帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼的制备方法及注射剂 【技术领域】
本发明属于医药化工技术领域，特别涉及帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼的制备方法及注射剂。
背景技术
盐酸帕洛诺司琼(英文名Palonosetron Hydrochloride，化学名：(3aS)-2-[(S)-1-氮杂环双[2，2，2]辛-3-基]-2，3，3a，4，5，6-六氢-1-酮-1H苯[并]异喹啉盐酸盐)为白色结晶性粉末，熔点＞290℃，分子式为C19H24N2O·HCl，分子量为332.9；在水中易溶，在丙二醇、甲醇和三氯甲烷中溶解，在乙醇和2-丙醇中微溶。盐酸帕洛诺司琼是一种新型高选择性、高亲和性的5-HT3受体拮抗剂，临床上用于中到重度致吐性化疗药物引起的急性和延迟性恶心和呕吐。其与5-HT竞争性地作用于5-HT3受体，从而阻断呕吐，其结构如式I所示：
式I
现有的盐酸帕洛诺司琼的制备方法有以下几种：
1、200610156874.1号专利申请公开了(S)-四氢萘甲酸与二氯亚砜和(S)-3氨基-奎宁环胺反应获得(s，s)-奎宁环四氢萘甲酰胺，(s，s)-奎宁环四氢萘甲酰胺再与还原剂和三氟化硼乙醚反应得到(s，s)-四氢萘甲基奎宁环胺，(s，s)-四氢萘甲基奎宁环胺与氯甲酸三氯甲酯反应，加入三氟化硼乙醚，产物中再加入盐酸和水，得到盐酸帕洛诺司琼。
该方法第一步、第二步的终产品用乙酸乙酯萃取后除水不容易彻底，导致产率较低；最终产品重结晶时采用异丙醇和水，产率不高。
2、synthesis 1996 7 816-818中公开的方法一合成路线如下：
该方法在用硼氰化钠还原时需要-70℃的低温条件，而且加氢时条件难以控制，同时反应的选择性不高。
3、synthesis 1996 7 816-818中公开的方法二合成路线如下：
该方法加氢时条件难以控制，反应的选择性不高；氢解时萘甲酸原料中含有的金属容易使催化剂中毒。
4、美国专利US5510486公开的合成路线为：
该方法第一步骤需要无水无氧和-30℃的低温条件，条件要求苛刻，其余各步操作相对比较简单，不需要特殊的反应装置，易于工业化生产，得到的盐酸帕洛诺司琼粗品用异丙醇重结晶一次来除去杂质。但是采用该方法制备得到的粗品重结晶后，产品中还存有较多杂质，并且多次重结晶后成品的纯度才能达到99％，单一杂质含量也超过0.1％，若要进一步提高产品的质量很困难。
综上所述，现有的盐酸帕洛诺司琼的制备方法存在产品纯度低、工艺要求高、生产成本较高等问题。
【发明内容】
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种工艺简单的帕洛诺司琼的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：帕洛诺司琼的制备方法为(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-(1，2，3，4-四氢萘-1S-甲基)胺与三聚光气反应后，加入三氟化硼回流反应后萃取即得帕洛诺司琼。
其中(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-(1，2，3，4-四氢萘-1S-甲基)胺、三聚光气、三氟化硼的用量摩尔比为1∶6～8∶8～10，优选为1∶7∶9。三氟化硼使用时为三氟化硼溶于乙醚的溶液。因为三聚光气在回流时容易气化而溢出，可能造成反应不完全，三聚光气分两次加入(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-(1，2，3，4-四氢萘-1S-甲基)胺的甲苯溶液中，保证反应彻底，先加入60～70％的三聚光气，于室温反应8h～12h，回流反应3～6h，再加入剩余的三聚光气，于室温反应0.5～1.5h，回流反应3～6h。室温下加入三氟化硼乙醚溶液，回流反应5～8h。反应完全后进行萃取步骤：加盐酸回流，分离水相和有机相，有机相用盐酸萃取，收得的水相调节pH＝9～11，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷层并以饱和氯化钠溶液洗涤，除去溶剂即得。
