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抗肿瘤相关肽及相关抗癌疫苗组合物
技术领域
本发明涉及免疫治疗肽及其在免疫疗法，特别是癌症免疫疗法中的用途。本发明披露了单独形式的或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应疫苗化合物的活性药物成分)组合形式的肿瘤相关T辅助细胞肽表位。特别是本发明的肽组合物可用于引发结直肠癌抗肿瘤免疫反应的疫苗化合物。
为了本发明之目的，以下所有引用文献均以其参考文献的完整形式并入本文。
背景技术
结直肠癌
根据美国癌症协会的报道，结直肠癌(CRC)是美国位于第三位的最常见癌症，每年折磨着超过175,000名新增患者。在美国、日本、法国、德国、意大利、西班牙和英国，每年有超过480,000例患者罹患该疾病。它是发达国家癌症死亡的最常见原因之一。
研究表明，结直肠癌的发病是遗传和环境因素之间相互作用的结果。在大多数病例中，结直肠肿瘤似乎由腺瘤息肉演变而来；但是这个演变过程可能需要很多年。结直肠癌的主要危险因素是年龄，90％的病例在50岁之后诊断患有此病。根据美国癌症协会的报道，结直肠癌的其他危险因素包括饮酒、饮食富含脂肪和/或红色肉类、水果和蔬菜的摄取量不足。结直肠癌的发病率继续上升，特别是日本等地区，这些地区接受西化饮食，摄入过多的脂肪和肉类而纤维摄入量减少，这些因素可能是罪魁祸首。但是发病率的上升速度比不上以前，这可能是由于进行了更多的筛查和息肉切除从而防止了息肉发展成为癌症。
和大多数实体肿瘤的治疗一样，一线治疗方案为手术治疗，然而，手术受益者仍仅限于早期患者，但有很大一部分患者确诊时已是晚期。基于氟尿嘧啶的化疗方案是晚期结直肠癌的标准治疗方法。这些治疗方案的大多数是FOLFOX方案(注射5-FU/亚叶酸+奥沙利铂)和FOLFIRI(伊立替康、亚叶酸，团注和连续输注5-FU)方案。
第三代细胞毒素类药物(如伊立替康和奥沙利铂)的应用增加了显著改善疗效的希望，但预后仍较差，转移癌的生存率一般仍只有大约20个月，因此，治疗该疾病的需求仍远未满足。
最近，新一代药物-分子靶向药物(如阿瓦斯丁(贝伐单抗)和爱必妥(西妥昔单抗))已经问世，大约有40种针对各种期别结直肠癌的化合物正处于临床开发后期。这些化合物的几种联合用药有望增加未来潜在治疗方案的数量。绝大部分药物都处于开发的第二阶段，这些化合物比其他任何药物都更多地针对促使结直肠癌发展的表皮生长因子受体(EGFR)，这是由于80％以上结直肠癌患者的EGRF表达都上调。
针对II期结直肠患者使用最近批准的单克隆抗体(mAb)联合化疗(西妥昔单抗+伊立替康或FOLFOX4方案；贝伐单抗单药或与FOLFOX4方案联合)的临床试验目前正在进行。经过三至四年的观察，预计这些试验会得出有统计学意义的结果。
目前肿瘤科所用的单克隆抗体(mAb)一般都可能不会妨碍主动免疫治疗。事实上，有临床前证据表明，用贝伐单抗去除VEGF是DC-介导的T细胞激活的积极结果。
目前，大约有16个试验正在测试治疗结直肠癌的新免疫疗法的安全性和潜力。
免疫治疗方法
是否能刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索控制免疫系统中的体液和细胞免疫的各种机制。
细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T细胞(CTL)表明，这些细胞对癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用(Cheever et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.1993 690：101-112；Zeh HJ，Perry-Lalley D，Dudley ME，Rosenberg SA，Yang JC；J Immunol.1999，162(2)：989-94；High avidity CTLs for two self-antigensdemonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy.).特别是CD8阳性T细胞(TCD8+)在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别细胞液8至10个源自蛋白或缺损核糖体产物(DRIPS)(Schubert U，Antón LC，Gibbs J，Norbury CC，Yewdell JW，Bennink JR.；Rapiddegradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes；Nature 2000；404(6779)：770-774)的残基中载有主要组织相容性复合体(MHC)的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。
MHC分子有两类：MHC-I类分子，大部分细胞核提呈内源性蛋白DRIPS裂解生成的肽以及较大肽的细胞上都能发现此类分子。MHC-II类分子，主要发现于专职抗原提呈细胞(APC)及其在内吞作用过程中摄取并且随后进行加工的外源性蛋白提呈肽中。肽和MHC-I类分子的复合物由CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞的相应TCR识别，肽和MHC-II类分子的复合物由CD4阳性辅助T细胞的相应TCR识别。
CD4阳性辅助T细胞在安排抗肿瘤T细胞反应的效应子功能中发挥重要作用，因此，肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能引发抗肿瘤免疫反应的药物可能非常重要(Kobayashi，H.，R.Omiya，M.Ruiz，E.Huarte，P.Sarobe，J.J.Lasarte，M.Herraiz，B.Sangro，J.Prieto，F.Borras-Cuesta，and E.Celis.Identification of an antigenic epitope for helper Tlymphocytes from carcinoembryonic antigen.Clin.Cancer Res.2002，8：3219-3225.，Gnjatic，S.，D.Atanackovic，E.，M.Matsuo，A.Selvakumar，N.K.Altorki，R.G.Maki，B.Dupont，G.Ritter，Y.T.Chen，A.Knuth，and L.J.Old.Survey of naturally occurring CD4+T-cell responses againstNY-ESO-1in cancer patients：Correlation with antibody responses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003，100(15)：8862-7)CD4+T cells can lead to locally increased levels of IFNγ(Qin Z，Schwartzkopff J，Pradera F，Kammertoens T，Seliger B，Pircher H，Blankenstein T；A criticalrequirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+T cells；J CancerRes；2003，63(14)：4095-4100)。
哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应细胞(即，CD8阳性T淋巴细胞)，CD4阳性T细胞也能通过抑制干扰素-γ(IFNγ)分泌的血管生成从而抑制肿瘤的出现(Qin，Z.and T.Blankenstein.CD4+T-cell--mediated tumour rejection involvesinhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoieticcells.Immunity.2000，12：677-686)。此外，研究还显示，CD4阳性T细胞可识别HLA-II类分子所提呈的肿瘤相关抗原中的肽，这样可通过诱导抗体(Ab)反应而阻止肿瘤进展(Kennedy，R.C.，M.H.Shearer，A.M.Watts，and R.K.Bright.CD4+T lymphocytes play a critical role inantibody production and tumour immunity against simian virus 40large tumour antigen.CancerRes.2003，63：1040-1045)。与肿瘤相关肽和HLA-I类分子相结合相比较而言，迄今只对TAA的少量II类配体有过描述(www.cancerimmunity.org，www.syfpeithi.de)。
由于HLA-II类分子的组成性表达通常仅限于免疫系统的细胞(Mach，B.，V.Steimle，E.Martinez-Soria，and W.Reith.Regulation of MHC class II genes：lessons from a disease.Annu.Rev.Immunol.1996，14：301-331)，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽被认为是不可能的事。然而，发明人最近成功地在肿瘤中直接识别了MHC-II类抗原的表位(EP 1642905，EP 1760088；Dengjel J，Nastke MD，Gouttefangeas C，Gitsioudis G，Schoor O，Altenberend F，Müller M，B，Missiou A，Sauter M，Hennenlotter J，Wernet D，Stenzl A，Rammensee HG，Klingel K，S.；Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas；ClinCancer Res.2006；12：4163-4170)。
在没有炎症的情况下，MHC-II类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专职抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。令人吃惊的是，在肿瘤患者的肿瘤细胞中发现有MHC-II类分子的表达(Dengjel J，Nastke MD，Gouttefangeas C，Gitsioudis G，Schoor O，Altenberend F，Müller M，B，Missiou A，Sauter M，Hennenlotter J，Wernet D，Stenzl A，Rammensee HG，Klingel K，S.；Unexpectedabundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas；Clin Cancer Res.2006；12：4163-4170)。
对于触发(引发)细胞免疫反应的肽，它必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-10个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(“锚”)。这样，每个MHC的等位基因都有“结合基序”，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合(Rammensee HG，Bachmann J，Stevanovic S.MHC ligands and peptide motifs，Landes Bioscience，USA，1997)。
在MHC-I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们还必须能被T细胞特异性T细胞受体(TCR)识别。
肿瘤特异性T淋巴细胞所识别的抗原，即它们的表位，可以是源自所有类蛋白的分子，如，酶、受体、转录因子等。此外，肿瘤相关抗原也可以只存在于肿瘤细胞中，如突变基因产物中。另一种重要的肿瘤相关抗原是组织特异性抗原，如，表达于不同类型肿瘤和健康睾丸组织中的癌睾丸(CT)抗原。
多种肿瘤相关抗原已经得到确定。此外，在识别其他肿瘤相关抗原方面也做了大量研究。有些肿瘤相关抗原，在本领域中也称作肿瘤特异性抗原，具有组织特异性。例子包括但(不仅限于)黑色素瘤的酪氨酸酶、前列腺癌的PSA和PSMA、淋巴瘤中诸如bcr/abl的染色体交叉(易位)部位。但是，许多得到确定的肿瘤相关抗原出现于多种类型肿瘤中，有些抗原，如，实际上导致转化事件的致癌蛋白和/或肿瘤抑制基因(肿瘤抑制基因是Linehan WM，Walther MM，Zbar B关于肾癌综述The genetic basis of cancer of the kidney.J Urol.2003 Dec；170(6Pt1)：2163-72中所提及的)几乎出现于所有类型肿瘤中。例如，控制细胞生长和分化的正常细胞蛋白，如p53(一种肿瘤抑制基因)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu可累积突变，导致这些基因产物的表达上调，从而致癌(McCartey et al.Cancer Research，1998，15：582601-5；Disis et al.Ciba Found.Symp.1994，187：198-211)。这些突变蛋白也可以是多种癌症的肿瘤特异性免疫反应的一个标靶。
癌症患者免疫治疗的目标是特异性激活免疫系统细胞，特别是作用于肿瘤细胞而不作用于健康组织的所谓细胞毒性T细胞(CTL，称为“杀伤细胞”、也称为CD8阳性T细胞)。肿瘤细胞因表达肿瘤相关蛋白而与健康细胞不同。细胞表面的HLA分子将细胞内容物提呈出细胞外，从而使细胞毒性T细胞辨别出健康细胞和肿瘤细胞。这通过把细胞内的所有蛋白分解为短肽，然后再粘附到HLA分子并提呈到细胞表面上而实现(Rammensee，HG，Falk，K，andRotzschke，O；Peptides naturally presented by MHC class I molecules，Annu.Rev.Immunol.，1993，11，213-244)。提呈于肿瘤细胞但在人体健康细胞上没有或少得多的肽称为肿瘤相关肽(TUMAP)。
对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而正常健康组织根本不表达或表达数量较少。此外，必要时，各个抗原不仅出现于一种肿瘤中而且浓度高(即，每细胞各种肽的拷贝数)。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原通常是源于由于细胞周期调控或凋亡等功能在正常细胞转化为肿瘤细胞中直接受累的蛋白。另外，这些直接导致转化的蛋白的下游靶标也可能会被上调，因此间接与肿瘤相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标。至关重要的是，在这两种情况中，都存在抗原氨基酸序列的表位，所以这种来自肿瘤相关抗原的肽(“免疫原性肽”)可导致体外或体内T细胞反应。
基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞反应的前提是存在有着相应TCR的T细胞并且没有这个特定表位的免疫耐受性。辅助T细胞在安排抗肿瘤免疫方面的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发TH1类型辅助T细胞反应的辅助T细胞表位支持CD8阳性杀伤T细胞的效应功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合物)。这样，单独形式的或与其他肿瘤相关肽形成组合物的肿瘤相关T辅助细胞肽表位可作为刺激抗肿瘤免疫反应疫苗化合物的活性药物成分。
由于CD8及CD4依赖型反应共同和协同促进抗肿瘤作用，因此，CD8+CTL(MHC-I分子)或CD4阳性CTL(MHC-II类分子)对肿瘤相关抗原的识别和鉴定对开发肿瘤疫苗非常重要。因此，提出含有与任一类MHC复合物结合的肽组合物是本发明的一个目标。
使用肿瘤相关肽进行的临床试验最初由Boon及其同事在20世纪90年代中期进行，主要适应症为黑色素瘤。试验的最佳临床有效率为10％至30％。使用基于肽的疫苗单一治疗的任何临床试验中，都未曾报告有严重的副作用或严重的自身免疫性。用黑色素瘤相关肽治疗的一些患者报告有轻度的白癜风。
但是，使用一种CTL通常不足以消灭所有肿瘤细胞。肿瘤具有很强的诱变性，能快速对CTL的攻击作出反应，通过改变CTL的蛋白质模式以逃避被CTL识别。为了反击肿瘤逃逸机制，在接种疫苗中，运用各种特异性肽。这样，可同时使用数种CTL克隆物对肿瘤进行广泛的同时攻击。这可能会减少肿瘤逃避免疫反应打击的机会。这一假设最近已经在治疗晚期黑色素瘤患者的一项临床研究中得到证实。除了少数情况之外，至少有三次不同T细胞反应的患者显示出客观的临床有效率或稳定的病情(Banchereau，J，Palucka，AK，Dhodapkar，M，Burkeholder，S，Taquet，N，Rolland，A，Taquet，S，Coquery，S，Wittkowski，KM，Bhardwaj，N，Pineiro，L，Steinman，R，and Fay，J；Immune and clinical responses in patients with metastaticmelanoma to CD34(+)progenitor-derived dendritic cell vaccine，Cancer Res.，2001，61，6451-6458)以及生存期延长(与J.Banchereau私下交流结果)，但绝大多数少于三次T细胞反应的患者诊断患有进展性疾病。
申请人的一项研究显示，当使用一种由13种不同肽组成的疫苗接种肾细胞癌患者时，得到了类似结果(H.Singh-Jasuja，S.Walter，T.Weinschenk，A.Mayer，P.Y.Dietrich，M.Staehler，A.Stenzl，S.Stevanovic，H.Rammensee，J.Frisch；Correlation of T-cell response，clinical activity andregulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901，a novel multi-peptidevaccine；ASCO Meeting 2007 Poster#3017；M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich，T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter，H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief；An open label study toevaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901，ASCO meeting2007；Poster#3017)。
因此，开发一种肿瘤疫苗的主要任务不仅要识别和鉴定新型肿瘤相关抗原及其免疫原T辅助表位，而且还要组合不同抗原表位以增加每位患者对一种以上表位产生反应的可能性。因此，本发明的一个目标是提出有能力与人主要组织相容性复合体(MHC)I(HLA-I)或II(HLA-II)类分子结合的肽氨基酸序列的组合物。本发明的另一目标是提出一种基于肽组合物的有效抗癌疫苗。
在本发明中，发明人分离和描述与直接来自于哺乳动物结直肠癌等肿瘤中的HLA-I或II类分子结合的肽。
本发明提出了这样的肽：它们来源于致瘤相关抗原并且有能力与MHC(HLA)-II类分子充分结合，触发人白细胞免疫反应，特别是淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4阳性T淋巴细胞、介导Th1型免疫反应的CD4阳性T淋巴细胞。
本发明还提出了这样的肽：它们来源于致瘤相关抗原，并且有能力与MHC(HLA)-I类分子充分结合，触发人白细胞免疫反应，特别是淋巴细胞、T淋巴细胞、CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞以及对癌症患者接种疫苗有益的两种肽的组合物。
根据本发明，其目标通过这样方式达成：提供了一种至少有两种肽组成的药物组合物，这两种肽含有从SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 7组成的基团中所选的氨基酸序列、和/或含有与SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 7组成的基团80％同源的一个变异氨基酸序列，和/或含有编码为SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 7核酸的多聚核苷酸或变异氨基酸序列，以及药用载体。同时，本发明的药物组合物还可包括至少这样的一种额外的肽：它含有从SEQ ID NO 8至SEQ IDNO 15组成的基团中所选的氨基酸序列、或含有与SEQ IDNO 8至SEQ IDNO 15组成的基团80％相同的一个变异氨基酸序列，或含有编码为SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 15核酸的多聚核苷酸或变异氨基酸序列。这些肽的总长度可为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸，最优选为8至16个氨基酸。这些肽也可含有非肽键。
如下文所述，构成本发明基础的肽都被确定为MHC-I类或II类承载细胞所提呈的肽。因此，这些特殊肽以及其他含有序列的肽(即衍生肽)都能引发特异性T细胞反应，虽然其诱导的反应程度可能会因不同的肽和患者而不同。差异可能因肽的突变等原因造成。本领域技术人员熟知可应用于确定各个肽诱导反应程度的方法，特别是参照本文实施例和有关文献后。
优选情况是，发明中的变体可诱导T细胞与发明中各个肽发生交叉反应。
肽氨基酸序列或编码肽的核酸序列及变体间的同源比例可运用本领域已知的算法计算。本发明中，“同源性”一词是指两个氨基酸序列之间的同一度，如肽或多肽序列。前文所述的“同源”是通过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此处要比对的氨基酸或核酸序列在两个序列最佳排列中可能有增加或删除(例如，序列缺口等)。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个排列而进行计算(Nucleic Acid Res.，22(22)：46734680(1994)。可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是Vector NTI、GENETYX或由公共数据库，如http://restools.sdsc.edu/biotools/biotools16.html提供的分析工具。
药用载体通常是已熟知的液体，可配制其中的一种有效治疗剂制。剂型中的载体虽然可能具有化学和/或生物稳定性、释放特性等等，但是一般不具备任何药理活性。典型配方可在诸如Alfonso R.Gennaro.Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th EditionBaltimore，MD：Lippincott Williams&Wilkins，2000等书籍中找到，包括(但不限于)盐水、水、缓冲水、0.3％甘氨酸、透明质酸、葡萄糖等。最近，人们发现在人类患者中用作静脉营养很多年的某些脂肪乳剂也可充当一种肽赋形剂。有两种此类乳剂已用作商用脂肪乳剂，名叫Intralipid、Lipofundin。″Intralipid″是瑞典Kabi Pharmacia公司一种静脉营养脂肪乳剂的注册商标，美国专利号为3169094。″Intralipid″是德国B.Braun Melsungen公司的注册商标。两者均包含大豆油脂肪(1000蒸馏水中含100或200克：即含量分别为10％或20％)。Intralipid中卵黄磷脂用作乳化剂(12g/l蒸馏水)，Lipofundin中蛋黄卵磷脂用作乳化剂(12g/l蒸馏水)。Intralipid和Lipofundin的等渗性均是在它们中加入甘油(25g/l)的结果。
