寡核苷酸烷基膦酸酯和 烷基硫代膦酸酯 本发明涉及用于反义方法的合成寡核苷酸。尤其是，本发明涉及具有修饰的糖磷酯骨架的合成寡核苷酸(这种修饰可增强其反义特性)以及它们的应用。
各种生物分子对细胞核酸靶位的序列特异性识别和结合是分子生物学过程的(如基因表达与调控)基础。根据序列特异的核酸靶位设计多肽用于包括治疗目的的许多应用是很困难的，因为至今关于蛋白质与DNA之间的序列特异性的识别与互相作用还知之甚少。然而，可以设计和开发序列特异性的寡核苷酸，通过与DNA上的任一预先确定的序列形成三螺旋而结合，和通过与RNA上的预定序列形成双螺旋而结合，因为碱基通过氢键的相互作用而互补识别。根据这一理论，在分子及细胞生物学中现已广泛地应用天然的和修饰的寡核苷酸来研究生物体内某些特殊基因所起的作用。
最近几年，在细胞培养系统中，已应用寡核苷酸与mRNA的相互作用来阻断特定基因地表达(Uhlmann等(1990)Chem.Rev.90：543-584；Helene等(1990)Biochem.Biophys.Acta 1049：99-125)。这些反义寡核苷酸可在体内用作治疗剂。例如，可应用反义寡核苷酸来抑制大鼠颈动脉的平滑肌细胞的迁移或生长(Simons等(1992)Nature 359：67-70)。
作为有用的治疗剂，反义寡核苷酸必须能被细胞吸收，并在此发挥作用。天然的磷酸二酯键相连的寡核苷酸由于其多阴离子性质不能有效地被细胞吸收。在细胞内它们也易于被核酸酶水解(见Wickstrom(1986)Biochem.Biophys.meth.13：97-102)，这样限制了它们在体内的应用。为了提高细胞的吸收及对核酸酶作用的抵抗，对这些寡核苷酸的糖磷酯骨架进行了修饰。如Ts′O等(美国专利No.4469863)和Miller等(Biochem.(1981)20：1874-1880)制备了含有甲基膦酸酯连键的寡脱氧核苷酸。其它修饰包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和磷酸酯(phosphate ester)。
现已合成了嵌合性的寡脱氧核糖核苷酸，它具有一种以上类型的核苷酸间连键，如上面描述的这几种修饰的连键。如Pederson等(美国专利NO.5149797，本文在此引入作为参考)公布了嵌合性寡核苷酸，它们有寡核苷酸磷酸二酯或者寡核苷酸硫代磷酸酯核心序列，该核心序列两侧有寡核苷酸甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。Furdon等(Nucleic Acids Res.(1989)17：9193-9204)公布了嵌合性寡脱氧核糖核苷酸，这些寡核苷酸除了有寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸酯或甲基膦酸酯外，还有寡核苷酸磷酸二酯区。Quartin等(NacleicAcids Res.(1989)17：(7523-7562)公布了具有寡核苷酸磷酸二酯和寡核苷酸甲基膦酸酯区的嵌合性寡脱氧核糖核苷酸。
许多这些修饰的寡核苷酸已提高了反义寡核苷酸的治疗效果。然而仍然存在某些不足，这些不足限制了寡核苷酸作为治疗剂的作用。如Agrawal等(proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：1401-1405)讲述了当寡脱氧核糖核苷酸氨基磷酸酯与RNA杂交时，不能激活RNA酶H，而该酶的激活对于反义寡核苷酸的功能来说是很重要的。Agra-wal等(Nucleosides & Nucleotides(1989)8：5-6)也讲述了当寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸酯与RNA杂交后，降低了双螺旋的稳定性。
因此，还有必要改进寡核苷酸来克服现有技术已知的寡核苷酸的缺陷。最理想的是，这样的寡核苷酸应该抵抗核酸酶的降解并能与RNA形成稳定的双螺旋体。
首先，本发明提供了具有非离子型核苷酸间连键的合成寡核苷酸类似物。该寡核苷酸类似物具有高度的核酸酶抗性，可与RNA形成十分稳定的双螺旋体，并具有必需的亲水性而容易被细胞吸收。这些类似物的必备条件就是在寡核苷酸内和/或在其一端或两端的任意选定位置上，他们至少有一个核糖核苷酸烷基膦酸酯或者烷基硫代膦酸酯。
