放射致敏二胺及其药物组合物 本发明背景
本发明涉及新的放射致敏化合物，尤其涉及取代的、具有2-4个亲电子放射致敏官能团的二胺，其药物制剂，以及制备和使用该种新的、低氧肿瘤细胞高效放射致敏剂的方法。
仅仅在美国，作为与癌症斗争的组成部分，每年有超过50万的病人经历放射性治疗。然而，至今为止，放射性治疗在抗癌领域中仅仅收到有限的效果。因此可以理解，多少年来，为了开发能够改进该放射性治疗功效的方法，人们进行了大量的努力。
已确信，在抗辐射剂存在下，肿瘤中低氧(氧合作用差)细胞是引起常规放射性治疗癌症局部失败的重要因素。例如，Gatenby等人在Int.J.Radiat Oncol.Biol.Phys.14：831-833(1988)中报道，对于头和颈部肿瘤来说，低氧肿瘤细胞的体积与肿瘤的放射敏感性成反向关系。其它报道证实，该结论适用于各种类型的肿瘤，并指出，肿瘤中低氧细胞浓度为2-3％时，控制肿瘤所需要的照射剂量可能需要加倍。
已提出使用各种溶液来克服低氧问题，包括在高压氧仓中进行照射治疗和用“快中子”或π重电子照射代替X-射线。然而，由于各种原因，包括花费高和常见地、与该方法有关的困难，使得这些技术不能完全令人满意。
在处理抗辐射低氧肿瘤细胞研究中，一个有可能成功的领域是应用“放射致敏化合物”，它选择性地增加低氧细胞对照射的敏感性。低氧细胞的这种特异性也是有价值的，因为该种细胞的特征是固体肿瘤占的比例很大，而大多数正常组织不是这样。因此，用该种化合物治疗使得照射对肿瘤细胞的影响增强，同时对健康细胞组织的影响很小。大量杂环、亲电子化合物，并且特别是那些具有氧化氮部分的化合物已成功地用于放射致敏低氧肿瘤细胞。特别是发现硝基咪唑，如甲硝唑(metro)和misonidazoles(miso)可以致敏低氧细胞使其对照射敏感化后，人们对提供一种能够解决肿瘤低氧问题的突破性溶液持乐观态度。然而，不幸的是已证明，上述两种药物在治疗水平下毒性很大。因此，显然需要更有效的放射致敏化合物，并且可以在低剂量下给予该化合物来减小毒副作用。
本发明概述
因此，本发明的目的是提供用于癌症的放射性治疗的新的、以低氧肿瘤作为靶的放射致敏剂。在特定剂量下，包含具有2-4个亲电子放射致敏官能团二胺衍生物的这些化合物大大增强低氧肿瘤的放射致敏性并因此减小对正常身体组织的毒副作用。本发明也提供制备该放射致敏化合物的中间体和方法，并提供在放射致敏低氧肿瘤细胞中和在破坏温血动物的该种肿瘤细胞中应用该化合物和包含该化合物的药物组合物的技术。
因此，简单地说，本发明提供新的化合物或其盐，所述化合物包含具有2-4个亲电子放射致敏官能团的二胺。本发明进一步提供用于放射致敏低氧肿瘤细胞的药物组合物，它包含放射致敏量的上述二胺或其可药用盐和可药用载体的混合物。
本发明进一步涉及含有用于制备本发明优选二胺的中间体的组合物，该组合物包含硝基咪唑或其衍生物，其中，组合物中所包含的硝基咪唑化合物或其衍生物中，至少大约50％(重量)包含具有式(6)结构的醛：其中R5为氢，低级烷基或卤素，R6为氢，低级烷基，卤素或硝基，并且A′包含在其链上具有大约1-8个碳原子的碳链。
本发明另一方面提供制备式(1)的本发明优选二胺的方法其中A包含在其链上具有约2-10个碳原子的碳链，R1，R2，R3和R4为H或T，T为其中A′包含在其链上具有约1-8个碳原子的碳链，R5为H，低级烷基，或卤素，并且R6为H，低级烷基，卤素或硝基，条件是至少R1和R2中的一个为T，并且至少R3和R4中的一个为T，该方法包括下列步骤