本发明方法的有益效果是：
本制备方法都是常压操作，反应条件温和，工艺简便，设备简单，成本低，适合大规模工业生产。
本制备方法中没有使用有毒害的试剂，试剂的回收利用简便，有利于环境保护。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种盐酸帕洛诺司琼的制备方法，该方法为上述方法得到的帕洛诺司琼溶于异丙醇后滴加乙醇的饱和氯化氢溶液得到盐酸帕洛诺司琼。盐酸帕洛诺司琼用异丙醇/甲醇混合液重结晶得到盐酸帕洛诺司琼的精制品；异丙醇/甲醇混合液的体积比优选为3∶1。
盐酸帕洛诺司琼粗品用异丙醇和甲醇重结晶纯化，产率较高、纯度较好。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种性质稳定的盐酸帕洛诺司琼注射剂。
所述盐酸帕洛诺司琼注射剂每毫升盐酸帕洛诺司琼注射剂中含有盐酸帕洛诺司琼(以C19H24N2O计)0.05mg，甘露醇41.2～41.8mg、枸橼酸钠1.8～1.92mg、枸橼酸0.7～0.82mg和依地酸钙钠0.46～0.54mg。
其中甘露醇为等渗调节剂，枸橼酸钠和枸橼酸为缓冲体系，调节注射液的pH值。依地酸钙钠能络合注射液中的重金属离子，起着抗氧化剂、稳定剂的作用。
优选的每毫升盐酸帕洛诺司琼注射剂中含有盐酸帕洛诺司琼(以C19H24N2O计)0.05mg，甘露醇41.5mg、枸橼酸钠1.86mg、枸橼酸0.77mg和依地酸钙钠0.50mg。
盐酸帕洛诺司琼注射剂制剂单位为0.05mg/5ml。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述盐酸帕洛诺司琼注射剂的制备方法，具体包括以下步骤：
A、按比例分别称取甘露醇206～209g、枸橼酸钠9～9.6g、枸橼酸3.5～4.1g和依地酸钙钠2.3～2.7g，加1500～3000ml的注射用水，搅拌溶解，再加入溶液总量0.04～0.06％(W/V)的药用活性炭，55～65℃保温吸附10～20分钟，过滤；
B、称取250mg盐酸帕洛诺司琼(以C19H24N2O计)于800～1500ml的注射用水中，溶解完全；
C、将步骤A、B得到的两种溶液混合，加注射用水定容至5000ml，调节pH值4.5～5.5，用0.18～0.26μm的微孔滤膜滤过至澄明；
D、步骤C制得的溶液灌装于安瓿中，封口，于114～118℃热压灭菌30～50min，冷却即得。
优选的，盐酸帕洛诺司琼注射剂的制备方法中步骤A原料用量为：甘露醇207.5g、枸橼酸钠9.32g、枸橼酸3.85g和依地酸钙钠2.5g。药用活性炭加入量为溶液总量0.05％(W/V)，活性炭吸附条件为60℃保温吸附15分钟。
步骤C微孔滤膜规格为0.22μm。
步骤D安瓿为棕色，热压灭菌条件为116℃热压灭菌40min。
采用本发明制备方法制得的盐酸帕洛诺司琼注射剂，杂质含量少，性质稳定。
【具体实施方式】
本发明所用的(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-(1，2，3，4-四氢萘-1S-甲基)胺可以通过市场购买得到，也可以通过以下方法制备得到，包括：