肽来源于肿瘤相关抗原，特别是具有蛋白酶解、血管生成、细胞生长、细胞周期调控、细胞分裂、转录调控、翻译调控、组织浸润等功能的肿瘤相关抗原。表1描述了这些肽及生成这些肽的蛋白的功能。
表1：本发明中的肽及其亲本蛋白的功能

  序列  ID号  肽ID  序列  基因符号  功能  与MHC结合  1  C20-001  ALSNLEVTL  C20orf42  连接肌动蛋白细胞骨架和  ECM  HLA-A*02  2  NOX-001  ILAPVILYI  NOX1  NADPH氧化酶  HLA-A*02
  序列  ID号  肽ID  序列  基因符号  功能  与MHC结合  3  ODC-001  ILDQKINEV  ODC1  鸟氨酸脱羧酶  HLA-A*02  4  PCN-001  KLMDLDVEQL  PCNA  DNA聚合酶δ辅助蛋白  HLA-A*02  5  TGFBI-001  ALFVRLLALA  TGFBI  β诱导的转化生长因子  HLA-A*02  6  TOP-001  KIFDEILVNA  TOP2A/TOP2B  异构酶  HLA-A*02  7  TGFBI-004  TPPIDAHTRNLLRNH  TGFBI  β诱导的转化生长因子  HLA-DR
20号染色体开放阅读框42
C20orf42是参与肌动蛋白细胞骨架附着到细胞质膜和整合素介导细胞过程的粘着斑蛋白。C20orf42缺失会导致丧失功能的突变，从而引起Kindler综合症，它是一种常染色体隐性遗传性皮肤病，其特点是皮肤起泡、逐步萎缩、对光敏感，偶尔也能致癌(Herz，C，Aumailley，M，Schulte，C，Schlotzer-Schrehardt，U，Bruckner-Tuderman，L，and Has，C；Kindlin-1 is aphosphoprotein involved in regulation of polarity，proliferation，and motility of epidermalkeratinocytes，J Biol Chem.，2006，281，36082-36090)。最近，一名患有功能丧失突变的患者报告有严重的胃肠道疾病并伴出血性肠炎(Sadler，E，Klausegger，A，Muss，W，Deinsberger，U，Pohla-Gubo，G，Laimer，M，Lanschuetzer，C，Bauer，JW，and Hintner，H；Novel KIND1 genemutation in Kindler syndrome with severe gastrointestinal tract involvement，Arch.Dermatol.，2006，142，1619-1624)。
在癌症方面，关于癌症相关基因表达的研究已对C20orf42进行了描述。结果发现，接受检查的70％结肠癌和60％肺癌(n＝10)中C20orf42表达过量。Northern Blot法检测显示，正常组织表达仅限于神经肌肉组织(Weinstein，EJ，Bourner，M，Head，R，Zakeri，H，Bauer，C，andMazzarella，R；URP1：a member of a novel family of PH and FERM domain-containingmembrane-associated proteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas，Biochim.Biophys.Acta，2003，1637，207-216)。此外，C20orf42已被确定为参与TGF-β介导的细胞迁移和肿瘤浸润的一种基因(Kloeker，S，Major，MB，Calderwood，DA，Ginsberg，MH，Jones，DA，and Beckerle，MC；The Kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-betaand involved in integrin-mediated adhesion，J.Biol.Chem.，2004，279，6824-6833)。
NADPH氧化酶同源物-1(NOX1)
NOX1是一种对生长因子有反应的酶，催化生成活性氧超氧化物(O2-)和过氧化氢(H2O2)。其表达最初发现于结肠、前列腺、子宫和增殖的血管平滑肌细胞中(Suh，Y.A.et al.Celltransformation by the superoxide-generating oxidase Moxl.Nature 1999，401，79-82)。它的表达与细胞增殖、血管生成、细胞信号通路激活等生物反应次数相关(Harper，R.W.，Xu，C.，Soucek，K.，Setiadi，H.and Eiserich，J.P.A reappraisal of the genomic organization of human Noxl and its splicevariants.Arch.Biochem.Biophys.2005，435，323-330)。
NOX1在结肠中高表达，但其在结肠生理或病理学中的功能仍然知之甚少。在正常组织中，NOX1在回肠中表达低，在右结肠中表达中等，在左结肠中表达高。NOX1在腺瘤、高分化或低分化结肠腺癌样本中的表达没有统计学差异。NOX1在结肠上皮细胞的隐窝内和腔表面均呈高表达。总之，NOX1是组成型表达于结肠上皮细胞并与致瘤不直接相关的一种酶(Szanto，I.et al.Expression of NOX1，a superoxide-generating NADPH oxidase，in colon cancer andinflammatory bowel disease.J Pathol.2005，207，164-176)。
免疫组织化学表明，NOX1组成型表达于表面粘液细胞。腺瘤和高分化腺癌上调NOX1表达。核因子(NF)-κB主要在NOX1表达丰富的腺瘤和腺癌细胞中被激活，这表明NOX1可在结肠肿瘤中刺激NF-κB依赖型抗凋亡途径(Fukuyama，M.et al.Overexpression of a novelsuperoxide-producing enzyme，NADPH oxidase 1，in adenoma and well differentiatedadenocarcinoma of the human colon.Cancer Lett.2005，221，97-104)。
Wnt3a/β-Catenin信号传导被描述为可诱导NOX1表达(Petropoulos，H.&Skerjanc，I.S.Beta-catenin is essential and sufficient for skeletal myogenesis in P19cells.J Biol Chem.2002，277，15393-15399)。
最近，活性氧分子表明可诱导内皮细胞凋亡，随后可诱导各种肿瘤细胞粘附分子的表达。这表明，通过阻止ROS的生成而预防肿瘤远处复发是可行的(Ten，KM，van der Wal，JB，Sluiter，W，Hofland，LJ，Jeekel，J，Sonneveld，P，and van Eijck，CH；The role of superoxide anions in thedevelopment of distant tumour recurrence，2006，Br.J Cancer，)。
鸟氨酸脱羧酶1(ODC1)
ODC1是将鸟氨酸催化为腐胺的多胺生物合成途径的限速酶。该限速酶的活性水平根据对生长促进性刺激的反应而不同，与其他哺乳动物蛋白质相比，表现出较高的周转率。
多胺代谢是上皮组织癌变机制的组成部分。ODC1增加往往与正常细胞开始生长以及肿瘤细胞持续生长相关。实验模型中，ODC1抑制剂可抑制膀胱癌、乳腺癌、结肠癌和皮肤癌的形成。ODC1活性的过度表达是许多癌症的公认特点，ODC1已被视作一种原癌基因(Auvinen，M.，Paasinen，A.，Andersson，L.C.and Holtta，E.Ornithine decarboxylase activity iscritical for cell transformation.Nature 1992，360，355-358)。
结肠腺瘤样息肉(APC)基因的胚系突变是结肠癌最明确的遗传因素之一。APC突变导致游离β-catenin水平大幅增高并进入细胞核，在那里，与序列特异性转录因子中的淋巴增强因子(LEF)/T细胞因子(TCF)家族成员形成一种复合物。c-myc癌基因是一种Tcf靶向基因(He，T.C.et al.Identification of c-MYC as a target of the APC pathway(Science 281，1509-1512(1998)。c-MycRNA和蛋白在结直肠肿瘤癌变早期和晚期都过量表达)。ODC是一种c-Myc靶向基因。
APC功能丧失可导致ODC1上调(Gerner，EW and Meyskens，FL，Jr.，Polyamines andcancer：old molecules，new understanding，Nat.Rev.Cancer，2004，4，781-792)，结直肠癌中经常可观察到过量表达(Hu，H.Y.et al.Ornithine decarboxylase gene is overexpressed in colorectalcarcinoma，World J.Gastroenterol.2005，11，2244-2248；Kitahara，O.et al.Alterations of geneexpression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capturemicrodissection of tumor tissues and normal epithelia；Cancer Res.2001，61，3544-3549；Nemoto，T.，Kubota，S.，Ishida，H.，Murata，N.and Hashimoto，D.Ornithine decarboxylase，mitogen-activatedprotein kinase and matrix metalloproteinase-2expressions in human colon tumors.World J.Gastroenterol.2005，11，3065-3069)。
ODC1充当血管内皮抑制素的抑制剂，具有促进血管生成的特性(Nemoto，T.，Hori，H.，Yoshimoto，M.，Seyama，Y.&Kubota，S.Overexpression of ornithine decarboxylase enhancesendothelial proliferation by suppressing endostatin expression.Blood 2002，99，1478-1481)。
结直肠癌细胞株HT-29感染ODC1和S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(另一重要多胺生物合成途径酶)的腺病毒编码的反义RNA可导致CCND1下调和细胞周期阻滞。此外，β-catenin的核转位也受到了抑制(Gong，L，Jiang，C，Zhang，B，Hu，H，Wang，W，and Liu，X；Adenovirus-mediatedExpression of Both Antisense Ornithine Decarboxylase and S-adenosylmethionine DecarboxylaseInduces G(1)Arrest in HT-29Cells，J Biochem.Mol.Biol，2006，39，730-736)。腺病毒也诱导裸鼠肿瘤的消退(Zhang，B，Liu，XX，Zhang，Y，Jiang，CY，Hu，HY，Gong，L，Liu，M，and Teng，QS；Polyamine depletion by ODC-AdoMetDC antisense adenovirus impairs human colorectal cancergrowth and invasion in vitro and in vivo，2006，J Gene Med，8，980-989)。
ODC1的特异性不可逆转性抑制剂为2-二氟甲基鸟氨酸(DMFO，Eflornithine(Sanofi-Aventis公司))。它作为昏睡病(由锥虫引起)的治疗方法而推广，并且是脱毛霜Vaniqa的活性成分。
在癌症方面，DMFO已被广泛用于临床前模型中，并通过降低多胺水平而显示出有希望的抗肿瘤作用(Gerner，EW and Meyskens，FL，Jr.；Polyamines and cancer：old molecules，newunderstanding，Nat.Rev.Cancer，2004，4，781-792)。对于多个癌种已经进行了临床试验，而针对结直肠癌的一些试验目前正在进行中。但是，这些研究大多数针对容易演变为结直肠癌(腺瘤息肉)患者，采取预防组合方法。免疫原性ODC肽(ODC-001)先前已得到确定(M.Diehl，PhD Thesis，University of Tübingen，1998)
增殖细胞核抗原(PCNA)
PCNA发现于细胞核中，是DNA聚合酶δ的辅助因子。编码蛋白质充当一个同源三聚体，帮助提高DNA复制过程中前导链的持续合成能力。因此，它在所有增殖细胞尤其是肿瘤细胞中表达，用作检测增殖的标志物。
PCNA免疫组化分析中定义的肿瘤及其邻近正常粘膜的增殖指数很久以前就被认为是结直肠癌患者复发和生存期差的独立预测因素(al-Sheneber，IF，Shibata，HR，Sampalis，J，andJothy，S；Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer，Cancer，1993，71，1954-1959；Mayer，A，Takimoto，M，Fritz，E，Schellander，G，Kofler，K，andLudwig，H；The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen，epidermal growth factorreceptor，and mdr gene expression in colorectal cancer，Cancer，1993，71，2454-2460；Nakamura，T，Tabuchi，Y，Nakae，S，Ohno，M，and Saitoh，Y；Serum carcinoembryonic antigen levels andproliferating cell nuclear antigen labeling index for patients with colorectal carcinoma.Correlationwith tumor progression and survival，Cancer，1996，77，1741-1746)。
DNA拓扑异构酶II(TOP2)
TOP2A和TOP2B编码一种DNA拓扑异构酶的异形体，这种酶能够控制和改变转录过程中DNA的拓扑状态。这种核酶参与诸如染色体凝集、染色单体分离以及减轻DNA转录和复制过程中产生的扭转应力等过程。它可催化两个双链DNA的短暂断裂和重新连接，这使得DNA链可穿过对方，从而改变DNA的拓扑结构。这种酶的两种异构体可能以基因复制产物的形式存在。该基因编码的α形式位于17号染色体处，β基因位于3号染色体处。
TOP2A是几种抗癌药物的靶标，这个基因的各种突变都可导致出现耐药。
TOP2A基因与HER-2癌基因(最常见的乳腺癌扩增癌基因)相邻，位于染色体位置17q12-q21处，其扩增或删除频率在几乎90％的HER-2扩增原发性乳腺肿瘤中都相等(Jarvinen，TA and Liu，ET；Topoisomerase IIalpha gene(TOP2A)amplification and deletion incancer--more common than anticipated，Cytopathology，14，309-313)。另外，其他癌症也报告了有TOP2A扩增。最近的实验以及很多大型的多中心试验表明，TOP2A扩增(和/或删除)可证明该基因对常用细胞毒药物敏感或耐药，如对拓扑异构酶II抑制剂(蒽环类药物等)(Kellner，U，Sehested，M，Jensen，PB，Gieseler，F，and Rudolph，P；Culprit and victim--DNA topoisomerase II，Lancet Oncol.，2002，3，235-243)，这取决于TOP2A处的具体基因缺陷(Jarvinen，TA and Liu，ET；Simultaneous amplification of HER-2(ERBB2)and topoisomerase IIalpha(TOP2A)genes--molecular basis for combination chemotherapy in cancer，Curr.Cancer Drug Targets.，2006，6，579-602)。
没有TOP2A DNA复制和细胞分裂是不可能的。因此，它成为了众多抗癌治疗方案的主要靶标，即使杀伤细胞的确切机制仍难以解释(Kellner，U，Sehested，M，Jensen，PB，Gieseler，F，and Rudolph，P；Culprit and victim--DNA topoisomerase II，Lancet Oncol.，2002，3，235-243)。这种方法的成功与否受到自发耐药性的限制，药物引起的DNA损伤可增加肿瘤的恶性程度。
TOP2B是TOP-001的第二种潜在源蛋白，由于其位于染色体区域(3p24)中，是否在肿瘤中频繁扩增尚不清楚，因此，癌症研究中还没有得到过多关注。但是，TOP2B与TOP2A的主要结构类似，并与其具有几乎相同的催化性能(Leontiou，C，Lightowlers，R，Lakey，JH，andAustin，CA；Kinetic analysis of human topoisomerase IIalpha and beta DNA binding by surfaceplasmon resonance，FEBS Lett.，2003，554，206-210)。另一项研究中也显示这两个异构体可以相互替代(Sakaguchi，A and Kikuchi，A；Functional compatibility between isoform alpha and beta oftype II DNA topoisomerase，J Cell Sci.，2004，117，1047-1054)。
本发明中，发明人提出了确凿的证据表明，肿瘤相关肽与HLA-I类分子充分结合能引发人CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫反应，同时也证明了权利要求中的肽适合触发人免疫系统对肿瘤细胞多肽组选定的肽发生反应。
同样地，我们发现肿瘤相关肽与HLA-II类分子充分结合，尤其是与人基因组HLA DR位点编码的HLA-II类等位基因结合，能够引发人CD4阳性T细胞介导的免疫反应。CD4阳性T细胞从人外周血中分离，这表明权利要求中的肽适合触发人免疫系统对肿瘤细胞多肽组选定的肽发生反应。下面所列举的肽TGFBI-004(与HLA-DR结合肿瘤相关肽)发现可被CD4阳性T细胞识别。
由于肽可化学合成，并可用作药物制剂的药用活性成分，因此，本发明提出的肽可用于免疫治疗，优选为癌症免疫治疗。
另一方面，该药物组合物包括至少另外一种肽，这种肽含有从SEQ ID NO 8至SEQ ID NO15组成的基团中所选的一个氨基酸序列、或含有与SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 15组成的基团至少80％同源的一个变异氨基酸序列，或含有编码为SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 15核酸的多聚核苷酸或变异氨基酸序列。含SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 13以及SEQ ID NO 15序列的肽是之前确定的并与MHC-I类和MHC-II类分子结合的免疫原性肽(见表2)。
这些肽显示可引发肾细胞癌(RCC)患者的体内T细胞反应(H.Singh-Jasuja，S.Walter，T.Weinschenk，A.Mayer，P.Y.Dietrich，M.Staehler，A.Stenzl，S.Stevanovic，H.Rammensee，J.Frisch；Correlation of T-cell response，clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cellcarcinoma patients treated with IMA901，a novel multi-peptide vaccine；ASCO Meeting 2007 Poster#3017；M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich，T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter，H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief；An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of thepeptide based cancer vaccine IMA901，ASCO meeting 2007；Poster#3017)。由于亲本蛋白质不仅在肾细胞癌中，而且在结直肠癌以及其他类型癌症中过量表达，因此这些肽也可用于治疗其他癌种的疫苗中，特别是抗结直肠癌疫苗中。
表2：本发明组合物中其他有用的免疫原性肽
  序列  ID号 肽ID  序列  基因符号  功能  与MHC结合  8 CEA-006  SPQYSWRINGIPQQHT  CEACAM5  癌胚抗原  HLA-DR  9 CCN-001  LLGATCMFV  CCND1  细胞周期蛋白D1  HLA-A*02  10 MUC-001  STAPPVHNV  MUC1  粘蛋白1  HLA-A*02  11 MMP-001  SQDDIKGIQKLYGKRS  MMP7  金属蛋白酶7  HLA-DR  12 CEA-005  YLSGADLNL  CEACAM5  CEA肽变体  HLA-A*02  13 MET-001  YVDPVITSI  MET  Met原癌基因  HLA-A*02  14 (HBV-001)  FLPSDFFPSV  控制肽
  序列  ID号 肽ID  序列  基因符号  功能  与MHC结合  15 CEA-004  YLSGANLNL  CEACAM5  CEA肽  HLA-A*02
癌胚抗原相关细胞粘附分子5
癌胚抗原(CEA＝CEACAM5)是一种分子量为180kDa的高度糖基化膜蛋白分子，由三个C2Ig样重复单元组成，两侧含有一个N-端IgV样区域和一个C-端区域，其中包括糖磷脂酰肌醇连接区域(Hegde，P，Qi，R，Gaspard，R，Abernathy，K，Dharap，S，Earle-Hughes，J，Gay，C，Nwokekeh，NU，Chen，T，Saeed，AI，Sharov，V，Lee，NH，Yeatman，TJ，and Quackenbush，J；Identification of tumour markers in models of human colorectal cancer using a 19，200-elementcomplementary DNA microarray，Cancer Res.，2001，61，7792-7797)。
癌胚抗原CEA在胎儿发育过程中表达，但是在成人胃肠道上皮中表达低。但是，CEA在人肿瘤中有较高比例的过量表达，其中包括90％的胃肠道癌、结直肠癌和胰腺癌，70％的非小细胞肺癌细胞和50％的乳腺癌(Thompson，JA，Grunert，F，and Zimmermann，W；Carcinoembryonic antigen gene family：molecular biology and clinical perspectives，J Clin Lab Anal.，5，344-366 2005)。由于CEA在肿瘤细胞中表达并向血清中分泌，因此，CEA已被广泛用作肿瘤标志物(Sikorska，H，Shuster，J，and Gold，P；Clinical applications of carcinoembryonic antigen，Cancer Detect.Prev.，12，321-355 1988)，并作为监测结直肠癌的标准血清标志物(Locker，GY，Hamilton，S，Harris，J，Jessup，JM，Kemeny，N，Macdonald，JS，Somerfield，MR，Hayes，DF，andBast，RC，Jr.；ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumour markers ingastrointestinal cancer，J Clin Oncol，24，5313-5327，2006)。
