地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂 本发明涉及一株新的地衣芽孢杆菌菌株以及用该菌株制备的微生态制剂，以及生产所述微生态制剂的方法。
有关活菌制剂以及生态防治的应用已有近百年的历史，并在本世纪50年代后有了较快的发展，各种生菌制剂不断问世，如单价或多价的口服与注射的制剂，皆收到较好的防治效果。但在国外这类制剂多为双岐杆菌和乳酸菌类，制成单价的或多联的制剂；1981年国内康白教授以腊样芽孢杆菌制成了活菌制剂“促菌生”。但在国内外仍无地衣芽孢杆菌的生态制剂。在国外，对地衣芽孢杆菌的研究、文献也很少，并且只限于生物酶类(如淀粉酶)、抗生素以及畜牧方面(如家畜育肥、乳牛产奶等)。1992年11月19日由本发明人将一株地衣芽孢杆菌63516株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：0183，利用该菌株制备的微生态制剂对急性肠炎和轻型痢疾有较好的疗效，其作用与氟哌酸相同，并且有治疗肠菌群失调的作用。在上述发明基础上，本发明分离到一株更优良的新菌株，利用该菌株制备的微生态制剂，可明显提高制剂稳定性，简化贮藏条件有利于长期贮藏。
本发明目的之一是提供新的地衣芽孢杆菌20389菌株，本发明的另一个目的是提供利用地衣芽孢杆菌20389菌株制备的微生态制剂。
本发明的技术方案如下：
在1986年发明人从健康妇女阴道培养发现的G染色阳性大杆菌。经系统鉴定与反复核定为地衣芽孢杆菌、但该菌与文献记载的典型地衣芽孢杆菌菌种地某些特性方面有明显的差异，是一株新型的地衣芽孢杆菌菌种。该菌生物毒性极低或无毒，且具有一些有益的生物活性或作用。因此，地衣芽孢杆菌20389(简作BL20389)及其发现对临床医学微生态学及微生态药物的开发具有重要意义。BL20389株的生物与生化特性综合描述如下：
一、形态：
杆状：杆长：1.6-3.8微米；
杆宽：0.6-1.2微米；
G染色：十
芽孢：中生，椭圆形，不膨大；
荚膜：一
鞭毛：周毛
二、生物学性状
(一)生物培养特性
1、营养要求：不高、在普通培养基上易生长，
1.1、普通肉汤：混浊生长，形成菌膜，有沉淀物；
1.2、普通营养琼脂平板：36℃培养18-24小时，多数菌落呈粗糙型，表面不光泽，乳白色不透明，边缘不整齐，直径2-3mm，间杂有小量圆形，表面光滑，半透明，边缘整齐的，直径1-1.5mm小菌落；
1.3、血平板培养：36℃ 24-48小时，不溶血→B溶血※。
2、生长温度：
2.1、最佳生长温度：35-37℃
2.1、最高生长温度：50-55℃
2.3、最低生长温度：15℃
3、生长环境气体要求：兼性厌氧生长，PH 5.7-7.4
4、明胶液化：迟缓
(二)色素产生：在含有铁的培养基中能产生紫红色色素；
三、生化学反应
(一)糖、醇酵解：表1
糖 醇 类 分解座酸
乳 糖 -
葡 萄 糖 +
木 糖 -※
阿拉伯胶糖 ±※
麦 芽 糖 -
蔗 糖 -
鼠 李 糖 -
菊 糖 -
棉 子 糖 -
纤 维 二糖 -
果 糖 ±
密 二 糖 -
蕈 糖 ±
杏 素 -
甘 露 醇 ±※
肌 醇 +
赤丝草醇 -
卫 矛 醇 -
山 梨 醇 -
水 杨 素 -
(二)其它生化反应：表2
表2反 应 水 解 分 解 ∨ ∨ 1 1 PH P P卵黄反应石 触凝蕊 乳牛乳 酶酶淀粉与尿酸盐酪素 酪氨酸 脲结 果+ ++ - +※ + 5.0- A ※ + +
(三)0.001％溶菌酶：不生长
(四)能利用桔缘酸盐，丙酸盐，及硝酸盐，还元为亚硝酸盐
四、G+C：42mol％※
注：※号项反应为BL20389特有与典型BL区别点
本发明获得的新菌株地衣芽孢杆菌(BacillusLichenifornis)20389菌株已于1997年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0298
实施例1
地衣芽孢杆菌20389微生态制剂的制备
1、种子液制备
将保藏菌株20389菌株接种于营养肉汤培养液(PH为6.4-7.4)，于37℃温度下培养24-48小时。
2、固体发酵法
将种子液接种于营养琼脂培养基上，30-38℃条件下培养24-96小时，回收菌苔于生理盐水中，以3000-5000转/分离心40分钟，去除上清，得到菌泥。
将得到的菌泥加入生理盐水，使菌泥溶解，按菌泥与无水碳酸钙的重量比为1∶8，优选为1∶5，加入无水碳酸钙，充分混匀后，放入65-75℃烤箱内烘烤30分钟，间歇30分钟，重复三次使之干燥。
将烘干的菌泥块放入球磨机内研磨1小时使之成粉，包装。
3、液体发酵法：