a、(S)-1，2，3，4-四氢-1-萘甲酰氯的甲苯溶液加入1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺的三氯甲烷溶液中反应，得到N-(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-1，2，3，4-四氢萘-1S-甲酰胺；
b、N-(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-1，2，3，4-四氢萘-1S-甲酰胺与硼氢化钠和三氟化硼乙醚溶液反应后，加入盐酸反应得到(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-(1，2，3，4-四氢萘-1S-甲基)胺。
其中，步骤a所述的(S)-1，2，3，4-四氢-1-萘甲酰氯可以由1，2，3，4-四氢-1S-萘甲酸与二氯亚砜反应后得到，1，2，3，4-四氢-1S-萘甲酸与二氯亚砜的摩尔比为1∶5；反应溶剂为甲苯，甲苯用量为1，2，3，4-四氢-1S-萘甲酸重量的9～11倍；DMF为催化剂，用量为1，2，3，4-四氢-1S-萘甲酸重量的0.055～0.07倍。反应条件为室温反应0.5～1.5h后，再于45～55℃反应2～5h。
步骤a所述地1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺可以由1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺盐酸盐溶于醇后，调节pH＝9～11，挥发掉溶剂后制备得到；优选的，所述醇为甲醇或乙醇，调节pH＝10。
步骤a(S)-1，2，3，4-四氢-1-萘甲酰氯与1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺的摩尔比为1∶1.3～1.7，优选为1∶1.5；反应时，先将(S)-1，2，3，4-四氢-1-萘甲酰氯溶于甲苯，1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺溶于三氯甲烷后混合，反应条件为45～55℃反应8～12h，反应完全后，反应液调pH＝9～11(调pH试剂优选为50％NaOH(wt％)溶液)，加入水并分离出水相，水相用三氯甲烷萃取，收得的有机相以饱和氯化钠溶液洗涤后除去溶剂，残余物用甲苯洗涤后即得。
步骤b N-(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-1，2，3，4-四氢萘-1S-甲酰胺与硼氢化钠和三氟化硼的摩尔比为1∶4～5∶7～9，优选为1∶4.6∶8，反应溶剂为四氢呋喃，三氟化硼使用时为三氟化硼溶于乙醚的溶液，反应条件为20℃以下反应0.5～1.5h，60℃反应3～6h。反应完全后，于10℃以下，加盐酸使反应液中固体溶解，蒸干溶剂，加盐酸并升温使反应液变澄清，调节反应液pH＝9～11，用三氯甲烷萃取，收集的三氯甲烷溶液以饱和氯化钠溶液洗涤，蒸干溶剂即得。
上述方法的两个起始原料是易得、价格低廉且已经拆分好的1，2，3，4-四氢-1S-萘甲酸和1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺盐酸盐，中间体和最终产品分离纯化简便，产品质量容易控制。
以下结合实施例对本发明作进一步的阐述。实施例仅用于说明本发明，而不是以任何方式来限制本发明。
实施例1
步骤一、N-(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-1，2，3，4-四氢萘-1S-甲酰胺的合成