尽管CEA在肿瘤细胞中过量表达，但是癌症患者通常对这种抗原并未表现出免疫反应(Orefice，S，Fossati，G，Pietrojusti，E，and Bonfanti，G；Delayed cutaneous hypersensitivity reactionto carcinoembryonic antigen in cancer patients，Tumouri，1982，68，473-475，)。由于CEA一般在体内表达水平低，因此免疫系统通常对其具有耐受性。但是，在一系列临床疫苗试验中，CEA的免疫原性已得到证明(Sarobe，P，Huarte，E，Lasarte，JJ，and Borras-Cuesta，F；Carcinoembryonicantigen as a target to induce anti-tumour immune responses，Curr.Cancer Drug Targets.，2004，4，443-454)，特别是结直肠癌(CRC)(Mosolits，S，Ullenhag，G，and Mellstedt，H；Therapeuticvaccination in patients with gastrointestinal malignancies.A review of immunological and clinicalresults，Ann.Oncol.，2005，16，847-862)，并且CEA是这种癌种试验中在最多疫苗平台上得到测试的肿瘤相关抗原(TAA)(von Mehren，M；Colorectal cancer vaccines：what we know and what wedon′t yet know，Semin.Oncol.，2005，32，76-84)。
CEA的几种细胞毒性和辅助T细胞表位已进行了描述(Crosti，M，Longhi，R，Consogno，G，Melloni，G，Zannini，P，and Protti，MP；Identification of novel subdominant epitopes on thecarcinoembryonic antigen recognized by CD4+T-cells of lung cancer patients，J Immunol.，2006，176，5093-5099；Novellino，L，Castelli，C，and Parmiani，G；A listing of human tumour antigensrecognized by T-cells：March 2004update，Cancer Immunol.Immunother.，2004，54，187-207；Ruiz，M，Kobayashi，H，Lasarte，JJ，Prieto，J，Borras-Cuesta，F，Celis，E，and Sarobe，P；Identification andcharacterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen，Clin Cancer Res.，2004，10，2860-2867)，这使得各种以肽为基础的结直肠癌免疫试验成为可能(Babatz，J，Rollig，C，Lobel，B，Folprecht，G，Haack，M，Gunther，H，Kohne，CH，Ehninger，G，Schmitz，M，and Bornhauser，M；Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatictumours after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells，CancerImmunol.Immunother.，2006，55，268-276；Fong，L，Hou，Y，Rivas，A，Benike，C，Yuen，A，Fisher，GA，Davis，MM，and Engleman，EG；Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expandeddendritic cells for tumour immunotherapy，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，200l，98，8809-8814；Liu，KJ，Wang，CC，Chen，LT，Cheng，AL，Lin，DT，Wu，YC，Yu，WL，Hung，YM，Yang，HY，Juang，SH，and Whang-Peng，J；Generation of carcinoembryonic antigen(CEA)-specific T-cell responses inHLA-A*0201and HLA-A*2402 late-stage colorectal cancer patients after vaccination with dendriticcells loaded with CEA peptides，Clin Cancer Res.，2004，10，2645-2651；Matsuda，K，Tsunoda，T，Tanaka，H，Umano，Y，Tanimura，H，Nukaya，I，Takesako，K，and Yamaue，H；Enhancement ofcytotoxic T-lymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies followingvaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells，Cancer Immunol.Immunother.，2004，53，609-616；Ueda，Y，Itoh，T，Nukaya，I，Kawashima，I，Okugawa，K，Yano，Y，Yamamoto，Y，Naitoh，K，Shimizu，K，Imura，K，Fuji，N，Fujiwara，H，Ochiai，T，Itoi，H，Sonoyama，T，Hagiwara，A，Takesako，K，and Yamagishi，H；Dendritic cell-based immunotherapy of cancer withcarcinoembryonic antigen-derived，HLA-A24-restricted CTL epitope：Clinical outcomes of 18patients with metastatic gastrointestinal or lung adenocarcinomas，Int.J Oncol.，2004，24，909-917；Weihrauch，MR，Ansen，S，Jurkiewicz，E，Geisen，C，Xia，Z，Anderson，KS，Gracien，E，Schmidt，M，Wittig，B，Diehl，V，Wolf，J，Bohlen，H，and Nadler，LM；Phase I/II combined chemoimmunotherapywith carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan，5-fluorouracil，and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer，Clin Cancer Res.，2005，11，5993-6001)。到目前为止，上述试验以及其他临床试验已经证实了CEA接种的安全性并提供了诱导这种抗原免疫反应的证据(von Mehren，M；Colorectal cancer vaccines：what weknow and what we don′t yet know，Semin.Oncol.，2005，32，76-84)。
CEA-006的变种在先前已经公布(Ruiz，M，Kobayashi，H，Lasarte，JJ，Prieto，J，Borras-Cuesta，F，Celis，E，and Sarobe，P；Identification and characterization of a T-helper peptidefrom carcinoembryonic antigen，Clin Cancer Res.，2004，10，2860-2867)。CEA-005是进行单个氨基酸交换的变种，已报告能克服中枢免疫耐受性(Zaremba，S，Barzaga，E，Zhu，M，Soares，N，Tsang，KY，and Schlom，J；Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptidefrom human carcinoembryonic antigen，Cancer Res.，1997，57，4570-4577)。
转化生长因子β诱导的(TGFBI)基因
TGFBI最先被认定为人肺腺癌细胞株的TGF-β诱导基因。它能编码分泌出的细胞外基质蛋白，该蛋白被认为作用于细胞粘附物和细胞外基质成分。
TGFBI是一种结直肠癌中升高最为明显的基因，也在腺瘤中高表达。定量PCR结果显示，它在未纯化的和纯化的肿瘤上皮细胞中均大大升高。因此，原位杂交实验表明，TGFBI在基质和上皮细胞等多种细胞类型中表达(Buckhaults，P，Rago，C，St，CB，Romans，KE，Saha，S，Zhang，L，Vogelstein，B，and Kinzler，KW；Secreted and cell surface genes expressed in benign andmalignant colorectal tumours，Cancer Res.，2001，61，6996-7001)。
在一次对结直肠癌基因表达研究进行的荟萃分析中，TGFBI被确认为9个基因中唯一的一个不断上调的基因(TGFBI的4个研究)(Shih，W，Chetty，R，and Tsao，MS；Expressionprofiling by microarrays in colorectal cancer，Oncol.Rep.，2005，13，517-524)。
在人胰腺癌组织中，TGFBI mRNA水平比正常对照组织中增加32.4倍。原位杂交分析结果显示，TGFBI mRNA主要表达于胰腺肿瘤中的癌细胞(Schneider，D，Kleeff，J，Berberat，PO，Zhu，Z，Korc，M，Friess，H，and Buchler，MW；Induction and expression of betaig-h3 in pancreaticcancer cells，Biochim.Biophys.Acta，2002，1588，1-6)。
在体外模型中，TGFBI被确定为一种促血管生成基因。此外，在另外几种肿瘤中，检测到TGFBI表达显著增强。TGFBI的反义寡核苷酸既阻止体外基因表达又阻止体外内皮细胞管形成，这表明TGFBI可在内皮细胞基质的相互作用中发挥着关键作用(Aitkenhead，M，Wang，SJ，Nakatsu，MN，Mestas，J，Heard，C，and Hughes，CC；Identification of endothelial cell genesexpressed in an in vitro model of angiogenesis：induction of ESM-1，(beta)ig-h3，and NrCAM，Microvasc.Res.，2002，63，159-171)。
粘蛋白-1(MUC1)
粘蛋白是高分子量上皮糖蛋白，与富含苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸的串联重复肽O-型糖苷连接的簇生寡糖含量高。根据结构和功能，有类粘蛋白：跨膜粘蛋白(MUC1属于该类蛋白)和分泌型凝胶形成粘蛋白。结肠癌粘蛋白在作为诊断及预后标志物以及癌症疫苗的靶标时，其碳水化合物结构有所不同。
MUC1蛋白的细胞外区由20种氨基酸高度保守的重复序列组成，实际重复次数为25至100不等，取决于等位基因。每个串联重复序列包含5个潜在的糖基化位点，在苏氨酸和丝氨酸二联体之间有一个免疫优势区，包含各种抗MUC1抗体识别的表位(Taylor-Papadimitriou，J，Burchell，J，Miles，DW，and Dalziel，M；MUC1and cancer，Biochim.Biophys.Acta，1999，1455，301-313)。
与大多数其他上皮细胞相比，结肠的MUC1糖基化程度更高，从而掩盖了MUC1特异性抗体对MUC1蛋白的免疫组化染色。在结直肠癌中，MUC1糖基化程度较低，可进行免疫检测。异常糖基化MUC1具有新的结合特性，能同时介导和阻止与具有某些分子特异性的粘附分子结合，从而在肿瘤细胞的转移扩散中扮演着双重角色(McDermott，KM，Crocker，PR，Harris，A，Burdick，MD，Hinoda，Y，Hayashi，T，Imai，K，and Hollingsworth，MA；Overexpression of MUC1reconfigures the binding properties of tumor cells，Int.J Cancer，2001，94，783-791)。
免疫学检测显示，MUC1在结肠癌中表达增加，与较差的预后相关(Byrd，JC and Bresalier，RS；Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer，Cancer Metastasis Rev.，2004，23，77-99)，这表明结直肠癌的进展可能与MUC1的上调有关。转移结肠癌比无转移者MUC1的表达更高(Nakamori，S，Ota，DM，Cleary，KR，Shirotani，K，and Irimura，T；MUC 1mucinexpression as a marker of progression and metastasis of human colorectal carcinoma，Gastroenterology，1994，106，353-361)，并且一项研究显示，MUC1染色在所有累及肝脏的结直肠癌中均呈阳性(Matsuda，K，Masaki，T，Watanabe，T，Kitayama，J，Nagawa，H，Muto，T，andAjioka，Y；Clinical significance of MUC1 and MUC2mucin and p53 protein expression in colorectalcarcinoma，Jpn.J Clin Oncol.，2000，30，89-94)。最近针对462名结直肠患者的一项研究发现，MUC 1表达是预后差的一个独立指标(Duncan，TJ，Watson，NF，Al-Attar，AH，Scholefield，JH，and Durrant，LG；The role of MUC1 and MUC3 in the biology and prognosis of colorectal cancer，World J Surg.Oncol，2007，5，31)。
结直肠癌中的循环型抗MUC1抗体具有病理生理学意义：31名健康受试者中有5名检测出有抗MUC1抗体(16.1％)和56名结直肠患者中有27名检测出有抗MUC1抗体(48.2％)(Nakamura，H，Hinoda，Y，Nakagawa，N，Makiguchi，Y，Itoh，F，Endo，T，and Imai，K；Detection ofcirculating anti-MUC1 mucin core protein antibodies in patients with colorectal cancer，JGastroenterol.，1998，33，354-361)。
除了作为抗体靶标，MUC1还是细胞毒性T细胞的大家接受的靶标。数份报告表明，卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌以及多发性骨髓瘤的细胞毒性MHC非限制性T细胞可识别串联重复序列中的MUC1蛋白核的表位(Apostolopoulos，V and McKenzie，IF；Cellular mucins：targets forimmunotherapy，Crit Rev.Immunol.，1994，14，293-309；Finn，OJ，Jerome，KR，Henderson，RA，Pecher，G，Domenech，N，Magarian-Blander，J，and Barratt-Boyes，SM；MUC-1 epithelial tumormucin-based immunity and cancer vaccines，Immunol.Rev.，1995，145，61-89；Barnd，DL，Lan，MS，Metzgar，RS，and Finn，OJ；Specific，major histocompatibility complex-unrestricted recognition oftumor-associated mucins by human cytotoxic T cells，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1989，86，7159-7163；Takahashi，T，Makiguchi，Y，Hinoda，Y，Kakiuchi，H，Nakagawa，N，Imai，K，and Yachi，A；Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC 1from a multiple myeloma patient，J.Immunol.，1994，153，2102-2109；Noto，H，Takahashi，T，Makiguchi，Y，Hayashi，T，Hinoda，Y，and Imai，K；Cytotoxic T lymphocytes derived from bonemarrow mononuclear cells of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form ofMUC1 mucin，Int.Immunol.，1997，9，791-798)。但是来自MUC1蛋白的HLA-A*02限制性T细胞表位也得到确认(Apostolopoulos，V，Karanikas，V，Haurum，JS，and McKenzie，IF；Induction ofHLA-A2-restricted CTLs to the mucin 1 human breast cancer antigen，J Immunol.，1997，159，5211-5218；Brossart，P，Heinrich，KS，Stuhler，G，Behnke，L，Reichardt，VL，Stevanovic，S，Muhm，A，Rammensee，HG，Kanz，L，and Brugger，W；Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopesderived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies，Blood，1999，93，4309-4317)。这些肽中其中一个为MUC-001。它来自MUC1蛋白的串联重复区。接种疫苗后，使用这些MUC1肽在晚期乳腺癌或卵巢癌患者的肽冲击树突细胞中成功地诱导了细胞毒性T淋巴细胞的体内反应(Brossart，P，Wirths，S，Stuhler，G，Reichardt，VL，Kanz，L，and Brugger，W；Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulseddendritic cells，Blood，2000，96，3102-3108；Wierecky，J，Mueller，M，and Brossart，P；Dendriticcell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1，Cancer Immunol.Immunother.，2005Apr.28：288-94)。此外，这些疫苗已成功地诱导了肾细胞癌患者的临床反应(Wierecky，J，Muller，MR，Wirths，S，Halder-Oehler，E，Dorfel，D，Schmidt，SM，Hantschel，M，Brugger，W，Schroder，S，Horger，MS，Kanz，L，and Brossart，P；Immunologic and clinical responses after vaccinations withpeptide-pulsed dendritic cells in metastatic renal cancer patients，Cancer Res.，2006，66，5910-5918)。
结直肠癌中免疫反应性MUC1的上调大多并不是因为mRNA的过量表达，而是糖基化降低、暴露了表位从而抗体可识别造成的，特别是在MUC1串联重复区。同时，这种去糖基化通过改变肿瘤细胞的抗原加工过程(这在正常细胞因糖基化而受阻)为T细胞表位生成提供了机会。这一机制可解释为什么MUC-001尽管没有很强的mRNA过量表达却具有肿瘤相关T细胞表位的鲜明特征。糖基化的变化确实可能影响到抗原加工的一些证据来自最近的一项观察，结直肠癌MUC1糖基化改变可通过专门识别肿瘤糖型的受体而被抗原提呈细胞检测到(Saeland，E，van Vliet，SJ，Backstrom，M，van，dB，V，Geijtenbeek，TB，Meijer，GA，and van，KY；2006，The C-type lectin MGL expressed by dendritic cells detects glycan changes on MUC1 in coloncarcinoma，Cancer Immunol.Immunother.，2007，56(8)：1225-36)。抗原提呈细胞对肿瘤糖型的特异性吸收和加工也可解释MUC-001特异性T细胞在未接种疫苗的乳腺癌患者(Rentzsch，C，Kayser，S，Stumm，S，Watermann，I，Walter，S，Stevanovic，S，Wallwiener，D，and Guckel，B；Evaluation of pre-existent immunity in patients with primary breast cancer：molecular and cellularassays to quantify antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells，Clin CancerRes.，2003，9，4376-4386)和结直肠癌患者(Dittmann，J，Keller-Matschke，K，Weinschenk，T，Kratt，T，Heck，T，Becker，HD，Stevanovic，S，Rammensee，HG，and Gouttefangeas，C；CD8+T-cellresponse against MUC1-derived peptides in gastrointestinal cancer survivors，CancerImmunol.Immunother.，2005，54，750-758)自然观察到这一事实。在这些患者中，未报告有自体免疫作用。这说明，MUC-001具有诱导特异性T细胞的肿瘤相关肽的自然属性；并且表明，虽然MUC1在mRNA水平上并未检测到过量表达，但是给予MUC-001可考虑为安全的。
Met原癌基因(肝细胞生长因子受体)(c-Met)
MET原癌基因的蛋白产物是肝细胞生长因子受体。它包含一个激活参与细胞增殖、运动、粘附和浸润的信号途径的酪氨酸激酶域(Trusolino，L and Comoglio，PM；Scatter-factor andsemaphorin receptors：cell signalling for invasive growth，Nat.Rev.Cancer，2002，2，289-300)。
