人角质细胞生长因子1在制备治疗糖尿病足部及腿部溃疡的药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种人角质细胞生长因子1的新用途，特别是在制备治疗糖尿病足部及腿部溃疡的药物中的应用。具体地说是将人角质细胞生长因子1制备成既能保持生物活性、又适合外部给药的制剂，并用于治疗糖尿病足部及腿部溃疡。
背景技术
糖尿病足部及腿部溃疡是糖尿病最常见的并发症之一，是一种慢性、进行性神经血管病变，其主要原因是肢端缺血、神经病变、感染等多种诱因综合所致；其病理基础是动脉和小动脉粥样硬化，导致脉管狭窄、阻塞，以致所支配的组织器官缺血缺氧而造成坏疽或溃疡经久不愈。
随着人们生活水平提高和生活方式的改变，人口老龄化，糖尿病的发病率亦呈上升趋势，成为继心脑血管疾病，肿瘤之后的第三大慢性疾病。在我国，糖尿病发病率约5％，并以每年大于0.1％的速度增加，严重威胁人们的健康。而在糖尿病慢性并发症中，糖尿病足是最严重影响患者生活质量的并发症之一。国内报道糖尿病病人并发糖尿病足约占0.9％～1.7％，老年糖尿病病人并发糖尿病足约占2.8％～14.5％，国外并发率更高，约占5.8％～6.3％，是非糖尿病患者的20～30倍，其中50岁以上高达40倍；糖尿病患者截肢的主要原因是糖尿病足并发足部及腿部溃疡长期不愈合。
临床上尚无能很好满足需求的治疗方案。市场上的药物多为护理、防护类产品，其中用于糖尿病足部及腿部溃疡治疗的重组人PDGF凝胶是用于糖尿病足部及腿部溃疡的第一个生物制品。
hKGF1是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的一员，又称FGF7。它能刺激来源于不同组织的上皮细胞的生长，但对其它类型的细胞没有直接的作用。这种明显的特异性是由于受到KGF1受体(KGFR)的限制性表达所造成的。不同组织中的上皮细胞包括：胰腺、肝脏、肺和尿道上皮组织都表达KGF1受体。KGF1是由处于与许多器官的上皮细胞相邻的间叶细胞所产生的，这些组织包括：胰腺、肝脏、肺、尿道上皮、前列腺上皮和其它的一些组织。它是由皮肤内真皮成纤维细胞和肠道的固有层细胞所产生的。KGF1在正常组织中的广泛表达表明它在组织动态平衡中的作用。KGF1在真皮损伤时的mRNA的水平比在完整皮肤中所发现的水平高出160倍，而且在患有炎症性肠道疾病患者肠道中的水平也有升高。这些观察结果提示：KGF1生成的增加是上皮损伤的一种正常反应，并且它可能代表了损伤修复的一种成分，但是人体在创伤中存在KGF1分泌相对不足的情况，因此上皮细胞损伤时单靠自身分泌的KGF1是不足以存进创面修复的，这为外源性补充KGF1提供了理论基础。
美国Amgen公司已经将重组人角质细胞生长因子开发为肿瘤放化疗后口腔溃疡的治疗用药，静脉滴注给药，为冻干生物制品，得到FDA和欧洲EMEA的批准上市，其对口腔粘膜损伤具有极其良好的修复治疗作用。
本发明利用人角质细胞生长因子1对人上皮细胞的专一性和促进分裂分化和迁移的生物学活性，促进糖尿病足部及腿部溃疡部位的上皮的修复、皮肤结构重建，达到对溃疡的治疗、阻止病情进一步发展。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种人角质细胞生长因子1在制备治疗糖尿病足部及腿部溃疡的药物中的应用，所述人角质细胞生长因子1为缺失N端23个氨基酸残基的重组人角质细胞生长因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的药物是以人角质细胞生长因子1为活性成分，加上药学上可以接受的辅料制备而成的药剂。
本发明的另一目的是提供一种治疗糖尿病足部及腿部溃疡的药物组合物，其以有效量的人角质细胞生长因子1为活性成分，加上药学上可以接受的辅料制备而成地药剂。所述人角质细胞生长因子1的含量为10ng～500ug/ml，优选的人角质细胞生长因子1的含量为50ng～100ug/ml。
