用于植物胚胎圆形顶部三维成像的方法和系统.pdf

本发明提供对位于植物胚胎子叶末端的圆形顶部三维成像的方法和系统。圆形顶部的三维信息可以通过在沿胚胎轴向变换的焦点平面上扫描圆形顶部，或利用多个以共聚焦方式设置的相机对圆形顶部成像而获得。也可以通过用多彩色光线照射圆形顶部而获得，其中多波长的光线在沿胚胎轴向的多焦点平面被聚焦，从而基于圆顶表面每一个点上精确聚焦和反射的光线的波长，可以获得圆顶的高度信息。三维信息可以用来确定圆形顶部的各种生态学特征(例如尺寸，形状，纹理等)，这些特征又可以用来评价胚胎的发芽力。

1.  一种对植物胚胎的圆形顶部进行三维成像的方法，包括：
获取植物胚胎圆形顶部的三维信息；
在获取的三维信息的基础上确定圆形顶部的生态学特征；和
在确定的生态学特征的基础上根据胚胎推定的发芽力将其分类。

2.  权利要求1的方法，其中生态学特征包括一个或多个的圆形顶部的尺寸，形状，颜色和表面纹理。

3.  权利要求1的方法，其中生态学特征包含圆形顶部的尺寸，并且与圆形顶部尺寸较小的胚胎相比，圆形顶部尺寸较大的胚胎被归于具有相对较强的推定的发芽力。

4.  权利要求1的方法，其中获取圆形顶部三维信息的步骤包含：
在植物胚胎圆形顶部相对的位置提供一个成像探测器；
利用成像探测器，在沿胚胎轴向的第一个焦点平面上摄制圆形顶部的第一张图像；
利用成像探测器，在沿胚胎轴向的第二个焦点平面上摄制圆形顶部的第二张图像；和
组合第一和第二张图像以获取圆形顶部的三维信息。

5.  权利要求4的方法，其中成像探测器含有相机。

6.  权利要求4的方法，其中成像探测器含有光电探测器，而且所述方法中包含使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)。

7.  权利要求1的方法，其中获取圆形顶部三维信息的步骤包括；
设置第一个成像探测器用于摄制植物胚胎圆形顶部的第一张图像；
设置第二个成像探测器以共聚焦的方式摄制圆形顶部的第二张图像，其中第一张图像的目标平面与第二张图像的目标平面排列成一个夹角；和
处理第一和第二张图像以获取圆形顶部的三维信息。

8.  权利要求1的方法，其中获取圆形顶部三维信息的步骤包括：
设置彼此之间相对的多色光源，双色镜，透镜，过滤器和分光计，这样从光源发出的多色光线透过双色镜和透镜传播到圆形顶部，以及从圆形顶部反射的光线透过透镜和双色镜传播到过滤器和分光计上；
用多色光线照射圆形顶部；和
在分光计接收的反射光线的基础上获取圆形顶部的高度信息。

9.  权利要求1的方法，其中植物胚胎是体细胞胚胎。

10.  权利要求1的方法，其中植物胚胎是针叶树胚胎。

11.  获取植物胚胎的圆形顶部三维信息的系统，包括：
与植物胚胎的圆形顶部相对安置的成像探测器，该成像探测器被装配成沿胚胎轴向改变其焦点平面，从而在沿胚胎轴向的第一个焦点平面上摄制圆形顶部的第一张图像，并在沿胚胎轴向的第二个焦点平面上摄制圆形顶部的第二张图像；和
图像处理器，用于组合第一和第二张图像以获取圆形顶部的三维信息。

12.  权利要求11的系统，其中图像探测器含有相机。

13.  权利要求11的系统，包含激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)系统。

14.  获取植物胚胎的圆形顶部三维信息的系统，包括：
用于摄制植物胚胎圆形顶部第一张图像的第一成像探测器；
以共聚焦方式用于摄制圆形顶部第二张图像的第二成像探测器，其中第一个图像的目标平面与第二个图像的目标平面有一个夹角；和
图像处理器，用于处理分别由第一和第二成像探测器摄制的第一张和第二张图像以获取圆形顶部的三维信息。

