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冷冻的酸乳酪促酵物
    本发明涉及一种用于直接接种牛奶的冷冻促酵物的制备方法，以及用该方法获得的冷冻促酵物。

    已知将乳酸菌培养物进行冷冻处理可以保存这种培养物，用于制备酸乳酪。这种培养物也称作促酵物，它们在接种牛奶前通过预培养可以被活化，或者以冷冻形式直接用于接种牛奶而制备酸乳酪。

    美国专利No.3,975,545描述了一种冷冻的酸乳酪促酵物的制备，该促酵物在用于接种牛奶前被活化。在该方法中，乳酸菌生长于一种合成培养基中，浓缩后，加入一种名为甘油磷酸的低温防护剂，然后将该细菌于-20℃冷冻。随后将该促酵物与低温防护剂一起在合成培养基中或牛奶中预培养而将它活化，然后用于接种牛奶制备酸乳酪。

    同样，EP0,378,478描述了一种用于直接接种牛奶的冷冻促酵物的制备方法。在该方法中，乳酸菌生长于一种合成的营养培养基中，具体来说，该培养基特别含有用于溶解酪蛋白的多磷酸盐，将得到的培养物浓缩后冷冻。已冷冻过的这种促酵物每克大约含有10⁹-10¹⁰个活细胞菌落或含有10⁹-10¹⁰cfu/g(cfu是菌落形成单位的缩写)，通常以0.01-0.1％的浓度用于直接接种。

    但是用于直接接种的在冷冻促酵物中的乳酸菌常受多种应激因素(stress factor)的影响，这些因素影响它以正常方式发酵牛奶的能力。

    这些应激因素归因于例如在组成在不同程度上与牛奶大不相同的合成营养培养基中培养所述细菌。于是，细菌产生了一种难于适用于发酵牛奶的代谢作用。同样，例如通过离心作用将细菌浓缩，因而也扰乱了细菌。最后，按传统做法在冷却前向培养物中加入低温防护剂，以便保持细胞免于被冻坏。但是，这些低温防护剂也具有抑制细菌生长的作用。

    因此，一旦这种促酵物的活细菌被扰乱，那么实际上只有一部分细菌能真正发酵牛奶，并因而产生乳酸。由此发现只有低于10％的被接种细菌能有效地发酵牛奶。因此，提高冷冻促酵物的发酵活性水平是非常有意义的。

    本发明的一个目的是为了克服现有技术的缺点，并提供一种具有10％以上，优选95％以上发酵活性水平的用于直接接种牛奶的冷冻促酵物。

    为了达到目的，在制备用于直接接种牛奶而制备酸乳酪的冷冻促酵物的方法中，乳酸菌生长于温度为40-45℃的牛奶中，直到PH达到4.3-5.5，然后直接将该培养物冷冻。

    本发明还涉及该冷冻促酵物以及它在制备酸乳酪中的应用。

    因此，本发明所述的制备冷冻促酵物的方法具有省却合成培养基以及省却浓缩装置的优点。因而该方法特别简单和易于实施。

    而且，令人惊奇地发现本发明的冷冻促酵物具有高于95％的发酵活性水平，这意味着在冷冻处理后存活下来的活细菌中，有95％以上的细菌能快速发酵牛奶，从而导致乳酸的形成。

    因此，本发明提供的促酵物能与用于直接接种的传统的冷冻促酵物一样快地发酵牛奶，直到PH值达到酸乳酪的常规值即4.4-4.8的范围，而后者含有至少多10倍的活细胞。

    最后，本方法实施时可以不使用低温防护剂，尤其是在制备链球菌属冷冻促酵物时，更是如此。

    在下文中，术语“链球菌属”包括根据新命名法(bergey′smanual)所述的乳球菌和链球菌。

    实施本方法时，在牛奶中至少生长例如一个链球菌菌株和/或至少一个乳杆菌菌株。对于所述链球菌，优选使用乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis Subsp.lactis)、乳酸乳球菌cremoris亚种(Lactococcus lactis Subsp.Cremoris)、乳酸乳球菌乳酸变种二乙酰乳酸(diacetylactis)亚种(Lactococcus lactis Subsp.lacticbiovar diacetylactis)以及嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。同样，对于乳杆菌，例如可以使用德彼利氏乳芽孢杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii Subsp.bulgaricus)、嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillus acidophillus)、瑞士乳芽孢杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳芽孢杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei Subsp.casei)和德彼利氏乳芽孢杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbruckii Subsp.Lactis)(见Bergey′s Manualof Systematic Bacteriology，vol2，1986)。

