用于向肺脏递送药物的方法以及组合物.pdf

本发明提供了一种配置为用于吸入的药物组合物，该组合物包括一种表面活化剂与一种肺部活性药物的一种结合物。该表面活化剂具有对人类肺泡/气体界面的亲和力并且包括一种哺乳动物的肺表面活性物或它的一种模拟物的至少一个部分。本发明还提供了治疗患有一种肺病或处于患有一种肺病的风险中的受试者的一种方法，该方法包括以在肺中有效诱导一种药物效应的量将一种结合物通过吸入法给予该受试者，该结合物包括一种用于肺脏治疗的药物以及一种表面活化剂。

1.  一种配制为用于吸入的药物组合物，该组合物包括：
一种表面活化剂，其特征为对人类肺泡/气体界面的亲和力，所述表面活化剂包括对人类基本上无免疫原性的一种哺乳动物的肺表面活性多肽或者它的一种模拟物的至少一个部分；以及，
在所述活化剂共价地键合了，
一种肺部活性药物，该药物与一种可到达肺部的/气体界面的细胞外或细胞表面结合的靶相结合。

2.  如权利要求1所述的组合物，其中该活化剂包括一种肺表面活性物质、一种非人类哺乳动物的肺表面活性物质如一种猪或牛的肺表面活性物质、包括一种哺乳动物的肺表面活性多肽的一种缺失突变体或氨基酸置换突变体的一种模拟肽、或者它们的一个片段。

3.  如权利要求1所述的组合物，其中该活化剂包括一种哺乳动物的肺表面活性物质部分的多肽组分的一个合成的或者以重组方式产生的部分。

4.  如权利要求3所述的组合物，其中该活化剂包括SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、或它们的一个混合物中的至少一个部分。

5.  如权利要求3所述的组合物，其中该活化剂包括SP-B的至少一个部分，如来自SP-B的N端的25个氨基酸的区段。

6.  如权利要求1所述的组合物进一步包括一种脂类。

7.  如权利要求1所述的组合物，其中所述活化剂包括或者是衍生自从哺乳动物的肺脏中收集的一种哺乳动物的肺表面活性物质。

8.  如以上权利要求中的任一项所述的组合物，其中该肺部活性药物是选自下组，其构成为：一种弹性蛋白酶抑制剂、一种皮质类固醇、一种支气管扩张药、一种抗生素、以及一种化学治疗剂。

9.  如权利要求8所述的组合物，其中该肺部活性药物是一种选自下组的皮质类固醇，该组的构成为：倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、以及曲安西龙。

10.  如权利要求1至8中的任一项所述的组合物，其中该肺部活性药物是一种选自下组的支气管扩张药，该组的构成为：柳丁胺醇、沙丁胺醇、特布他林、非诺特罗、氢溴酸非诺特罗、利米特罗、瑞普特罗、吡布特罗、异丙肾上腺素、奥西那林、比托特罗、溴沙特罗、沙美特罗、沙美特罗昔萘酸酯、福莫特罗、富马酸福莫特罗、克仑特罗、丙卡特罗、异丙托铵、异丙托溴铵、噻托铵、噻托溴铵一水合物、氨茶碱、奥西那林、胆茶碱、硫酸特布他林、以及茶碱。

11.  如权利要求1至8中的任一项所述的组合物，其中该肺部活性药物是选自下组的一种抗生素，该组的构成为：阿莫西林、氨苄西林、巴氨西林、羧苄西林、卡茚西林、美洛西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、青霉素、氯唑西林、双氯西林、苯氧甲基青霉素、羧苄西林、甲氧西林、苯唑西林、青霉素G(苄星青霉素G、钾、普鲁卡因)、青霉素v、丙匹西林、依匹西林、环青霉素、哌拉西林加上三唑巴坦、替卡西林加上克拉维酸、萘夫西林、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢雷特、头孢西丁、头孢丙烯、头孢美唑、头孢呋辛、头孢呋辛酯、氯碳头孢、头孢地尼、头孢布烯、头孢托仑、头孢他美、头孢哌酮、头孢克肟、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、阿奇毒素、克拉霉素、克林霉素、地红霉素、红霉素、林可霉素、泰利霉素、醋竹桃霉素、氨曲南、多利培南、亚胺培南-西司他丁、美罗培南、阿米卡星、硫酸阿米卡星、庆大霉素、硫酸庆大霉素、卡那霉素、奈替米星、新霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素、巴龙霉素、达巴万星、奥利万星、替拉凡星、替考拉宁、万古霉素、地美环素、多西环素、美他环素、米诺环素、土霉素、四环素、金霉素、利奈唑胺、奎奴普丁加达福普汀、磺胺米隆、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、柳氮磺吡啶、磺胺、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、磺胺甲二唑、杆菌肽、氯霉素、多粘菌素E甲磺酸、磷霉素、异烟肼、乌洛托品、红霉素、甲硝唑、莫匹罗星、呋喃妥因、呋喃西林、新生霉素、多粘菌素B、大观霉素、甲氧苄啶、多粘菌素E、环丝氨酸、卷曲霉素、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸、琥乙红霉素加磺胺异噁唑、以及替加环素。

12.  如权利要求1至8中的任一项所述的组合物，其中该肺部活性药物是选自下组的一种化学治疗剂，该组的构成为：烷化剂、抗雌激素药、阿柔比星、放线菌素D、阿地白介素、阿来组单抗、阿利维A酸、别嘌醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、门冬酰胺酶、贝沙罗汀、比生群、博来霉素、白消安、BCNU(卡莫司汀)、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、塞来考昔、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、环氧合酶-2抑制剂、阿糖胞苷、CCNU(洛莫司汀)、达卡巴嗪、柔红霉素、道诺霉素、地尼白介素-毒素连接物、右雷佐生、地吖醌、多西他赛、阿霉素、表柔比星、阿法依伯汀、依索比星、雌莫司汀、依托泊苷(VP-16)、依西美坦、非格司亭、氮尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟维司群、半乳糖醇、吉西他滨、吉姆单抗、醋酸戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素α、干扰素γ、伊立替康、异丙铂、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑、氯尼达明、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、米托胍腙、苯丙酸南诺龙、诺莫单抗、氮芥、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、培加酶、培门冬酶、培非司亭、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、卟吩姆钠、丙卡巴肼、黄体酮、泼尼莫司汀、PCNU、米帕林、拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、链佐星、滑石、他莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷(VM-26)、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、乌拉莫司汀、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、以及唑来膦酸盐。

13.  如以上权利要求中的任一项所述的组合物，该组合物被安置在一个吸入装置中供一位人类患者使用。

14.  治疗患有一种肺病或者处在一种肺病的风险中的人的一种方法，该方法包括：
提供一种结合物，该结合物包括一种用于肺脏治疗的药物，该药物与一种表面活化剂共价地键合，该表面活化剂的特征为对人类肺泡/气体界面的一种亲和力，其中该表面活化剂包括对人类基本上无免疫原性的一种哺乳动物的肺表面活性多肽或者它的一种模拟物的至少一个部分；并且
将该结合物以在肺中有效诱导一种药物效应的量通过吸入法以给予这个人。

15.  如权利要求14所述的方法，其中与未结合的药物的吸入给药相比所述给药降低了该药物的系统性生物利用度。

16.  如权利要求14所述的方法，其中与未结合的药物的吸入给药相比所述给药增加了该药物在肺中的停留时间。

17.  如权利要求14所述的方法，其中重复该给药步骤每日一次，隔日一次、每三天一次、每五天一次、或每周一次。

18.  如权利要求14所述的方法，其中该给药步骤是使用一种吸入装置来实施的。

19.  如权利要求14所述的方法，其中所提供的结合物包括如权利要求1至13中的任一项所述的组合物。

20.  如权利要求1至12中的任一项所述的一种组合物用于制备一种治疗人类肺脏的一种疾病或病况的药物的用途。

用于向肺脏递送药物的方法以及组合物
相关申请
本申请要求对2007年6月5日提交的U.S序列号60/942,026的优先权，其全部内容通过引用结合在此。
背景
在肺部紊乱(包括慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、以及肺气肿)中存在着肺内外气流的慢性阻塞。在这些紊乱表现出的阻塞经常是永久性的并且随时间而发展。加重是呼吸功能的急性恶化，导致发病率和死亡率增加。
最近几十年来，对治疗慢性肺部病(如COPD)的研究集中于识别人类嗜中性细胞弹性蛋白酶(HNE)的抑制剂。HNE是一种能够降解多种蛋白质(包括结构蛋白质纤连蛋白、胶原、以及弹性蛋白)的蛋白酶。在被异常表达时，HNE是体内最具破坏性的酶类之一。HNE与组织的破坏和炎症有关并涉及多种肺部疾病，包括COPD、囊性纤维病、以及急性呼吸窘迫综合征(ARDS)连同身体的其他疾病。然而，HNE抑制剂的开发是困难的，并且尽管研究了数十年，目前市场上只有一种HNE治疗法被批准仅在日本使用。被设计用于肺脏治疗的HNE抑制剂以及其他药物的开发集中于全身治疗。这种方法的主要障碍(不论这种药物是以口服、肠胃外的方式、或是通过吸入法进行递送)是在肺脏中达到有意义的停留时间。因此，对于有效的肺脏治疗仍存有一种未满足的需求。