本发明所述的药剂是外用固体制剂、半固体制剂或液体制剂。其中，所述的固体制剂是冻干粉剂或敷料制剂；所述的半固体制剂是凝胶制剂、乳剂或膏剂；所述的液体制剂为喷雾剂。
本发明所使用重组人角质细胞生长因子1为用E.coli表达的缺失23氨基酸残基的140氨基酸人角质细胞生长因子。
本发明所用重组人角质细胞生长因子1保存方式为冷冻干燥后4-8℃冷藏保存，使用时用特定溶媒溶解后，直接使用于溃疡部位；亦可将重组人角质细胞生长因子1制备成凝胶制剂、冻干医用敷料直接施用于溃疡部位。
试验证明，重组人角质细胞生长因子1能促进糖尿病足部及腿部溃疡部位快速修复，完成结构重建。
下面通过具体实施方式对本发明作进一步描述，但并非对本发明的限制。
【附图说明】
图1重组人角质细胞生长因子1对成纤维细胞形态影响
图2.重组人角质细胞生长因子1对称纤维细胞生长曲线影响
【具体实施方式】
实施例1本发明冻干制剂的的制备
活性成分：重组人角质细胞生长因子1(可购买美国安进公司的产品palifermin或kepivance)或者利用常规的基因重组技术生产重组人角质细胞生长因子1，其方法如下：
a、按照生物技术领域技术人员所熟知的方法，人工合成或者用RT-PCR技术克隆重组人角质细胞生长因子1的cDNA序列【fibroblast growth factor7(keratinocyte growth factor)，Homo sapiens，Gene ID 2252】，构建重组质粒，并转染工程菌E.coli表达，得到表达重组人角质细胞生长因子1的基因工程菌，并经发酵培养基因工程菌进行重组人角质细胞生长因子1的生产；
b、经过亲和层析、离子交换层析等分离纯化步骤，获得纯度达到95％以上的重组人角质细胞生长因子1，按照Edman法测定蛋白N-末端序列，其序列与SEQ ID NO1 N-末端15个氨基酸残基相符合，同时通过质谱法测定分子量，与预期分子量16278Da相吻合证明得到的蛋白为重组人角质细胞生长因子1，并经检测物热源物质和生物活性测定，符合国家注射用蛋白的质量标准。
辅料：甘露醇、组氨酸、蔗糖等
将辅料溶解、与相应的重组人角质细胞生长因子1原液混合，调整pH值到6.5、组成为每毫升液体含1毫克重组人角质细胞生长因子1、50毫克甘露醇、25毫克蔗糖、2毫克组氨酸，经过滤除菌后，冷冻干燥，即为冻干制剂，规格按照需要确定。
实施例2本发明喷雾制剂的制备
为便于运输和保存，重组人角质细胞生长因子1制备成冻干制剂，使用时可根据需要配制为喷雾制剂：将冻干制剂用生理盐水或医学常用溶媒溶解，溶解后的活性物质浓度范围为50ng～100ug/ml，装入符合要求的喷雾器中，即可喷雾使用。
实施例3本发明凝胶制剂的制备
为便于运输和保存，重组人角质细胞生长因子1制备成冻干制剂，使用时可根据需要配制为凝胶制剂，制备方法如下：
用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)的低温呈液态，体温凝聚成凝胶的特点，将其配制成重组人角质细胞生长因子1冻干粉的凝胶伴侣，与重组人角质细胞生长因子1冻干粉共同低温(4-8℃)保存，使用时用凝胶伴侣溶解冻干粉，吸出涂抹到患处，体温作用即形成凝胶覆盖患处，并释放重组人角质细胞生长因子1产生治疗作用。
20％Pluronic F-127液制备方法：20mM PBS pH7.0缓冲液，缓慢加入Pluronic F-127搅拌30分钟，4℃下过夜，过滤除菌分装成1ml每支，4-8℃运输或保存。
使用时，凝胶伴侣与重组人角质细胞生长因子1冻干粉溶解配制方法与生理盐水配制方法相同，配制后重组人角质细胞生长因子1浓度为50ng～100ug/ml。
试验例一重组人角质细胞对糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖的影响
1材料与方法
1.1主要试剂
RPMI1640培养基，新生小牛血清，Hyclone公司生产。MTT(噻唑蓝)Amresco公司生产。实施例1制备的重组人角质细胞生长因子(rhKGF-1)，由成都博发生物技术有限公司提供。