(a)、利用由草酰氯活化的二甲基亚砜将式(5)化合物转化为式(6)化合物，和
(b)、在有机酸和还原剂存在下，用在其主链上具有2-10个碳原子的二胺来处理式(6)化合物
本发明另一方面提供放射致敏低氧肿瘤细胞的方法，它包括将放射致敏量的上述药物组合物给予低氧肿瘤细胞。相应地，本发明也提供杀灭温血动物低氧肿瘤细胞的方法，它包括将放射致敏低氧肿瘤细胞有效量的上述药物组合物给予温血动物，然后，在足够增强低氧肿瘤细胞放射致敏作用的时间间隔后，用杀灭低氧肿瘤细胞有效剂量的射线照射低氧肿瘤细胞。
本发明的其它目的和特征部分是显而易见的并且一部分将在下文中指出。本发明优选实施方案的详细说明
按照下文所描述的方法，已制备出本发明多官能团二胺衍生物，它们所表现出的放射致敏功效高达单一官能团放射致敏化合物如甲硝唑的400倍。而且，通过用体外菌落形成分析来评估细胞存活率，证明在轻度加热条件下，用本文所描述的有代表性的取代二胺治疗是非常有效的，使得低氧细胞变得对放射性更敏感，成为完全氧合(fully oxic)的细胞群。结果是，由于放射致敏功效大大增强，可以给予剂量低得多的这些化合物就达到相同或者更大放射致敏的低氧肿瘤细胞，同时，对于有效地放射致敏低氧肿瘤细胞所需要的任何特定剂量水平来说，它对健康组织的毒副作用降低。
不受任何理论的限制，假设该类化合物所表现出的明显高的功效是由于至少两种因素的协同作用。首先，二胺部分为弱碱性的。据认为，其机理是所连接的放射致敏部分将以主要为酸性的低氧肿瘤细胞作为其作用目标的机理。而且，二胺很可能被吸引到该类细胞中的脱氧核糖核酸(DNA)上，所述脱氧核糖核酸由于其磷酸根含量高而呈酸性。其次，致敏功效大大增强有可能与射线诱导细胞死亡机理有关。据认为，为了在低水平射线下引起细胞死亡，要求在DNA或其附近多次电离。因此，含多个放射致敏官能团基的分子可能能够参与一次以上局部电离而不需要充分接近其它分子。
该种新的、有效的放射致敏剂包含具有2-4个亲电子放射致每官能团的取代二胺。优选地，本发明取代二胺包含具有下列通式的化合物：其中A包含在其链上具有约2-10个碳原子的碳链，R1，R2，R3和R4为H或T，T为其中A′包含在其链上具有约1-8个碳原子的碳链，R5为H，低级烷基，或卤素，并且R6为H，低级烷基，卤素或硝基，在优选的实施方案中，至少R1和R2中的一个为T，并且至少R3和R4中的一个为T。
更优选地，A为亚烷基，T为2-，4-或5-硝基咪唑基烷基，特别是5-硝基咪唑基烷基，R5为乙基或甲基，特别是2-甲基，R6为H，甲基或硝基，特别是H，并且A′为亚乙基或亚甲基，特别是亚甲基。该特别优选的化合物可以具有下列结构式
本发明特别优选的化合物包括二胺四甲硝唑(DATMs)如N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，4-丁二胺；N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，5-戊二胺；和N，N，N′， N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，8-辛二胺；和二胺二甲硝唑CDADMs如N，N′-二〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，4-丁二胺；N，N′-二〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，5-戊二胺；和N，N′-二〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，8-辛二胺。