概述
本披露提供了用于向肺脏递送药物的方法和组合物。现在应当理解的是，与治疗肺病有关的一个关键问题是在肺脏中获得足够的活性药物分子的停留时间方法具有困难。肺脏非常擅于清除外源物质，这样使得在达到所希望的药物效果之前活性药物分子可能就从肺脏中被清除。
肺脏中的II型肺细胞分泌了肺表面活性物质来减小肺泡内的表面张力，因此在呼气过程中防止了肺泡塌陷。肺表面活性物质是一种脂类和蛋白质的复合物，它散布在肺泡表面以降低表面张力并且在肺脏中保持延长的时间。因此，可以通过将这种活性药物分子共价地连接到一种表面活性脂类或蛋白质上来增加活性药物分子在肺脏中的停留时间。对与一种表面活性脂类或蛋白质共价地连接的活性药物分子进行给药导致提供了在肺脏中增加的作用时间(导致基本上更低的剂量和更好的患者顺应性)、活性药物分子局限于肺脏(导致全身毒性降低)、以及显著更高的局部肺浓度用于增强疗效。
一方面，本发明提供了一种配制为用于吸入的药物组合物，该药物组合物包括对人类肺泡/气体界面具有亲和力的一种表面活化剂。这种表面活化剂包括对人类基本上没有免疫原性的一种哺乳动物的肺表面活性多肽或其模拟物的至少一个部分。
这种表面活化剂与一种肺部活性药物共价地键合，该药物与一种可到达肺部的/气体界面的细胞外或细胞表面的靶进行结合。通过举例，这种细胞外或细胞表面的靶可以是弹性蛋白酶、TNF受体、EGF受体、肾上腺素能受体、或者P2X嘌呤能受体。在某些实施方案中，将与一种肺部活性药物(该药物与一种细胞外或细胞表面的靶进行结合)共价地键合的表面活化剂给予一位患有肺病的患者，这些肺病包括但不限于结核、哮喘、以及肺癌。例如，在巨噬细胞内负责针对结核(TB)的活化剂通过下调凋亡避免了破坏并影响了的细胞内增殖。携带TB的巨噬细胞将P2X嘌呤能受体过量表达(Placido et al.，Cell Immunol.244：10-8(2006))。P2X激动剂(如ATP)在这些巨噬细胞中会诱导凋亡并因此杀死寄生的TB(Pfeiffer et al.，J.Leukoc.Biol.75：1173(2004))。ATP的苯甲酰基衍生物是有力的P2X受体的细胞外激动剂，并且能够被共价地连接到表面活化剂上并作为一种长时间的TB治疗法通过吸入法得以递送。β2-肾上腺素能受体的激动剂是被很好确认的用于治疗哮喘的支气管扩张药(Anderson，Clin.Rev.Allergy Immunol.31：119-30(2006))。然而，这种β2-肾上腺素能受体表达广泛，并且因此重复给药可能会具有有害的全身性副作用。将一种β2-肾上腺素能受体激动剂与一种表面活性肽共价地连接实质上将这种活性剂隔离到肺上，因此避免或减小了潜在的全身性毒性。表皮生长因子受体(EGFR)已被证实是一种抗癌靶(Carney，Expert Rev.Mol.Diagn.7：309-19(2007))，具有的产品是如上市的治疗乳癌的赫赛汀。基质金属蛋白酶已显示通过一种细胞表面脱落机制来释放EGFR的内源性激动剂(Horiuchi et al.，Mol.Biol.Cell 18：176-188(2007))。抑制EGFR的激活是针对非小细胞肺癌的一种潜在的治疗(Y.H.Ling et al.，Molecular Pharmacology72：248-58(2007))。通过将MMP的一种或多种小分子抑制剂附连到肺表面活性肽上以便通过吸入而进行递送，可以使EGFR失活。这些例子(包括肺气肿、结核、哮喘、以及非小细胞肺癌)证实了将治疗性分子与以吸入递送而优先停留在肺脏中的活化剂共价地连接的普遍性。
在另一个实施方案中，将这种表面活化剂与一种肺部活性药物以及进入这些肺细胞的一种细胞膜可渗透性运输分子共价地键合。在细胞内发挥作用的活化剂包括但不限于类视黄醇类、存活蛋白抑制剂类、以及半胱天冬蛋白酶启动子类(caspase promoters)。
在另一个实施方案中，这种表面活化剂包括一种人类肺表面活性物质或一种非人类的哺乳动物的肺表面活性物质或它一个片段(fraction)。示例性的非人类的哺乳动物的肺表面活性物质包括牛、猪、或绵羊的肺表面活性物质、或它们的一个片段。这种活化剂可以包括或衍生自从人类或非人类的哺乳动物的肺脏中收集到的一种哺乳动物的肺表面活性物质。
在另一个实施方案中，这种表面活化剂包括一种哺乳动物的肺表面活性多肽、它的一种等位基因变异体、或它的一种合成模拟物的至少一个部分。这种活化剂可以包括一种天然的表面活性多肽，如SP-A、SP-B、SP-C、SP-D，它们的多个部分，或它们的混合物。这种活化剂可以包括一种SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、或它们的多个部分的混合物。示例性的肽包括一种天然的表面活性多肽的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸的区段。这种表面活化剂可以包括SP-B的至少一个部分。示例性的SP-B多肽包括SP-B的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸的区段。SP-B肽可以是一种氨基端肽或一种羧基端肽。一种示例性的SP-B肽可以是一种25个氨基酸的氨基端肽。
在另一个实施方案中，这种表面活化剂包括一种以合成方式所产生的肽。模拟肽(peptidomimetic)可以包括一种哺乳动物的肺表面活性多肽的至少一种缺失突变体或氨基酸置换突变体。模拟肽可以包括一种人类肺表面活性多肽的至少一种缺失突变体或氨基酸置换突变体。
在另一个实施方案中，这种表面活化剂可以包括一种以重组方式所产生的表面活性多肽。在一种原核或真核的表达系统中通过表达对SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、或它们的一个部分进行编码的DNA，可以产生一种重组的哺乳动物的肺表面活性多肽，如SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、或它们的一个部分。重组的表面活性多肽可以与哺乳动物的肺表面活性多肽相同或不同。重组的多肽可以包括一种哺乳动物的(优选是人的)肺表面活性多肽的至少一种缺失突变体或氨基酸置换突变体。
在另一个实施方案中，这种表面活化剂包括一种表面活性多肽和一种脂类。这种表面活化剂被共价地键合到一种肺部活性药物上。可以将这种肺部活性药物与一种表面活性蛋白或脂类共价地连接。可以将这种肺部活性药物与一种表面活性多肽的氨基端或羧基端的氨基酸或一个内部的氨基酸共价地键合。在某些实施方案中，将多于一种的肺部活性药物与一种表面活化剂相结合。在其他的实施方案中，将一种单独的肺部活性药物与一种表面活化剂相结合，并且将该肺部活性药物与结合到一种表面活化剂上的至少一种其他的肺部活性药物相混合。
在一个实施方案中，这种肺部活性药物分子用一种氨基酸或模拟的连接物(linker)(如甘氨酸连接物)得到扩展，以便创造出一种可在自动的肽合成中使用的非天然的氨基酸。然后，这种经扩展的分子(即药物加上这种氨基酸连接物)可以通过一个氨基或羟基的基团被附连至这种表面活化剂上。这种肺部活性药物与一种可到达肺部的/气体界面的细胞外或细胞表面结合的靶进行结合。这种肺部活性药物可以是一种弹性蛋白酶抑制剂、皮质类固醇、支气管扩张药、抗生素、或者化学治疗剂。在某些实施方案中，多于一种的肺部活性药物可以与一种表面活化剂共价地键合并且进行联合给药。当多于一种的肺部活性药物与一种表面活化剂共价地键合时，该药物可以是相同的药物、相同药物类别的一员、或者一个不同的药物类别的一员。
这种药物组合物通过一个吸入装置被递送至一位人类患者的肺脏。示例性吸入装置包括剂量固定的吸入器类、定量吸入器类(metered dose inhalers)、以及喷雾器类。
另一方面，本发明提供了一种治疗患有肺病或者处于肺病风险的受试者的方法。这种方法包括给予一种结合物，该结合物包括与一种表面活化剂共价地键合的一种肺部活性药物，该表面活化剂的特征为对人类肺泡/气体界面的一种亲和力，其中该表面活化剂包括对人类基本上无免疫原性的一种哺乳动物的肺表面活性多肽或它的一种模拟物的至少一个部分。这种结合物是通过吸入法以在肺中有效诱导一种药物效应的量给予这位受试者的。
这种给药法方法将这种肺部活性药物靶向至需要该药物的受试者的肺脏。与吸入给予一种未结合的药物相比，这种给药方法降低了药物的系统性生物利用度。与吸入给予一种未结合的药物相比，这种给药方法增加了药物在肺脏中的停留时间。
在一个实施方案中，与给予一种未结合的药物相比，给予一种肺部活性药物-表面活性剂结合物降低了给药频率。可以重复该给药步骤每日一次、隔日一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、或者每周一次。这种给药步骤可使用一个吸入器、一种气溶胶、具有或没有推进剂的微粒、计量的剂量、或一个喷雾器来进行。
在某些实施方案中，需要治疗的受试者正患有肺部炎症或疾病或者正处于患有肺病的风险之中。需要治疗的受试者可能患有肺气肿、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPO)、哮喘、呼吸性窘迫紊乱(respiratory distressdisorder)(RDS)、肺炎、结核或者其他的细菌性感染、囊性纤维病、和/或肺癌。
附图简要说明
图1A示出了编码人表面活性蛋白A的核酸序列(SEQ ID NO：1)。图1B示出了人表面活性蛋白A的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图2A示出了编码人表面活性蛋白B的核酸序列(SEQ ID NO：3)。图2B示出了人表面活性蛋白B的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。图2C示出了成熟的人表面活性蛋白B的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
图3A示出了编码人表面活性蛋白C的核酸序列(SEQ ID NO：6)。图3B示出了人表面活性蛋白C的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。图3C示出了成熟的人表面活性蛋白C的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图4A示出了编码人表面活性蛋白D的核酸序列(SEQ ID NO：9)。图4B示出了人表面活性蛋白D的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。图4C示出了成熟的人表面活性蛋白D的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。
图5A示出了编码牛表面活性蛋白A的核酸序列(SEQ ID NO：12)。图5B示出了牛表面活性蛋白A的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。
图6A示出了编码牛表面活性蛋白B的核酸序列(SEQ ID NO：14)。图6B示出了牛表面活性蛋白B的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。
图7A示出了编码牛表面活性蛋白C的核酸序列(SEQ ID NO：16)。图7B示出了牛表面活性蛋白C的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。
图8A示出了编码牛表面活性蛋白D的核酸序列(SEQ ID NO：18)。图8B示出了牛表面活性蛋白D的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。
图9A示出了编码猪表面活性蛋白A的核酸序列(SEQ ID NO：20)。图9B示出了猪表面活性蛋白A的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。
图示出了编码一个部分的猪表面活性蛋白B的核酸序列(SEQ ID NO：22)。图10B示出了猪表面活性蛋白B的一个部分氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。
图11A示出了编码猪表面活性蛋白C的核酸序列(SEQ ID NO：24)。图11B示出了猪表面活性蛋白C的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。
图12A示出了编码猪表面活性蛋白D的核酸序列(SEQ ID NO：26)。图12B示出了猪表面活性蛋白D的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。
图13A示出了编码绵羊表面活性蛋白A的核酸序列(SEQ ID NO：28)。图13B示出了绵羊表面活性蛋白A的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。
图14A示出了编码绵羊表面活性蛋白B的核酸序列(SEQ ID NO：30)。图14B示出了绵羊表面活性蛋白B的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。
图15A示出了编码绵羊表面活性蛋白C的核酸序列(SEQ ID NO：32)。图15B示出了绵羊表面活性蛋白C的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。
图16A示出了编码一个部分的绵羊表面活性蛋白D的核酸序列(SEQ ID NO：34)。图16B示出了绵羊表面活性蛋白D的一个部分氨基酸序列(SEQ IDNO：35)。
图17是描绘示例性的人类嗜中性细胞弹性蛋白酶(HNE)抑制剂的表格。在该表格中列出的参考号对应于在Philip D.Edwards and Peter R.Bernstein in“Synthetic Inhibitors of Elastase，”Medicinal Research Reviews，Vol.14，No.2，127-194(1994)中所提到的化合物识别号。