不同类型肿瘤的研究已证明了激活c-Met的若干机制，包括HGF/c-Met的自分泌循环、激活位点突变、TPR-Met融合蛋白以及将c-Met分裂为α和β链失败(Di Renzo，MF，Olivero，M，Martone，T，Maffe，A，Maggiora，P，Stefani，AD，Valente，G，Giordano，S，Cortesina，G，andComoglio，PM；Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread ofhuman HNSC carcinomas，Oncogene，2000，19，1547-1555；Ebert，M，Yokoyama，M，Friess，H，Buchler，MW，and Korc，M；Coexpression of the c-met proto-oncogene and hepatocyte growth factorin human pancreatic cancer，Cancer Res.，1994，54，5775-5778；Mondino，A，Giordano，S，andComoglio，PM；Defective posttranslational processing activates the tyrosine kinase encoded by theMET proto-oncogene(hepatocyte growth factor receptor)，Mol.Cell Biol.，1991，11，6084-6092；Olivero，M，Valente，G，Bardelli，A，Longati，P，Ferrero，N，Cracco，C，Terrone，C，Rocca-Rossetti，S，Comoglio，PM，and Di Renzo，MF；Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogenetyrosine kinase in a HPRCC family，Int.J Cancer，1999，82，640-643；Park，M，Dean，M，Cooper，CS，Schmidt，M，O′Brien，SJ，Blair，DG，and Vande Woude，GF；Mechanism of met oncogene activation，Cell，1986，45，895-904；Park，WS，Dong，SM，Kim，SY，Na，EY，Shin，MS，Pi，JH，Kim，BJ，Bae，JH，Hong，YK，Lee，KS，Lee，SH，Yoo，NJ，Jang，JJ，Pack，S，Zhuang，Z，Schmidt，L，Zbar，B，and Lee，JY；1999，Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene inchildhood hepatocellular carcinomas，Cancer Res.，59，307-310；Rahimi，N，Tremblay，E，McAdam，L，Park，M，Schwall，R，and Elliott，B；1996，Identification of a hepatocyte growth factor autocrineloop in a murine mammary carcinoma，Cell Growth Differ.，7，263-270；Schmidt，L，Duh，FM，Chen，F，Kishida，T，Glenn，G，Choyke，P，Scherer，SW，Zhuang，Z，Lubensky，I，Dean，M，Allikmets，R，Chidambaram，A，Bergerheim，UR，Feltis，JT，Casadevall，C，Zamarron，A，Bernues，M，Richard，S，Lips，CJ，Walther，MM，Tsui，LC，Geil，L，Orcutt，ML，Stackhouse，T，Lipan，J，Slife，L，Brauch，H，Decker，J，Niehans，G，Hughson，MD，Moch，H，Storkel，S，Lerman，MI，Linehan，WM，and Zbar，B；1997，Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene inpapillary renal carcinomas，Nat.Genet.，16，68-73；Schmidt，L，Junker，K，Weirich，G，Glenn，G，Choyke，P，Lubensky，I，Zhuang，Z，Jeffers，M，Vande，WG，Neumann，H，Walther，M，Linehan，WM，and Zbar，B；1998，Two North American families with hereditary papillary renal carcinoma andidentical novel mutations in the MET proto-oncogene，Cancer Res.，58，1719-1722)。从作用机理上来说，c-Met过量表达与致癌基因Ki-ras突变共同提高体内结肠癌细胞的致瘤性(Long，IS，Han，K，Li，M，Shirasawa，S，Sasazuki，T，Johnston，M，and Tsao，MS；Met receptor overexpression andoncogenic Ki-ras mutation cooperate to enhance tumorigenicity of colon cancer cells in vivo，Mol.Cancer Res.，2003，1，393-401)。
有趣的是，有些证据表明，MET信号与Wnt/β-catenin途径的相互作用经常在结肠癌中加强。前列腺素E2(PGE2)可激活MET，并且前列腺素E2激活的c-Met与β-catenin相关而且增加其酪氨酸磷酸化，从而诱导结肠癌细胞的浸润性(Pai，R，Nakamura，T，Moon，WS，andTarnawski，AS；Prostaglandins promote colon cancer cell invasion；signaling by cross-talk betweentwo distinct growth factor receptors，FASEB J，2003，17，1640-1647)。最近，有研究说明了MET和β-catenin可相互激活，导致结直肠肿瘤癌变中这两个主要因素间的正反馈环路(Rasola，A，Fassetta，M，De，BF，D′Alessandro，L，Gramaglia，D，Di Renzo，MF，and Comoglio，PM；A positivefeedback loop between hepatocyte growth factor receptor and beta-catenin sustains colorectal cancercell invasive growth，Oncogene，2007，26，1078-1087)。
原发性结直肠癌(n＝36)中的c-MetmRNA表达水平是早期浸润和疾病局部转移的预测性标记物，这与结肠癌的期别直接相关(Takeuchi，H，Bilchik，A，Saha，S，Turner，R，Wiese，D，Tanaka，M，Kuo，C，Wang，HJ，and Hoon，DS；c-MET expression level in primary colon cancer：apredictor of tumor invasion and lymph node metastases，Clin Cancer Res.，2003，9，1480-1488)。另一项对130个结直肠癌样本中c-Met表达的分析显示，c-Met在69％的原发性结直肠癌中过度表达(T/N＞2.0)并且在有血管浸润(P＝0.04)以及晚期(P＝0.04)的结直肠癌中c-Met水平显著增高，这支持了c-Met在人结直肠癌进展和转移中的作用(Zeng，Z，Weiser，MR，D′Alessio，M，Grace，A，Shia，J，and Paty，PB；Immunoblot analysis ofc-Met expression in human colorectal cancer：overexpression is associated with advanced stage cancer，Clin Exp.Metastasis，2004，21，409-417)。另一项研究显示，60名结肠腺癌患者中，有69％和60％的患者癌中c-Met表达比邻近正常粘膜分别高2倍和10倍(Kammula，US，Kuntz，EJ，Francone，TD，Zeng，Z，Shia，J，Landmann，RG，Paty，PB，and Weiser，MR；Molecular co-expression of the c-Met oncogene and hepatocyte growthfactor in primary colon cancer predicts tumor stage and clinical outcome，Cancer Lett.，2007，248，219-228)。因此，c-Met信号传导增强在早期结直肠癌中经常发生，但在晚期和转移性癌肿中表达大大提高。
细胞周期蛋白D1(CCND1)
CCND1属高度保守的细胞周期蛋白家族，其成员的特点是在整个细胞周期中都富含蛋白。细胞周期蛋白的功能是调节CDK激酶。不同的细胞周期蛋白表现出不同的表达和降解模式，以进行每个有丝分裂活动的时序协调。该细胞周期蛋白可形成一种复合物，作为CDK4或CDK6的一种调节亚基，其活性是细胞周期G1/S期转换所需的。这种改变细胞周期进程的基因之突变、扩增和过量表达经常可在各种肿瘤中观察到，并可能有助于肿瘤癌变(Fu，M，Wang，C，LI，Z，Sakamaki，T，and Pestell，RG；Minireview：Cyclin D1：normal and abnormal functions，Endocrinology，2004，145，5439-5447)。
常见的A/G单核苷酸多态性(A870G)导致a、b两种不同的mRNA异构体。交替拼接异构体b可编码一种截短蛋白，该截短蛋白与较高的肿瘤发病率有关(包括肺癌、结肠癌和其它癌种)(Fu，M，Wang，C，LI，Z，Sakamaki，T，and Pestell，RG；Minireview：Cyclin D1：normal andabnormal functions，Endocrinology，2004，145，5439-5447)。
对于结直肠癌，也经常报道有CCNDl在mRNA和蛋白水平上过量表达(Sutter，T，Doi，S，Carnevale，KA，Arber，N，and Weinstein，IB；Expression of cyclins D1 and E in human colonadenocarcinomas，J Med，1997，28，285-309；Mermelshtein，A，Gerson，A，Walfisch，S，Delgado，B，Shechter-Maor，G，Delgado，J，Fich，A，and Gheber，L；Expression of D-type cyclins in colon cancerand in cell lines from colon carcinomas，Br.J Cancer，2005，93，338-345；Balcerczak，E，Pasz-Walczak，G，Kumor，P，Panczyk，M，Kordek，R，Wierzbicki，R，and Mirowski，M；Cyclin D1protein and CCND1 gene expression in colorectal cancer，Eur.J Surg.Oncol.，2005，31，721-726；Bondi，J，Husdal，A，Bukholm，G，Nesland，JM，Bakka，A，and Bukholm，IR；Expression and geneamplification of primary(A，B1，D1，D3，and E)and secondary(C and H)cyclins in colonadenocarcinomas and correlation with patient outcome，J Clin Pathol.，2005，58，509-514；Perez，R，Wu，N，Klipfel，AA，and Beart，RW，Jr.；A better cell cycle target for gene therapy of colorectalcancer；cyclin G，J Gastrointest.Surg.，2003，7，884-889；Wong，NA，Morris，RG，McCondochie，A，Bader，S，Jodrell，DI，and Harrison，DJ；Cyclin D1 overexpression in colorectal carcinoma in vivo isdependent on beta-catenin protein dysregulation，but not k-ras mutation，J Pathol.，2002，197，128-135；McKay，JA，Douglas，JJ，Ross，VG，Curran，S，Murray，GI，Cassidy，J，and McLeod，HL；Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer.Aberdeen ColorectalInitiative，Int.J Cancer，2000，88，77-81；Bartkova，J，Lukas，J，Strauss，M，and Bartek，J；ThePRAD-1/cyclin D1 oncogene product accumulates aberrantly in a subset of colorectal carcinomas，Int.J Cancer，1994，58，568-573)。
CCND1是结直肠癌经常上调的β-Catenin-TCF/LEF 途径这一既定事实也可解释上述现象(Shtutman，M，Zhurinsky，J，Simcha，I，Albanese，C，D′Amico，M，Pestell，R，and Ben-Ze′ev，A；Thecyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1999，96，5522-5527；Tetsu，O and McCormick，F；Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in coloncarcinoma cells，Nature，1999，398，422-426)。
CCND1增强表达预示着肿瘤分级高、有转移以及生存期下降(Balcerczak，E，Pasz-Walczak，G，Kumor，P，Panczyk，M，Kordek，R，Wierzbicki，R，and Mirowski，M；Cyclin D1 protein andCCND1 gene expression in colorectal cancer，Eur.J Surg.Oncol.，2005，31，721-726；Bahnassy，AA，Zekri，AR，El-Houssini，S，El-Shehaby，AM，Mahmoud，MR，Abdallah，S，and El-Serafi，M；CyclinA and cyclin D1 as significant prognostic markers in colorectal cancer patients，BMC.Gastroenterol.，2004，4，22；McKay，JA，Douglas，JJ，Ross，VG，Curran，S，Murray，GI，Cassidy，J，and McLeod，HL；Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer.Aberdeen ColorectalInitiative，Int.J Cancer，2000，88，77-81；Maeda，K，Chung，Y，Kang，S，Ogawa，M，Onoda，N，Nishiguchi，Y，Ikehara，T，Nakata，B，Okuno，M，and Sowa，M；Cyclin D1 overexpression andprognosis in colorectal adenocarcinoma，Oncology，1998，55，145-151)。
基质金属蛋白酶7(基质溶解素，子宫)(MMP7)
基质金属蛋白酶(MMP)系属结构相关的锌依赖蛋白酶的大家族，通常描述为可降解细胞外基质降解成分。各种已确认的MMP显示在肿瘤中表达增加，大多数肿瘤显示MMP活性增强(Curran，S and Murray，GI；1999，Matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis，J Pathol.，189，300-308；Curran，S and Murray，GI；2000，Matrix metalloproteinases：molecularaspects of their roles in tumour invasion and metastasis，Eur.J Cancer，36，1621-1630)。
基底膜和细胞外基质是恶性肿瘤浸润的两个物理障碍，而MMP对其降解作用在肿瘤进展和转移性扩散中起着关键作用(Johnsen，M，Lund，LR，Romer，J，Almholt，K，and Dano，K；1998，Cancer invasion and tissue remodeling：common themes in proteolytic matrix degradation，Curr.Opin.Cell Biol.，10，667-671；Nelson，AR，Fingleton，B，Rothenberg，ML，and Matrisian，LM；2000，Matrix metalloproteinases：biologic activity and clinical implications，J Clin Oncol.，18，1135-1149；Wang，FQ，So，J，Reierstad，S，and Fishman，DA；2005，Matrilysin(MMP-7)promotesinvasion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase，Int.J Cancer，114，19-31)。除了上述功能，MMP还参与肿瘤的发生和发展(包括在细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化的作用)目前正在讨论中。这些功能都与MMP介导的非基质蛋白水解及与其酶活性不同的作用相关(Egeblad，M and Werb，Z；2002，New functions for the matrix metalloproteinases in cancerprogression，Nat.Rev.Cancer，2，161-174；Leeman，MF，Curran，S，and Murray，GI；2003，Newinsights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal cancer development and progression，J.Pathol.，201，528-534)。
最近的研究表明，一些基质金属蛋白酶，特别是基质溶解素(MMP7)，与参与结直肠癌发展的特异性分子遗传和信号通路相互作用。特别是，基质溶解素在结直肠早期癌变时被β-catenin信号通路激活(Brabletz，T，Jung，A，Dag，S，Hlubek，F，and Kirchner，T；1999，beta-catenin regulates the expression of the matrix metalloproteinase-7in human colorectal cancer，Am.J Pathol.，155，1033-1038；Leeman，MF，Curran，S，and Murray，GI；2003，New insights into theroles of matrix metalloproteinases in colorectal cancer development and progression，J.Pathol.，201，528-534；Zucker，S and Vacirca，J；2004，Role of matrix metalloproteinases(MMPs)in colorectalcancer，Cancer Metastasis Rev.，23，101-117)。
MMP7在良性和恶性结直肠肿瘤中都过量表达(Ishikawa，T，Ichikawa，Y，Mitsuhashi，M，Momiyama，N，Chishima，T，Tanaka，K，Yamaoka，H，Miyazakic，K，Nagashima，Y，Akitaya，T，andShimada，H；1996，Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor，Cancer Lett.，107，5-10；McDonnell，S，Navre，M，Coffey，RJ，Jr.，and Matrisian，LM；1991，Expression and localizationof the matrix metalloproteinase pump-1(MMP-7)in human gastric and colon carcinomas，Mol.Carcinog.，4，527-533；Miyazaki，K，Hattori，Y，Umenishi，F，Yasumitsu，H，and Umeda，M；1990，Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase，matrin(pump-1)，secreted from human rectal carcinoma cell line，Cancer Res.，50，7758-7764；Nagashima，Y，Hasegawa，S，Koshikawa，N，Taki，A，Ichikawa，Y，Kitamura，H，Misugi，K，Kihira，Y，Matuo，Y，Yasumitsu，H，and Miyazaki，K；1997，Expression of matrilysin in vascular endothelial cells adjacentto matrilysin-producing tumors，Int.J Cancer，72，441-445；Newell，KJ，Witty，JP，Rodgers，WH，andMatrisian，LM；1994，Expression and localization of matrix-degrading metalloproteinases duringcolorectal tumorigenesis，Mol.Carcinog.，10，199-206；Yoshimoto，M，Itoh，F，Yamamoto，H，Hinoda，Y，Imai，K，and Yachi，A；1993，Expression of MMP-7(PUMP-1)mRNA in human colorectalcancers，Int.J Cancer，54，614-618)。MMP7是肿瘤细胞真正分泌的少数几种MMP之一(Overall，CM and Kleifeld，O；2006，Tumour microenvironment-opinion：validating matrix metalloproteinasesas drug targets and anti-targets for cancer therapy，Nat.Rev.Cancer，6，227-239)。此外，MMP7mRNA表达水平与预示着结直肠癌发展期别(Ishikawa，T，Ichikawa，Y，Mitsuhashi，M，Momiyama，N，Chishima，T，Tanaka，K，Yamaoka，H，Miyazakic，K，Nagashima，Y，Akitaya，T，andShimada，H；1996，Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor，Cancer Lett.，107，5-10；Mori，M，Barnard，GF，Mimori，K，Ueo，H，Akiyoshi，T，and Sugimachi，K；1995，Overexpression of matrix metalloproteinase-7mRNA in human colon carcinomas，Cancer，75，1516-1519)。在结直肠癌的转移中，MMP7起着关键作用(Adachi，Y，Yamamoto，H，Itoh，F，Hinoda，Y，Okada，Y，and Imai，K；1999，Contribution of matrilysin(MMP-7)to the metastaticpathway of human colorectal cancers，Gut，45，252-258；Mori，M，Barnard，GF，Mimori，K，Ueo，H，Akiyoshi，T，and Sugimachi，K；1995，Overexpression of matrix metalloproteinase-7mRNA inhuman colon carcinomas，Cancer，75，1516-1519)。