通过使用适宜的反应流程式，将2个或多个亲电子放射致敏官能团连接到二胺的末端氮上来制备本发明放射致敏化合物。例如，优选的式(1)二胺：其中A包含在其链上具有2-10个碳原子的碳链，R1，R2，R3和R4为H或T，T为其中A′包含在其链上具有约1-8个碳原子的碳链，R5为H，低级烷基，或卤素，并且R6为H，低级烷基，卤素或硝基，其中至少R1和R2中的一个为T，并且至少R3和R4中的一个为T，可通过两步来制备，其中，利用中等强度的氧化剂，即由草酰氯活化的二甲基亚砜将式(5)硝基咪唑氧化其反应条件有利于形成具有式(6)结构的醛然后，在有机酸和还原剂存在下，用在其主链上大约具有2-10个碳原子的二胺来处理由此得到的醛，得到取代的二胺。
在上述反应流程式中形成重要醛中间体非常难得。Berg和Sharp在European Journal of Med.Chemistry 10：171-177(1975)中报道了一种方法用于生产在与未改变醇的混合物中含大约30％2-甲基-5-硝基咪唑-1-基-乙醛的粗品混合物。然而，从该混合物中分离游离醛的尝试引起游离醛的分解。用铬酸，铬酸-吡啶，铬酸叔丁基酯，硅藻土中的碳酸银和氯苯并三唑氧化甲硝唑只产生相应的酸。当在室温下进行铬酸氧化时，得到含大约7％2-甲基-5-硝基咪唑-1-基-乙醛的混合物。Berg和Sharp使用重铬酸钾-乙酸来氧化甲硝唑，但仅仅能够得到含量不超过30％醛的混合物，如上所述，该醛不能在不引起分解的情况下分离出来。
转化为醛也难以进行，因为甲硝唑不容易溶解在可进行氧化反应的溶剂中。然而，申请人发现，对于该反应来说，用二甲基亚砜可以将甲硝唑溶解。
因此，申请人开发了一种方法，在该方法中，所生产的组合物在甲硝唑和甲硝唑衍生物的混合物中，包含大于50％(重量)(以组合物中甲硝唑和甲硝唑衍生物总浓度计算)的所述硝基咪唑烷基醛并且从该方法中，可得到分离和纯化的醛。该方法通过改良的Swern氧化反应(见Huang和Swern，J.Organic Chemi stry 43：2480-2482，1978)，在反应混合物温度大约为-45℃--65℃下，优选大约在-50℃下进行。将用草酰氯活化的二甲基亚砜与醇反应形成烷氧基锍盐。加入三乙胺或类似物后，烷氧基锍盐很容易转化为羰基化合物，形成相应的醛。申请人进一步发现，如果在氧化反应结束，在如下开始醛的还原胺化反应之前，将反应混合物加热(例如，通过除掉用作制冷源的干冰和丙酮)不超过约10分钟，基本上可加速反应进程。
例如，通过下列反应流程式：来说明所公开的、如用于形成2-甲基-5-硝基咪唑-1-基-乙醛的氧化方法，该2-甲基-5-硝基咪唑-1-基乙醛具有下列结构式：
在氮气下，将CH2Cl2加到草酰氯中。将溶液冷却到-50℃，然后，将Me2SO滴加到搅拌的溶液中。加入溶解在Me2SO中的甲硝唑〔1-(2-羟乙基)-2-甲基-5-硝基咪唑。再次搅拌后，加入三乙胺，将反应混合物再搅拌并放置至室温。将得到的混合物稀释，洗涤，提取，过滤并干燥，得到分离并基本上纯化的醛。
通过在有机酸和弱还原剂存在下，按照下列反应流程式所显示的还原性胺化反应，将上述醛中间体与在其主链上具有约2-10个碳原子的二胺反应来合成优选的二-和四-硝基咪唑烷基二胺。在还原反应中，三乙酸硼氢化钠〔NaBH(OAc)3〕可有效地用作弱的和选择性还原剂。在还原步骤中，用有机酸，优选乙酸将反应混合物酸化。当控制反应物的相对量，使得所产生的醛与二胺的摩尔比大约为4.1∶1时，最有利于反应进行。