在本发明中，“寡核苷酸”一词包括一个或多个核糖核苷酸单体至少通过一种5′到3′核苷酸之间的连键连接在一起的、或者连接到一个脱氧核糖核苷酸单体的多聚体。这种连键包括在反义寡核苷酸现有技术中已知的任何一种连键。此外，“寡核苷酸”一词也包括具有核酸/碱基和/或糖基修饰的分子，加入了如二胺、胆甾烯基和其它脂溶性基团取代基的分子，和2′位取代的核糖核苷单体。“寡核苷酸类似物”一词包括至少有一个非磷酸二酯核苷酸间连键和/或具有修饰的核酸/碱基和/或糖基的寡核苷酸。
在优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸类似物的长度范围为约2-约60个核苷酸，最优选的长度在约25-约30个核苷酸。因此，根据本发明的寡核苷酸将有1～约59个核糖核苷酸烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯，或者这两种连键的组合，并最好具有大约24到29个基团。
如本文所用，烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯是一含有膦酸酯或硫代膦酸酯连键的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或2′-取代的核糖核苷酸，并在2′位有一烷基，包括(但不限于)甲基，乙基，丙基，或丁基。
在本发明的一些实施方案中，该寡核苷酸类似物在其分子内的某些位置含有烷基膦酸酯和/或烷基硫代膦酸酯，而在其它位置含有通过磷酸二酯键或通过人造连键连接的天然核苷酸。这些称之为嵌合性或杂合性寡核苷酸。
如本文所用，人造核苷酸间连键是一种非磷酸二酯连键，它把核糖核苷酸单体从5′到3′连接在一起，它包括(但不局限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、碳酸酯、磷酸酯(phosphate ester)、氨基磷酸酯和氨基甲酸酯。在本发明的另一实施方案中，该寡核苷酸类似物至少含有一个，最好是6-10个，2′-取代的核糖核苷酸。在本发明中，“2′-取代的”含意为：用，如2′-O-甲基、2′-烯丙基、2′-芳基、2′-烷基、2′-卤基、或2′-氨基，但不用2′-H取代戊糖分子中的2′-OH，其中，烯丙基、芳基、或烷基可以用卤基、羟基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、三氟甲基、烷酯基、氨基不取代或取代。
第二，本发明提供了用于治疗的药物配方，它对于治疗病毒感染、病原性微生物感染、或由于因异常基因表达或异常基因产物的表达而导致的疾病是很有效的。这类治疗的药物配方包括根据本发明第一部分的、生理上可接受载体携带的寡核苷酸。
第三，本发明提供了应用上面已描叙的寡核苷酸类似物抑制病毒基因、病原微生物基因、或细胞基因表达的一种方法。该方法包括用本发明的寡核苷酸类似物处理在前两种情况下病毒或病原性微生物感染的细胞，或一般来说后一种情况下的细胞。
第四，本发明提供了一种治疗哺乳动物所患的某些疾病或异常的方法，这些疾病或异常是由于病毒或病原微生物感染，或是由于某一细胞基因的异常表达或异常产物引起的。该方法包括给哺乳动物施用含有根据本发明的寡核苷酸类似物的治疗用药物配方，其施用量足以使其与病毒、病原体、或基因的核酸形成稳定的双螺旋体因此使之失去活性。优选的用药途径包括口服、鼻内施用、直肠施用、静脉注射及局部施用。这一治疗方法也可包括其它治疗剂与含有寡核苷酸类似物的配方的联合施用。
结合附图阅读下面的描叙，可更全面地理解本发明上文叙述的内容和其它内容，及发明本身。
图1是表示各种磷酸酯骨架连键和修饰的示意图：图1A，磷酸二酯；图1B，甲基硫代膦酸酯；图1C，甲基膦酸酯；图1D，硫代磷酸酯；图1E，二硫代磷酸酯；图1F，氨基磷酸酯；和图1G，磷酸酯
(phosphate ester)；
图2是3′-O-亚膦酰胺(3′-O-phosphanamidite)的合成和它们随后掺入到寡核苷酸中的示意图；
图3是比较寡核苷酸11聚体类似物1-3(序列编号：1-3)与对照d(A)11聚体的离子交换高效液相色谱(HPLC)的示意图；
图4是表示25聚体类似物(序列编号：4)与互补的DNA链(A)和RNA链(B)形成的双螺旋体的熔解特性示意图；
图5是比较经蛇毒磷酸二酯酶消化寡核苷酸类似物(序列编号：4)(图：5A)和寡核苷酸对照(序列编号：5)(图：5B)后得到的消化曲线图；