将1，2，3，4-四氢-1S-萘甲酸300g投入5L的反应瓶中，加入3L新鲜蒸馏的甲苯，搅拌至完全溶解、反应液澄清。在冰浴冷却条件下，滴加加入20ml N，N-二甲基甲酰胺。保持反应体系温度在20℃以下，缓慢滴加二氯亚砜0.56L，滴加完毕后室温搅拌反应1h。然后于50继续搅拌，TLC(薄层色谱)跟踪反应进程(展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)，大约3h后反应完全。减压浓缩除去溶剂，补加0.5L新鲜蒸馏的甲苯继续减压浓缩至无溶剂流出，残余物((S)-1，2，3，4-四氢-1-萘甲酰氯)中加入0.5L甲苯后备用。
1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺盐酸盐的处理：
将408g 1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺盐酸盐投入10L的反应瓶中，加入3L甲醇，室温下用饱和氢氧化钠溶液调节pH＝10左右，减压浓缩干，再分别加入0.3L×3无水乙醇，0.3L甲苯浓缩带水，残留物加入6L三氯甲烷溶解，冰浴冷却备用。
保持反应体系温度为20℃以下，将(S)-1，2，3，4-四氢-1-萘甲酰氯溶液缓慢滴加到上述制备好的1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛基胺的三氯甲烷溶液中，滴加完毕后室温搅拌反应30min，然后升温至50℃搅拌反应10h左右，TLC跟踪反应进程使(S)-1，2，3，4-四氢-1-萘甲酰氯完全反应为止(展开剂为三氯甲烷∶甲醇＝5∶1)。反应完全后，于冰浴下以50％NaOH溶液调反应液pH＝10左右，加入2L水，分离水相和有机相，水相用1L三氯甲烷萃取3次，合并有机相，以1L饱和氯化钠溶液洗涤2次，无水硫酸镁干燥.过滤，减压浓缩除去溶剂，残余物加入0.5L冰冷甲苯，摇匀，过滤，滤饼以0.2L冰冷甲苯洗涤，60℃减压干燥6h，得浅黄色固体350g，收率85.8％。
步骤二、(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-(1，2，3，4-四氢萘-1S-甲基)胺的合成
将N-(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-1，2，3，4-四氢萘-1S-甲酰胺(350g)投入20L的反应瓶中，加入7.5L新鲜蒸馏的四氢呋喃，搅拌至完全溶解。在冰浴冷却条件下，保持反应体系温度≤10℃，加入硼氢化钠168g，然后缓慢滴加1.15L三氟化硼乙醚溶液(以BF3计，三氟化硼重量百分比含量为47.0-47.7％)，滴加完毕后于20℃以下搅拌反应1h。
升温至60℃保温搅拌反应4h(使反应液微沸即可，反应时间以实际TLC或HPLC监测原料消失为准，TLC展开剂为三氯甲烷∶甲醇＝5∶1)。
将前述反应瓶置于冰浴中，保持瓶内温度10℃以下，缓慢滴加6mol/L的盐酸2L(产生大量气体)，搅拌使瓶中白色固体大部分溶解。减压浓缩除去四氢呋喃，残余物加入6mol/L盐酸2L，升温至80℃反应至反应液变澄清。冰浴下加入50％(wt％)氢氧化钠溶液调节反应液pH＝10，用1L三氯甲烷萃取3次，合并收集的三氯甲烷溶液，以0.5L饱和氯化钠溶液洗涤2次，加适量无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得浅黄色油状产物(240g)，收率68.6％。
步骤三、帕洛诺司琼的合成