上述反应的好处为，它是高效率和方便的“单一容器”反应，因此允许同时制备二-和四-硝基咪唑基烷基二胺。
因为反应对称有利于在还原性胺化过程中加入二个或四个官能团基团，所以，为了形成含三个放射致敏官能团基的取代二胺，需要将适宜的位阻基团加到一个末端胺上。
将本发明化合物转化为其相应的盐是有利的，这有助于将其配制成药物组合物的水溶性制剂。可药用盐的实例包括将本发明取代二胺与下列酸反应形成的盐，所述酸包括葡糖酸，HCl，H3PO4，马来酸，草酸，乙酸，磺酸，硫酸，烟酸，葡糖醛酸和乳糖酸。在下文的实施例5中描述了获得该盐的方法。
本发明二胺衍生物，特别是刚刚描述的盐形式可以与本领域公知的各种赋形剂和/或佐剂混合，所述赋形剂和/或佐剂作为可药用载体使得药物可以以例如注射剂，悬浮剂，乳剂，片剂、胶囊剂和软膏剂等形式给予。可通过任何适宜的、放射致敏低氧肿瘤细胞的方法，给予含放射致敏量的所述取代二胺化合物的药物组合物。对于温血动物，尤其对于进行放射治疗的人来说，给药途径可以为口服，非肠道给药，皮下注射，静脉注射，肌肉内注射和/或腹膜内注射。为了杀灭低氧肿瘤细胞，以放射致敏低氧肿瘤细胞有效量(对于人来说为1-100mg/kg)给予含放射致敏二胺的药物组合物。所给予的具体剂量将依赖于病人的一般健康状况和身体条件以及病人的年龄，体重，病人疾病的阶段，和是否同时存在任何其它治疗。
将放射致敏的组合物给予低氧肿瘤细胞并经过足够增强低氧肿瘤细胞放射致敏作用的时间间隔后，用杀灭低氧肿瘤细胞有效量的射线照射低氧肿瘤细胞。通常，病人需要接受7-8周的照射，总照射剂量大约为60-76Gy，在给予放射致敏剂后大约1-4小时内给予各照射剂量。如果需要，依次重复该放射致敏治疗和照射来减轻并且最好消除恶性肿瘤的扩散。
当与加热治疗低氧肿瘤细胞同时进行时，由本发明放射致敏二胺所提供的放射致敏作用明显增强。例如，可通过在预先从37℃加热到41℃的温水浴中浸没或通过用微波头局部加热肿瘤来进行加热治疗。
为了进一步说明和解释本发明，下面提供几个实施例。
实施例1
制备2-甲基-5-硝基-咪唑-1-基乙醛
在氮气下，将2ml(22mmol)草酰氯滴加到160mlCH2Cl2中。将溶液冷却至-50℃下并在搅拌下，将17ml(240mmol)Me2SO滴加到该溶液中。大约20分钟后，加入溶解在15ml Me2SO中的3.42g(20mmol)甲硝唑〔1-(2-羟乙基)-2-甲基-5-硝基咪唑〕。再搅拌20分钟后，加入33ml(240mmol)三乙胺。将反应混合物再搅拌10分钟，然后温热至室温。将混合物用400ml乙酸乙酯稀释并用水洗涤4次，先用100ml水洗涤一次，再用50ml水洗涤3次。将250ml水洗涤液用250ml乙酸乙酯提取3次并将乙酸乙酯加到CH2Cl2中。将混合物用100ml饱和NaCl溶液洗涤，用无水MgSO4干燥，过滤，并旋转蒸发浓缩至干。将得到的粗品残渣通过闪式硅胶色谱层析纯化，得到所需醛的纯品(2-甲基-5-硝基咪唑-1-基-乙醛)。
通过下列数据评估所得到纯品醛的化学结构：
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ9.76(s，1H，CHO)，7.99(s，1H，咪唑H)，5.21(s，2H，CH2CHO)，2.41(s，3H，CH3).