图6是显示在不同时间内磷酸二酯酶I对寡核苷酸1-3(序列编号：1-3)和d(A)11(序列编号：6)消化类型的放射自显影图；
图7是显示在含有10％的胎牛血清中序列编号：4和序列编号：5的寡核苷酸稳定性的聚丙烯酰胺凝胶电泳的放射自显影图。
本发明提供了寡核苷酸类似物，其特征为其中至少有一个核苷酸间连键是烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯连键。其余的连键可以是磷酸二酯连键或是其它人工核苷酸间连键，包括(但不限于)硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，和磷酸酯。一些这类连键示于图1。核酸糖骨架的这些修饰可提高细胞的吸收，抵抗核酸酶的消化。寡核苷酸中烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯连键的数目范围可从1到多达整个寡核苷酸中核苷酸间连键的数目。因此，在本发明中，术语“寡核苷酸烷基膦酸酯”或“寡核苷酸烷基硫代膦酸酯”意指包含所有这些物质。
在优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸的长度范围将是约2～约60个核苷酸，最好为约25～约30个核苷酸。因而，在这些实施方案中，本发明的寡核苷酸将分别具有1～约59和24～29个烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键。
在本发明的一些实施方案中，该寡核苷酸至少应该有一个，最好是6-10个2′-取代的核糖核苷。有用的2′-取代物包括：如，2′-O-甲基、2′-烯丙基、2′芳基、2′-烷基、2′-卤基、或2′-氨基，但不能用2′-H取代，其中，烯丙基、芳基、烷基可用如，卤基、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷酯基或氨基取代或不取代。这些取代方法可根据本领域技术人员十分了解的方法进行(见，Goodchild(1990)BioconjugateChem.1：165-187)。在特别有用的寡核苷酸中，有6个或更多的核糖核苷和/或2′-取代的核糖核苷，以提高双螺旋的稳定性。
例如，根据Agrawal和Goodchild的方法(Tetr.Lett.(1987)28：3539-3542)，通过合成2′-O-Me5′-DMT核糖核苷的3′-亚膦酰胺，可制备本发明的寡核苷酸烷基膦酸酯类似物。该过程如图2所示。这样产生的亚膦酰胺干粉可用于DNA自动合成仪来制备所需要的寡核苷酸。用所需位置受到适当保护的2′-O-甲基核糖核苷甲基亚膦酰胺进行连接。如此合成的寡聚体从可控孔度(CPG)支持物上切下来，然后用1，2-乙二胺去保护。本发明的代表性的寡核苷酸类似物如序列编号：1-4和7所示。
根据合成烷基膦酸酯(如图：2B所示)的方法可制备本发明的寡核苷酸甲基硫代膦酸酯，但氧化剂是1％的3H-1，2-苯并二硫酚-3-(一)1，1-二氧化物溶液(Iyer等(1990)J.org.Chem.55：4693-4698)而不是I2/H2O/THF/二甲基吡啶。
通过确定类似物—互补链双螺旋体解链温度来测试如此制备的寡核苷酸类似物与互补DNA和RNA链稳定杂交的能力。具代表性的具有25碱基长的寡核苷酸甲基膦酸酯类似物(25聚体)与互补的DNA(A)或与互补的RNA(B)形成的双螺旋体的熔解曲线如图4所示。用修饰的25聚体(序列编号：4)和普通的25聚体(序列编号：5)得到的熔解温度值(Tm)总结在表1中。这些值是两次实验的平均值。
表1
热熔解数据寡聚体 互补链 Tm，℃ ％吸收增强率25聚体类似物 DNA 63.7 19.2(序列编号：4) RNA 68.7 15.025聚体对照 DNA 65.7 22.3(序列编号：5) RNA 71.8 18.1
这些结果提出，该甲基磷酸酯修饰并不阻碍寡核苷酸与互补的DNA和RNA链形成双螺旋体的能力，它的存在也不会使形成的双螺旋不稳定。