1.2主要仪器
电镜，日本电子公司JEM-1220透射电镜。酶标仪，美国450型酶联检测仪。
1.3细胞株
试验用糖尿病足溃疡处成纤维细胞由解放军总医院烧伤研究所赠送。
2方法
2.1成纤维细胞形态学观察
取对数生长期的单层生长细胞，用含0.3％新生小牛血清的RPMI1640培养液培养48小时，加入10ug/ml重组人角质细胞生长因子(对照空加入等体积溶媒)，20％小牛血清，培养24小时，弃液，用0.25％胰蛋白酶消化处理，离心、，加入2％戊二醛固定、脱水、包埋、切片、染色，然后电镜观察。
2.2MTT法测定成纤维细胞生长曲线
用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％新生小牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，以每孔2*105个细胞接种96孔板，每孔体积200ul。实验分5组，即第一组空白对照组、第二组阴性对照组，第3-5组分别为0.1、10、100ug/ml重组人角质细胞生长因子。培养7天，每组设复孔，在490nm处测定各孔光吸收值，取平均值；绘制生长曲线。
3结果
3.1重组人角质细胞生长因子1对成纤维细胞形态学影响
电镜观察结果显示，加入重组人角质细胞生长因子1后，成纤维细胞形态及超微结构发生变化；表现为核分裂相增加，胞浆内粗面内质网明显紧密，其中内容物增加，高尔基复合体增加(见图1)。
对照组，线粒体空泡变，粗面内质网疏松，扩张呈囊泡状(左)；加入重组人角质细胞生长因子，核分裂相增加，胞浆内粗面内质网明显紧密，其中内容物增加，高尔基复合体增加(右)。
3.2重组人角质细胞生长因子1对成纤维细胞生长曲线影响
生长曲线如图2：添加重组人角质细胞生长因子1的成纤维细胞其生长曲线最高，较对照组和阴性对照组明显增。以上结果说明重组人角质细胞生长因子促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖，有利于糖尿病足溃疡面愈合。
4结论
重组人角质细胞生长因子1显著刺激糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖，对糖尿病足溃疡创面具有促进愈合作用。
试验例二KGF1治疗糖尿病足部及腿部溃疡的临床观察
糖尿病足是糖尿病中晚期因神经病变和/或因双下肢缺血造成的足部病理状态，常合并感染，临床以肢体末端麻木、疼痛、感染、溃疡(烂)、坏疽，甚至指趾脱落为主要表现，是糖尿病患者，尤其是老年患者最痛苦的一种慢性并发症，也是老年患者致残、致死的主要原因之一。近年来糖尿病足溃烂和坏疽的发病率正在逐渐增加，已成为非创伤性截肢手术的首要原因【1】。目前医生们虽然尝试多种方法，包括中西药，来治疗糖尿病足部坏疽，但是效果都十分有限。使用KGF(角质细胞生长因子)外敷治疗糖尿病足部坏疽15例，效果优异，现报道如下。
1材料与方法
1.1一般资料
糖尿病足的诊断标准
按国际wagner的分级及1995年中华医学会第一届全国糖尿病足学术会制定的分级标准共分O V级：O级：肢端供血不足；I级：皮肤有开放性病灶；II级：感染病灶已侵犯深部肌肉组织；III级：肌腱韧带破坏；IV级：骨质缺损；V级：大部或全足坏疽，甚至累及踝关节和小腿【2】。
15例患者均为常规换药方法无效的病例，常用方法局部庆大霉素加中药外敷，外科清创等。男性8例，女性7例；年龄最大83岁，最小45岁；糖尿病史最长35年，最短2年，均为2型糖尿病患者。诊断分级病例：I级4例，II级4例，III级3例，IV级3例，V级1例。
1.2治疗方法
15例患者均使用胰岛素严格控制原发病血糖外，有感染灶者，根据局部坏疽的分泌物培养，选用敏感和足量的广谱抗生素。
局部治疗：凡有感染灶、溃烂坏疽者，外科清创去除溃烂坏疽，然后在创面上均匀涂抹5ug/ml或10ug/ml rhKGF1凝胶制剂，也可以按照相同的量使用冻干粉【冻干粉和凝胶剂的制备方法和使用方法见实施例1、3】，后用无菌纱布覆盖，前一周每天换药两次，一周后，每天换药一次，此后每周换药两次，疗程一个月，一个月时评价疗效。