在氮气保护下，将(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-(1，2，3，4-四氢萘-1S-甲基)胺(220g)投入20L的反应瓶中，加入5L新鲜蒸馏的甲苯，搅拌至溶解完全。控制反应温度在5℃下，缓慢滴加1L溶解了510g三聚光气的甲苯溶液，滴加完毕后搅拌反应20分钟，升温至室温(25℃以上)搅拌反应10h，然后升温回流4h，将反应体系冷却至5℃下，缓慢滴加0.5L溶解了255g三聚光气的甲苯溶液，滴加完毕后搅拌反应20min，然后升温至室温(25℃以上)搅拌反应1h，升温回流反应4h左右，HPLC监测反应进程。待(1-氮杂-3(S)-双环[2，2，2]辛烷基)-(1，2，3，4-四氢萘-1S-甲基)胺反应完全后，将反应液冷却至室温，滴加0.84L三氟化硼乙醚溶液，升温回流反应6h(HPLC监测反应进程)。
反应完全后，冰浴下加入2mol/L盐酸3L，加热回流1h，反应液冷却至室温，分离水相(丢弃)和有机相，有机相分别用2mol/L盐酸0.5L萃取2次，合并2次萃取收得的水相，冰浴下以50％氢氧化钠溶液调节pH＝10左右，分别用1L三氯甲烷萃取3次，合并三氯甲烷层并以0.5L饱和氯化钠溶液洗涤2次，适量无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂后残余物即为帕洛诺司琼。
步骤四、盐酸帕洛诺司琼的制备
以400ml异丙醇溶解步骤三制得的帕洛诺司琼，冰浴冷却下滴加乙醇的饱和氯化氢溶液1.5L，析出盐酸帕洛诺司琼产品，5℃以下冷却结晶10h左右，过滤，0.2L冷异丙醇洗涤、抽干，得粗产品(118g)，收率53.6％。
步骤五、盐酸帕洛诺司琼的精制
第一次重结晶：
将步骤三制得的盐酸帕洛诺司琼粗品(118g)投入5L反应瓶中，加入3.6L异丙醇/甲醇(3∶1)混合液，搅拌，加热至回流，加入3g活性炭回流脱色20min，趁热过滤，滤液自然静置冷却至室温后放入冰箱(5℃)冷却10h。过滤，滤饼以0.2L冰冷的异丙醇洗涤、抽干，得晶体(93g)。
第二次重结晶：
将第一次重结晶制得的盐酸帕洛诺司琼晶体投入5L反应瓶中，加入2L异丙醇/甲醇(3∶1)混合液，搅拌，加热至回流，加入3g活性炭回流脱色20min，趁热过滤，滤液自然静置冷却至室温后放入冰箱(5℃)冷却10h左右。过滤，滤饼以0.2L冰冷的异丙醇洗涤、抽干，得白色结晶性粉末(65g)。
干燥：
将第二次重结晶制得的精制品送入真空干燥箱中，进行干燥，控制干燥温度60±5℃，干燥4～6h，干燥至干燥失重不大于0.5％，得白色结晶性粉末(45g)。HPLC测定纯度为99.72％，收率55.1％，熔点：大于290℃，其余理化性质参数如下所示：
EI-MS M/Z：296，109。
UV(CH3OH)λmax：208nm。
比旋光度氯仿(C＝0.1)。
元素分析：C 68.48，H 7.47，N 8.53，Cl 10.66，O 4.86。
IR(KBr压片)vmax(cm-1)：3023.9、2924.6、2877.3、2506.4、2456.9、1647.8、1590.3、1476.56、1445.4、1408.5、768.5、695.2。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm)：1.402-1.314(1H，m，8-Hb)，1.821-1.714(1H，m，8-Ha)，2.034-1.894(2H，m，7-H)，2.276-2.079(4H，m，16-H，18-H)，2.385-2.339(1H，m，17-H)，2.908-2.748(2H，m，14-H)，3.025-2.922(1H，m，9-H)，3.327-3.244(3H，m，11-Hb，6-H)，3.421-3.369(1H，m，11-Ha)，3.840-3.668(4H，t，15-H，19-H)，4.972-4.929(1H，t，13-H)，7.268-7.248(2H，m，2-H，4-H)，7.848-7.830(1H，t，3-H)，12.235(1H，s，20-H)。