将种子液接种于营养肉汤培养基中，30-38℃，通气培养24-96小时。其余回收菌体及制剂的制备相同于固体发酵法。
实施例2
20389菌株与63516菌株的生物毒性的比较
1、对小鼠急性毒性试验：
(1)小鼠尾静脉注射法：
用昆明系小鼠(体重18-20克)36只，随机分9组，每组4只，1～7组为试验组，8～9为对照组。分别将20389菌株与63516菌株的24小时肉汤培养物4500rom/分离心30分钟，以生理盐水洗涤沉淀菌体，再离心，然后分别以无菌生理盐水稀释成含2×108活菌/ml菌液，按1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128数量级的活菌数给1～7组小鼠每只尾静脉注射0.4ml，第8组每只注射洗涤菌体的离心后的上清液0.4ml，放室温观察3～24小时，对存活鼠作长期观察。
结果：经24小时观察，两组(20389、63516)的全部试验小鼠皆未发生异常反应与死亡，其LD50＞50×108活菌/Kg对全部存活小鼠连续观察1个月未发现异常反应，以颈椎脱臼法处死后，对心、肝、脾、肺、肾等主要器官行组织病理检查，亦未见有意外义的改变。足证二者皆为无毒株。
(2)小鼠腹腔注射法：
用昆明系小鼠(体重18～20克)60只，随机分为6组，每组10只，1～5为实验组，6为对照组，按予试验确定1～5组的攻击用湿菌量(mg/kg)：100，160，220，280，360，以0.5ml生理盐水稀释，分别一次注射各组每只小鼠腹脸腔。对照组注射0.5ml生理盐水。
在室温观察，累计72小时每组小鼠的死亡数，按外氏改良叩氏法公式算出LD50。
结果：20389菌株，LD50：224.6mg湿菌/kg：63516菌株，LD50：217.3mg湿菌/kg20389的LD50剂量高于与63516。
2、小鼠亚急性毒性比较：
用昆明系小鼠(体重18～20克)30只，随机分成3组，每组10只，第3组为对照。试验前称量每只鼠体重，检查血像(红、白血细胞数、白细胞分类)。
试验1～2组分别按LD10与1/5LD10的菌量悬浮于0.5ml生理盐水，以球头针对每只小鼠灌胃，每日1次，连续15天，停灌24后，测体重和血像。用颈椎脱臼法处死1/2小鼠，解剖取小肠、结肠、乙状结肠及心、肺、肝、脾、肾等组织器官进行组织病理学检查。
结果：1)试验后小鼠体重与血像与对照小鼠未见有意义的差别；
2)处死小鼠均未见到组织病理学变化。
3、易热与耐热性肠毒素试验，结果见表4
表4 易热性(ST) 耐热性(LT)(免疫溶血空斑法) (乳鼠法)2038963516 - - - -
实施例3 20389与63516对某些重要菌种的共生与拮抗关系的比较
方法：
1)取过夜的菌培养液，以1/20比例接种于5ml肉汤管中置37℃培养至该菌的对数生长期，(由予试验确定，方法略)。
2)取目的菌和试验菌的对数期菌液分别以1/40比例混入同一试管中37℃培养，并分列设对照管。
3)同时将上述对数期菌液稀释后，取0.01ml点种于琼脂平板37℃培养24小时后，计数菌落形成单位(CFU)做为起始菌数(零时菌数)。
4)分别于0，15，24，48小时取试验管与对照管的培养液10×系例稀释后，取0.01ml接种于平板37℃，24小时培养后，分别计数各管的菌落形成单位数。
5)取各菌落数对数，进行统计分析：
(一)20389与63516对全黄色葡萄球菌的拮抗作用比较
1、菌株：金黄色葡萄球菌 APCC6536T
2、培养基：LB肉汤 普通营养琼脂
3、方法：略
4、结果：见表4
表4菌落形成单位Log10/ml组别 培养时间(小时) 0 15 24 48 20389 + 6538T 63516 + 6538T 7.581 8.175 8.610 9.217 8.651 7.535 8.175 8.591 9.370 8.954 对照管 8.175 9.041 10.225 9.617
结果：经t检验，20389与63516分别与6538T的混合管中的6538T的活菌数与对照管间，P均＜0.05差异显著，但二株的拮抗作用则无明显差异。
(二)20389与63516对白色念珠菌的生物拮抗作用的比较
(1)菌珠：白色念珠菌ATCC20131
(2)培养基：BL肉汤(PH6.0)普通营养琼脂
(3)方法：同前(略)
(4)结果：见表5
表5菌落形成单位Log10/ml组别 培养时间(小时) 0 24 48 20389 + 20138 63516 + 20131 6.212 5.983 5.614 6.010 6.114 5.983 5.724 6.030 对照管 20131 5.983 6.924 7.010