1.3疗效判定标准
显效：7-15d溃烂伤口好转及愈合；
有效：10-20d伤口好转及愈合；
无效：在治疗30d内病情无好转，反而继续加重及恶化或15d以上局部伤口无变化者。
2结果
使用rhKGF1凝胶制剂后，全部病例足部坏疽情况好转，有效率100％，其中显效11例，有效率73.3％，有效27.7％。V级病例1例，曾经尝试多种治疗方法无效，患者考虑患肢切除，用rhKGF1之后1个月，创面40％以上有明显好转。使用rhKGF1凝胶制剂之后，所有病例1周之内小创面明显愈合，大创面渗液、溃烂有好转倾向，用药至1个月左右，大创面渗液、溃烂情况基本消失，逐渐形成新鲜肉芽肿，有愈合倾向。
3不良作用
使用rhKGF1凝胶制剂，患者未出现明显不良反应，耐受性良好。仅一例使用rhKGF1凝胶制剂2天后，有轻度皮肤瘙痒，继续用药后皮肤瘙痒消失，考虑与使用rhKGF1关系不大。
讨论
糖尿病足坏疽的病因复杂，可以由神经营养不良、动脉粥样硬化和外伤引起。糖尿病血管病变虽然广泛，但病理发展缓慢，有利于侧支循环的形成，若能在坏疽形成早期进行积极治疗，促进血管和表皮细胞的新生，能有效缓解或者治愈坏疽，有可能避免截肢。但遗憾的是，目前所使用的局部用药，如庆大霉素和胰岛素，虽然能够抑制局部细菌生长，却不能很好促进伤口愈合，而具有生肌作用的中药，往往具有疗效不佳，甚至因为使用过程中无菌工艺不佳，导致感染的副作用。
KGF1是人体自然分泌的生长因子，具有强效促进上皮细胞增生，和修复表皮创伤的作用，其冻干粉工艺可以保证无菌，因此在使用过程中无需担心感染等副作用。局部外用KGF1不但安全，而且起效十分迅速，使用方便，是目前治疗糖尿病足部坏疽的最佳选择。
参考文献
【1】荆丹清，马学毅，尹士男，胡景胜，白桦，孙艳.促进糖尿病足坏疽发生的危险因素：15年100例2型糖尿病足临床分析。中国临床康复，2006：10(36)：24
【2】李仕明.糖尿病足与相关并发病的诊治.第1版.北京：人民卫生出版社，2002，165-169
治疗糖尿病溃疡.ST25.txt
SEQUENCE LISTING
<110>成都博发生物技术有限公司
<120>人角质细胞生长因子1在制备治疗糖尿病足部及腿部溃疡的药物中的应用
<130>CD566-09P108073
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>140
<212>PRT
<213>重组人角质细胞生长因子1
<400>1
Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe
1 5 10 15
Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys
20 25 30
Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr
35 40 45
Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr
50 55 60
Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn
65 70 75 80
Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr
85 90 95
Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala
100 105 110
Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu
115 120 125
Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr
130 135 140