血清MMP7水平升高预示着晚期结直肠癌患者的预后差(Maurel，J，Nadal，C，Garcia-Albeniz，X，Gallego，R，Carcereny，E，Almendro，V，Marmol，M，Gallardo，E，Maria，AJ，Longaron，R，Martinez-Fernandez，A，Molina，R，Castells，A，and Gascon，P；2007，Serum matrixmetalloproteinase 7 levels identifies poor prognosis advanced colorectal cancer patients，Int.J Cancer，Published Online：8May 2007)，在结直肠患者中过量表达又能导致生存期下降，这表明通过肿瘤细胞上的Fas裂解可促进其从免疫监视中逃逸(Wang，WS，Chen，PM，Wang，HS，Liang，WY，and Su，Y；2006，Matrix metalloproteinase-7increases resistance to Fas-mediated apoptosis and is apoor prognostic factor of patients with colorectal carcinoma，Carcinogenesis，27，1113-1120)。
本发明中的蛋白可作为多种癌症的肿瘤特异性免疫反应的标靶。
乙型肝炎病毒核心抗原肽HBV-001并非来自内源性人肿瘤相关抗原，而是来自于乙肝病毒核心抗原。首先，有了它，就可对TUMAP诱导的细胞反应量进行量化比较，从而可得出抗肿瘤反应能力的重要结论。其次，它可在患者缺乏任何T细胞反应时，作为重要的阳性对照。第三，有了它还可以对患者的免疫功能状态得出结论。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起肝病的主要原因之一，全球约有3.5亿人受其影响(Rehermann，B and Nascimbeni，M；Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection，Nat.Rev.Immunol.，2005，5，215-229)。由于该病毒较容易进行水平和垂直传播并可能发展为慢性疾病，这些慢性疾病可能导致肝硬化和肝癌，因此，乙肝病毒对全球很多国家的公共卫生系统产生重大影响。乙型肝炎病毒基因组(Previsani，N and Lavanchy，D；2002，Hepatitis B，(Epidemic and Pandemic Alert and Response，World Health Organization，Geneva，2002)由部分双链环状DNA组成。在乙肝病毒体中，含有核心蛋白HBc和其他蛋白质一起形成核衣壳，包裹于含脂质的外部包膜以及表面蛋白家族HBs(也称为包膜蛋白)中。与HBc和HBs相关的抗原决定簇分别为HbcAg和HBsAg。这些抗原与血清学反应，如患者血液中发现的抗体反应有关，并且是临床上最有用的乙型肝炎病毒感染诊断抗原-抗体系统之一。HBc代表所有先前无HBV感染者的一种新型外来抗原。由于这种抗原熟知免疫原性肽(Bertoletti，A，Chisari，FV，Penna，A，Guilhot，S，Galati，L，Missale，G，Fowler，P，Schlicht，HJ，Vitiello，A，Chesnut，RC，and.；1993，Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis B virusnucleocapsid protein，J.Virol.，67，2376-2380；Livingston，BD，Crimi，C，Grey，H，Ishioka，G，Chisari，FV，Fikes，J，Grey，H，Chesnut，RW，and Sette，A；1997，The hepatitis B virus-specific CTLresponses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acuteviral infection，J.Immunol.，159，1383-1392)，因此，HbcAg中一种由10个氨基酸组成的肽被选定为IMA内的一种阳性对照抗原。那么，对HBc肽特异性CTL的诱导将被看作患者免疫功能和成功疫苗接种的一个指标。
该药物组合物还可包含更有效的其他肽和/或赋形剂，将进一步解释如下。
发明人用给定氨基酸序列的“变种氨基酸序列”表示，一个或多个氨基酸残基等的侧链通过取代另一个自然产生的氨基酸残基的侧链或其他侧链而改变，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如果不提升的话)其与HLA-A或HLA-DR等合适的MHC分子互动和结合，以及至少维持(如果不提升的话)其产生能识别和杀伤细胞(这些细胞表达含本发明中所定义的一种氨基酸序列的多肽)的激活CTL的能力。正如数据库中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合基序相称的核心序列。
这些不与T细胞受体互动的氨基酸残基可通过取代另一个几乎不影响T细胞反应并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本发明中的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或段或变体的肽(发明人所用的这个术语包括寡肽或多肽)。
MHC-II类提呈肽更为大家熟知，这些肽由具有某种HLA特异性氨基酸基序并且N和/或C-端随意延伸(不干扰肽核心序列功能，如，被视为与肽和T细胞相互作用无关)的“核心序列”组成。N-和/或C端可分别延伸1至10个氨基酸的长度。这些肽可直接用于加载MHC-II类分子或其序列可克隆入下文所述载体。由于这些肽可在细胞内形成较大肽加工过程的最终产物，因此，也可用长肽。本发明中肽的大小不限，但通常它们的分子量可能小于100000，优选为小于50000，更优选为小于10000，通常约为5000。对于氨基酸残基数目，本发明中的肽可能少于1000个残基，优选为少于100个残基，更优选为少于500个残基。因此，本发明还提出了总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至16个(即8、9、10、11、12、13、14、15或16个)氨基酸的肽或变体的复合物。
相应地，诱导T细胞与本发明中的肽发生交叉反应的变体往往为长度可变的变体。
如果长度约为12个氨基酸残基的肽直接与MHC-II类分子结合，那么，两侧有核心HLA结合区、且不会对该肽与MHC-II类分子的结合槽特异性结合能力或该肽提呈至CTL的能力产生重大影响的残基则为优选。但是，正如上所述，应了解，可使用较大的肽(特别是核苷酸进行编码时)，因为这些较大的肽可被适当的抗原提呈细胞分成片段。
MHC-I类表位(通常长度为8至10个氨基酸)也可能由肽从较长的肽或包含实际表位的蛋白中加工而产生。与MHC-II表位相似，两侧有结合区、不会对该肽与MHC-I类分子的结合槽特异性结合能力或该肽提呈至CTL的能力产生重大影响、也不会掩盖加工过程中暴露实际表位所需蛋白裂解位点的残基为MHC-I类表位的优选。
因此，本发明还提出了总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至16个(即8、9、10、11、12、13、14、15或16个)氨基酸的MHC-I类表位的肽或变体。
当然，本发明中的肽或变体能与人主要组织相容性复合体(MHC)I或II类分子结合。肽或变体与MHC复合物结合性可用本领域内的已知方法进行测试，例如，本发明下列实施例中所述的方法或文献中所述的检测不同MHC-II类等位基因的方法(例如，Vogt AB，KropshoferH，Kalbacher H，Kalbus M，Rammensee HG，Coligan JE，Martin R；Ligand motifs ofHLA-DRB5*0101and DRBl*1501molecules delineated from self-peptides；J Immunol.1994；153(4)：1665-1673；Malcherek G，Gnau V，Stevanovic S，Rammensee HG，Jung G，Melms A；Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands；J Immunol.1994；153(3)：1141-1149；Manici S，Sturniolo T，Imro MA，Hammer J，Sinigaglia F，Noppen C，Spagnoli G，Mazzi B，Bellone M，Dellabona P，Protti MP；Melanoma cells present a MAGE-3epitope to CD4(+)cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11；J Exp Med.1999；189(5)：871-876；Hammer J，Gallazzi F，Bono E，Karr RW，Guenot J，Valsasnini P，Nagy ZA，Sinigaglia F；Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules：correlation with rheumatoidarthritis association；.J Exp Med.1995181(5)：1847-1855；Tompkins SM，Rota PA，Moore JC，JensenPE；A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins；J Immunol Methods.1993；163(2)：209-216；Boyton RJ，Lohmann T，Londei M，Kalbacher H，HalderT，Frater AJ，Douek DC，Leslie DG，Flavell RA，Altmann DM；Glutamic acid decarboxylase Tlymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes：analysis indisease discordant human twins，non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice；IntImmunol.1998(12)：1765-1776)。
氨基酸其他N和/或C端延伸处不一定能形成作为MHC分子表位的肽，但对有效将本发明中的肽引进细胞具有重要作用。在本发明的一实施案中，本发明的肽为融合蛋白，含来自NCBI、GenBank登录号X00497的HLA-DR抗原相关不变链(p33，以下称为“Ii”链)的80个N-端氨基酸等(Strubin，M.，Mach，B.and Long，E.O.The complete sequence of the mRNA forthe HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembranepolarity EMBO J.3(4)，869-872(1984)。
优选的药物组合物，其中这些肽的总长度可为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸，最优选为8至16个氨基酸。
此外，该肽或变体可进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子结合，从而引发更强的免疫反应。肽序列的该类优化方法是本领域内所熟知的，包括，例如，反式肽键和非肽键的引入。
因此，另一方面，本发明提出了一种药物组合物，其中，至少有一个含非肽键的肽或变体。
在反式肽键氨基酸中，肽(-CO-NH-)并未连接其残基，但是其肽键是反向的。这种逆向反向模拟肽(retro-inverso peptidomimetics)可通过本领域已知的方法制备，例如：Meziere等在《免疫学杂志》((1997)J.Immunol.159，3230-3237)中所述的方法，以引用的方式并入本文。这种方法涉及制备包含骨架(而并非侧链)改变的模拟肽。Meziere等人(1997年)的研究显示，这些模拟肽有利于MHC和辅助性T细胞的反应。以NH-CO键替代CO-NH肽键的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。
非肽键为-CH₂-NH、-CH₂S-、-CH₂CH₂-、-CH＝CH-、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-等。美国4897445号专利提出了多肽链中非肽键(-CH₂-NH)的非固相合成法，该方法涉及按标准程序合成的多肽以及通过氨基醛和一种含NaCNBH₃的氨基酸相互作用而合成的非肽键。
含本发明上述序列的肽可与其氨基和/或羧基末端的其他化学基团进行合成，从而提高肽的稳定性、生物利用度、和/或亲和力等。例如，苄氧羰基、丹酰基等疏水基团或叔丁氧羰基团可加入肽的氨基末端。同样，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，如疏水基团、叔丁氧羰基团或氨基团都可能被加入肽的羧基末端。
另外，本发明中的所有肽都可能经合成而改变其空间构型。例如，可能使用这些肽的一个或多个氨基酸残基的右旋体，通常不是其左旋体。更进一步地，本发明中肽的至少一个氨基酸残基可被熟知的一个非天然氨基酸残基取代。诸如此类的改变可能有助于增加本发明肽的稳定性、生物利用度和/或结合作用。
同样，本发明中的肽或变体可在合成肽之前或之后通过特异氨基酸的反应而进行化学修饰。此类修饰的实施例为本领域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的Chemical Reagents forProtein Modification(3rd ed.CRC Press，2005)中有概述，以参考文献的方式并入本文。氨基酸的化学修饰方法包括(但不限于)通过以下方法修饰：酰基化、脒基化、赖氨酸吡哆基化、还原烷基化、以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基团、通过将半胱氨酸过甲酸氧化为磺基丙氨酸而对羧基团和巯基进行氨基修饰、形成易变衍生物、与其他巯基化合物形成混合二硫化合物、与马来酰亚胺反应，与碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在碱性pH值下与氰酸盐甲氨酰化，上述方法无限制。在这方面，技术人员参考了Current Protocols In Protein Science(Eds.Coligan et al.(John Wiley&Sons NY 1995-2000))中第15章所述的在蛋白质化学修饰相关的广泛方法。
简言之，修饰蛋白质的精氨酰残基等往往依赖于邻二羰基化合物(如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮以及1，2-烯巳二酮)的反应而形成加合物。另一个实施例是丙酮醛与精氨酸残基反应。半胱氨酸可在赖氨酸和组氨酸等亲核位点不作随同修饰的情况下就得到修饰。因此，有大量试剂可进行半胱氨酸的修饰。Pierce化学公司、Sigma-Aldrich公司以及其他公司的网站有具体试剂的信息。
蛋白质中二硫键的选择性还原也很普遍。二硫键可在生物制药热处理中形成和氧化。
伍德沃德氏试剂K可用于修饰特定的谷氨酸残基。N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺可用于形成赖氨酸残基和谷氨酸残基的分子内交联。
例如：焦碳酸二乙酯是修饰蛋白质组氨酸残基的试剂。组氨酸也可使用4-羟基-2-壬烯醛进行修饰。
赖氨酸残基与其他α-氨基团的反应，例如，有利于肽结合到蛋白/肽的表面或交联处。赖氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附着点，也是蛋白质糖基化的主要修饰位点。
蛋白质的蛋氨酸残基可通过碘乙酰胺、溴乙胺、氯胺T等被修饰。
四硝基甲烷和N-乙酰基咪唑可用于酪氨酸残基的修饰。经二酪氨酸形成的交联可通过过氧化氢/铜离子完成。
对色氨酸修饰的最近研究中使用了N-溴代琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝基苄溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巯基)-3H-吲哚(BPNS-粪臭素)。
当蛋白与戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交联用于配制水凝胶时，治疗性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修饰往往可延长循环半衰期。针对免疫治疗的变态反应原化学修饰往往通过氰酸钾的氨基甲酰化实现。
一般来说，肽和变体(至少含氨基酸残基之间的肽联接)可使用Lu等人(1981)J.Org.Chem.46，3433)以及此处列出的参考文献所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式等方法进行合成。
纯化可通过以下技术的任何一种或组合方法实现，如：再结晶法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法以及(通常)反相高效液相色谱法(如使用乙腈/水梯度分离)。
肽分析可使用以下方法进行：薄层色谱法、电泳法、特别是，毛细管电泳法、固相萃取法(CSPE)、反相高效液相色谱法、酸水解后的氨基酸分析、快原子轰击(FAB)质谱分析法以及MALDI、ESI-Q-TOF质谱分析法。
另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能为DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA等或为单链和/或双链，或多聚核苷酸的原生或稳定形式，如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸，或其组合物，并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。不同类型细胞的表达载体为本领域所熟知并且无需过度不当实验就可选定。
一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准技术被引入宿主。
指导可参阅，如：Sambrook等(1989)所著Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY。
但是，在本发明的一个特别优选实施方案中，药物组合物至少包括两种含有从SEQ ID NO1至SEQ ID NO 15所选的氨基酸序列的肽。
疫苗所含每种肽的最佳量以及最佳给药方案可由一名对本领域技术人员确定，而无需进行过度不当实验。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹腔(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选途径为s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选途径为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予1至500mg、50μg至1.5mg，优选为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围在以前的试验中成功使用(Brunsvig PF，Aamdal S，Gjertsen MK，Kvalheim G，Markowski-Grimsrud CJ，Sve I，Dyrhaug M，Trachsel S，M，Eriksen JA，GaudernackG；.Telomerase peptide vaccination：a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer；Cancer Immunol Immunother.2006；55(12)：1553-1564；M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich，T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter，H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief；An open labelstudy to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901，ASCOmeeting 2007；Abstract No 3017)
本发明的药物组合物可能会进行汇编，其中，从而组合物中肽的选择和所含数量都能特异性地针对组织、癌症和/或患者。例如，特定组织中亲本蛋白的表达模式可引导肽的准确选择，从而避免副作用。这种选择可能会依赖于待治疗患者具体的癌症类型、以及疾病状态、早期治疗方案、患者免疫状态，当然，还有患者的HLA单倍型。此外，根据特定患者的个人需求，本发明的疫苗可包含个性化成分。根据特定患者的相关TAA的表达、由于个人过敏或其它治疗方法而产生的意外副作用、以及第一轮治疗后对二次治疗或治疗方案的调整，各实施例中的肽含量有所不同。
对于用作结直肠癌疫苗的一种组合物，例如，亲本蛋白在正常组织中高表达的肽在本发明的组合物中将会避免使用或含量较低。另一方面，如果已知某个患者的肿瘤高表达某种蛋白，则治疗这种癌症的各药物组合物可能含有大量和/或一个以上针对这种特定蛋白的肽，或者可能含有这种蛋白的通路。
技术人员可通过以下测试选择免疫原性肽的优选组合，如：测试体外T细胞的产生情况及其效果和总量、针对某些肽的某些T细胞的增殖、亲和力和扩增，以及通过分析IFN-γ的产生(参阅下文实施例)测试T细胞的功能性。通常为了上述之目的，最有效的肽然后组合为一种疫苗。
一种合适的疫苗将优选为包含1至20个肽，更优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个不同的肽，进一步优选为6、7、8、9、10、11、12、13或14个不同的肽，最优选为14个不同的肽。用于癌症疫苗的肽长度为任何合适的肽。特别是，它可能是一种合适的9-mer肽或一种合适的7-mer或8-mer或10-mer或11-mer肽或12-mer、13-mer、14-mer或15-mer肽.。较长的肽也可能适合，附表1和2中所述的9-mer或10-mer肽优选为MHC-I类肽，而12-至15-mer肽优选为MHC-II类肽。
肽组成了肿瘤或癌症疫苗。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。
该肽可能为纯肽，也可能是与免疫刺激佐剂的组合物(见下文)、或与免疫刺激细胞因子联合使用、或以适当的输送系统给药，例如脂质体。该肽也可共轭形成一种合适的载体如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露到合适的载体(参阅WO 95/18145及Longenecker等(1993)Ann.NY Acad.Sci.690，276-291)。该肽也可进行标记、或是一种融合蛋白或是杂合分子。本发明中给出肽序列的肽预期会刺激CD4或CD8CTL。但是，有反向CD阳性T细胞提供帮助时，刺激更为有效。因此，对于刺激CD4CTL的MHC-II类表位，一种杂合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD8阳性T细胞的适当表位。另一方面，对于刺激CD8CTL的MHC-I类表位，一种杂合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD4阳性T细胞的适当表位。CD4-和CD8刺激表位为本领域所熟知、并包括本发明中确定的表位。