13C NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm)：19.652(1C，18-C)，21.738(1C，16-C)，24.195(1C，8-C)，25.617(1C，17-C)，25.935(1C，7-C)，27.998(1C，6-C)，34.845(1C，9-C)，45.941(2C，11-C，14-C)，49.167(2C，15-C，19-C)，49.314(1C，13-C)，125.971(1C，3-C)，126.570(1C，4-C)，128.274(1C，1-C)，132.624(1C，2-C)，134.939(1C，10-C)，136.973(1C，5-C)，165.994(1C，12-C)。
盐酸帕洛诺司琼的精制过程需在30万级洁净区中操作。
重结晶过程中滤掉晶体的的母液可收集起来于5℃保存，等量大时集中处理。处理时将母液浓缩至约1/3体积，冷却(5℃)后抽滤。滤得的固体于60±2℃烘干4～6h，测定干燥失重≤1.0％，得白色结晶性粉末，为盐酸帕洛诺司琼粗品，粗品经过两次重结晶后可得到精制品。
试验例1盐酸帕洛诺司琼注射液pH缓冲剂选择和pH值筛选
血液pH值的恒定是细胞生理活动的必要条件，如果pH超过范围，不仅改变神经细胞的兴奋性，而且可影响酶的活性，使所有细胞的代谢活动和生理功能都受到影响。一般注射剂pH值要求控制在4～9之间，否则，pH值过高或过底均可引起局部组织的刺激或坏死。
分别配制浓度为0.01mol/L，pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲溶液各1000ml，分别加入盐酸帕洛诺司琼56mg(以C19H24N2O计为50mg)和0.5g依地酸钙钠搅拌溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，分装于5ml的棕色安瓿中，封口，于100℃流通蒸汽灭菌30分钟。对注射剂的性状、pH值、有关物质及含量进行检测，结果见表1。
表1pH缓冲剂选择和pH值筛选
表1中数据可看出，经100℃流通蒸汽灭菌30min后，各pH值下注射液盐酸帕洛诺司琼含量相差不大，但在pH值4.5～5.5范围内有关物质低。以上结果表明：pH值在4.5～5.5范围内的注射液经100℃流通蒸汽灭菌30min后，其有关物质和盐酸帕洛诺司琼含量变化不明显。
试验例2盐酸帕洛诺司琼注射液抗氧化剂用量试验
当药液中含有微量金属离子时，常会加速药物的氧化、降解。这些金属离子可能来自原料、辅料及配制过程中制药器械等。除严格控制以上诸因素外，常采用加入金属离子络合剂，使与金属离子生成稳定的水溶性络合物，以阻止注射液氧化变质。
试验方法：取四份盐酸帕洛诺司琼56mg(以C19H24N2O计为50mg)，用1000ml注射用水搅拌溶解，分别加入0、0.1、0.3、0.5及0.7g的依地酸钙钠，再加入770mg枸橼酸和1860mg的枸橼酸钠使之成为浓度为0.01mol/L、pH为5.0的缓冲体系，用0.45μm微孔滤膜过滤，分装于5ml的棕色安瓿中，封口，于100℃流通蒸汽灭菌30分钟。对注射剂的性状、pH值、含量及有关物质进行检测，结果见表2。
表2不同量抗氧化剂的抗氧化结果
表2数据可见，用量为0.5g的依地酸钙钠具有明显的抗氧化作用。在0.5g的依地酸钙钠的存在下，样品的pH、可见异物、有关物质较小、含量较高，表明每1000ml加入0.5g的依地酸钙钠用量即已满足要求，所以确定依地酸钙钠用量为2.5g。
试验例3盐酸帕洛诺司琼注射液中甘露醇用量的试验