图18是描绘一种代表性的肺气肿抑制剂的化学合成的示意图。所示出的肺气肿抑制剂包含一种甘氨酸连接物。这种甘氨酸连接物(画圈的)将该化合物转化为一种非天然的氨基酸，在一个标准的肽合成反应中这种非天然的氨基酸可用于共价偶联至SP-B的N端1至25个氨基酸上。
图19是描绘了作为HNE抑制剂而使用的示例性的靶的表格。附连至人表面活性B肽的最初25个残基的N端的靶2形成了靶C。类似地，附连至人表面活性B肽的最初25个残基的N端的靶3形成了靶B。
详细说明
表面活性蛋白
这种表面活化剂包括对人类基本上没有免疫原性的一种哺乳动物的肺表面活性多肽的至少一个部分。这种多肽或其部分可以是一种哺乳动物的肺表面活性物质部分(moiety)或它的一种合成的模拟物。示例性的表面活性多肽可以是由动物衍生的、重组的、合成的、类似物、或者肽模拟物。
天然的肺表面活性蛋白包括单独或与脂类相组合的SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、或它们的多个部分(美国专利号5,302,581)。在一些实施方案中，这种表面活化剂包括全长的表面活性多肽。在其他实施方案中，这种表面活化剂包括一种表面活性多肽的一个部分。例如，人SP-B是一种79个氨基酸残基的多肽，然而，SP-B的N端25个氨基酸残基具有可与整个肽进行比较的治疗效果(Kurutz and Lee，Biochem.，41，9627-36(2002))。天然的肺表面活性蛋白的示例性的肽的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸。人SP-B的示例性肽示于表1中。
在一个实施方案中，这种表面活化剂包括通过尸检时对人类尸体进行肺灌洗或通过对征得同意的成年人进行肺灌洗而获得的人肺脏表面活性物质。在某些实施方案中，这种表面活化剂包括一种非人类的哺乳动物的肺表面活性物质或它的一个片段。示例性的非人类的肺表面活性物质包括牛、猪、或绵羊的肺表面活性物质或它的一个片段。这种非人类的表面活性物质可以使用本领域熟知的技术从一种非人类的哺乳动物的肺脏中进行收集。例如，猪表面活性物质可以从新生仔猪和/或成年猪中用盐水收集肺脏的支气管肺泡灌洗(BAL)而获得，如在Bernhard et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.17：41-50(1997)中所说明，该文献通过引用结合在此。将所收集的BAL液体离心以除去细胞，然后将不含细胞的BAL液体进一步离心以产生一种粗制的表面活性物质小粒。绵羊表面活性物质可以从成年绵羊的全肺灌洗中获得，如由Brackenbury et al.，Am.J.Respir Cir.Care Med.163：1135-1142(2001)所说明，该文献通过引用结合在此。将所收集的肺泡灌洗液离心以除去细胞碎片，随后通过进一步离心获得一种与肺表面活性物质聚集小粒相对应的小粒。牛表面活性物质也可以从成年牛的全肺灌洗中获得，如由Panda等人(J ColloidInterface Sci.，311：551-5(2007))所说明，该文献通过引用结合在此。还可以使用它是一种天然牛表面活性物质提取物，包含磷脂类、中性脂类、SP-B和SP-C多肽。
还可以使用从这些人类肺表面活性物质中衍生的或与其具有相似的特性的蛋白质和多肽。例如，可以使用微分有机萃取、柱色谱法、和/或制备性SDS-PAGE将SP-B从牛表面活性物质中分离出来，如由Beers et al.，Am.J.PhysiolLung Cell Mol.Physiol.262：L773-L778(1992)所说明，该文献通过引用结合在此。
这些哺乳动物的肺表面活性多肽或其部分还可以通过重组的方式进行生产。通过使用不同的已知技术在一种适宜的原核或真核的表达系统中表达对SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、或它们的一个部分进行编码的DNA序列，重组的SP-A、SP-B、SP-C、SP-D、或它们的一个部分是可以获得的。重组载体(很容易将它们调适为包括一个分离的核酸，该核酸对一种表面活性多肽或它的一个部分进行编码)、包含这些重组载体的宿主细胞、以及制造此类载体和宿主细胞的方法连同通过重组技术将它们用于生产这些所编码的多肽的方法是熟知的。可以在一个表达载体中提供对一种表面活性多肽或它的一个部分进行编码的核酸，该表达载体包括对一种表面活性多肽进行编码的核苷酸序列，该核苷酸序列与至少一种调节序列可操作地连接。应当理解的是，这种表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择和/或希望被表达的蛋白质的类型的因素。应当考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、以及由该载体进行编码的任何其他蛋白质(如抗生素标记物)的表达。可以使用这些主题核酸来引起在培养系中繁殖的细胞内一种激酶或磷酸酶多肽的表达和过量表达(例如)来产生蛋白质或者多肽，包括融合蛋白或融合多肽。
可以用一种重组基因转染宿主细胞以便对一种表面活性多肽或其部分进行表达。这种宿主细胞可以是任何一种原核或真核的细胞。例如，多肽可表达于细菌的细胞中，如大肠杆菌、昆虫细胞(杆状病毒)、酵母、或哺乳动物细胞。在这些例子中，当这种宿主细胞是人的细胞时它可在或不在一位活着的受试者中。其他适宜的宿主细胞对于本领域的普通技术人员而言是已知的。额外地，这种宿主细胞可以补充有在该宿主中并非典型地发现的tRNA分子以便将这种多肽的表达优化。适宜于使这种多肽的表达最大化的其他方法对于本领域的技术人员而言将是已知的。
生产多肽的方法在本领域内是熟知的。例如，可以在适当条件下培养用编码了一种表面活性多肽或其部分的表达载体进行转染的宿主细胞以允许该多肽的表达发生。这种多肽可以从包含该多肽的细胞与培养基的混合物中分泌并分离出来。可替代地，这种多肽可以通过细胞质的方式得以保留。然后，将细胞收集，溶解，并且将这种蛋白质从细胞溶解产物中分离出来。
细胞培养物包括宿主细胞、培养基、以及其他的副产物。对于细胞培养而言适宜的培养基在本领域内是熟知的。使用本领域已知的用于纯化蛋白的技术可以将这种多肽从细胞培养基、宿主细胞、或二者中分离出来，这些用于纯化蛋白的技术包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析法、凝胶过滤层析法、磷酸纤维素层析法、疏水作用层析法、亲和层析法、羟基磷灰石层析法、凝集素层析法、超滤法、电泳、用对本发明的多肽的特定表位具有特异性的抗体进行的免疫亲和纯化，并且采用高效液相层析法(“HPLC”)用于纯化。因此，可以使用编码了一种表面活性多肽的所有或一个选定的部分的核苷酸序列通过微生物的或真核的细胞方法来生产这种蛋白质的一个重组体形式。标准的步骤是将该序列连接到一个多核苷酸构建体(如一个表达载体)上，并转化或转染至宿主(无论真核(酵母、禽、昆虫、或者哺乳动物)的或原核(细菌细胞)的宿主)中。可以采用类似的步骤或其变更通过微生物手段或组织培养技术来制备本发明的重组多肽。用于产生重组蛋白的表达载体包括质粒和其他载体。例如，用于表达本发明的一种多肽的适宜的载体包括以下类型的质粒：用于在真核细胞(如大肠杆菌)中表达的由pBR322衍生的质粒、由pEMBL衍生的质粒、由pEX衍生的质粒、由pBTac衍生的质粒、以及由pUC衍生的质粒。
在某些实施方案中，哺乳动物表达载体包含促进该载体在细菌中繁殖的原核序列，以及在真核细胞中表达的一种或多种真核转录单位。由pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo、以及pHyg衍生的载体是适宜转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。用来自细菌质粒(如pBR322)的序列对这些载体中的一些进行修饰以促进在原核和真核的细胞中的复制和抗药性选择。可替代地，可以将病毒(如牛乳头瘤病毒(BPV-I)或爱泼斯坦-巴尔病毒(pHEBo、由pREP衍生、以及p205))的衍生物用于在真核细胞中蛋白的瞬时表达。在这些质粒的制备以及宿主有机体的转染中所采用的不同的方法在本领域内是已知的。对于原核和真核细胞的其他适宜的表达系统连同总体的重组步骤，参见由Sambrook、Fritsch、以及Maniatis编著的分子克隆实验指南第二版(冷泉港实验室，1989)的第16章和17章。在某些情况中，通过使用一种杆状病毒表达系统来表达重组蛋白可能是可取的。此类杆状病毒表达系统的例子包括由pVL衍生的载体(如pVL1392、pVL1393、以及pVL941)、由pAcUW衍生的载体(如pAcUW1)、以及由pBlueBac衍生的载体(如包含[β]-半乳糖苷酶([beta]-gal)的pBlueBac III)。在另一个实施方案中，蛋白质的产生可以使用体外翻译系统来实现。总体而言，体外翻译系统是一种无细胞的提取物的翻译系统，该提取物包含将一个RNA分子翻译成一个蛋白质所必需的至少最小量的元件。体外翻译系统典型地包括至少核糖体、tRNA、起始物甲硫氨酰基-tRNAMet、参与翻译的蛋白质或复合物，例如eIF2、eIF3、帽结合(CB)复合物(包括帽结合蛋白(CBP)和真核起始因子4F(eIF4F))。多种体外翻译系统在本领域内是熟知的并且包括可商购的试剂盒。体外翻译系统的例子包括真核的裂解物，如兔的网织红细胞裂解物、兔的卵母细胞裂解物、人的细胞裂解物、昆虫的细胞裂解物、以及麦胚抽提物。裂解物可以从制造商处通过商购而获得，这些制造商如Promega Corp.，Madison，Wis.；Stratagene，La Jolla，Calif.；Amersham，Arlington Heights，IU.；以及GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y。体外翻译系统典型地包括大分子(如酶)；翻译、起始和延伸的因子；化学试剂；以及核糖体。此外，可以使用一种体外转录系统。此类系统典型地包括至少一种RNA聚合酶全酶、核糖核苷酸、以及任何必需的转录起始、延伸和终止的因子。可在一锅法反应(one-pot reaction)中将体外转录和翻译进行结合以便从一种或多种经分离的DNA中生产蛋白质。当多肽的一个羧基端区段的表达是所希望的时(即，一个平截突变体)，可能有必要将一个起始密码子(ATG)加至包含有待表达的所希望的序列的寡核苷酸片段中。在本领域内熟知的是，在N端位置的一个甲硫氨酸可通过使用甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)这种酶进行酶切。MAP已经从大肠杆菌(Ben-Bassat et al.，(1987)JBacteriol.169：751-757)和鼠伤寒沙门菌中克隆出来，并且其体外活性已经展示在重组的蛋白质上(Miller et al.，(1987)PNAS USA 54：2718-1722)。所以，如果希望的话，去除N端的甲硫氨酸可以在体内通过在产生MAP的宿主(例如，大肠杆菌或CM89或酿酒酵母(S.cerevisiae))中对此类重组多肽进行表达，或者在体外通过使用经纯化的MAP(例如，Miller等人的步骤)来实现。
本发明的多肽还可以经受不同的变化，如插入、缺失、以及置换(保守的或非保守的)，其中此类变化提供了在多肽的使用中的某些优势。保守性置换是以下置换，其中一个氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基替换。保守性置换的例子包括将一个疏水性残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、或者甲硫氨酸)置换成另一个，或者将一个极性残基置换成另一个，如在精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酸与门冬氨酸之间、或者在谷氨酰胺与天冬酰胺之间，以及类似情况。术语“保守性置换”还包括将一种经置换的氨基酸代替一种未经置换的母氨基酸的使用，条件是这种多肽也展示出必要的结合活性。与全长成熟的多肽相比，本发明的多肽还可以被截短。多肽可以在氨基端、羧基端、或者在这两端被截短。多肽可以被截短至少一个氨基酸，或至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、或70个氨基酸。哺乳动物的肺表面活性多肽或它的一个部分可以通过多肽领域内的普通技术人员所已知的技术从氨基酸中进行合成。多种可供使用的技术的概述可以在以下文献中发现：针对固相肽合成的J.M.Steward and J.D.Young，″SolidPhase Peptide Synthesis″，W.H.Freeman Co.，San Francisco，1969，以及J.Meienhofer的″Hormonal Proteins and Peptides″，Vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1983，以及针对经典的溶液合成的E.Schroder and K.Kubke，″ThePeptides″，Vol.1，Academic Press(New York)，1965。
总体而言，这些方法包括将一种或多种氨基酸残基或适当地受保护的氨基酸残基顺序地加到一个增长的肽链上。通常，第一个氨基酸残基的氨基或羧基基团由一个适宜的、可选择性移去的保护性基团进行保护。对包含一个反应性侧基(例如赖氨酸)的氨基酸使用了一个不同的、可选择性移去的保护性基团。
使用固相合成作为一个例子，将这种受保护的或衍生的氨基酸通过其未受保护的羧基或氨基基团附连至一个惰性的固相支撑体上。然后，将这个氨基或羧基基团的保护性基团选择性地移去，并且将在该序列中使该互补性(氨基或者羧基)基团受到适当保护的下一个氨基酸与已附连至这种固相支撑体上的残基进行混合并在适宜形成酰胺键的条件下进行反应。然后，将这个氨基或羧基基团的保护性基团从这个新加入的氨基酸残基上移去，并接着加入下一个氨基酸(受到适当保护)，并如此继续。在所有所希望的氨基酸被连接在适当的序列中之后，将任何一种剩余的端基和侧基的保护性基团(以及任何一种固相支撑体)顺序地或同时地移去，以便提供最终的多肽。然后，这种多肽通过溶解在低级脂肪醇中而进行洗涤并干燥。可通过已知的技术对已干燥的表面活性多肽进行进一步纯化，如果希望的话。