    制备本发明的促酵物时，具体可用所用的各细菌属或种的新鲜预培养物和/或用所用的细菌属或种的混和物的预培养物接种牛奶。另外，预培养培养基可以是常规用于实验室培养乳细菌的合成营养培养基，例如MRS培养基(De Man et al，1960)或以牛奶为主要成分的培养基，例如MSK培养基，该培养基含有10％的粉状复原脱脂牛奶和1/10,000份的市售酵母提取物。因此，考虑用一种或多种新鲜预培养物接种的所有可能性，其中每种预培养物包括来自于不同属或种的乳细菌的一个或多个菌株。因此，所加入的各新鲜预培养物的接种物的量依据达到最终PH值所需发酵时间以及所使用的乳细菌的一个或几个菌株而定。最后，优选的是通过将最初被冷冻或冷干地菌株连续几代预培养而制备新鲜预培养物，并用这最后一代预培养物接种牛奶，一般来讲，该最后一代预培养物是在预培养培养基处于凝固阶段时获取的第三代培养物。

    还可以使用其他形式的直接接种法，例如使用冻干的培养物的方法。

    优选在冷冻以前向具体含有乳杆菌的培养物加入3-10％甘油。于是，该培养物除含有乳杆菌外，还含有其它种或属的细菌，例如链球菌的一个或多个菌株。加入甘油后可以提高乳杆菌在冷冻时的存活率，从而获得具有95％以上发酵活性水平的本发明促酵物。但是，必须注意到，加入甘油并不是获得本发明所述具有10％以上发酵活性水平的促酵物的必要条件。

    同样，乳酸菌可以以传统方式进行冷冻，例如在-20～-90℃之间冷冻。

    最后，所述牛奶可以采用无菌脱脂牛奶，或者无菌复原脱脂牛奶，即用奶粉复原的并在110-120℃灭菌了20-40分钟得到的牛奶。这种牛奶还可以含有1％酵母提取物，以在制备促酵物时促进细菌的生长。

    在本发明制备具有最大发酵活性水平的链球菌促酵物的方法的第一优选实施方案中，链球菌在41-44℃温度生长，直到PH值达到4.9至5.2，以便使细胞密度达到2×10⁸至5×10⁸cfu/g范围内，然后直接将该培养物冷冻。

    于是也可在牛奶中生长链球菌的多个种或菌株。链球菌的接种物可以是含有以混合物形式使用的链球菌的几个种或几个有株的一种新鲜预培养物，和/或者可以是所使用的链球菌的各个种或菌株的多种新鲜预培养物。特别是可以以这种方式生长至少一个嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)的菌株。

    在本发明制备具有最大活性水平的乳杆菌促酵物的方法的第二个优选实施方案中，乳杆菌于41-44℃温度生长，直到PH值达到4.6至5，从而使细胞密度达到10⁸－5×10⁸cfu/g范围，然后直接将该培养物冷冻。

    于是可以在牛奶中培养多个的乳杆菌种或菌株。该乳杆菌接种物可以是含有以混合物形式使用的乳杆菌的几个种或菌株的一种新鲜预培养物，和/或可以是所用的乳杆菌的各个种或各个菌株的多种新鲜预培养物。尤其是可以以这种方式生长德彼利氏乳芽孢杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbruckii Subsp.bulgaricus)的至少一个菌株。

    在本发明制备含有具有最大发酵活性水平的乳杆菌和链球菌的混合物的混合促酵物的方法的第三个优选实施方案中，所述细菌于41-44℃生长，直到PH值达到4.5-4.9，以使细胞密度达到3×10⁸－5×10⁸cfu/g范围，然后将该培养物直接冷冻。

    该接种物还可以是一种新鲜预培养物，培养物包括以混合物形式使用的细菌的几个属，几个种或几个菌株和/或者可以是所使用的细菌的每个属，每个种或每个菌株的多种新鲜预培养物。尤其是这些经培养的细菌混合物可含有例如相对于乳杆菌的比例为50-90％的链球菌。

    冷冻促酵物也是本发明的目的之一。事实上，将会惊奇地看到从冷冻中存活下来的细胞中有95％以上能够产生乳酸。

    将该冷冻促酵物用于制备酸乳酪也是本发明的一个目的。事实上，这样一种促酵物能与传统促酵物一样快地发酵牛奶，而后者含有至少多10倍的活细胞。因此优选的是以在牛奶中浓度为0.01至0.1％的量使用本发明的促酵物，这也是本发明的目的之一。

    在下文中描述的实施例将更详细地阐述本发明的方法和冷冻促酵物。所述百分数都以重量计。在描述这些实施例前先对附图进行简单描述。

    图1一种凝固酸乳酪的制备。并显示了用不同冷冻促酵物的混合物发酵的二种牛奶的PH值与发酵时间的函数关系。

    图2一种搅碎酸乳酪的制备。并显示了用不同冷冻促酵物的混合物发酵的二种牛奶的PH值与发酵时间的函数关系。

                     实施例1

    一种商业酸乳酪菌株嗜热链球菌的冷冻促酵物的制备过程如下：

    将10％的脱脂奶粉复原成脱脂牛奶，加入1％酵母提取物，将该混合物在115℃灭菌30分钟，然后冷却到大约42℃。

    通过在已于155℃灭菌30分钟的MSK培养基中连续几次预培养而将传统的冷冻嗜热链球菌菌株活化。然后用在培养基凝固阶段时获取的第三代预培养物以1％的比例接种到该无菌的复原牛奶中，将该混合物在大约42℃培养直到PH值达到5.1，然后冷却到4℃。最后将这一批产物在-75℃冷冻。