实施例2制备N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙
基〕-1，4-丁二胺
将通过实施例1方法合成的2-甲基-5-硝基咪唑-1-基-乙醛(3.0g，17.6mmol)溶解在80ml的1，2-二氯乙烷中，加入0.44ml丁二胺(4.4mmol)，将反应混合物搅拌30分钟，然后用1ml乙酸(17.6mmol)酸化。然后加入4.48g三乙酸硼氢化钠(21.12mmol)作为还原剂并将溶液在室温下搅拌48小时。在整个方法过程中，将反应容器中通入氮气。将得到的混合物用60ml乙酸乙酯稀释，然后将混合物溶液用85ml饱和NaHCO3水溶液和30ml水洗涤。将水溶液合并用于进一步提取化合物(5)。将有机层用无水MgSO4干燥，并将溶剂蒸发，将残留的油状物在4℃下固化2天。将得到的固体在乙酸乙酯/己烷中重结晶得到N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，4-丁二胺(m.p.194-196℃)。
通过下列数据评估所合成的化合物的化学结构：
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.93(s，4H，咪唑H4)；4.28(t，J＝6.6Hz，8H，H2′)；2.81(t，J＝6.6Hz，8H，H1′)；2.55-2.52(m，4H，H1，H4)；2.52(s，12H，咪唑Me2)；1.25-1.23(m，4H，H2，H3).制备N，N′-二〔2-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-1，
4-丁二胺
将上述合并的水溶液用250ml乙酸乙酯再提取3次并用500ml二氯甲烷提取3次。将二氯甲烷溶液用40ml水洗涤，用MgSO4干燥，并减压蒸发。将残留的油状物在4℃下冷却至结晶。将得到的固体在乙酸乙酯/已烷中重结晶，得到N，N′-二〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-1，4-丁二胺。
通过下列数据进行化学结构分析：
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.93(s，2H，咪唑H4)；4.38(t，J＝6.6Hz，4H，H1′)； 2.57-2.53(m，4H，H1，H4)；2.50(s，6H，咪唑 Me2)；.75(br，s，2H，NH，N，H)；1.40-1.39(m，4H，H2，H3)。
实施例3制备N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙
基〕-1，5-戊二胺
将通过实施例1方法合成的2-甲基-5-硝基咪唑-1-基-乙醛(3.6g，19.5mmol)溶解在80ml 1，2-二氯乙烷中，加入0.57ml戊二胺(4.88mmol)，将反应混合物搅拌30分钟，然后用1.11ml乙酸(19.5mmol)酸化。然后加入4.96g三乙酸硼氢化钠(23.4mmol)作为还原剂并将溶液在室温下搅拌48小时。在整个方法过程中，将反应容器中通入氮气。将得到的混合物用60ml乙酸乙酯稀释，然后将混合物溶液用85ml饱和NaHCO3水溶液和30ml水洗涤。将水溶液合并用于进一步提取化合物(11)。将有机层用无水MgSO4干燥，并将溶剂蒸发，将残留的油状物在4℃下固化2天。将得到的固体在乙酸乙酯/己烷中重结晶得到N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，5-戊二胺(m.p.150-151℃)。
通过下列数据进行化学结构分析：
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.93(s，4H，咪唑H4)；4.24(t，J＝7.2Hz，8H，H2′)；2.78(t，J＝7.2Hz，8H，H1′)；2.51-2.49(m，4H，H1，H5)；2.49(s，12H，咪唑Me2)；1.26-1.20(m，4H，H2，H4)；1.1(m，2H，H3)
并通过下列数据评估碳原子数目：
13C NMR(CDCl3，75MHz)δ150.526(咪唑C5)；138.992(咪唑C2)；133.134(咪唑C4)；54.599(C2′)；54.159(C1′)；44.964(C1，C5)；26.964(CH2)；24.293(CH2)；14.019(咪唑Me2).制备N，N′-二〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-1，5-
戊二胺
将上述合并的水溶液用250ml乙酸乙酯再提取3次并用500ml二氯甲烷提取3次。将二氯甲烷溶液用40ml水洗涤，用MgSO4干燥，并减压蒸发。将残留的油状物在4℃下冷却至结晶。将得到的固体在乙酸乙酯/己烷中重结晶，得到N，N′-二〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-1，5-戊二胺。
通过下列数据进行化学结构分析：
by 1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.93(s，2H，咪唑H4)；4.38(t，J＝6.6Hz，4H，H2′)；2.94(t，J＝6.6Hz，NH，N′H)；1.42-1.22(m，6H，H2，H3，H4).