在某些实施方案中，可以使用常用的方法，如α-氨基基团的t-BOC或f-MOC保护。这两种方法均涉及分步合成，从而从该肽的C端开始在每个步骤中加入一个单一氨基酸(参见，Coligan et al.，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，Unit 9)。本发明的肽可以(例如)通过在Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149，1962，以及Stewart and Young，1969，Solid PhasePeptides Synthesis，pp.27-62中所说明的熟知的固相肽合成方法，使用一种含有0.1至1.0mMol胺/g聚合物的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)进行合成。当化学合成完成时，可以通过在0℃下用液态的HF-10％茴香醚处理大约1/4至1小时将这些肽脱保护并且从该聚合物中切割出来。在试剂蒸发之后，用1％醋酸溶液将这些肽从该聚合物中提取出来，然后将醋酸溶液冻干以产生粗制材料。通常，这可通过诸如在Sephadex G-15上使用5％醋酸作为溶剂进行凝胶过滤的技术来进行纯化。对柱子的适当馏分进行冷冻干燥将产生均匀的肽或肽衍生物，然后它可通过以下标准的技术进行表征，如氨基酸分析、薄层色谱分析法、高效液相色谱法、紫外线吸收分光法、摩尔旋光、溶解度，并且通过固相埃德曼降解进行定量。
在一个实施方案中，重组的和/或合成的SP-B肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸2、4、6、以及9。SEQ ID NO：5的脯氨酸2、4、以及6和色氨酸9可以组成针对蛋白质功能所必需的结构基序。在一些实施方案中，SP-B肽可以在任何氨基酸残基处被取代，除了色氨酸9氨基酸(相对于SEQ ID NO：5)。肺表面活性多肽的模拟物通常是一种多肽，将该多肽进行工程化以便模拟人类表面活性蛋白的本质性属性。一个示例性模拟的肽模拟物是SP-B。SP-B模拟物的一个实例是KL4，一种21个氨基酸残基的多肽(包括序列KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO：94))。这种SP-B模拟蛋白也称为Lucinactant(Discovery Laboratories)。
表面活性脂类
在某些实施方案中，在本发明中使用的一种表面活化剂包括与体内天然表面活性脂类有关的一种表面活性蛋白、它的一个部分、或它的一种混合物。在其他的实施方案中，在本发明中使用的一种表面活化剂包括一种脂类或一种脂类-蛋白复合物。
天然的哺乳动物的肺表面活性物质是一种磷脂、中性磷脂、以及蛋白质的复合物。在此处披露的本发明中使用的表面活化剂可以包括一种或多种脂类。在某些实施方案中，这种表面活化剂可以包括(例如)从少到约0.05至100％重量百分比的脂类，只要得到的组合物具有表面活性物质活性。提及重量百分比是指在一种按重量计的组合物中一种按重量计的化合物的百分比。因此，一种具有50重量百分比的脂类的组合物(例如)每100克总的组合物包含50克脂类。一种表面活化剂可以包含0.1至50重量百分比的脂类，尽管可以使用更高浓度的脂类。所以，既包含磷脂又包含一种表面活性多肽或其部分的表面活化剂可以包含0.1、1、10、50、80、至几乎100重量百分比的脂类以及大约50、20、10、至小于1重量百分比的表面活性多肽。可替代地，表面活化剂可以包含相反比例的脂类与表面活性多肽。
在此使用的术语“脂类”是指一种天然发生的、合成的、或半合成(即，改性的天然品)的化合物，该化合物通常是两亲的。这种脂类典型地包括一个亲水成分和一个疏水成分。示例性的脂类包括但不限于磷脂类、脂肪酸类、脂肪醇类、中性脂肪类、磷脂类、油类、糖脂类、脂肪醇类、蜡类、萜类、以及类固醇类。短语半合成的(或改性的天然品)表示一种通过某种方式已进行化学改性的化合物。
磷脂类的例子包括自然的和/或合成的磷脂类。可以使用的磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱类(饱和的以及不饱和的)、磷脂酰甘油类(phospatidylglycerols)、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰丝氨酸类、磷脂酸类、磷脂酰肌醇类、鞘脂类、二酰基甘油酯类、心磷脂、神经酰胺类、脑苷脂类、以及类似物。示例性的磷脂类包括但不限于二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)(C12:0)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)(C14:0)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二植烷酰磷脂酰胆碱(diphytanoyl phosphatidylcholine)、十九酰磷脂酰胆碱、花生酰基磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)(C18:1)、二棕榈油酰磷脂酰胆碱(C16:1)、亚油酰磷脂酰胆碱(C18:2)、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、硬脂酰(steroyl)肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(SMPC)、硬脂酰棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰棕榈油酰基(palmitooleoyl)磷脂酰胆碱(PPoPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷酯酰丝氨酸(DMPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、棕榈酰油酰磷酯酰丝氨酸(POPS)、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、以及蛋磷脂酰胆碱(EPC)。脂肪酸类和脂肪醇类的例子包括但不限于甾醇、棕榈酸、十六醇、月桂酸、肉豆寇酸、硬脂酸、植烷酸、二棕榈酸(dipamlitic acid)、以及类似物。示例性的脂肪酸包括棕榈酸。
示例性的脂肪酸酯类包括但不限于棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、棕榈酸异丙酯、胆甾醇棕榈酸酯、棕榈酸棕榈酯(palmityl palmitate)、棕榈酸钠、棕榈酸钾、棕榈精、以及类似物。
表面活性多肽和表面活性脂类通过流体静力的相互作用进行相互作用。带电荷的氨基酸与这些脂类的极性头部基团(head group)相互作用，并且疏水性氨基酸与磷脂酰基的侧链相互作用。例如，SP-B和SP-C是疏水性蛋白质。SP-B和SP-C均优先地结合阴离子的脂类(如磷脂酰甘油(PG))而不结合DPPC。SP-A和SP-D是亲水性蛋白质并且与广泛的两亲性脂类相互作用，这些两亲性脂类包括甘油磷脂类、鞘磷脂类、糖鞘脂类、类脂A、以及脂聚糖类。SP-A结合DPPC。通过举例，对于SP-B模拟物、KL4、以及天然表面活性剂中的脂类或在表面活化剂中所包括的脂类观察到了流体静力的相互作用。例如，KL4肽中的赖氨酸残基与DPPC的带电荷的头部基团相互作用，并且疏水性的亮氨酸残基与磷脂酰甘油的磷脂酰基侧链相互作用。
在某些实施方案中，如在此披露的一种药物组合物包括一种表面活化剂(该表面活化剂包括一种哺乳动物的肺表面活性多肽或其模拟物的一个部分)，并且不额外包括一种脂类或脂类的混合物。通过吸入法进行给药的药物组合物包括表面活化剂，这些表面活化剂仅包括一种哺乳动物的肺表面活性多肽或其模拟物的一个部分，这种药物组合物可以通过流体静力学的相互作用与肺脏中的天然表面活性剂进行相互作用。例如，通过结合阴离子的磷脂类(如磷脂酰甘油)，重组的SP-B可以与肺脏中的天然表面活性剂相互作用。在其他的实施方案中，如在此披露的一种药物组合物包括一种表面活化剂，该表面活化剂包括一种哺乳动物的肺表面活性多肽或其模拟物的一个部分、以及至少一种脂类。为了促进包括一种多肽或其模拟物以及至少一种脂类的药物组合物吸收至肺脏中的天然表面活性剂中，可以使用模拟在天然表面活性剂中发现的那些磷脂单层的磷脂(phopholipid)单层。示例性的脂类混合物包括二棕榈酰磷脂酰胆碱/棕榈酰油酰磷脂酰甘油，例如比例为7∶3的重量/重量。可以将哺乳动物的肺表面活性多肽插至该磷脂(phosphoplipid)单层中，并且在吸入之后将这种蛋白质/脂类的混合物吸收至在肺脏中的肺泡/气体界面处的天然表面活性剂中。
肺部活性药物
肺部活性药物可包括但不限于弹性蛋白酶抑制剂类、皮质类固醇类、支气管扩张药类、抗生素类、以及化学治疗的酸类。
示例性的弹性蛋白酶抑制剂类包括在图17中示出的化合物。其他示例性的弹性蛋白酶抑制剂包括由Philip D.Edwards and Peter R.Bernstein in“SyntheticInhibitors of Elastase，”Medicinal Research Reviews，Vol.14，No.2，127-194(1994)所说明的化合物，该文献通过引用结合在此。可以将两种或多种弹性蛋白酶抑制剂与本发明的一种表面活化剂进行连接，并进行联合给药。可替代地，可以将一种弹性蛋白酶抑制剂与一种表面活化剂进行连接，并且将该弹性蛋白酶抑制剂与连接至一种表面活化剂上的第二种弹性蛋白酶抑制剂进行联合给药。
可以被递送到肺脏的示例性的皮质类固醇类包括但不限于阿氯米松、醛固酮、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、环索奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、可的松、可的伐唑、地夫可特、脱氧皮质酮、地奈德、去羟米松、去氧皮质酮、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、氟氯奈德(fluclorolone)、氟氢可的松、氟氢缩松、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、氟替卡松、福莫可他、哈西奈德、卤米松、氢化可的松(hydrocortisone)/考的索(cortisol)、醋丙氢可的松、氢化可的松丁丙酸酯、氢化可的松丁酸酯、氯替泼诺、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、醋丙甲泼尼龙、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松、泼尼松龙、泼尼立定、利美索龙、替可的松、曲安西龙、以及乌倍他索。可以将两种或多种皮质类固醇与本发明的一种表面活化剂进行连接，并进行联合给药。可替代地，可以将一种皮质类固醇与一种表面活化剂进行连接，并且将该皮质类固醇与连接至一种表面活化剂上的第二种皮质类固醇进行联合给药。肺部活性药物还可包括支气管扩张药类，如短效的β2-肾上腺素能受体激动剂、长效的β2-肾上腺素能受体激动剂、短效的抗胆碱能药、以及长效的抗胆碱能药。非限制性的短效的β2-肾上腺素能受体激动剂类包括柳丁胺醇(salbutamol)或沙丁胺醇(albuterol)、特布他林、非诺特罗、氢溴酸非诺特罗、利米特罗、瑞普特罗、吡布特罗、异丙肾上腺素、奥西那林、比托特罗、以及溴沙特罗。非限制性的长效的β2-肾上腺素能受体激动剂类包括沙美特罗、沙美特罗昔萘酸酯、福莫特罗、富马酸福莫特罗、克仑特罗、以及丙卡特罗。非限制性的短效的抗胆碱能药类包括异丙托铵、异丙托溴铵、氧托铵(oxitropium)及其盐。非限制性的长效的抗胆碱能药包括噻托铵(tiotropium)以及噻托溴铵一水合物。其他的支气管扩张药类可以包括但不限于氨茶碱(aminophyliline)、奥西那林(iorciprenaline)、胆茶碱、硫酸特布他林、以及茶碱。可以将两种或多种支气管扩张药与本发明的一种表面活化剂进行连接，并进行联合给药。可替代地，可以将一种支气管扩张药与一种表面活化剂进行连接，并将该支气管扩张药与连接至一种表面活化剂上的第二种支气管扩张药进行联合给药。
可递送到肺脏的示例性的抗生素类包括但不限于青霉素类、青霉素类和β-内酰胺酶抑制剂类、头孢菌素类(I、II、III、以及IV代)、大环内酯类和林可酰胺类(lincosamines)、喹诺酮类和氟喹诺酮类、碳青霉烯类(carbepems)、单环内酰胺类(monbactams)、氨基糖苷类、糖肽类、四环素类(tetracylines)、磺胺类、利福平、噁唑烷酮类、链阳性菌素类、氨苯磺胺类(sulfanomides)、以及其他抗生素。可以将两种或多种抗生素与本发明的一种表面活化剂进行连接，并进行联合给药。可替代地，可以将一种抗生素与一种表面活化剂进行连接，并将该抗生素与连接至一种表面活化剂上的第二种抗生素进行联合给药。
示例性的青霉素类包括但不限于阿莫西林、氨苄西林、巴氨西林、羧苄西林、卡茚西林、美洛西林(mezlocilin)、哌拉西林、以及替卡西林(ticarcilin)。
示例性的青霉素类和β-内酰胺酶抑制剂类包括但不限于阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、青霉素、氯唑西林(cloxacilin)、双氯西林(dicloxacilin)、苯氧甲基青霉素、羧苄西林、甲氧西林、苯唑西林(oxacilin)、青霉素G(苄星青霉素G、钾、普鲁卡因)、青霉素V(penicilin V)、丙匹西林、依匹西林、环青霉素、哌拉西林(piperacilin)加上三唑巴坦、替卡西林(ticarcilllin)加克拉维酸、以及萘夫西林(naficillin)。