人的血浆有一定的渗透压，平均约为7.4个大气压。凡与血浆具有相同渗透压的溶液称为“等渗溶液”。临床上常用的等渗溶液为0.278mol·L-1葡萄糖溶液，毫渗量溶液浓度为278mOsm·L-1(近似于280mOsm·L-1)。本试验加入甘露醇做渗透压调节剂，经计算需盐酸帕洛诺司琼注射液每1000ml加入41.5克，才能调节为“等渗溶液”，故处方中甘露醇的加放量为每1000ml加甘露醇41.5g。
试验例4盐酸帕洛诺司琼注射液中活性炭加入方法和用量的选择
活性炭是一种吸附性很强的物质，常用于制备注射液。它既能吸附不溶性微粒，又能吸附杂质、热原、色素，因此能提高注射液质量。但它在吸附杂质的同时，也能吸附主药，而且用量过大造成过滤困难，所以活性炭用量直接影响注射液的质量。活性炭的用量没有具体的规定，应视原料药的质量、药液可见异物等而定，一般活性炭用量范围为0.01～0.3％(W/V)。若用量不足，达不到预期的效果；若用量过大，除造成活性炭的浪费外，其所含的水溶性杂质可对药液造成污染。因此我们以活性炭用量为0、0.01％、0.05％、0.1％(W/V)，进行了试验，具体操作如下：
称取盐酸帕洛诺司琼56mg(以C19H24N2O计为50mg)用适量注射用水溶解并稀释至1000ml，分成4组，1组不加活性炭，另3组分别加入活性炭为溶液总量的0.01％、0.05％、0.1％(W/V)搅拌均匀，保温(约60℃)吸附15min，用0.45μm～0.22μm的复合微孔滤膜滤至澄明，分装于5ml棕色安瓿中，100℃流通蒸汽灭菌30min。放冷后检查其可见异物和含量，结果见表3。
表3活性炭用量筛选试验
结果表明：盐酸帕洛诺司琼注射液从加入0.01％活性炭开始，其可见异物基本合格但其含量在不断下降，与不加活性炭比较，下降较多(同一测定条件下比较)，由于本品中盐酸帕洛诺司琼含量微少，仅0.25mg/5ml，根据此特点，因此在实际生产工艺中仅用0.05％活性碳吸附辅料溶液。
试验例5盐酸帕洛诺司琼注射液灭菌工艺的研究
(1)样品的制备：
原料为：盐酸帕洛诺司琼280mg(以C19H24N2O计为250mg)，辅料为甘露醇207.5g、枸橼酸钠9.32g、枸橼酸3.85g和依地酸钙钠2.5g，注射用水加至5000ml，制成1000支，规格：5ml:0.25mg(以C19H24N2O计)。
称取上述重量的枸橼酸钠、枸橼酸、甘露醇和依地酸钙钠，加2000ml的注射用水，搅拌溶解，再加入溶液总量0.05％(W/V)的药用活性炭，60℃保温吸附15分钟，过滤后备用。
称取上述重量的盐酸帕洛诺司琼于1000ml的注射用水中，溶解完全，备用。
将前述两种溶液混合后，加注射用水定容至5000ml，调节pH值4.5～5.5，用0.22μm的微孔滤膜滤过至澄明。
取上述液体检测其含量、pH值，待合格后灌装于5ml棕色安瓿中，封口，制备了批号为06031901的中间品1000支(规格：5ml:0.25mg)，进行灭菌条件的筛选。
(2)灭菌条件考察：
采用湿热灭菌法，取06031901批中间品100支，各4份，分别于100℃流通蒸汽灭菌40min，116℃灭菌30min、116℃灭菌40min、116℃灭菌45min。检查各条件下的性状、pH值、可见异物、有关物质及含量。具体结果见表4：
表406031901批中间品灭菌后检测结果
结果表明：随着灭菌温度和时间的增加，上述各项目检查结果相近，样品的有关物质及含量变化均不大。
为确保灭菌效果，除了采用以上指标来评价灭菌工艺外，还采用了F0值对该工艺作评价，各灭菌条件F0值见表5：
计算公式F0＝Δt∑10(T-121)/10
F0——标准灭菌时间
Δt——测量被灭菌物温度的时间间隔
T——每个时间间隔Δt所测得被灭菌物温度
表5各灭菌条件F0值表
灭菌条件 F0值 100℃灭菌40min 0.32 116℃灭菌30min 9.48 116℃灭菌40min 12.64 116℃灭菌45min 14.22