为了引发免疫反应，通常疫苗有必要包括使该组合物具有更多免疫原性的辅料。因此，在本发明的一个优选实施方案中，本药物组合物进一步包括了至少一种合适的佐剂。
佐剂是那些非特异性地增强或加强免疫反应的物质(例如，通过CTL和辅助T(T_H)细胞介导的对一种抗原的免疫应答，因此被视为对本发明的药剂有用。
适合的佐剂包括(但不仅限于)1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870，893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、Imiquimod、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、MontanideISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、载体系统、PLG微粒、resiquimod、SRL172、病毒颗粒和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物的Aquila公司的QS21刺激子(Aquila生物技术公司，Worcester，MA，USA)，以及其他专有佐剂，如：Ribi′s Detox。Quil或Superfos。优选佐剂如：弗氏不完全佐剂或GM-CSF。前面一对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59)及其制备方法进行了描述(Dupuis M，Murphy TJ，Higgins D，Ugozzoli M，van Nest G，Ott G，McDonald DM；Dendritic cells internalizevaccine adjuvant after intramuscular injection；Cell Immunol.1998；186(1)：18-27；Allison AC；Themode of action of immunological adjuvants；Dev Biol Stand.1998；92：3-11)。也可使用细胞因子。一些细胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，特别以其参考文献的完整形式并入本文)，并充当免疫佐剂(如，IL-12)(GabrilovichDI，CunninghamHT，Carbone DP；IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specificimmunotherapy of cancer；J Immunother Emphasis Tumor Immunol.1996(6)：414-418)。
据报告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可通过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)激活先天(非适应性)免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液和细胞反应，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状细胞的成熟和分化，导致T_H1细胞的活化增强以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成加强，甚至CD4T细胞帮助的缺失。甚至有疫苗佐剂的存在也能维持TLR9活化作用诱发的TH1偏移，这些佐剂如：正常促进TH2偏移的明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)。CpG寡核苷酸与以下其他佐剂或配方一起制备或联合给药时，表现出更强的佐剂活性，如微粒、纳米粒子、脂肪乳或类似制剂，当抗原相对较弱时，这些对诱发强反应尤为必要。他们还能加速免疫反应，使抗原剂量减少约两个数量级，在有些实验中，对不含CpG的全剂量疫苗也能产生类似的抗体反应(Arthur M.Krieg，Therapeuticpotential of Toll-like receptor 9activation，Nature Reviews，Drug Discovery，2006，5，471-484)。美国6406705B1号专利对CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原结合使用促使抗原特异性免疫反应进行了描述。市售CpG TLR9拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药物组合物的优选成分。也可使用其他如TLR结合分子，如：RNA结合TLR7、TLR8和/或TLR9。
其他有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、Poly(I：C)(如polyI：C12U)、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：咪唑喹啉、环磷酰胺、舒尼替单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、ipilimumab、tremelimumab和SC58175，这些药物都可能有治疗作用和/或充当佐剂。技术人员无需过度进行不当实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。
优选佐剂为dSLIM、BCG、OK432、咪喹莫特、PeviTer和JuvImmune。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)。
在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为咪喹莫特。
此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉注射，也可口服。为此，肽和其他选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多辅料可在从A.Kibbe所著的Handbook of PharmaceuticalExcipients(第3版，2000年，美国医药协会和制药出版社)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/或治疗腺瘤或癌性疾病，优选为结直肠癌。
细胞毒性T细胞(CTL)可识别与MHC分子而不是与完整外来抗原本身结合的以一种肽形式出现的抗原。MHC分子本身位于抗原提呈细胞的细胞表面。因此，只有出现肽抗原、MHC分子和APC三聚体复合物时，才可能激活CTL。相应地，如果并非只有该肽用于激活CTL，而是添加了含各MHC分子的额外APC，则可提高免疫反应。
因此，在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，另外至少包含一种抗原提呈细胞。
抗原提呈细胞(或刺激因子细胞)通常在其表面有一个MHC-I类或II类分子，在一个实施方案中，该抗原提呈细胞自身基本上不能向MHC-I类或II类分子载入选定抗原。正如下面的更为详细描述，MHC-I类或II类分子在体外可很容易载入选定抗原。
优选情况是，哺乳动物细胞缺乏TAP肽转运载体或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽转运载体的适合细胞包括T2、RMA-S和果蝇细胞。TAP表示“转运载体相关的抗原加工”。
人体肽载入的缺陷细胞株T2从属美国菌种保藏中心(ATCC，12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美国)目录号CRL1992；果蝇细胞株Schneider2号株从属ATCC目录CRL 19863；小鼠RMA-S细胞株Karre和Ljunggren(985)在《实验医学杂志》(J.Exp.Med.162，1745)中有过描述。这些细胞株可作为抗原提呈细胞(APC)，由于缺乏TAP，MHC-I类分子提呈的所有的肽几乎都受到关注，用于外部载入这些细胞株的空载MHC-I类分子，因此所有作用都将无疑地归因于使用的肽。
抗原提呈细胞优选为树突状细胞。适当的树突状细胞为自体树突状细胞，用抗原肽作脉冲处理。抗原肽可以是产生适当T细胞反应的任何合适的抗原肽。Murphy等人(1996)在《前列腺》杂志(The Prostate 29，371-380以及The Prostate 32，272-278)中披露了一种使用自体树突状细胞的T细胞疗法，自体树突状细胞由一种抗原相关肿瘤的肽进行脉冲处理。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，至少包含一种抗原提呈细胞的药物组合物以该肽进行脉冲处理或进行加载，例如，通过实施例4的方法。
作为一种替代物，抗原提呈细胞包括一个编码肽的表达载体。多聚核苷酸可能选为任何合适的多聚核苷酸，优选为能转导树突状细胞，从而提呈一种肽并诱导免疫性。
本发明的核酸优选为由一种病毒核苷酸或病毒组成。例如，腺病毒转导的树突状细胞表明可诱导与MUC1相关的抗原特异性抗肿瘤免疫(参阅Gong et al(1997)Gene Ther.4，1023-1028)。同样地，也可使用基于腺病毒的系统(例如参阅，Wan et al(1997)Hum.Gene Ther.8，1355-1363)；可使用逆转录病毒系统(Specht et al(1997)J.Exp.Med.186，1213-1221和Szabolcset al(1997)(也可使用血液颗粒介导移转至树突状细胞的方法(Tuting et al(1997)Eur.J.Immunol.27，2702-2707)；亦可使用RNA(Ashley et al(1997)J.Exp.Med.186，11771182)。
一般来说，本发明中，含有发明中的一种(多种)核酸的药物组合物可用本发明中那些含有肽的药物复合物的相似给药方式给予，如：静脉注射、动脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、瘤内注射、口服、经皮、经鼻腔、经口腔、经直肠、经阴道、吸入、或外用。
由于逃逸机制的原因，肿瘤往往对治疗药物产生耐药。耐药性可能在治疗期间出现，并转移和复发肿瘤中表现出来。为了避免这种耐药性，肿瘤通常通过联合给药治疗，转移瘤和无病期后复发的肿瘤后往往需要不同的药物组合来治疗。因此，在本发明的一方面，药物组合物与第二种抗癌药物结合使用。第二种药物可在本发明中的药物组合物给药之后给予，也可同时给药。例如，如果化学性质相容，本发明中的药物组合物可与第二种抗癌药物混合使用，从而实现同时给药。同时给药的另一种方法是，本组合物与抗癌药物同一天给药，给药途径可不同，例如，本发明的药物组合物可注射给药，而第二种抗癌药物可口服。药物组合物和第二种抗癌药物也可在同一疗程给药，但是不在同一天和/或在不同的疗程内给药。
另一个方面，本发明提出了一种治疗或预防患者癌症的方法，包括给予患者本发明中的任何一种药物组合物的有效治疗量。
有效治疗量是指能引发免疫反应的量，特别是激活CTL亚群。本领域的技术人员可使用免疫学标准方法很容易确定使用量是否有效，如：本说明书实施例中的方法。监测本药物组合物某种量效果的方法是观察受治疗肿瘤的生长和/或其复发情况。
在本发明药物组合物的一个特别优选实施方案中，本药物组合物作为抗癌疫苗使用。
含肽组合物或肽编码的核酸也可以构成肿瘤或癌症的疫苗。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。
本发明的药物组合物可用于治疗癌症或作为癌症疫苗使用。癌种可能是口腔癌、咽癌，消化道癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、呼吸道癌、乳腺癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫体癌、卵巢癌、男性生殖道癌、尿道癌、骨癌、软组织癌、卡波西肉瘤、皮肤黑色素瘤、眼黑色素瘤、非黑色素瘤眼癌、脑癌、中枢神经系统癌、甲状腺癌、其他内分泌腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤，优选为肾癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、脑癌、胃肠道间质瘤或胶质母细胞瘤。
根据本发明，治疗方法或疫苗的一个最优选实施方案中，疫苗为治疗结直肠癌的一种多肽肿瘤疫苗。该疫苗优选包括从SEQ ID No.1至SEQ ID No.15选定的一系列肿瘤相关肽，它们已经被确定位于原发性结直肠癌中。这些肽包括HLA-I类和II类肽。这些肽还可至少包括乙肝病毒核心抗原中的一种肽，这种肽为正性控制肽，是检测皮内给药疗效的免疫标记物。在一个特别的实施方案中，疫苗包括14种肽(根据SEQ ID No.1至SEQ ID No.15)，每种肽含量约为1500μg至75μg，优选为约1000μg至750μg，更优选为约500μg至600μg，最优选为约578μg，所有的肽都可用HPLC和离子交换色谱法进行纯化，外观为白色或类白色粉末。真空冻干粉最好溶于碳酸氢钠，在室温下重组后30分钟用于皮内注射。根据本发明，肽的首选含量约为0.1至100mg，优选为约0.1至1mg，最优选为每500mg的溶液中约300μg至800μg。在此，如果未具体说明，“约”一词系指给定值的+/-10％。技能娴熟的人能根据以下因素调整肽的实际使用量，如：患者个体的免疫状态和/或特定癌种所提呈的TUMAP含量。本发明的肽可能有其它形式(无菌溶液等)，而不是真空冻干粉。
本发明中含肽和/或核酸的药物制剂给予罹患与各种肽或抗原相关的腺瘤或癌性疾病患者。通过这种方法可以触发T细胞介导的免疫反应。
根据本发明，优选的一种药物组合物，其中(尤其是肿瘤相关的)肽、核酸或表达载体含量为组织、癌症和/或患者特异性含量。
本发明的另一实施方案中，疫苗为核酸疫苗。接种核酸疫苗(如DNA疫苗)编码多肽会导致T细胞反应。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。如果核酸给予体外细胞，可能有益于细胞转染，以共同表达免疫刺激细胞因子，如白细胞介素-2或GM-CSF。核酸可完全单独给药，也可与免疫刺激佐剂或与免疫刺激细胞因子联合使用，或以适当的输送系统给药，例如脂质体。核酸疫苗可与佐剂一起使用，如上述与肽疫苗一起使用的佐剂。核酸疫苗优选为不与佐剂联合给药。
多聚核苷酸可完全单独给药，可用合适的载体或输送系统给药。合适的载体和输送系统包括病毒系统，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，都是DNA输送本领域内熟知的方法。也可使用物理输送系统，如通过“基因枪”。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含破伤风类毒素的一个表位(刺激CD-4阳性T细胞)。
适当的情况是，给予患者的任何核酸都是无菌、无热原的。裸DNA可肌肉注射、皮内注射或皮下注射。核酸疫苗优选可包括任何合适的核酸输送工具。核酸，优选为DNA，也可用一种脂质体或病毒载体输送系统输送。如果是核酸疫苗(如DNA疫苗)，首选注入肌肉，而肽疫苗首选皮下注射。疫苗也优选注入皮内。
我们认为，核酸的吸收和专业抗原提呈细胞(如树突状细胞)编码的肽的表达可能是免疫反应的启动机制所致；然而，树突状细胞可能不会被转染，但是由于它们可能会从组织中的转染细胞中挑选出被表达的肽，因此仍然很重要(“交叉启动”，例如，ThomasAM，SantarsieroLM，Lutz ER，Armstrong TD，Chen YC，Huang LQ，Laheru DA，Goggins M，Hruban RH，Jaffee EM.Mesothelin-specific CD8(+)T cell responses provide evidence of in vivo cross-priming byantigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer patients.J Exp Med.2004Aug2；200(3)：297-306)。
Conry等(1996年)在《肿瘤学论文集》(Seminars in Oncology 23，135-147)中、Condon等(1996年)在《自然-医学》(Nature Medicine 2，1122-1127)中、Gong等(1997年)在《自然-医学》(Nature Medicine 3，558-561)中、Zhai等(1996年)在《免疫学杂志》(J.Immunol.156，700-710)中、Graham等(1996年)在《国际癌症杂志》(Int J.Cancer 65，664-670)中、Burchell等(1996)309-313在Breast Cancer，Advances in biology and therapeutics一文中、Calvo等(eds)、John Libbey Eurotext都对多聚核苷酸介导的癌症免疫化治疗进行了描述，以完整引用形式并入本文。
这也可能有益于疫苗特异性靶向作用于细胞群(例如抗原提呈细胞)，可使用局部注射、使用靶向性载体和输送系统、或对患者该类细胞群的选择性纯化以及体外给予肽或核酸(例如，树突状细胞可按Zhou等人(1995年)在Blood 86，3295-3301中、Roth等人(1996年)在Scand.J.Immunology 43，646-651中所述的方法进行分类)。例如，靶向性载体可包括一个组织或肿瘤特异性启动子，引导抗原在适当的位置表达。
最后，本发明的疫苗可由待治疗患者具体的癌症类型、以及疾病状态、早期治疗方案、患者免疫状态所决定，当然，还有患者的HLA单倍型。此外，根据特定患者的个人需求，本发明的疫苗可包含个性化成分。根据特定患者的相关TAA的表达、由于个人过敏或其它治疗方法而产生的意外副作用、以及第一轮治疗后对二次治疗或治疗方案的调整，各实施例中的肽含量有所不同。
本发明中的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由胶质母细胞瘤产生，并且这些肽确定不在正常组织中出现，因此这些肽可用于诊断癌症是否存在。
含本发明肽的组织切片有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱或其它本领域内已知的方法检测本发明的某些肽可使病理师判断该组织为恶性的、炎症还是一般病变。本发明肽的提出使得能对病变组织进行分类或进一步分成子类。
对病变标本中本发明肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的利益进行判断，特别是如果T淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪些受感染的恶性细胞逃避了免疫监视。因此，本发明肽的提出表明，分析过的细胞并没有利用这种机制。
本发明的肽可用于分析对本发明肽发生的淋巴细胞反应(如T细胞反应)，或对本发明肽发生的抗体反应，或分析本发明中与MHC分子络合的肽。这些淋巴细胞反应可以作为预后指标，决定是否采取进一步的治疗。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代指标，旨在以不同方式诱导淋巴细胞反应，如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，对本发明肽发生的淋巴细胞反应可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞反应监测也可能成为移植疗法复查中的一种有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
本发明中的肽可用于生成和开发出针对MHC/肽复合物的特定抗体。这些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向作用于病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如PET)将病变组织作为放射性核素的靶标。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和准确位置。此外，可用这些肽在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。
在另一个方面，本发明涉及一种套件，包括(a)一个容器，包含上述溶液或冻干粉形式的药物组合物；(b)可选项，第二个容器，含冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；及(c)可选项，(i)使用溶液或(ii)重组和/或使用冻干粉剂型的说明。该套件还包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。容器优选为瓶子、西林瓶、注射器或试管；也可为多用途容器。药物组合优选为冻干粉剂。
本发明中的套件优选包含一种置于合适容器中的冻干制剂以及重组和/或使用说明。适当的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如双室瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。该容器可能由多种材料制成，如玻璃或塑料。优选情况是，套件和/或容器上有说明，表明重组和/或使用的指示。例如，标签可能表明冻干剂型重组为上述肽浓度。该标签可进一步表明制剂用于皮下注射。
存放制剂的容器可使用多用途西林瓶，使得可重复给予(例如，2-6次)重组剂型。该套件可进一步包括装有合适稀释剂(如碳酸氢钠溶液)的第二个容器。
稀释液和冻干制剂混合后，重组制剂中的终肽浓度优选为至少0.15mg/mL/肽(＝75μg)，不超过3mg/mL/肽(＝1500μg)。该套件还可包括商业和用户角度来说可取的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂，过滤液、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。
本发明中的套件可能有一个单独的容器，其中包含药品成分的制定根据与其他组件或无本发明(例如，其他化合物或及其药物组合物)或可能有明显的每个组件的容器。
优选情况是，本发明的套件包括与本发明的一种制剂，包装后与第二种化合物(如佐剂(例如GM-CSF)、化疗药物、天然产品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物联合使用。该套件的组件可预络合或每个组件在给予患者之前可放置于单独的不同容器。该套件的组件可以是一种或多种溶液，优选为水溶液，更优选为无菌水溶液。该套件的组件也可为固体形式，加入合适的溶剂后转换为液体，最好放置于另一个不同的容器中。
治疗套件的容器可能为西林瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器、或任何其他指装载固体或液体的工具。通常，当多于一个组件时，套件将包含第二个西林瓶或其他容器，使得可以单独计量。该套件还可能包含另一个装载药用液体的容器。优选情况是，治疗套件将包含一个设备(如，一个或多个针头、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本发明的药物(本套件的组合物)。
本发明的药物配方适合以任何可接受的途径进行肽给药，如口服(肠道)、鼻内、眼内、皮下、皮内、肌内，静脉或经皮给药。优选为皮下给药，最优选为皮内给药，也可通过输液泵给药。
应该认识到，此处披露和描述的本发明特点不仅可联合使用，而且也可以单独的方式使用，只要在本发明的预期用途范畴内。为了本发明之目的，所有参考文献均以完整引用的形式并入本文。
下列参考图、序列表和实施例将对本发明进行详细描述。以下实施例仅作为说明之用，而不是为了限制本发明。
附图说明