示例性的头孢菌素类(I代)包括但不限于头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢匹林、以及头孢拉定。头孢菌素类(II代)包括但不限于头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西(cefoicid)、头孢雷特、头孢西丁、头孢丙烯、头孢美唑(ceftmetazole)、头孢呋辛、头孢呋辛醋氧乙酯(cefuoximeaxetil)、以及氯碳头孢。头孢菌素类(III代)包括但不限于头孢地尼、头孢布烯、头孢托仑、头孢他美(cefatamet)、头孢哌酮、头孢克肟、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、以及头孢曲松。头孢菌素类(IV代)包括但不限于头孢吡肟。
示例性的大环内酯类(marcolides)和林可酰胺包括但不限于阿奇毒素、克拉霉素、克林霉素、地红霉素、红霉素、林可霉素、泰利霉素(telithromycine)、以及醋竹桃霉素。
单环内酰胺类包括但不限于包括氨曲南。碳青霉烯类包括但不限于多利培南、亚胺培南-西司他丁、以及美罗培南。
氨基糖苷类包括但不限于阿米卡星、硫酸阿米卡星、庆大霉素、硫酸庆大霉素(genatmicin sulfate)、卡那霉素、奈替米星(metilmicin)、新霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素、以及巴龙霉素(paromycin)。
糖肽类包括但不限于达巴万星、奥利万星、替拉凡星、替考拉宁、以及万古霉素。
四环素类包括但不限于地美环素(demclocylline)、多西环素、美他环素(methacyline)、米诺环素(minocyline)、土霉素、四环素(tetracyline)、以及金霉素(chloretracycline)。
噁唑烷酮类(oxazolidonones)包括但不限于利奈唑胺。链阳性霉素类包括但不限于奎奴普丁(quinoprisitin)加上达福普汀。
磺胺类包括但不限于磺胺米隆、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、柳氮磺吡啶(sulfasalzine)、磺胺、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、以及磺胺甲二唑。
其他的抗生素包括但不限于杆菌肽、氯霉素(chloramphenical)、多粘菌素E甲磺酸(colistemetate)、磷霉素、异烟肼、乌洛托品、甲硝唑(Metronidazol)、莫匹罗星、呋喃妥因、呋喃西林、新生霉素、多粘菌素B、大观霉素、甲氧苄啶、多粘菌素E、环丝氨酸、卷曲霉素、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸、琥乙红霉素加上磺胺异噁唑、以及替加环素。
可以被递送到肺脏的化学治疗药物包括但不限于烷化剂、抗雌激素药、阿柔比星、放线菌素D、阿地白介素、阿来组单抗、阿利维A酸、别嘌醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、门冬酰胺酶、贝沙罗汀、比生群、博来霉素、白消安、BCNU(卡莫司汀)、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、塞来考昔、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、环氧合酶-2抑制剂、阿糖胞苷、CCNU(洛莫司汀)、达卡巴嗪、柔红霉素(daunorubine)、道诺霉素、地尼白介素-毒素连接物、右雷佐生、地吖醌、多西他赛、阿霉素、表柔比星、阿法依伯汀、依索比星、雌莫司汀、依托泊苷(VP-16)、依西美坦、非格司亭、氮尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟维司群、半乳糖醇、吉西他滨、吉姆单抗、醋酸戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素α、干扰素γ、伊立替康(iriniotecan)、异丙铂(iroplatin)、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑、氯尼达明、醋酸甲地孕酮(megrestrol acetate)、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、米托胍腙、苯丙酸南诺龙、诺莫单抗、氮芥、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、培加酶、培门冬酶、培非司亭、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、卟吩姆钠、丙卡巴肼、黄体酮、泼尼莫司汀、PCNU、米帕林、拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、链佐星、滑石、他莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷(VM-26)、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸(tertinoin)、乌拉莫司汀、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、以及唑来膦酸盐。
可以将两种或多种化学治疗剂与本发明的一种表面活化剂进行连接，并进行联合给药。可替代地，可以将一种化学治疗剂与一种表面活化剂进行连接，并将该化学治疗剂与连接至一种表面活化剂上的第二种化学治疗剂进行联合给药。示例性的联合治疗包括紫杉醇和卡铂、顺铂和酒石酸长春瑞滨(vinorelbline tartrate)、顺铂和依托泊苷、以及卡铂和依托泊苷。
共价连接
可以使用许多策略将一种肺部活性药物与在本发明中所使用的一种表面活化剂共价地连接。总体而言，可以使用一个键或一个连接物将这种肺部活性药物共价地附连至这种表面活化剂上，该键或连接物保护了药物的天然位点并保留了这种表面活化剂在肺脏/空气界面上的相当长的停留时间。可以将至少一个额外的残基加在此处披露的一种表面活性多肽的氨基端或羧基端或者一个内部的氨基酸残基上以产生一个用于将药物分子与该表面活化剂共价地结合的连接物。在一个示例性的实施方案中，SP-B通过至少一个氨基酸得到延长以便通过自动的肽合成来创造出一个非天然的氨基酸。可以通过一个氨基或羟基基团将一种药物与氨基酸(例如甘氨酸残基)进行结合。代表性的共价连接可包括一个酯、一个酰胺、或脲。(March，Advanced OrganicChemistry，4^th Ed.，John Wiley&Sons，1992.)
氨基酸残基连接物通常是至少一个残基，并且在长度上可以是40或更多个残基，更常见的是1至10个残基，并且最常见的是1至5个氨基酸残基。这种连接物通常是一种小的中性的极性或非极性的氨基酸。用于连接的典型氨基酸残基是甘氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸、以及门冬氨酸、或者类似物。
在其他的实施方案中，这种连接物可以是一种并非自然发生的氨基酸的异双功能的连接物。
给药方法
本发明的组合物通过吸入法被递送至肺脏。可以使用吸入装置如吸入器(包括干粉吸入器和定量吸入器)和喷雾器(也称作雾化器)以便将这些所披露的组合物递送至肺脏。示例性的干粉吸入器可以从Inhale Therapeutic Systems获得，如在美国专利号5,458,135；5,740,794；5,785,049中所说明，它们均通过引用结合在此。干粉吸入器还可以从3M获得，如在美国专利6,029,661中所说明，它通过引用结合在此。
在此披露的组合物还可以使用一种定量吸入器(MDI)进行给药，该定量吸入器包含处于一种药学上惰性的液体推进剂(例如，一种氯氟碳(CFC)或氟烷)中的药物的溶液或悬浮液，如在美国专利号5,320,094和美国专利号5,672,581中所说明，它们均通过引用结合在此。定量吸入器被设计为每次驱动或“喷出”递送固定单位剂量的药物，例如每次喷出在10到5000微克药物的范围内。示例性的定量吸入器可以从3M获得，如在美国专利号5,224,183；5,290,534；5,511,540；6,454,140；以及6,615,826中所说明，它们均通过引用结合在此。定量吸入器还可以是不含CFC的。用吸入器来使用的药物组合物可以是处于雾化的固体微粒或液体的小液滴或悬浮液的形式。可替代地，可以将在此说明的这些组合物溶解或悬浮在一种溶剂(例如，水或盐水)中，并且通过喷雾法进行给药。用于递送雾化溶液的示例性的喷雾器包括the AERx^TM(Aradigm)、the(Mallinkrodt)、the Pari LCPlus^TM或the Pari LC Star^TM(Pari GmbH，Germany)、the DeVilbiss Pulmo-Aide、以及the(Marquest Medical Products)。
药物配制品
在此披露的药物组合物可以被配制成处于一种适合于吸入至呼吸道和肺脏中的载体中的溶液和/或颗粒的悬浮液。此类载体对于熟悉用于将精细液滴递送至呼吸道的吸入剂以及用于将可吸入的精细的颗粒(数量级为例如从0.5至1微米，并且优选地从大约0.5至大约0.7微米，包括粉末、雾或气溶胶)递送至呼吸道的吹入剂(如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，1980，Ed.By Arthur Osol中所说明，其通过引用结合在此)的普通技术人员而言也是熟知的。
在一个实施方案中，用于吸入给药的药物组合物可以作为粉末进行给药。这种粉状药物或者组合物通常位于一个容器内，如一个硬胶囊或一个泡罩包装、或一种多剂量的设计。这种胶囊或泡罩在一个吸入器装置中被撕破或开孔，由此使得粉末能被吸入。总体而言，用于吸入的药物的平均粒径是在1至10微米之间，其中粒径范围在2至5微米之间是特别适宜于穿透肺脏的外周气道的。这种粒径范围通常通过微粉化或喷雾干燥来实现。
粉状药物组合物通常作为一种组合物进行给药，该组合物包括这种药物与一种惰性载体的共混物或混合物。通常，这种惰性载体具有的平均粒径基本上大于该药物的平均粒径。除了其他优点之外，这还提供了该组合物的流动特性和分配准确度方面的改进。
用于所生产的药物的通常说明的载体材料包括碳酸钙和糖，例如蔗糖、甘露醇或右旋糖，或者更特别地是乳糖，它们是药学上可接受的并且不引起毒性的问题，这是因为在给药过程中所吸取的任何残基在摄入时具有良好的耐受性或者可能容易通过溶解(disillusion)(例如，在糖的情况中)或黏液纤毛清除而从肺脏中清除。
在胶囊或泡罩中的组合物时常是约25mg。这个重量大概表示了可舒服地被吸入而没有不适当的副作用(如咳嗽)的粉末的最大量，并且还对应于通常通过灌装机配药的最小量。
在某些实施方案中，为粉末的吸入所配制组合物包括一种载体，该载体以大约95.0至99.99％的浓度而存在。更特别地，按重量计是从97.0至99.9％，尤其是从98.0至99.8％。通过应用或改编已知的方法，用于制备此类粉末的方法也构成了本发明的特征。
在其他的实施方案中，可以使用本领域内熟知的方法将这种药物组合物配制为一种气溶胶配制品。一种广泛使用的用于分配这种气溶胶配制品的方法涉及在一种液化的推进剂气体中制造作为精细分割的粉末的药物的悬浮液配制品。可替代地，可以制备一种溶液配制品，其中将这种药物溶解于一个推进剂系统中，该系统可能包含了辅助药物的溶出作用的增溶剂和共溶剂。通常，升压定量吸入器(pMDI)用于将此类配制品分配给患者。推进剂可以包括氯氟碳(CFC)、氟烷(fluorocarban)(FC)、或者氢氟烷(hydrofluroalkane)(HFA)推进剂。
治疗的方法
本披露还提供了用于治疗患有肺部炎症或肺病的受试者的方法。在另一个实施方案中，本披露提供了治疗处于患有肺脏紊乱的风险之中的受试者的一种方法。这种方法包括给予该受试者一种结合物，该结合物包括与一种表面活化剂共价地键合的一种肺部活性药物，该表面活化剂对人类肺泡/气体界面具有一种亲和力，并且这种表面活化剂包括对人类基本上无免疫原性的一种哺乳动物的肺表面活性多肽或它的一种模拟物的至少一个部分。这种结合物是通过吸入法以在肺中有效诱导一种药物效应的量给予这位受试者的。这位受试者可以是人、猴子、黑猩猩、马、狗、猫、牛、绵羊、猪、大鼠、或小鼠。在示例性实施方案中，这位受试者是人。
需要治疗的受试者正患有肺部炎症或正患有肺病或具有患肺病的风险。可以用在此说明的药物组合物进行治疗的示例性肺病包括但不限于肺气肿、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、呼吸性窘迫紊乱(RDS)、肺炎、结核或者其他的细菌性感染、囊性纤维病、和/或肺癌。
剂量
与给予一种未结合的药物相比，给予与一种表面活化剂相结合的肺部活性药物降低了给药频率。在某些实施方案中，可以重复该给药步骤每日一次、隔日一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、或者每周一次。
例证
通过以下实例进一步说明本发明。提供这些实例仅是出于说明的目的，并且不得以任何方式解释为限制本发明的范围或内容。
实例1：人类嗜中性细胞弹性蛋白酶抑制剂与一种SP-B肽的结合可以将一组有力的小分子人类嗜中性细胞弹性蛋白酶(HNE)抑制剂与一种SP-B肽结合，该SP-B肽包括SP-B的氨基端25个氨基酸(FPIPLPYCWLCRALIKRIQAMIPKG)(SEQ ID NO：88)。在水分子去除之后，这种SP-B肽(包括氨基端25个氨基酸)的总分子量是2926.97。使用类似于在图18中所描绘的连接的一种甘氨酸连接物将这种HNE抑制剂与SP-B的N端25个部分(25-mer)相结合。
实例2：靶B的合成
用于该反应的所有溶剂是LR级的溶剂。室温(RT)表明在27至32℃范围内的温度。所有的反应均通过TLC进行监测，除非有所指明。使用旋转蒸发器在减压条件下将溶液蒸发。在Varian 400MHz上进行NMR。使用100-200目的硅胶完成柱色谱法，除非有所指明。
阶段1的合成