实施例4制备N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙
基〕-1，8-辛二胺
将通过实施例1方法合成的2-甲基-5-硝基咪唑-1-基-乙醛(3.52g，19mmol)溶解在80ml 1，2-二氯乙烷中，加入0.685g辛二胺(4.75mmol)，将反应混合物搅拌30分钟，然后用1.08ml乙酸(19mmol)酸化。然后加入4.83g三乙酸硼氢化钠(22.8mmol)作为还原剂并将溶液在室温下搅拌48小时。在整个方法过程中，将反应容器中通入氮气。将得到的混合物用60ml乙酸乙酯稀释，然后将混合物溶液用85ml饱和NaHCO3水溶液和30ml水洗涤。将水溶液合并用于进一步提取化合物(9)。将有机层用无水MgSO4干燥，并将溶剂蒸发，将残留的油状物在4℃下固化2天。将得到的固体在乙酸乙酯/己烷中重结晶得到N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，8-辛二胺(m.p.157158℃)。
通过下列数据进行化学结构分析：
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.93(s，4H，咪唑H4)；4.26(t，J＝6.9HZ，8H，H2′)；2.81(t，J＝6.6Hx，8H，H1′)；2.54-2.51(m，4H，H1，H8)；2.50(s，12H，咪唑Me2)；1.27-1.22(m，12H，H2，H3，H4，H5，H6，H7).
并通过下列数据评估碳原子数：
13C NMR(CDCl3，75MHz)δ 150.548(咪唑C5)；138.908(咪唑C2)；133.142(咪唑C4)；54.759(C2′)；54.045(C1″)；44.257(C1，C8)；29.051(C2，C7)；26.744(C3，C4，C5，C6)；13.951(咪唑Me2).制备N，N′-二〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-1，8-
辛二胺
将上述合并的水溶液用250ml乙酸乙酯再提取3次并用500ml二氯甲烷提取3次。将二氯甲烷溶液用40ml水洗涤，用MgSO4干燥，并减压蒸发。将残留的油状物在4℃下冷却至结晶。将得到的固体在乙酸乙酯/己烷中重结晶，得到N，N′-二〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-1，8-辛二胺。
通过下列数据进行化学结构分析：
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.93(s，2H，咪唑H4)；4.38(t，J＝6.6Hz，4H，H2′)；2.94(t，J＝6.6Hz，4H，H1′)；2.57-2.53(m，4H，H1，H8)；2.50(s，6H，咪唑Me2)；1.89(br，s，2H，NH，N′H)；1.45-1.20(m，12H，H2，H3，H4，H5，H6，H7).
实施例5制备N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙
基〕-1，8-辛二胺葡糖酸盐
通过将N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，8-辛二胺溶解在20ml CH2C12中来制备N，N，N′，N′-四〔2′-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)乙基〕-1，8-辛二胺游离碱的溶液。将2g在5ml水中的葡糖酸加到该溶液中。将纯MeOH滴加到得到的混合物中直至混合物变为均匀的溶液。将该溶液中加入50ml乙醚，然后加入200ml己烷，由此产生固体沉淀。将反应混合物冷却至4℃，通过烧结玻璃漏斗过滤该沉淀的盐，用无水乙醚洗涤并真空干燥。该右旋-葡糖酸盐在水中高度溶解。
实施例6
对低氧肿瘤细胞的放射致敏作用