图1：微球促使的外周血ODC-001和NOX-001特异性CD8+淋巴细胞增殖的四聚体技术分析。与抗CD28+高密度肿瘤抗原A*0201/ODC-001(上板)或抗CD28+高密度肿瘤抗原A*0201/NOX-001(下板)耦合的微球每周对每孔中健康HLA-A*0201的1x10⁶CD8+浓缩PBMC+供体HD100进行刺激。经过三次体外刺激，所有的细胞用抗体CD8FITC+四聚体A*0201/NOX-001PE和A*0201/ODC-001APC进行染色。细胞在淋巴细胞群或CD8+淋巴细胞(右板)上得到门控，并且数字代表四聚体+CD8+淋巴细胞群内的百分比。
图25个刺激周期后干扰素γ酶联免疫斑点(IFNγELISPOT)检测到的TGFBI-004体外免疫原性。TGFBI-004反复引发和再刺激细胞，然后以分别相关TGFBI-004(第1、2、3和4孔)和不相关(阴性对照)肽进行培养。IFNγELISPOT检测后，对ELISPOT阅读器(CTL公司，美国克利夫兰)进行分析。植物血凝素离子霉素作为阳性对照。数字表示阳性点计数。
图3：5个刺激周期后ICS检测到的TGFBI-004体外免疫原性。负载TGFBI-004的DC引发细胞，自体PBMC+TGFBI-004反复再刺激细胞。对于读出细胞分别以相关TGFBI-004(第1、2、3和4孔)和不相关(阴性对照)肽进行培养。除了细胞内IFNγ染色，细胞还用CD4-FITC和CD8-PerCP抗体染色。用四色流式细胞仪(BD生物科学公司，德国)进行分析。
图4：NOX-001肽体外重刺激后T细胞株产生IFNγ的ELISPOT分析。A.T细胞株7+源自供体HBC-154(分选的CD8+NOX-001四聚体+)；B.T细胞株7-源自供体HBC-154(分选的CD8+NOX-001四聚体-)。分选的CD8+NOX-001四聚体+(A.)和分选的CD8+NOX-001四聚体-(B.)细胞在用不相关(MLA-001)(上孔)和相关(NOX-001)(下孔)肽(10μg/ml)重新刺激之后，用IFNγELISPOT法分析。数字表示阳性点计数。
图5：四个HLA-A2健康供体用CEA-004刺激后流式细胞术分析得出的CEA-004特异性CD8+T细胞频率。
图6：HLA-A*0201等位基因编码的本发明HLA-I类肽对MHC分子的亲和性。
实施例
1.合成与结构
肽通过使用Fmoc化学以标准、广为接受的固相合成法合成。制备液HPLC纯化之后，进行离子交换纯化程序从而加入生理相容性反离子(醋酸或氯化物)。最后，在冻干后制得白色至类白色固体。在制造过程中由于技术原因，除了IMA-CCN-001以氯化盐形式存在之外，其它所有TUMAP都作为醋酸盐给予。
重要的是，肽的身份和纯度可很容易使用质谱、氨基酸分析法和HPLC分析法确定，并且确认精确度高。根据分析结果，IMA910疫苗所用的所有肽都显示出正确的结构，纯度为95％以上。
表：IMA910肽的物理化学特征


重组后获得的颗粒，通过直接捕捉每个颗粒(0.25至100μm)的图像之后进行分析从而测量其粒度分布和颗粒形状。结果发现大多数(＞95％)粒子的大小在0.25至0.27μm之间。到目前为止，在重组后1、2或3小时内未发现颗粒大小和形状分布上有很大的差异。
2.典型药物组合物IMA910的组成
IMA910由合成肿瘤相关肽(TUMAP)的混合物组成，其中大部分已在原发性结直肠癌细胞中得到确定。TUMAP包括10种能激活细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)的HLA-I类结合肽以及3种能激活T辅助细胞(CD4+T细胞)的HLA-II类结合肽。辅助性T细胞通过释放细胞因子而辅助细胞毒性T细胞的功能，此类细胞因子能提高CD8+T细胞杀伤力，也可直接作用于肿瘤细胞(Knutson，KL and Disis，ML；Augmenting T helper cell immunity in cancer，Curr.Drug Targets.Immune.Endocr.Metabol.Disord.，2005，5，365-371)。除了这13种TUMAP外，IMA910包含一种病毒控制肽。
手术切除的恶性肿瘤样本和结直肠肠癌患者的正常组织以及健康供体的血液以循序渐进的方法进行分析：
首先使用微阵列全基因组mRNA表达分析法来确定恶性肿瘤组织与一系列正常器官和组织相比过度表达的基因。
在第二个步骤中，恶性肿瘤的HLA配体用质谱法确定。
随后，确定的HLA配体与基因表达数据进行比较。第1步中检测到的选择性表达或过度表达基因所编码的肽考虑为多肽疫苗的合适候选TUMAP。
文献检索以确定更多证据以支持确认为TUMP的肽的相关性。
最后，使用多种免疫检测方法(体外T细胞检测法)检测健康个体中的外周血CD8+T细胞对肿瘤相关HLA配体的活性。
表3：IMA910TUMAP组合物。
IMA910含有10种HLA-A*02(I类)和3个HLA-DR(II类)TUMAP。此外，也包括HBV-001病毒标志物肽，在此未罗列。

3.肿瘤样本中IMA910所含表位的提呈
制备
手术切除组织标本由für Allgemeine，Viszeral-undTransplantationschirurgie，Tübingen获得每名患者的书面知情同意后提供。
从组织样本中分离HLA肽
根据方案略加修改，使用HLA-A*02特异性抗体BB7.2或HLA-A、HLA-B、HLA-C特异性抗体W6/32、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理和超滤方法以固体组织的免疫沉淀法获得了冷休克组织样本的HLA肽库(Falk，K.，Rotzschke，O.，Stevanovic，S.，Jung，G.&Rammensee，H.G.Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHCmolecules.Nature 1991，351，290-296；Seeger，F.H.et al.The HLA-A*6601 peptide motif：predictionby pocket structure and verification by peptide analysis.Immunogenetics 1999，49，571-576)。
用电喷雾液相色谱质谱(ESI-LCMS)检测TUMAP
IMA910所含表位用质谱法在结直肠癌样本上进行了系统搜索。获得HLA肽库根据其疏水性用反相色谱(CapLC，Waters)分离，洗脱肽用装备电喷雾源的四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF Ultima，Waters)进行了分析。肽库被载到C18预处理柱进行浓缩和脱盐。载入后，C18预处理柱排成一行，用填充5μm C18反相材料(Dionex)的熔炼石英微毛细管柱(75μm内径x250mm)进行分离。溶剂A为4mM醋酸铵/水。溶剂B为2M浓度为80％乙腈/水中的醋酸铵。这两种溶剂均用甲酸将pH值调整为3.0。对15％至60％的溶剂B在90分钟内进行二元梯度色谱法分析，分流系统将应用流量从5μl/min降低至200nl/min。金镀膜玻璃毛细管(PicoTip，New Objective)用于引入到微电喷雾源。TOF分析仪的积分时间为1.9秒，扫描间延迟时间为0.1秒。对于已定义肽的检测，根据已知分子量和肽在色谱系统中的停留时间，在ESI-LCMS实验中进行了高灵敏度筛选。因此，在选择前体中，应用一个清单，其中含先前确定的肽(单电荷和/或双电荷)的m/z值。随后，用碰撞诱导解离(CID)质谱(ESI-LCMS/MS)揭示序列。生成的自然TUMAP破碎模式与合成序列相同参考肽的破碎模式进行比较后，确保了TUMP的序列。使用企业内标准-丰富内源性HLA-A*02肽(从DDX5获得的YLLPAIVHI)的强度和存留时间，评价了HLA纯化产量和分析系统的可复制性，包括保留时间的稳定性。因此，这些实验中为了检测先前确认的TUMAP所用的结直肠癌样本纳入标准在LCMS/MS实验中(企业内标双电荷信号，YLLPAIVHI)每次扫描的最小强度设定为650次，以确保成功分离HLA肽以及分析系统的性能。
表3显示了不同阶段结肠和直肠癌样本以及源自这两种原发性肿瘤转移癌的分析结果。大部分样本中都发现了所有HLA-A*02TUMAP。HLA-DR TUMAP一般很少需要再次检测。这是因为每个核心序列都可能村子HLA-II类肽、几种长度可变的变体。
表3：重新检测结直肠癌样本中的TUMAP

n.a.未作分析
4.IMA910MHC-I类提呈肽的体外免疫原性
为了获知关于IMA910包括的肽免疫原性方面的信息，我们使用了Walter，S、Herrgen，L、Schoor，O、Jung，G、Wernet，D、Buhring，HJ、Rammensee，HG和Stevanovic，S等人2003年在Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibratedMHC/anti-CD28-coated microspheres，J.Immunol.，171，4974-4978一文中所述的被广为接受的体外刺激平台进行了研究。用这种方法，IMA910中得到检测的10种HLA-A*0201限制肽都显示出正向免疫原性数，这表明这些肽为人CD8+前体T细胞的T细胞表位。IMA910(MUC-001)中所含的唯一另外一种HLA-I类肽不能使用此方法进行检测，因为该TUMAP的A*0201亲和力较低。
最近的证据给CEA-005对癌症疫苗的用处带来了严峻的挑战。在最近的一项综合研究中(Iero，M，Squarcina，P，Romero，P，Guillaume，P，Scarselli，E，Cerino，R，Carrabba，M，Toutirais，O，Parmiani，G，Rivoltini，L；Low TCR avidity and lack of tumor cell recognition in CD8(+)T cellsprimed with the CEA-analogue CAP1-6D peptide，Cancer Immunol Immunother.2007Dec；56(12)：1979-91)，作者首次系统地描述了CEA-005激活的T细胞对原生序列CEA-004的效应子功能。在结直肠癌患者和健康者的大量血液样本中，观察到T细胞和CEA-005的激活可重复促进低亲和性T细胞(这些细胞无能力识别表达CEA的结直肠癌细胞提呈的原生序列)的生成。对原生序列进行这种无效低亲和力交叉识别可能时使用改变肽配体的疫苗接种方案中普遍存在的一个问题，在另一种CEA肽及其改变激动剂的最近报道中有相似结果也证实了这一点(Alves，PM，Viatte，S，Fagerberg，T，Michielin，O，Bricard，G，Bouzourene，H，Vuilleumier，H，Kruger，T，Givel，JC，Levy，F，Speiser，DE，Cerottini，JC，Romero，P；Immunogenicity of thecarcinoembryonic antigen derived peptide 694in HLA-A2healthy donors and colorectal carcinomapatients，Cancer Immunol. Immunother.，2007，56，1795-1805)。此外，在广为接受的黑色素瘤抗原Melan-A/MART-1及其激动剂的原生序列中也报告了这样的结果(D.Speiser，私下交流)。
总之，尽管改变激动剂肽的免疫原性普遍增强，但是最近的证据表明，原生肽可能是更具吸引力的候选疫苗，因为改变激动剂刺激的T细胞对其原生序列的交叉识别能力不足。这表明，CEA-004(CAP1)应优选为其激动剂，如WO9919478A1中所述，如，CEA-005(CAP1-6D)或CAP1-6D，7I。
事实上，大量数据表明了原生CEA-004序列本身的重要体外免疫原性。在一些研究中，已发现了癌症患者(不是健康供体)对这种肽发生了自发性诱导T细胞反应(Nagorsen，D，Keilholz，U，Rivoltini，L，Schmittel，A，Letsch，A，Asemissen，AM，Berger，G，Buhr，HJ，Thiel，E，Scheibenbogen，C；Natural T-cell response against MHC class I epitopes of epithelial cell adhesionmolecule，her-2/neu，and carcinoembryonic antigen in patients with colorectal cancer，Cancer Res.2000，60，4850-4854；Weihrauch，MR，Ansen，S，Jurkiewicz，E，Geisen，C，Xia，Z，Anderson，KS，Gracien，E，Schmidt，M，Wittig，B，Diehl，V，Wolf，J，Bohlen，H，Nadler，LM；Phase I/II combinedchemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptideand irinotecan，5-fluorouracil，and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer，Clin Cancer Res.2005，11，5993-6001；Babatz，J，Rollig，C，Lobel，B，Folprecht，G，Haack，M，Gunther，H，Kohne，CH，Ehninger，G，Schmitz，M，Bornhauser，M；Induction of cellular immuneresponses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumors after vaccination withaltered peptide ligand-loaded dendritic cells，Cancer Immunol.Immunother.2006，55，268-276)。此外，使用CEA-004或CEA蛋白进行的疫苗接种方法已经被证明能有效刺激对CEA-004的T细胞反应(Tsang，KY，Zaremba，S，Nieroda，CA，Zhu，MZ，Hamilton，JM，Schlom，J；Generation ofhuman cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patientsimmunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine，J Natl.Cancer Inst.1995，87，982-990；Morse，MA，Deng，Y，Coleman，D，Hull，S，Kitrell-Fisher，E，Nair，S，Schlom，J，Ryback，ME，Lyerly，HK；APhase I study of active immunotherapy with carcinoembryonic antigen peptide(CAP-1)-pulsed，autologous human cultured dendritic cells in patients with metastatic malignancies expressingcarcinoembryonic antigen，Clin Cancer Res.1999，5，1331-1338；Zhu，MZ，Marshall，J，Cole，D，Schlom，J，Tsang，KY；Specific cytolytic T-cell responses to human CEA from patients immunizedwith recombinant avipox-CEA vaccine，Clin Cancer Res.2000，6，24-33；Weihrauch，MR，Ansen，S，Jurkiewicz，E，Geisen，C，Xia，Z，Anderson，KS，Gracien，E，Schmidt，M，Wittig，B，Diehl，V，Wolf，J，Bohlen，H，Nadler，LM；Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonicantigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan，5-fluorouracil，and leucovorin inpatients with primary metastatic colorectal cancer，Clin Cancer Res.2005，11，5993-6001)。
CD8+T细胞体外启动
为了用载有肽-MHC复合物(pMHC)和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞(aAPC)进行体外刺激，我们首先运用标准密度梯度分离介质(德国科尔贝PAA公司)从新鲜HLA-A*02+血沉棕黄层中分离出PBMC(外周血单核细胞)。血沉棕黄层从Tübingen或KatharinenhospitalStuttgart的血库获得。分离出的PBMC在T细胞培养基(TCM)中培养过夜，在体外填装，包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，卡尔斯鲁厄，德国)并补充10％热灭活人AB血清(PAA公司，科尔贝，德国)，100U/ml青霉素ml/100μg/ml链霉素(Cambrex公司，韦尔维耶，比利时)，lmM丙酮酸钠(CC Pro公司，Neustadt，德国)和20μg/ml庆大霉素(Cambrex公司)。CD8+淋巴细胞根据制造商的说明使用CD8+MACS阳性选择套件(Miltenyi公司，Bergisch Gladbach，德国)进行分离。获得的CD8+T细胞培养，直到TCM补充了2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，海德堡，德国)和10U/ml的IL-2(Chiron公司，慕尼黑，德国)后才使用。pMHC/抗-CD28涂层珠的生成、T细胞的刺激和读出方法如前所述(Walter，S，Herrgen，L，Schoor，O，Jung，G，Wernet，D，Buhring，HJ，Rammensee，HG，and Stevanovic，S；Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibratedMHC/anti-CD28-coated microspheres，J.Immunol.，2003，171，4974-4978)并作微小改动。简言之，缺乏跨膜域和在重链羧基端中生物素化的生物素化重组HLA-A*0201分子用以下所述方法制成(Altman，JD，Moss，PA，Goulder，PJ，Barouch，DH，Heyzer-Williams，MG，Bell，JI，McMichael，AJ，and Davis，MM；Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes，Science，1996，274，94-96)。纯化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗体9.3(Jung，G，Ledbetter，JA，andMuller-Eberhard，HJ；Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cellsby antibody heteroconjugates，Proc Natl Acad Sci USA，1987，84，4611-4615)使用制造商(Perbio公司，波恩，德国)推荐的N-羟基琥珀酰亚胺生物素进行化学生物素化处理。所用珠为5.60μm的大链霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯颗粒(Bangs Labooratories，伊利诺伊州/美国)。作为阳性和阴性对照的pMHC分别为A*0201/MLA-001(从Melan-A/MART-1中修饰制得的肽ELAGIGILTV)和A*0201/DDX5-001(从DDX5中获得的YLLPAIVHI)或A*0201/HBV-001(FLPSDFFPSV)。
800.000珠/200μl包裹于96孔板，以600ng生物素抗CD28+200ng相关生物素pMHC(高密度珠)或2ng相关+200ng不相关(pMHC库)MHC(低密度珠)存在。在37℃下，在含5ng/ml IL-12(PromoCell)的200μl TCM中共培养1x10⁶CD8+T细胞与2x10⁵的清洗涂层珠3至4天，从而启动刺激。之后，一半培养基与补充80U/ml IL-2的新鲜TCM进行交换，并且培养在37℃下持续3至4天。这种刺激性周期总共进行3次。最后，在四色流式细胞仪(BD公司)上用荧光MHC四聚体(如Altman，JD，Moss，PA，Goulder，PJ，Barouch，DH，Heyzer-Williams，MG，Bell，JI，McMichael，AJ，and Davis，MM；Phenotypic analysis ofantigen-specific T lymphocytes，Science，1996，274，94-96所述方法制得)+抗体CD8-FITC克隆SK1(BD公司，海德堡，德国)进行四聚体分析。肽特异性细胞以占总CD8+T细胞的百分比形式进行计算。四聚体分析结果用FCS Express软件(De Novo Software公司)进行评估。特定四聚体+CD8+淋巴细胞的体外填装用适当的门控技术以及与阴性对照刺激组比较而进行检测。如果健康供体中的至少一个可评价的体外刺激孔在体外刺激后发现含有特异性CD8+T细胞株(即该孔包含至少1％特定四聚体+CD8+细胞，并且特定四聚体+的百分比至少为阴性对照刺激中位数的10倍)，则检测给定抗原的免疫原性。
10IMA910肽的体外免疫原性
对于全部10种受到测试的HLA-I类肽，可通过肽特异性T细胞株的生成证明其体外免疫原性。代表性染色显示产生的NOX-001和ODC-001特异性T细胞株如图1所示。结果见表4。IMA910(MUC-001)中所含的唯一另外一种HLA-I类肽不能使用此方法进行测试，因为该TUMAP的A*0201亲和力较低，因此这使之在方法学上不可能使用pMHC单体进行此类刺激。
表4：IMA910所含10种HLA-I类肽的免疫原性
  抗原  阳性供体/得到测试的供体  阳性孔/得到测试的孔  IMA-HBV-001  7/16(44％)  10/107(9％)  IMA-TGFBI-001  3/4(75％)  4/22(18％)  IMA-NOX-001  3/5(60％)  9/60(15％)  IMA-PCN-001  3/4(75％)  4/42(10％)  IMA-TOP-001  2/5(40％)  7/72(10％)  IMA-C20-001  1/5(20％)  1/60(2％)  IMA-ODC-001  1/5(20％)  1/60(2％)  IMA-HBV-001  2/5(40％)  10/54(19％)  IMA-CEA-004  4/4(100％)  50/60(83％)  IMA-CCN-001  5/5(100％)  42/54(78％)  IMA-MET-001  4/6(67％)  30/72(42％)
Immatics公司针对IMA910所含11种HLA-I类肽中的10种进行了体外免疫原性实验，结果总结如下。所示结果通过刺激高密度珠CD8+细胞而获得。由于不同批次的血清可能会大大影响免疫原性的结果，所以只评价了那些只使用同一批次血清的化验结果。
IMA-CEA-004体外刺T细胞
有4/6的供体可进行评价。在所有四个供体中，用CEA-004刺激后，能成功地诱导CEA-004针对T细胞的体外反应(见图表)。因此，CEA-004肽被证明是人CD8+T细胞体外反应的一个很强的诱因。重要的是，CEA-004与CEA-005相比，可反复引发更高频率的CEA-004特异性T细胞反(83％的孔对64％的孔，见表4)。与CEA-005刺激相比，CEA-004刺激后，各个阳性孔内CEA-004特异性细胞的频率也较高(见图5)。
流式细胞分析确定的4个健康HLA-A*02供体的肽特异性CD8+T细胞体外反应
CD8+T细胞用分别载有CEA-004、CEA-005或不相关肽(IMA-RSL-001)的人工抗原提呈细胞引入。经过3个周期的刺激后，用CEA-004-+CEA-005四聚体(表5A.)和CEA-004-+不相关A*0201-四聚体(表5B.)双染色对肽反应性细胞进行检测。表中显示的数代表须含有CEA-004+或CEA-005+CTL的孔所占百分比。所有实验使用的人血清批次均为C02104-0167。
表5A.