方案1
将处于干的四氢呋喃(85mL)中的Cbz-Val-Pro-OH(5g，14mmol)的溶液在氮气下冷却到-20℃。将N-甲基吗啉(1.74mL，15mmol)之后跟随氯甲酸异丁酯(2mL，15mmol)加入到反应混合物中。将该反应混合物在-20℃搅拌15分钟，并接着将其冷却至-40℃。将处于四氢呋喃(25mL)中的L-Valinol(1.62g，15mmol)的溶液逐滴加至该反应混合物中。允许该反应混合物升温至室温过夜。将该反应混合物过滤，并且将滤液用乙酸乙酯(60mL)进行稀释。用1N HCl(60mL)、NaHCO₃(30mL)、以及盐水(30mL)顺序地对组合的有机层进行洗涤。将有机层在硫酸钠上进行干燥、过滤、并且浓缩以给出所希望的产物(5.7g)。HPLC Rt：5.76；LCMS(M+1)：434；产量：92.5％。
阶段2的合成

方案2
将处于干的二氯甲烷(110mL)中的草酰氯(2.45mL，28mmol)的溶液冷却至-60℃，并且在1h的时间内逐滴加入处于二氯甲烷(35mL)中的DMSO(4.09mL，57.7mmol)的溶液，将反应混合物的温度保持在-45℃。允许该反应混合物升温至-30℃，并且在1h的时间内逐滴加入处于二氯甲烷(35mL)中的阶段-1(6.1g，14mmol)的溶液。在-25℃将反应混合物搅拌1h。将反应混合物冷却至-40℃，并且在1h的时间内逐滴加入二异丙基乙胺(10mL，57.7mmol)。将该反应升温至室温，并接着用1N HCl(60mL)和盐水(60mL)进行洗涤。将有机层在硫酸钠上进行干燥、过滤，并且在减压条件下将滤液浓缩以给出所希望的产物(5.7g)。HPLC Rt：6.81；LCMS(M+1)：432；产量：94％。
阶段3的合成