为了显示甲基膦酸酯连键已渗入到寡核苷酸中，和这种修饰的存在并不阻止核苷酸链随后的增加和延伸，合成出各自含有1，2，3个甲基膦酸酯连键的具代表性的寡核苷酸类似物1-3(序列编号：1-3)，并通过离子交换高效液相色谱进行研究。正如所期望的那样，未修饰的d(A)11对照在30分钟时在Partisil SAX柱上洗脱下来。寡核苷酸类似物1-3(序列编号：1-3)分别于23，20和18分钟洗脱下来，所用的是0到50％梯度的溶剂A(60％甲酰胺，40％水，1mM磷酸二氢钾，pH6.3)和溶剂B(60％甲酰胺，40％水，300mM磷酸二氢钾，pH6.3)。
使用25聚体(序列编号：4)作为样品，在蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)或磷酸二酯酶I，即一个3′-核酸外切酶的存在下，检查寡核苷酸甲基膦酸酯类似物的稳定性。在分光光度计上监测由于寡核苷酸的水解光吸收值的增加。25聚体类似物(序列编号：4)和25聚体对照(序列编号：5)的消化曲线如图5所示。在大约100秒时，50％的对照25聚体(序列编号：5)已被消化。然而，经修饰的25聚体(序列编号：4)的半衰期在同样实验条件下为800-900秒，表明这种修饰能抵抗核酸酶的消化。
在磷酸二酯酶I的存在下也测试了寡核苷酸的稳定性。将d(A)11(序列编号：6)寡核苷酸用作对照。结果如图6所示。在5分钟内，该对照(序列编号：6)全部降解成为单核苷酸。寡核苷酸1(序列编号：1)含有1个甲基膦酸酯连键，稍比d(A)11(序列编号：6)稳定。但在10分钟内，寡核苷酸1(序列编号：6)几乎全部降解。对于寡核苷酸2和3(序列编号：2和3)来说(它们分别含有2个和3个甲基膦酸酯连键)，在第6或第7个核苷酸处降解停止。这提示磷酸二酯酶I可以从3′-端切掉第一个甲基膦酸酯，但不能切掉第二个。
另一方面，本发明提供了可有效抑制病毒，病原性微生物或细胞基因表达的寡核苷酸类似物。抑制这些因子的能力对治疗许多疾病显然是很重要的。根据本发明这一方面的寡核苷酸类似物具有上述寡核苷酸类似物的特性，也具有与病毒、病原微生物、或细胞基因的核酸序列互补的核苷酸序列。这种寡核苷酸的长度最好为约6～约50个核苷酸。就本发明的目的而言，“与一核酸序列互补的寡核苷酸序列”这一词意指在生理条件下通过Watson-Crick碱基配对(寡核苷酸和单链核酸之间的相互作用)、通过Hoogsteen碱基配对(寡核苷酸与双链核酸之间的相互作用)，或任何其它方式与核酸序列杂交的寡核苷酸序列(2至约50个核糖核苷酸)。这种生理状态下的杂交实事上是通过观察干扰核酸序列的功能来测定的。
随着所抑制的因子或靶核酸的不同，与本发明的寡核苷酸类似物互补的核酸序列是不同的。在许多情况下，该核酸序列是一病毒核酸序列。应用反义寡核苷酸来抑制各种病毒是公知的。最近Agrawal已作了综述(Tibtech(1992)10：152-15)。对于许多病毒来说，与有效的反义寡核苷酸互补的病毒核酸序列已有描述，包括人类免疫缺陷I型病毒(HIV1)(U.S.Patent NO.4,806,463，其内容引入本文作为参考)，单纯性疱疹病毒(U.S Patent NO.4,689,320，其内容引入本文作为参考)，流感病毒(U.S.Patent NO.5194428，其内容引入本文作为参考)，人乳头瘤病毒(Storey等(1991)Nuc-leic Acids Res.19：4109-4114)。根据本发明的寡核苷酸可具有与这些病毒核酸序列任何一部分互补的序列。可根据已知核酸序列制备出反义寡核苷酸的其它一些病毒包括口蹄疫病毒(见Robertson等(1985)J.Virol.54：651； Harris等(1980)J.Virol.36：659)；黄热病病毒(见Rice等(1985)Science 229：726)；水痘-带状疱疹病毒(见Davison和Scott(1986)J.Gen.Virol.67：2279)；和黄瓜花叶病毒(见Richards等(1978)Virol.89：395)。
另一方面，根据本发明的寡核苷酸可具有与病原微生物的核酸序列互补的核酸序列。对许多病原性原核生物的核酸序列已有描述，包括疟原体，恶性疟原虫，和许多其它致病性细菌。已知核酸序列并可制备出反义寡核苷酸的致病性真核生物，包括冈比亚布氏锥虫和利什曼原虫(见Campbell等(1984)Nature 311：350)；肝片吸虫(Fasciola hepatica)(见Zurita等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2340)。根据，如，几丁质合成酶基因的核酸序列，可制备出与之互补的抗真菌的寡核苷酸。同样，也可根据丙氨酸消旋酶基因的序列制备抗细菌的寡核苷酸。