                     实施例2

    商品粘稠型酸乳酪菌株德彼利氏乳杆菌保加利亚亚种的冷冻促酵物的制备过程如下。

    使用实施例1中描述的含有1％酵母提取物的同一种脱脂无菌牛奶。通过在无菌MSK培养基中连续几代预培养而将冷冻的德彼利氏乳杆菌保加利亚亚种的商品菌株进行活化。随后用在培养基凝固阶段获取的第三代预培养物以5％的比例接种到无菌复原牛奶中，并将该混合物在42℃培养直到PH值达到4.8，随后冷却到4℃，再加入5％无菌甘油，将该混合物在-75℃冷冻。

                     实施例3

    含有嗜热链球菌的两个商品菌株和德彼利氏乳杆菌保加利亚亚种的一个传统的粘稠菌株的混合物的一种冷冻混合促酵物的制备过程如下。

    首先制备实施例1中描述的也含有1％酵母提取物的同样的脱脂无菌牛奶。

    向这种牛奶中加入1％的按实施例1制备的嗜热链球菌各个菌株的新鲜预培养物以及2％的按实施例2制备的德彼利氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的一种新鲜预培养物。随后将牛奶于大约42℃培养，直到PH值达到4.7。将牛奶冷却到4℃，然后加入5％无菌甘油，将该混合物在-75℃冷冻。

                     实施例4

    用实施例1和2中描述的冷冻促酵物直接接种而制备凝固型酸乳酪。

    以含3.7％脂肪和2.5％脱脂奶粉的全脂牛奶为原料制备一种牛奶。将40升的这种牛奶在92℃灭菌6分钟，随后在75℃和150巴均质化(分两个阶段)，最后冷却到大约42℃。

    现在用三种冷冻促酵物的混合物发酵该牛奶，该混合物含有一个嗜热链球菌CNCM I-1422菌株，一个嗜热链球菌CNCMI-1424菌株以及一个德彼利氏乳杆菌保加利亚亚种CNCMI-1420菌株。通常这些菌株用于工业上生产酸乳酪，并已按照布达佩斯条约规定，于1994年5月18日将这些菌株寄存于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)Institut Pasteur，28 rue du Dr Roux，75724.Paris Cedex 15。含有菌株CNCM I-1422和CNCM I-1424的促酵物按实施例1制备，含有CNCM I-1420菌株的促酵物按实施例2制备。

    向牛奶加入7ml含有CNCM I-1422和CNCM I-1424菌株的冷冻促酵物以及6ml含有CNCM I-1420菌株的冷冻促酵物，将该牛奶在42℃培养直到PH值达到约4.65，随后冷却到4℃。

    同样，用另三种冷冻促酵物的混合物发酵经巴斯德灭菌的全脂牛奶，每种促酵物各含有嗜热链球菌CNCM I-1421菌株，嗜热链球菌CNCM I-1423菌株以及德彼利氏乳杆菌保加利亚亚种CNCM I-800菌株，这些菌株都可按常规用于工业上生产酸乳酪，并且已按照布达佩斯条约规定，将CNCM I-1421和I-1423菌株于1994年5月1 8日，CNCM I-800菌株于1988年4月10日寄存于Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes(CNCM)，Institut Pasteur，28 rue du Dr Roux，75724 Paris Cedex 15，法国。含有CNCM I-1421和CNCMI-1423菌株的促酵物按实施例1制备，含有CNCM I-800菌株的促酵物按实施例2制备。

    向该牛奶中加入7ml含有CNCM I-1421和CNCMI-1423的冷冻促酵物以及6ml含有CNCM I-800菌株的冷冻促酵物。将牛奶在42℃培养直到PH值达到大约4.65，随后冷却到4℃。

    图1显示了酸化曲线，下面表中描述了所获得的产品的特征。促酵物混合物(CNCM)酸化至PH4.65的时间在24小时后产物PH值    (4℃)24天后产物PH值(4℃)第24天时的味道I-1420I-1422I-14246小时    4.34    4.1味道好，微酸性，质地松脆I-800I-1421I-14235小时40分钟    4.35    4.2味道好，质地柔滑