在体外，评价化合物(8)和(10)对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的放射致敏作用，并且将结果与甲硝唑的作用进行比较。将细胞放置并使其附着在陪替氏玻璃培养皿中3小时，然后将基质用5ml加或不加药物的汉氏平衡盐溶液(HBSS)取代。为了引起细胞缺氧，在室温下，将培养皿放在密封的铝箱(8个培养皿/铝箱)中。通过泵抽吸铝箱中的气体，然后填充95％的N2和5％的CO2。在正气压下，将该方法重复4次，每次间隔5分钟。1小时后，当细胞严重缺氧时，将铝箱放在37℃水浴中1小时。对于oxic处理组来说，将细胞和5ml HBSS(±药物)放在37℃培养箱中2小时。将铝箱放在旋转的桌子上并暴露在由Generai Electric Maxit ron 300治疗仪在250kVp和20mA(HVL 20mm A1过滤器；剂量速率为2Gy/min)下操作产生的X-射线束中。照射后，将细胞用HBSS漂洗，并用新鲜的基质覆盖。将细胞在37℃培养箱中培养7天。将得到的细胞菌落染色并计数。结果显示于表1和2中。
表1：化合物(8)和(10)对CHO细胞的放射致敏作用。为了便于比较，将甲硝唑得到的值也显示于表中。化合物 药物剂量 SERa SERb 0.04SFd时 Do
(mM) (N2) (N2)(18 Gy) RTc剂量比 (Gy)
8 0.1 1.3 9.0 1.5 2.5
10 0.1 1.6 21.4 1.5 1.9 甲硝唑 0.5 1.0 1.9 1.1 3.3
N2 - - - - 3.3
O2 - - - - 1.4a＝致敏剂增强作用的比值，即缺氧不含药物条件下照射时的Do与缺氧含药物的Do的比值b＝存活部分的比值，即由一定照射剂量在加或不加药物时所产生的存活部分的比值c＝放射治疗d＝存活部分表2：当与甲硝唑比较时，化合物(8)和(10)对CHO细胞放射致敏作用的功效化合物 在20％存活水平下，致敏作用
的比率
8 50
10 400
在表2所显示的试验中，将缺氧CHO细胞用一次剂量为8Gy的X射线在加或不加药物下照射。细胞存活率减少到未处理对照值20％时所需要的药物体积克分子浓度为10mM(甲硝唑)，0.2mM(化合物8)，0.025mM(化合物10)。换句话说，化合物(8)的功效比甲硝唑大50倍，并且化合物(10)的功效比甲硝唑大400倍。
药物/加热的联合作用
为了测定化合物(8)和(10)的热-放射致敏作用，将缺氧CHO细胞用照射剂量范围为0-30Gy的射线(加或不加药物)照射。照射后，将铝箱放在37℃或41℃水浴中30分钟。然后，通过菌落形成分析来评估细胞存活率。结果显示于表3中。表3：在加热(41℃，30分钟)下，化合物(8)和(10)对CHO细胞的热-放射致敏作用。 化合物 药物剂量 Do (ug) (Gy)
8 50 0.8
10 10 0.6
O2 - 1.6
N2 - 40
从表3的结果明显可见，在放射致敏CHO细胞中，给予化合物(8)或(10)并结合适宜的高温治疗比单独给予药物治疗更有效。事实上，联合致敏作用的重要性是使得缺氧细胞变得对放射性的敏感性比不缺氧细胞更强(Do更小)。
实施例7
毒性数据(1)在体外
在4℃下给予0.2mM二胺四甲硝唑(DATM)(式8)和10mM甲硝唑2小时，发现在该剂量下对放射致敏的低氧CHO细胞具有同等的作用。因此，在37℃以下，将低氧CHO细胞用0.2mM DATM或10mM甲硝唑培养12小时。观察到用DATM培养的CHO细胞没有毒性作用，而用甲硝唑培养的CHO细胞在菌落形成上有95％减少。(2)在体内
在体内的预实验中，给两组小鼠腹腔注射1g/kg或4g/kg的DATM(式8)。观察到1g/kg组没有毒性，但在4g/kg组中全部小鼠都死亡。经比较，报告甲硝唑LD50(50％动物的致死剂量)约为3.3g/kg。因此，DATM的毒性似乎与相同剂量的甲硝唑的毒性基本相似，而其放射致敏能力较高。
由上文可见，本发明的一些目的被完成并获得了其它有益的结果。由于在不脱离本发明的范围下对上文化合物和方法可作各种改变，因此本说明书所包含的全部内容都应当是说明性的并且没有限制意义。