另外，根据本发明的寡核苷酸可具有与细胞基因或基因转录物互补的寡核苷酸序列，这些基因的异常表达或产物能导致疾病或生理紊乱。一些这类细胞基因的核酸序列已有描述，包括朊病毒蛋白(Stahl等(1991)FASEB J.5：2799-2807)，与老年性痴呆相关的淀粉样蛋白(U.S.Patent NO.5,015,570，其内容引入本文作为参考)，和许多已知的癌基因和原癌基因，如C-myb，C-myc，C-abl，和n-ras。另外抑制主要或唯一参与精子发生、精子泳动、精子与卵子的结合或任何影响精力生存力步骤的酶或结构蛋白之合成的寡核苷酸可用作男性避孕药。与之相似，抑制参与排卵、受精、着床或涉及这些过程的激素生物合成的酶或蛋白质的合成或功能的寡核苷酸可用作女性避孕药。
本发明的寡核苷酸类似物也可用来控制高血压。这类类似物抑制血管紧张肽转换酶的合成或者血管紧张肽原酶/血管紧张肽系统中有关酶的合成。同样，可通过抑制血栓烷A2合成所必需酶的合成来控制血小板凝集，用于心肌和大脑循环性疾病的治疗，如，心梗，动脉硬化，栓塞和血栓形成。在动脉硬化中也可以通过抑制脂酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶的合成，阻止胆固醇在血管壁内的沉积。抑制胆碱磷酸转移酶的合成在低血脂症的治疗中可能是很有用的。
有许多神经性疾病，其中也可应用杂交终止来减少或消除这些疾病的有害作用。如在帕金森氏病中，可采用抑制单胺氧化酶的合成；抑制儿茶酚-O-甲基转移酶的合成可治疗抑郁症。抑制吲哚N-甲基转移酶可用于治疗精神分裂症。
抑制花生四烯酸级联反应最终产生前列腺素和白细胞三烯中选出的酶可用于控制血小板凝集、过敏、炎症、疼痛和哮喘。
抑制多药抗性(mdr)基因表达的蛋白质(该蛋白质可导致对一些抗癌药物的抗性，是化疗中的主要障碍)可被证明有益于对肿瘤的治疗。
与这些基因的任何一部分互补的寡核苷酸序列都可用作本发明的寡核苷酸，就象与任何其它细胞基因或基因转录物互补的寡核苷酸序列都可用作本发明的寡核苷酸一样，这些基因的异常表达或产物可导致疾病或生理紊乱。
关于植物细胞基因表达的反义调控在美国专利NO.5,107,065中已有描述。其内容引入本文作为参考。
另外，本发明提供了一种应用上述寡核苷酸类似物来抑制病毒基因，病原性微生物基因，或细胞基因表达的方法。该方法包括用本发明的寡核苷酸处理前两种情况下的病毒或病原性微生物感染的细胞，或后一种情况下的一般性细胞，所用类似物的量要足以与存在的与之互补的核酸拷贝杂交。治疗可通过直接将该类似物施于培养的或机体的细胞来进行，如下所述。
此外，本发明包括治疗的药物配方，该配方可有效地治疗病毒感染，病原微生物感染、或由异常基因表达或异常基因产物表达所致的疾病或生理紊乱。这种治疗药物配方含有存在于生理上可接受的载体内的根据本发明第一方面的寡核苷酸。
如本文所用，“生理上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌药剂、等渗和缓吸药剂等。将这些介质和药剂用于药物活性物质在现有技术中是公知的。除了可与活性成分配伍的任一传统介质和试剂以外的物质也可考虑用于该治疗配方，另外的活性成份也可加入到该组合物中。
应用这些药物配方还可进行本发明的另一实施方案，即治疗哺乳动物的由病毒感染、病原微生物感染或某一细胞基因异常表达或异常产物所致的疾病或生理紊乱。该方法包括将本发明的治疗药物配方施用于受感染的哺乳动物，其用量足以使寡核苷酸能与互补的靶核酸结合。这样，寡核苷酸就能抑制来自于病毒、病原微生物的基因的表达与复制或异常细胞基因的表达。
在治疗各种疾病如爱滋病时寡核苷酸的有效剂量和用药方式可由常规实验来确定。适合于注射用的药物形式包括无菌水溶液或悬浮液、和用于临时制备无菌注射液或悬浮液的无菌粉末。在所有情况下这些形式都必需是无菌的。在生产、贮藏条件下必需稳定，也可进行防腐处理，以防细菌、真菌等微生物的污染。该载体可是溶剂，或分散介质。可使用各种抗细菌、抗真菌药剂防止微生物的作用。可使用缓吸剂组合物来使注射治疗药物延长吸收。
载体里的寡核苷酸也可通过任何有用的途径施用，包括静脉内或腹膜内注射，或通过鼻内、直肠内、口服、穿过皮肤、或皮下施用。通过将寡核苷酸溶于适量的合适的溶剂中，然后过滤消毒来制备消毒针剂。