                     实施例5

    用实施例1和2描述的冷冻促酵物直接接种而制备搅碎的酸乳酪。

    用含有3.7％脂肪和2.5％脱脂奶粉的全脂奶粉制备牛奶。在105℃将40ml这种牛奶灭菌2分钟，随后在75℃和300巴均质化(第一阶段)，最后将它冷却到约43℃。

    然后用三种冷冻促酵物的混合液发酵该牛奶，促酵物分别含有CNCM I-1 422，CNCM I-1424和CNCM I-800菌株。为了实现该目的，向牛奶中加入7ml实施例4的含有CNCM I-1422和CNCM I-1424菌杆的冷冻促酵物，以及6ml实施例4的含有CNCM I-800菌株的冷冻促酵物。随后将该牛奶在43℃培养直到PH值达到4.65，随后在搅拌同时冷却至4℃。

    同样，用另外三种冷冻促酵物的混合液发酵全脂牛奶，混合液分别含有CNCM I-1421，CNCM I-1423和CNCM I-1420菌株。为了达到目的，向该牛奶中加入7ml实施例4的含有CNCM I-1421和CNCM I-1423菌株的冷冻促酵物以及6ml实施例4的含有CNCM I-1420菌株的冷冻促酵物。随后在43℃培养该牛奶，直到PH值达到4.65，然后冷却到4℃。

    图2中显示了酸化曲线，下面的表中描述了获得的产品的特性。促酵物混合物(CNCM)酸化至PH4.65的时间1天后产物PH值(4℃)24天后产物PH值(4℃)第24天时的味感I-1422I-1424I-8007小时15分钟    4.49    4.3味道很好，质地芳香，光滑含奶油I-1420I-1421I-14236小时45分钟    4.55    4.32口味好质地芳香、含奶油

                     实施例6

    用0.05％的实施例5的冷冻促酵物的混合液接种到实施例4中的巴斯德灭菌后的牛奶中，其中促酵物混合液含有相同比例的菌株CNCM I-1422，I-1424和I-800，然后将该牛奶在42℃培养直到PH值达到4.65。

    为了进行比较，用3％的传统新鲜培养物接种同样的牛奶，其中传统新鲜培养物含有相同比例的同种嗜热链球菌和德彼利氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，然后将该牛奶于42℃培养直到PH值达到4.65。

    为了进行比较，用0.02％的传统的浓缩冷冻促酵物接种同样的牛奶，传统浓缩冷冻促酵物含有相同比例的同种嗜热链球菌和德彼利氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，然后在42℃培养牛奶直到PH值达到4.65。

    下表中显示了三种类型的发酵方法获得的结果。    培养物特性新鲜培养物冷冻促酵物混合液传统的冷冻浓缩促酵物混合液促酵物中活细胞数目(CFU/g)    3.10^*    2.5.10^* 10^**直接接种(％)    3    0.05 0.02接种后牛奶中活细胞数目(CFU/g)    9.10^*    1.3.10² 2.10^*观察到的潜伏期    10分钟    1小时 1小时100％细胞活性达到PH465(约5.3×10³CFU/g)的预计时间    3小时7分钟    7小时 5小时达到PH4.65的实际时间    3小时10分钟    7小时5分钟 6小时55分钟细胞活性水平(L)    (100％)    ＞95％ ＜10％

    假定细胞的平均增殖时间为30分钟，并且以新鲜培养物中细胞活性水平为100％，则利用下式可以大略地测定冷冻促酵物中细胞的相对发酵活性水平。

    L＝109×(5.3×10⁸/(1.02338)^{(实际时间-潜伏期，以分钟计)}/(CFU/每克接种牛奶)

    这样发现两种类型的冷冻促酵物混合液具有相同的潜伏期，这自然是由于细胞需对新环境进行适应。

    但是，这两种类型的促酵物混合液不能以同样方式发酵牛奶。事实上，传统冷冻促酵物混合液发酵牛奶的时间为6小时55分钟，而如果以平均增殖时间为30分钟作为基准则该混合液发酵牛奶的时间应为5小时。相反，本发明的促酵物混合液实质上能在预计的时间内发酵牛奶。

    这样发现本发明促酵物中95％以上的乳酸菌发酵牛奶，而传统冷冻促酵物中只有低于10％的乳酸菌能够发酵牛奶。这就解释了下述事实：作为起始接种百分数的函数，作为本发明目的的促酵物能与传统冷冻促酵物(通过直接接种)一样快地发酵牛奶直到PH值达到酸乳酪的常规PH值，即4.4-4.8。为了达到该目的，优选用比传统冷冻促酵物高出2.5倍的本发明的促酵物接种牛奶。

    最后，对于与传统冷冻促酵物相同的接种百分数，本发明的促酵物发酵牛奶的速度略低于用传统冷冻促酵物的发酵速度(如上述表中可看出的)。但是，时间损失低，约在20分钟左右，并且可以通过本发明的促酵物的成本价格中的收益和它的易制备性得到补偿。