方案3
将处于干的四氢呋喃(100mL)中的锌(2.5g，39mmol)和阶段-2(5.64g，13mmol)的悬浮液在氮气氛围下加热至60℃。加入二氟溴乙酸乙酯(7.93g，39mmol)并且将反应加热至60℃持续1h。将该反应混合物冷却至室温，在减压条件下将四氢呋喃去除，并且加入乙酸乙酯(100mL)。反应混合物用1M KHSO₄(50mL)和盐水(50mL)进行洗涤并且在硫酸钠上进行干燥。
将有机层过滤并且在减压条件下将其浓缩以给出粗产物，然后将该粗产物通过制备型HPLC进行纯化以给出所希望的产物(2.9g)。HPLC Rt：7.44；LCMS(M+1)：556；产量：40％。
阶段4的合成

方案4
将处于乙醇(40mL)中的阶段-3(1.8g，3.2mmol)以及苄胺(1.06mL，9.7mmol)的溶液在回流时搅拌4h。将该反应混合物冷却至室温并且在氮气氛围下再搅拌48h。在减压条件下将溶剂去除。将残余物溶解于乙酸乙酯(50mL)中，并且用1N HCl(20mL)和盐水(20mL)对该溶液进行洗涤。将有机层在硫酸钠上进行干燥、过滤，并且在减压条件下将溶剂去除以给出所希望的产物(1.7g)。HPLC Rt：7.56；LCMS(M+1)：616；产量：88％。
阶段-5