本发明的方法可用于治疗各种病毒性疾病如爱滋病、爱滋病相关复合症(ARC)、口腔或生殖器疱疹、乳头疣、流感、口蹄疫、黄热病、水痘、带状疱疹、HTLV白血病、和肝炎。可用该方法治疗的真菌病原性疾病中包括念球菌病、组织胞浆菌病、隐球菌病、芽生菌病、曲霉病、孢子丝菌病、着色真菌病、皮真菌病(dematophy-tosis)和球孢子菌病。该方法还可用于治疗立克次氏体病(如，斑疹伤寒、落矶山斑疹热)，和由沙眼衣原体或性病性淋巴肉芽肿引起的性传播疾病。许多寄生虫病也可以用该方法治疗，包括阿米巴病、Chegas氏病、弓形体病、肺孢子虫病、贾第鞭毛虫病、隐孢子虫病、滴虫病、和卡氏肺囊虫肺炎、肠虫病(蠕虫病)如蛔虫病、丝虫病、旋毛虫病、血吸虫病和线虫或绦虫感染。不管是由恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫还是三日疟原虫引起的疟疾均可用该方法治疗。
上述传染性疾病均可用本发明的方法治疗，因为这些疾病的传染源均已知，可制备出根据本发明的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有与这些感染源繁殖所必需基因的核酸序列互补的核酸序列(如，必需基因)。
由细胞基因的异常表达或异常产物导致的其它疾病也可通过该方法治疗。这些情况上文已有讨论。
下面的实施例说明实施本发明的最优模式，不是限定本发明的范围，因为采用其它变换方法也可得到相似结果。实施例1合成核糖核苷亚膦酰胺(ribonucleoside Phosphonamidites)
根据Agrawal和Goodchild所描述的方法合成2′-O-甲基5′-DMT核糖核苷的3′-亚膦酰胺。这一过程如图2所示。简述如下：将溶于5ml无水二氯甲烷中的0.4mmol Hunig氏碱(乙基二异丙基胺)，加入0.024mmol 2′-O-甲基5′-DMT核糖核苷。然后冰浴10分钟冷却。将0.4mmol的甲基N，-N-二异丙基氯亚磷酰胺慢慢加入2ml二氯甲烷中。让该溶液的温度升到环境温度，之后室温放置30分钟。然后加入30ml的乙酸乙酯淬灭该反应。用饱和的碳酸氢钠和盐水抽提该混合物。在无水硫酸钠上干燥有机层，挥发至于。将产生的亚磷酰胺溶于少量乙酸乙酯中。然后把该乙酸乙酯溶液加入到30℃大体积的戊烷中使之沉淀。离心收集沉淀物并将其干燥。2寡核苷酸合成
将干燥的亚磷酰胺溶于DNA合成级的乙腈中，溶度为30mg/ml，通过DNA自动合成仪制备所需的寡核苷酸。在Milligen/Biosearch8700自动合成仪上，采用RNA合成程序，用亚磷酰胺方法(Agrawal等(1987)Tetra.Lett.，28：3539-3542)，以1μm规模合成寡核苷酸。用在所需位置适当保护的2′-O-甲基核糖核苷甲基亚磷酰胺进行偶联来合成寡核苷酸类似物1-4(序列编号：1-4)。3去保护
用1∶1氢氧化氨-乙醇混合物在室温下处理1小时把寡聚体从CPG上切下来，然后用1，2-乙二胺在室温下处理6小时去保护。4纯化和分析
应用反相C18 HPLC柱和0.1M乙酸铵和1∶4比例的0.1M乙酸铵-乙氰0-50％梯度洗脱液，通过反相层析纯化5′-DMT保护的寡聚体。用80％乙酸在室温处理1小时去除寡聚体上的三苯甲基，然后在C18 Sep-pack滤筒上脱盐(Agrawal等(1987)Tetra.Lett.28：3539-3542)。然后将该寡聚体在20％聚丙烯酰胺变性胶上纯化。将该寡聚体再在Sep-pack滤筒上脱盐，用于进一步研究。
为了显示甲基膦酸酯连键渗入到了寡核苷酸中和这种修饰的存在并不妨碍随后的核苷酸链的增加和延伸，通过离子交换HPLC分析了类似物1-3(序列编号：1-3)。使用的是0-50％梯度溶剂A(60％甲酰胺，40％水，1mM磷酸二氢钾，pH6.3)和B(60％甲酰胺，40％水，300mM磷酸二氢钾，pH6.3)。5杂交研究
通过DNA和RNA互补链的熔解实验来研究修饰的25聚体(序列编号：4)的杂交特性。将修饰的寡核苷酸与互补链(1：1)在E ppend-orf管中干燥，溶于1ml 100mM NaCl和10mM磷酸盐缓冲液中(pH7.4)。将该溶液加热至80℃ 5分钟，然后让其缓慢降至室温。通过Perkin Elmer Lambda 2UW/Vis分光光度计测定Tm值，分光光度计与Digital DECstation 316sx计算机相联。得到的25聚体类似物互互补链A(DNA)和B(RNA)的熔解曲线如图4所示。用修饰的25聚体(序列编号：4)和一般的对照25聚体(序列编号：5)得到的Tm值如表1所示。这些值均是两次实验的平均值。6寡核苷酸类似物对核酸酶的稳定性
在蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)或磷酸二酯酶I，3′核酸外切酶存在下，检测修饰的25聚体(序列编号：4)的稳定性。通过PerkinElmer Lambda 2 UV/Vis分光光度计监测因寡核苷酸水解而引起的光吸收的增加。在一典型的实验中，将0.2 A260单位的修饰寡核苷酸溶于0.5ml 10mM MgCl2，10mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，pH8.3，并在37℃平衡5分钟。加入1.5×10-3单位的SVPD，随时通过记录260nm处的光吸收变化来观察其降解速率。得到的消化曲线如图5所示。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用3′-磷酸二酯酶I来研究寡核苷酸1-3(序列编号：1-3)相对于对照的一般寡核苷酸d(A)11(序列编号：6)的稳定性。用τ-32P-ATP和T4多聚核苷酸激酶在其5′端用32P标记寡核糖核苷酸(约100ng)(Sambrook等，MolecularCloning，A laboratory Manual(2nd ed.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。将每一5′-端标记的寡核糖核苷酸(3μg)用1μl的磷酸二酯酶I处理(1.5×10-4单位)，反应在30μl的含有50mM Tris-HCl，pH7.5，5mM MgCl2，5mM DTT(二硫苏糖醇)，50μg/ml BSA(牛血清白蛋白)溶液中进行。分别在0，2，5，和10分钟间隔时从反应混合物中取出4μl等分样品。将等分样品在90℃加热5分钟，用20％聚丙烯酰胺-8M尿素凝胶电泳分离。放射自显影图如图6所示。
在含有10％胎牛血清的细胞培养基中研究修饰的25聚体类似物(序列编号：4)相对于对照25聚体寡核苷酸(序列编号：4)的稳定性。按照前节所述的方法用32P在5′端标记寡核苷酸(约100ng)。将大约10ng的每一标记寡核苷酸(比活106每分钟蜕变次数(dpm)/10ng)分别培养在300μl含有10％胎牛血清的SMEM细胞培养基中(GIBCO)。在每一时刻(0，1，2，和4小时)，取出50μl等分溶液，用10μl蛋白酶K处理，酚-氯仿抽提，并用乙醇沉淀。将产生的反应混合物通过含有8M尿素的20％聚丙烯酰胺凝胶电脉进行分析。放射自显影图如图7所示。
结果显示，该修饰的25聚体寡核苷酸类似物在4小时内大部分保持完整，而相比之下，对照25聚体在不到1小时的时间内降解为较短序列。7抑制爱滋病毒
在下述的组织培养中检测寡核苷酸甲基膦酸酯对HIV-1(爱滋病毒I型)的抑制能力。在37℃，用HIV-1病毒颗粒(0.01～0.1TCID50/cell)感染H9淋巴细胞1小时。1小时后，将未吸附的病毒颗粒洗去，感染的淋巴细胞分散于24孔板的各个孔中。在感染的细胞中，加入适当浓度的寡核苷酸类似物(取自贮存溶液)，在2ml培养基中得到所需要的浓度。然后将细胞培养4天。在此四天的最后，通过检测合成形成，p24的表达，及逆转录酶活性来检测HIV-1的表达水平。将寡核苷酸类似物处理的感染细胞的p24的表达水平与未处理的感染细胞的表达水平相比较。
本领域的一般技术人员将认识到，或能够确定，通过常规的实验手段，可得到许多与本文描述的特定的物质或方法等同的物质或方法。这些等同物质或方法被认为属于本发明的范围，包括在下文的权利要求中。
序列表(1)综合信息： (i)申请人：HYBRIDON，INC (ii)发明名称：寡核苷酸烷基膦酸酯和烷基硫代膦酸酯 (iii)序列数：7 (iv)通信地址：
(A)ADDRESSEE：Allegretti & Witcoff，Ltd
(B)STREET：10 S.Wacker Drive，Suite 3000
(C)CITY：Chicago
(D)STATE：Illinois
(E)COUNTRY：U.S.A.
