT TTT CTG CCA AAT ACC 432AAA ATT TTG ACG TTG TGC GGT GGT CAA CCG TTC GGT ATG CAG CGT GAT 480TCG TTG CAA CAT GCG CCG CAT ATT ATC GTG GCA ACG CCG GGG CGT TTG 528CTG GAT CAC CTG CAA AAA GGC ACG GTA TCA CTG GAT GCG TTG AAT ACG 576CTG GTG ATG GAT GAG GCC GAC CGC ATG CTG GAT ATG GGA TTT AGC GAT 624GCC ATT GAT GAT GTC ATC CGT TTT GCG CCT GCA TCT CGA CAG ACG CTT 672CTG TTT TCG GCA ACC TGG CCG GAA GCC ATC GCT GCA ATC AGC GGA CGA 720GTG CAA CGC GAT CCT TTG GCG ATT GAA ATT GAC TCA ACA GAT GCT TTG 768CCA CCC ATT GAA CAA CAA TTT TAT GAG ACA TCC AGC AAA GGC AAA ATT 816CCT CTG TTG CAA CGG TTA TTA AGC TTG CAT CAG CCA TCC TCT TGC GTG 864GTG TTT TGC AAT ACC AAA AAA GAT TGC CAG GCT GTC TGC GAC GCG CTG 912AAT GAA GTA GGG CAA AGT GCA TTG TCA TTA CAC GGC GAT TTG GAG CAA 960CGC GAT CGC GAT CAG ACC CTG GTA CGT TTT GCT AAC GGT AGC GCC CGT 1008GTA CTG GTC GCG ACT GAT GTT GCT GCG CGT GGT CTG GAT ATT AAA TCG 1056CTT GAG CTG GTG GTG AAC TTT GAG CTG GCG TGG GAC CCT GAA GTT CAT 1104GTA CAT CGC ATC GGT CGT ACA GCT CGT GCA GGA AAT AGC GGT CTG GCG 1152ATC AGT TTC TGT GCT CCG GAA GAA GCA CAG CGG GCC AAT ATC ATT TCT 1200GAC ATG TTG CAG ATA AAA CTT AAC TGG CAA ACG CCG CCA GCT AAT AGT 1248TCC ATT GCG ACG CTG GAA GCA GAA ATG GCA ACG TTG TGT ATC GAT GGC 1296GGG AAA AAA GCC AAA ATG CGC CCG GGT GAT GTA TTA GGT GCA CTG ACA 1344GGA GAT ATC GGG CTT GAT GGC GCA GAT ATT GGC AAA ATC GCC GTG CAT 1392CCG GCG CAT GTC TAT GTC GCG GTC CGT CAG GCT GTT GCT CAT AAA GCA 1440TGG AAA CAG TTA CAG GGC GGG AAG ATT AAA GGA AAA ACG TGC CGG GTG 1488CGG TTA TTA AAA TAA TGA AAT GTT GAA TTG CCG GGT GCA AGA GTA AAC 1536ATC TTA TTC GGG ATT GCC GGA TGC GAC GCT GGC CGC GTC TTA TCC GGC 1584CTC CAT AAG AGT AGC CCG ATA CGC TTG CGC 1614