经显著性测验—t检验
20389与63516和20131的混合管中20131活菌数与对照管间P＜0.05差别显著，但20389与63516间则无差别。
(三)20389与63516对嗜酸乳杆菌共生作用的比较
1)菌株：嗜酸乳杆菌La001
2)培养基：MRS肉汤GAm血琼脂，普通营养琼脂
3)方法：同前(略)
4)结果：见表6
表6菌落形成单位Log10/ml组别 培养时间(小时) 0 15 24 48 20389 + La001 63516 + La001 7.315 6.602 9.881 9.751 8.632 7.535 6.602 9.188 9.322 7.105 对照管 La001 6.602 9.140 9.362 8.442
结果表明嗜酸杆菌与20389与63516皆有体外共生作用，但20389与嗜酸乳杆菌La001的共生效果优于63516。
实施例4
地衣芽孢杆菌20389株与63516株生物耗氧效应对厌氧双岐杆菌与拟杆菌促生长作用的比较：
(一)菌种：
20389 63516
双岐杆菌 6-1
脆弱拟杆菌 NCTD 9343
(二)方法：
1)将待测试验专性厌氧菌的24小时液体培养物，适当稀释，取0.1ml接种于选择性培养基或血平板上，以L捧涂匀。
2)在平皿盖上倒入溶化的普通营养琼脂，待凝固后，密集地接种上待测耗氧菌种。
3)将上述平血用石腊密封后，放于37℃，培养48-72小时。
4)同时以专性厌氧菌接种于选择性培养基或血平板上放于厌氧颧内，通过抽气换气法行厌氧培养48-72小时做为对照。
5)将所试验的专性厌氧菌株接种于选择性培养基或血平板置37℃大气环境下培养，做耐氧试验。
6)培养一定时间后，检查和计数各组平皿上专性厌氧菌的菌落数。
(三)20389株与63516株对双岐杆菌生长支持作用的比较：
1)菌种：20389 63516双岐杆菌6-1
2)培养基：BAM肉汤 GAM琼脂 普通营养琼脂
3)方法：(略)
4)结果：见表7
表7 组别CFULog10/ml 实 验 组 厌氧对照 大气对照20389 63516第一次第二次7.910 7.602 8.041 07.825 7.778 7.049 0(四)20389与63516株对脆弱拟杆菌生长支持作用的比较：1、菌种：20389 63516 脆弱拟杆菌 NCTC 93432、培养基：BAM肉汤 GAM琼脂 普通营养琼脂3、方法：略4、结果：见表8
表8组别CFULog10/ml 实 验 组 厌氧对照 大气对照20389 63516 第一次 第二次9.785 9.382 9.176 09.564 8.978 10.467 0
结果表明地衣芽孢杆菌的两菌株对脆弱拟杆菌皆有生长支持作用，但二者无明显差异。
实施例5
20389与63516株在相同培养条件下孢子形成量的比较：
1、培养基：LB肉汤 普通营养琼脂
2、培养方法：以过夜的菌培养LB肉汤15ml，注加于装有普通营养琼脂的克氏瓶平板上，37℃静置培养96小时，以50ml生理盐水洗脱菌苔，以撮荡器使菌苔摇散，混匀后，取样测定孢子与繁殖体数量比。
3、测定法：
1)直接涂片染色计数法：1000×视野，以小黑框限制视野，以便于计数，数500菌体计百分数。
2)加热处理培养计数法：将混匀的检样置80-90℃恒温水浴中热处理10分钟前后，分别取样0.01ml点板，同时放37℃培养24小时，计数菌落数，算出孢子形成率。
4、结果：见表9
表9 检测次数(孢子生成％) 1 2 3 4 5 均值BL20389 直接镜检法 加热培养法BL20386 直接镜检法 加热培养法 87 89 90 91 88 89 82 85 84 87 83 84.2 65 61 59 63 64 62.4 60 58 55 60 59 58.4
结果提示，在相同培养条件下20389孢子形成明显高于63516，约70％，该生物特性表明，做为生产微生态制剂菌种，可明显提高制剂稳定性，简化贮藏条件有利于长期贮藏，它是微生态制剂的除安全与有效之外的又一重要的特点与优点。因此，20389是一株更安全、更有效、更稳定的用于生产、整肠治疗和调整阴道菌群，治疗细菌性阴道病的微生态制剂的优良菌种。
综合上述，将20389株的特点，即与模式菌种及63516株的区别要点，概括如下：见表10
表10
G+C 酪 木 阿 甘 乳 肌 尿 凝 芽
mol％ 拉 孢
(TM) 伯 露 乳 形
胶 成
素 糖 糖 醇 糖 醇 素 酶 (％)20389 43.9 + - - - + + + + 84-8963516 42 - + + + - - - + 58-62模式菌：ATCC14580 42.9-49.9 + + + +