(F)ZIP：60606 (v)计算机可读方式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：Patentin Release#10，Version#1.25 (vi)目前的申请情况
(A)申请号：US/08/009,262
(B)申请日：01/25/93
(C)分类： (viii代理人/代理机构：
(A)生名：Greenfield，Michael S
(B)登记号：37,142
(C)案号：92,774-A (ix)通讯号码：
(A)电话：312/715-1000
(B)传真：312/715-1234(2)序列编号(SEQ ID NO)：1： (i)序列特点：
(A)长度：11碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型 (ii)分子类型：mRNA (iii)是否假定：否 (iv)反义：是 (ix)特征：
(A)名称/关键词(NAME/KEY)：
(B)位置(LOCATON)：
(D)其它资料：/产品＝“碱基6-7之间的磷酸二酯连键；
U是2-O-甲基” (xi)序列描述：序列编号：1：
TTTTTUTTTT T 11(2)序列编号：2： (i)序列特点：
(A)长度：11碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型 (ii)分子类型：mRNA (iii)是否假定：否 (iv)反义：是 (ix)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：
(D)其它资料：/产品＝“核苷3-4，9-10之间的磷酸
二酯连键；U是2-O-甲基” (xi)序列描述：序列编号：2：
TTUTTTTTUT T 11(2)序列编号：3： (i)序列特点：
(A)长度：11碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型 (ii)分子类型：mRNA (iii)是否假定：否 (iv)反义：是 (ix)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：
(D)其它资料：/产品＝“核苷3-4，6-7，9-10之间
的磷酸二酯连键；U是2-O-甲基” (xi)序列描述：序列编号：3：
TTUTTUTTUT T 11(2)序列编号：4： (i)序列特点：
(A)长度：25碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型 (ii)分子类型：mRNA (iii)是否假定：否 (iv)反义：是 (ix)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：
(D)其它资料：/产品＝“核苷21-22，22-23，23-24
和24-25之间的磷酸二酯连键；碱基21
-24是2-O-甲基” (xi)序列描述：序列编号：4：
CTCTCGCACC CATCTCTCTC CUUCT 25(2)序列编号：5： (i)序列特点：
(A)长度：25碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型 (ii)分子类型：mRNA (iii)是否假定：否 (iv)反义：是 (xi)序列描述：序列编号：5：
CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25(2)序列编号：6： (i)序列特点：
(A)长度：11碱基对
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(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型 (ii)分子类型：mRNA (iii)是否假定：否 (iv)反义：是 (xi)序列描述：序列编号：6
AAAAAAAAAA A 11(2)序列编号：7： (i)序列特点：
(A)长度：8碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：mRNA(iii)是否假定：否(iv)反义：是(ix)特征： (A)名称/关键词： (B)位置： (D)其它资料：/产品＝“核苷7-8之间的磷酸二酯连
键；C和U是2-O-甲基”(xi)序列描述：序列编号：7： CCUUCCCT 8