综上所述，采用116℃灭菌40min时，F0值达到12，由表4可看出，该灭菌条件灭菌后与灭菌前相比，有关物质及含量变化不大，因此，为了既能有效地控制好产品质量，又能保障该注射液的安全，确定最佳灭菌条件为116℃灭菌40min。
(3)无菌检查：
取中间品于116℃灭菌40min后，进行无菌检查，结果见表6。
表6无菌检查结果
灭菌条件 无菌 无菌 符合规定 116℃灭菌40min 符合规定
由上表结果可知，采用该条件灭菌后的样品无菌检查符合规定。
(4)辅料与盐酸帕洛诺司琼的相互作用
按步骤(1)的方法制成盐酸帕洛诺司琼注射液样品溶液，按步骤(1)的方法不加盐酸帕洛诺司琼制成辅料溶液，按步骤(1)的方法不加辅料配制对照品溶液，三种溶液均于116℃灭菌40min。精密吸取以上三种溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，辅料溶液的保留时间在2分钟左右，而样品溶液的主峰保留时间为9分钟左右，对照品溶液主峰保留时间为9分钟左右。由此可见辅料与盐酸帕洛诺司琼无相互作用。
实施例2盐酸帕洛诺司琼注射液的制备
原料为：盐酸帕洛诺司琼280mg(以C19H24N2O计为250mg)，辅料为甘露醇207.5g、枸橼酸钠9.32g、枸橼酸3.85g和依地酸钙钠2.5g，注射用水加至5000ml，制成1000支，规格：5ml:0.25mg(以C19H24N2O计)。
称取上述重量的枸橼酸钠、枸橼酸、甘露醇和依地酸钙钠，加2000ml的注射用水，搅拌溶解，再加入溶液总量0.05％(W/V)的药用活性炭，60℃保温吸附15分钟，过滤后备用。
称取上述重量的盐酸帕洛诺司琼于1000ml的注射用水中，溶解完全，备用。
将前述两种溶液混合后，加注射用水定容至5000ml，调节pH值4.5～5.5，用0.22μm的微孔滤膜滤过至澄明。
取上述液体检测其含量、pH值，待合格后灌装于5ml棕色安瓿中，封口，于116℃热压灭菌40min，冷却，检查其可见异物，贴标签，包装。
实施例3盐酸帕洛诺司琼注射液的中试
按表7处方制备中试产品三批，各10000支，收率见表7。
表7三批中试样品配比及收率
表8列出了中试样品的检验结果：
表8三批样品检验结果
由上表可知，中试所制备的三批(06040301，06040501，06040701)样品，各指标均符合规定。
试验例6盐酸帕洛诺司琼注射液的光照试验
将实施例2制备的注射液置照度为4500±500LX的强光下照射10天，分别于第5、10天取样与0天比较，结果见表9。
将实施例2制备的注射液置60℃下放置10天，分别于第5、10天取样与0天比较，结果见表9。
将实施例2制备的注射液置2～4℃条件下放置10天，分别于第5、10天取样与0天比较，结果见表9。
表9样品影响因素考察结果
由上表可知，本品经高温和强光照射10天有关物质及含量测定与0天比较，有关物质有所增加(高温后有关物质增加最大)、含量有所下降，说明本品对光和热均不太稳定。低温条件下放置10天有关物质及含量测定与0天比较，有关物质无明显增加，含量变化不大，说明本品对低温比较稳定。
试验例7盐酸帕洛诺司琼注射液的冻融试验
取实施例2制备的注射液，置于-15℃放置2天，取出，置40℃条件下放置2天，反复3次，于第12天时取样，按稳定性重点考察项目进行检测，结果见表10。
表10冻融试验结果
结论：本品经冻融试验后有关物质略有增加，含量有所下降，故本品在贮藏运输的过程中应避免温差过大。
通过影响因素试验考察和冻融试验，可观察到盐酸帕洛诺司琼注射液在高温和光照条件下不太稳定，且不宜放置于较低温度，将本品贮藏条件暂定为：避光、20～25℃保存，避免冷冻。
试验例8盐酸帕洛诺司琼注射液容器的选择
根据影响因素的结果和该原料药的理化性质可知，盐酸帕洛诺司琼对光不稳定，需要避光贮存。因此我们制备的盐酸帕洛诺司琼注射液，选择容器仍为棕色安瓿，采取避光保存。