方案5
将处于乙酸乙酯(50mL)中的阶段-4(1.85g，3mmol)以及20％氢氧化钯(1g)的混合物在200psi放置于一个高压容器中20h。将反应混合物通过c盐进行过滤，并且在真空下将滤液浓缩以给出所希望的产物连同一些起始材料，这些起始材料如此进行使用，用于进一步反应没有任何纯化(1.1g)。HPLC Rt：4.90；LCMS(M+1)：482；产量：80％。
阶段-6

方案6
在0℃将三乙胺(0.25mL，1.8mmol)加至处于干的二氯甲烷(50mL)中的阶段-5(1g，2.1mmol)的溶液中。然后，逐滴加入处于二氯甲烷(20mL)中的乙二酸单乙酯单酰氯(0.2mL，1.87mmol)的溶液。允许反应混合物升温至室温，并再搅拌2h。用水(25mL)将反应混合物骤冷。将有机层分离，在硫酸钠上进行干燥，并且在减压条件下蒸发以给出所希望的产物，然后将该产物通过制备型HPLC进行纯化。HPLC Rt：6.72；LCMS(M+1)：583；产量：0.5g(42％)。
阶段-7

方案7
将三氟乙酸(0.92mL，12.02mmol)加至处于干的二氯甲烷(25mL)中的阶段-6(1.75g，3mmol)以及戴斯-马丁氧化剂(5.1g，12.02mmol)的经搅拌的溶液中。在室温下在氮气氛围下将该混合物搅拌4h。加入乙酸乙酯(100mL)，并且用饱和的硫代硫酸钠(60mL)、饱和的NaHCO₃(60mL)、以及盐水(60mL)对该混合物进行洗涤。将有机层在硫酸钠上进行干燥、过滤并且在减压条件下蒸发以给出所希望的产物，将该产物如此使用，用于另外的步骤。HPLC Rt：7.32；LCMS(M+1)：581；产量：1.7g(97％)。
阶段-8

方案8
用1N NaOH(0.18g，4.5mmol)对处于甲醇水1∶1(20mL)中的阶段-7(2.2g，3.7mmol)的溶液进行处理，并且在室温下搅拌4h。将反应混合物浓缩以除去甲醇，用1N HCl进行酸化，并且用乙酸乙酯(60mL)进行萃取。将有机层在硫酸钠上进行干燥，并且在减压条件下蒸发以给出所希望的产物，然后该产物通过制备型HPLC进行纯化。HPLC Rt：6.47-6.61；LCMS(M+1)：553；产量：500mg(在制备后24％)。
阶段-9

方案9
用处于DMF(15mL)中的20％哌啶对王树脂(2.5g，0.5eq)进行处理，并且将其搅拌约1小时。然后，用DMF(2次，15mL)、DCM(3次，15mL)对其进行洗涤，并且在真空下进行干燥。在树脂上进行Kaiser测验以确保完全去除F-moc基团。然后，将其用于与阶段-8产物进行偶合。将处于DMF(5mL)中的以上的酸(97mg，0.176mmol)的溶液加至处于DMF中的树脂的溶液中，之后加入PyBoP(91mg，0.176mmol)和N-甲基吗啉(0.24mL，0.22mmol)。允许反应混合物在振动器上振动大约3h。将溶液轻轻滗出，再次加入一批新鲜的以上试剂并且将其进一步振动3h。将这个过程重复大约4次。将溶液轻轻滗出，并且用DMF(3次，15mL)、DCM(3次，15mL)对树脂进行洗涤，并且在真空下进行干燥。在树脂上进行Kaiser测验以确保偶合已发生。
阶段-10

方案10
用于制作裂解溶液的步骤。TFA(81％)、苯酚(5％)、苯甲硫醚(5％)、1，2-乙二硫醇(2.5％)、水(3％)、二甲基硫化物(2％)、碘化铵(1.5％)。将该裂解溶液加至该树脂中，并允许其在振动器上振动大约3h。将树脂通过棉花进行过滤并且用TFA进行洗涤。然后，在真空下将滤液浓缩并且用冷乙醚进行研磨以给出一种白色固体，然后将该白色固体通过制备型HPLC进行纯化以给出所希望的产物。LCMS(M/3)：1155；产量：46mg(1.84％)。
实例3：靶C的合成
阶段-6

方案11
在室温下将丙二酸单乙酯(0.7mL，6mmol)之后跟随HOBT(1.63g，12mmol)、EDCI(1.27g，6.6mmol)、以及N-甲基吗啉(1.6mL，15mmol)加至出于干的THF(50mL)中的阶段-5(3.2g，6.6mmol)的溶液中。然后，允许将反应混合物在室温下搅拌4h。然后，用水将反应混合物骤冷并在减压条件下将其蒸发以去除THF。然后用乙酸乙酯(100mL)萃取水层。将有机层在硫酸钠上进行干燥，并浓缩以给出粗产物，然后通过制备型HPLC对该粗产物进行纯化(0.98g)。HPLC Rt：6.44；LCMS(M+1)：596；产量：在制备后25％。
阶段-7

方案12
将三氟乙酸(0.45mL，5.7mmol)加至处于干的二氯甲烷(30mL)中的阶段-6(0.86g，1.45mmol)以及戴斯-马丁氧化剂(2.46g，5.7mmol)的经搅拌的溶液中。在室温下在氮气氛围下将该混合物搅拌4h。加入乙酸乙酯(50mL)并且用饱和的硫代硫酸钠(20mL)、饱和的NaHCO₃(20mL)、以及盐水(20mL)对该混合物进行洗涤。将有机层在硫酸钠上进行干燥、过滤，并且在减压条件下将溶剂去除以给出所希望的产物(0.74g)。HPLC Rt：7.05；LCMS(M+1)：595；产量：86％。
阶段-8

方案13
用1N NaOH(0.060g，1.5mmol)对处于甲醇水1∶1(5mL∶5mL)中的阶段-7(0.75g，1.2mmol)的溶液进行处理，并且将该溶液在室温搅拌4h。将反应混合物浓缩以除去甲醇，用1N HCl进行酸化(直到pH 2)并用乙酸乙酯(50mL)萃取。将有机层在硫酸钠上进行干燥，并且在减压条件下浓缩以给出所希望的产物，然后通过制备型HPLC对该产物进行纯化(0.4g)。HPLCRt：6.01-6.51；LCMS(M+1)：567；产量：在制备后56％。
阶段-9

方案14
用处于DMF(20mL)中的20％哌啶对王树脂(2g，0.08mmol)进行处理，并且将其搅拌约1小时。然后，用DMF(2次)、DCM(3次)对其进行洗涤，并接着在减压条件下进行干燥。在树脂上进行Kaiser测验以确保完全去除F-moc基团。然后将其用于与阶段-8偶联。将处于DMF(3mL)中的以上的酸(0.1g，0.16mmol)的溶液加至处于DMF(5mL)中的树脂(2g，0.08mmol)的溶液中，之后跟随加入PyBoP(0.83g，0.16mmol)和N-甲基吗啉(0.2mL，0.2mmol)。使反应混合物在振动器上振动大约3h。将溶液轻轻倒出，再次加入许多新鲜的以上试剂并且另外使其振动3h。将这个过程重复大约4次。将溶液轻轻滗出，并且用DMF(3次)、DCM(3次)对树脂进行洗涤，并且在减压条件下进行干燥。在树脂上进行Kaiser测验以确保偶合已发生。
阶段-10

方案15
用于制作裂解溶液的步骤。TFA(81％)、苯酚(5％)、苯甲硫醚(5％)、1，2-乙二硫醇(2.5％)、水(3％)、二甲基硫化物(2％)、碘化铵(1.5％)。裂解溶液(25mL)加至树脂中，并允许其在振动器上振动大约3h。将树脂通过棉花进行过滤并且用TFA进行洗涤。然后，在减压条件下将滤液浓缩，并且用冷乙醚进行研磨以给出一种白色固体，然后通过制备型HPLC将其纯化以给出所希望的产物(0.080g)。LCMS(M/3)：1160；产量：2.4％。
实例4：在HNE暴露之后肺脏的支气管肺泡灌洗
在这项研究中使用了总计14只动物。经麻醉的小鼠接受了0.1ml的通过一根钝端导管递送到气管开口的溶液，并且允许这些动物将该溶液吸进其肺脏中。所有的动物被暴露于该处理持续2小时，并且使它们再次麻醉。如以下所说明进行肺脏的支气管肺泡灌洗。给予HNE(肺气肿的致病因子)的四只动物具有按重量计0.053克的平均肺脏血细胞水平。当给予HNE时，靶2(在二十世纪九十年代早期由Zeneca研制的一种有力的HNE抑制剂)使肺脏中的平均血液水平降低了34％，达到0.035克。当给予HNE时，靶C(与人表面活性B肽的最初25个残基的N端共价地附连的Zeneca分子)使肺脏中的平均血液水平降低了87％，达到0.007克。
使用一组动物来确定针对该项研究的最佳的HNE浓度。暴露于50微克HNE的一份最初的样本在暴露情况下没有存活。将HNE的量值降低到40微克以保持最大限度的有害但可存活的效果。暴露于40微克的HNE的动物能够存活足够长的时间来进行完整的研究。将在完整的研究中剩余的所有动物暴露于40微克的HNE中。
以相对于HNE 70倍摩尔过量给予靶2(Zeneca分子)。在动力学研究中，靶2具有2nM亲和力。在动力学研究中，如与靶2相比，靶C(与人表面活性肽B的最初25个残基共价地附连的Zeneca分子)失去大概两个数量级的效能的强度，并且由此靶C具有对于HNE大概200nM的亲和力。因此，在这些研究中，靶C是以相对于HNE的100倍摩尔的过量给予这些动物的。通过以下步骤进行支气管肺泡灌洗(BAL)：1)使动物麻醉；2)对这些动物进行气管切开术，并切开胸部，并将肋骨展开以便能够进行完全的肺扩张；3)通过气管切开术的导管将1ml的PBS缓冲溶液施加压力至肺脏中；4)将该溶液从肺脏中吸取出来；5)对回收的溶液进行离心以便从液体部分中分离红细胞部分；以及6)对红细胞部分进行称重。
表2：肺脏血细胞水平的测量