  抗原刺激物 含CEA-004+四聚体+细胞的孔  CEA-004  50/60(83％)  CEA-005  19/72(26％)
表5B.
  抗原刺激物 含CEA-004+四聚体+细胞的孔  CEA-004  50/60(83％)  CEA-005  46/72(64％)
CD8+T细胞从PBMC中分离，用分别载有CEA-004、RSL-001或DDX5-001肽的人工抗原提呈细胞引入。经过3个周期的刺激后，用CEA-004-+不相关A*0201-四聚体染色对肽反应性细胞进行检测。上述这些值代表了每个刺激孔CEA-004特异性细胞的百分比。RSL-001和DDX5-001刺激作为阴性对照。图5显示了四个HLA-A2健康供体用CEA-005刺激后流式细胞术分析得出的CEA-004特异性CD8+T细胞频率。阳性对照孔的阈值分别适用于每个供体()，并确定为阴性对照中位数的10倍，而且其值至少为1％。百分比高于阈值(≥1％)的孔被认为是阳性的，用粉红色菱形表示，而阴性对照孔用黑色菱形表示。
5.IMA910MHC-II类提呈肽的体外免疫原性
辅助T细胞在协助CTL激活和维持肿瘤细胞的免疫反应中发挥着重要作用。因此，MHC-II类肽被列入IMA910。TGFBI-004，IMA910中三个II类肽之一，对其体外免疫原性潜力进行了检测，结果证明它既是特异性CD4+T细胞也是CD8+T细胞的一种诱导物。使用自体系统刺激的实验显示生成了CD4+和功能性CD8+T淋巴细胞。
测试原理
特异性人CD4+和CD8+细胞的启动和扩增使用自体DC、通过单核细胞缺乏的PBMC启动以及使用自体PBMC进行重新刺激而进行体外检测。简言之，为了生成抗原特异性CD4+T细胞，健康供体的单核细胞缺乏的PBMC(HLA基因型I类：A1/A25/B8/B18和II类：DQB1*02/DQB1*06/DRB1*03/DRB1*15/DRB3/DRB5)使用肽脉冲击自体DC进行了刺激并且使用了自体PBMC+肽进行了再刺激。作为一个读出系统，短期重刺激后的IFNγ产量用ELISPOT和流式细胞术进行了评估。在ELISPOT和细胞内IFNγ染色+CD4-FITC和CD8-PerCPT刺激8次之后，对T细胞进行了分析以确定特异性T细胞亚群中产生IFNγ细胞的百分比。在本实验中，对不同孔中的TGFBI-004所刺激的细胞，进行汇集、使用读出的不相关肽进行培养并作为阴性对照。
树突状细胞(DC)的生成
人DC从DC培养基中培养的单核细胞获得，培养基包括RPMI 1640-Glutamax/25mMHepes(Invitrogen公司，德国)和10％自体血浆//100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。首先，血沉棕黄层和血浆经离心健康供体血液而获得(Tübingen血库)。然后，PBMC使用标准密度梯度分离法(淋巴细胞分离液，PAA公司，奥地利)从血沉棕黄层中分离，并在DC培养液中悬浮以确定总细胞数。洗涤100-120Mio PBMC，在15ml X-Vivo 20培养基BioWhittaker公司，比利时)中重新悬浮，并转移至细胞培养瓶。在37℃下待2小时后，含外周血白细胞(PBL)的培养液被清除，粘附单核细胞用10ml PBS洗涤两次并在用100ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4(ImmunoTools公司，德国)或20ng/ml(R&D systems公司，德国)在10ml DC培养液中培养6天。在第3天和第5天，加入100ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4(Immunotools公司)或20ng/ml IL-4(R&D Systems公司，德国)。第7天，未成熟的DC用10ng/ml TNF-α(R&D Systems公司，德国)和20μg/ml多聚(IC)(Sigma Aldrich公司，德国)或100ng/mlLPS刺激24小时。其余的PBMC以及获得的PBL进行等分和冷冻。
特异性T细胞体外启动
为了生成CD4+T细胞，用2×105自体DC对3Mio PBMC/PBL进行刺激。DCZ在第8天收集(参见第3.1章，“DC的生成”)。含5mM乙二胺四乙酸的PBS用于获得尽可能多细胞之目的(包括粘附细胞)。DC培养液洗涤后，确定细胞数。为了装载肽，DC在1ml DC培养液中再悬浮并用25μg/ml在37℃下培养2小时。用于冲击DC的肽为TGFBI-004、Posmix(EBV和CMV相关肽的混合物)、Padre和CMV。解冻自体PBMC/PBL、用DC培养液洗涤(至少两次)并在24孔板中展开，密度为1ml中3Mio细胞/ml。然后，将载有肽的DC加入(如含肽的1ml悬浮液)到入板的PBMC/PBL并在37℃下培养7天。启动后，首先用已接受照射(30Gy；Gammacell 1000Elite照射仪，Nordion International公司，加拿大)。为此目的，每孔加入5x10⁵CTL和2、5x10⁶PBMC。使用肽对PBMC进行冲击如前所述(针对DC的方法)。第一次重新刺激的第1天，加入IL-2(R&D Systems公司，德国)和IL-7使最终浓度分别为2ng/ml和5ng/ml。此后，在每个第2天和第7天，向培养液加入IL-2和IL-7。7天后进行第二次重新刺激，但这次只向培养的CTL加入肽(不加入PBMC)。重刺激7天为一周期用负载肽的PBMC和单肽交替加入。在第8次刺激之后，用细胞内IFNγ和IFNγELISPOT法进行分析。
结果
启动对相关肽特异性反应的CD4+T细胞株是可能的(图2和图3)。可通过ELISPOT法在4个细胞株中检测到其中2个有T细胞反应，而使用ICS法的检测结果表明，有四分之三的T细胞株TGFBI-004特异性IFNγ产生CD4+和/或CD8+细胞。
因此，用上述实验系统的测试中，TGFBI-004能引发供体的CD4+和CD8+T细胞反应。根据这一有前景的结果，很可能这种肽具有免疫原性，并有能力诱导T细胞反应。
6.NOX-001和TGFBI-001功能验证举例
IMA910疫苗中所含肽的免疫原性使用immatics`TUMAP验证平台进行了论证。对特异性T细胞的诱导说明了肽有能力成功地成功激活免疫系统。由于只有激活的T细胞具有高亲合力和功能性时才有可能发生有效的抗肿瘤免疫反应，因此，我们进一步研究了TUMAP以通过其IFNγ或杀死肿瘤细胞株的能力而激活其高亲合力和T淋巴细胞的功能。由于NOX-001和TGFBI-001能体外诱导CTL的高亲合力，因此选择这两种肽进行深入验证。我们能够证明，高亲合力前体T细胞对人体肽和NOX-001能产生的CD8+T细胞株都有作用。
测试原理
为了对IMA910肽免疫原性和特异性T细胞的特性更加深入的认识，选定NOX-001和TGFBI-001这两种肽作进一步的评估。为此目的，在Immatics公司进行了实验(细胞分选在Tübingen大学的Dr.Bühring实验室进行)。
T细胞株依据其被高密度或低密度抗原激活的能力大小，可分为高或低亲合力T细胞株。如先前研究所示，(Walter，S，Herrgen，L，Schoor，O，Jung，G，Wernet，D，Buhring，HJ，Rammensee，HG，and Stevanovic，S；Cutting edge：predetermined avidity of human CD8T cells expanded oncalibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres，J.Immunol.，2003，171，4974-4978)，与低亲合力CD8+T细胞相比，人高亲合力CTL可使用较少肽进行激活而成功获得。研究还表明，细胞以这种方式扩增可更有效地识别抗原表达细胞株，从而构成了开发治疗策略的一个可能的主要工具。
为了能够确定肽生成高亲合力CTL株的能力，用含低密度pMHC(肽-MHC-复合体)涂层珠和含IL-12与IL-2的抗CD28抗体对分离出来的人CD8+细胞进行反复刺激从而使之启动和扩增。经过三次刺激后，激活T细胞的一部分以四聚体染色和流式细胞术法检测。之后，根据其抗原特异性，对每个供体的四聚体阳性细胞进行储存，以pMHC-四聚体和人抗CD8-FITC抗体进行染色，最后在FACSAria上进行FACSA分类。分类过的细胞在照射过的饲养细胞、细胞因子及丝裂素中培养和扩增。为了读出高亲合力抗原特异性细胞的生成情况，进行四聚体法染色。为了确定它们的功能，在以相应的肽和肿瘤细胞株重刺激这些细胞后，用ELISPOT法测定IFNγ的产量，并在死/活细胞染色的基础上，使用细胞毒性测定法检查肿细胞株的杀伤情况。
特异性CD8+T细胞株的生成
如上所述，我们应用载有肽-MHC复合体(pMHC)和抗-CD28抗体的人工刺激抗原提呈细胞(aAPC)进行了体外刺激。与上述方法唯一的区别就是：进行刺激用的珠装载有2ng相关+200ng不相关库内(pMHC)MHC(低密度珠)，而不是200ng相关MHC(高密度珠)。因此，高亲合力T细胞的产生主要是为了对肽进行更深入的验证。经过三次刺激后，激活T细胞的一部分以四聚体染色和流式细胞术测。如果健康供体中的至少一个可评价的体外刺激孔在体外刺激后发现含有特异性CD8+T细胞株(即该孔包含至少1％特定四聚体+CD8+细胞，并且特定四聚体+的百分比至少为阴性对照刺激中位数的10倍)，则检测给定抗原的免疫原性。之后，根据其抗原特异性，对每个供体的四聚体阳性细胞进行储存，以相应的pMHC-四聚体和人抗CD8-FITC抗体克隆SKl进行染色，最后在FACSAria(BD Biosciences公司，德国)上进行FACSA分类。分类过的细胞在含有5x105细胞/ml照射过的新鲜异源PBMC、5x104细胞/ml照射过的LG2-EBV细胞、150U/ml IL-2(Chiron公司，慕尼黑，德国)和0.5μg/ml PHA-L(Roche Diagnostics公司，Mannheim，德国)的T细胞培养基中培养(培养基为RPMI-Glutamax，补充有10％热灭活人AB血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠和20μg/ml庆大霉素)。这些细胞在含150U/ml IL-2的T细胞培养基中扩展。为了读出高亲合力抗原特异性细胞的生成情况，如前述方法进行四聚体法染色并在四色FACSCalibur上进行了分析(BD Biosciences公司，德国)。
功能性测试
为了确定它们的功能，在以相应的肽重刺激这些细胞后，用ELISPOT法(IFNγELISPOTSet，BD公司，德国)评估IFNγ的产量。此外，细胞介导的特异性CTL的细胞毒性使用LIVE/DEAD(死/活)细胞介导的细胞毒性套件(L7010，Invitrogen公司，德国)杀死肿瘤细胞株而进行了研究。除非另有说明，否则上述两种测定方法都根据制造商的指示进行。
结果
用低密度pMHC aAPC成功启动后显示，NOX-001和TGFBI-001这两种肽具有体外免疫原性。对于NOX-001以及TGFBI-001特异性T细胞株可以用FACS建立，从而证明高亲合力CD8+T细胞前体存在于健康供体中。
此外，对于NOX-001，可确定一个T细胞株，ELISPOT法也证明了其功能，因为在用这种肽重刺激后，NOX-001特异性表达IFNγ(图4)。
7.将本发明中的HLA-I类限制肽与HLA-A*0201结合
本分析的目的是评价HLA-I类肽对HLA-A*0201等位基因编码的MHC分子的亲和力，因为这是IMA910作用模式的一项重要参数。IMA910中90％的HLA-I类限制肽都对HLA-A*0201有很高的亲和力，解离常数(KD)范围为0.001到0.2nM。同时，病毒标志物肽IMA-HBV-001还表现出较强的结合力。对IMA-MUC-001的亲和力大约减弱20倍。这些结果证实，IMA910候选疫苗中90％的HLA-I类肽对MHC分子具有较强的结合亲和力。
测试原理
稳定HLA/肽复合物包括三种分子：HLA重链、β-2微球蛋白(b2m)和肽类配体。变性重组HLA-A*0201重链分子的活性便可进行保存，使之功能与“空载HLA-A*0201”相当。被稀释为包含b2m和相应肽的水缓冲液后，这些分子以完全肽依赖方式迅速有效地折叠。这些可用的分子用于基于ELISA的检测方法中，来衡量肽和HLA-I类分子相互作用间的亲和力(Sylvester-Hvid等，2002)。
纯化的重组HLA-A*0201分子与b2m、不同等级剂量的肽一起培养。从头折叠HLA/肽复合物的量用定量ELISA法测定。解离常数(KD值)使用从校准HLA/肽复合物稀释液中记录的标准曲线进行计算。
结果
结果如图6所示。较低的KD值反应对HLA-A*0201具有较高的亲和力。大多数IMA910肽和病毒控制肽IMA-HBV-001在0.001(IMA-TGFBI-001)到0.2nM(IMA-ODC-001)的范围内对HLA-A*0201都具有相似的较强亲和力。IMA-MUC-001与大多数配体相比，其亲和力低20-30倍。然而，在immatics公司先前所做的一项临床试验中，接种IMA-MUC-001-001导致了肾细胞癌患者的免疫反应，因此，不必担心IMA-MUC-001较低的亲和力。