15.  权利要求14的系统，其中第一和第二成像探测器包含相机。

16.  获取植物胚胎的圆形顶部三维信息的系统，包括：
彼此之间相对排列的多色光源，双色镜，透镜，过滤器和分光计，这样从光源发出的多色光线经双色镜和透镜传播到圆形顶部上，以及从圆形顶部反射的光线经透镜和双色镜传播到过滤器和分光计；和
在分光计接收的反射光的基础上用于获取圆形顶部高度信息的处理器。

用于植物胚胎圆形顶部三维成像的方法和系统
发明领域
本发明涉及植物胚胎的成像，用于确定进一步处理的适宜性，更特别地涉及对位于植物胚胎子叶末端的圆形顶部三维成像，以便在确定的该圆顶的生态学特征基础上，选择合适的胚胎接入人造种子中。
发明背景
多年来，通过组织培养，被选择的植物品种的再生已经取得了商业成功。该技术已经使遗传上完全相同的被选择的观赏植物，农作物和森林物种的大规模生产成为可能。最后一类中的木材植物大概已经处于巨大的挑战中。在70年代，利用器官发生技术在针叶树上已经获得了一些成功，该技术是将芽或其它器官置于培养基上，最终在培养基上重复多次。新产生的芽被置于不同的培养基上以诱导根的发育。随后，有根的芽被种植到土壤中。
尽管针叶树的器官发生是一项重大发展，但是由于需要大量的手工操作，其成本很高。也有一些对可能的遗传改变的忧虑。10年后，体细胞胚胎发生取得了足够的成功率，成为针叶树组织培养占主导地位的入门技术。利用体细胞胚胎发生，外植体，通常是种子或种子胚胎，被置于起始培养基上，外植体在该培养基上增殖生成众多的遗传上完全相同的未成熟的胚胎。这些胚胎保持培养很长的一段时间，增殖长大成为所需的克隆。最终，未成熟的胚胎被置于发育或成熟培养基上长成成熟种子胚胎的体细胞类似物。本说明书中使用的“体细胞”胚胎是一种由实验室培养全能性植物细胞或诱导多胚细胞分裂发育成的植物胚胎，它与合子胚胎相反，后者是一种从相应植物的种子中分离出的植物胚胎。随后逐个地选择这些胚胎，并置于发芽培养基上使之进一步发育。或者，也可以选择将这些胚胎用在人工种子中，如已知的人造种子。
现在关于植物胚胎发生有大量的通用技术文献和正在增加的专利文献。在Gupta等的美国专利NO.5,036,007和NO.5,236,841；Roberts的5,183,757；Attree等的5,464,769以及Gupta的5,563,061中，可找到针叶树组织培养的方法的例子。在Carlson等的美国专利NO.5,701,699中可进一步找到一些人造种子的实例，这些专利中所披露的内容专门在此引作参考。简单地说，典型的人造种子用不同的材料如纤维素材料制成种子外衣(或被囊)，填入合成的配子体(一种发芽培养基)，其中容纳被管样约束包围的胚胎。人造种子种入土壤中后，种子外衣内的胚胎生根并在发芽过程中沿着种子外衣最终脱离约束。
胚胎发生方法中，较为劳动集中和主观的步骤之一是适于发芽(例如接入人造种子)的单个胚胎的选择。从成熟培养基得到的胚胎可能处在成熟和发育的若干阶段。利用若干目测的筛选标准，优选那些最可能成功地发芽和长成正常植株的胚胎。检定诸如轴对称，子叶发育，表面纹理，颜色和其它的生态学特征，而且要在胚胎被允许传代用于发芽之前采用及格/不及格测试。这是一个需要熟练的却很沉闷的手工劳动，耗时且成本高。更进一步地说，当最终需要生产数以百万计的植株时，这将对大量生产造成障碍。
已经有人建议利用一些仪器成像分析来进行胚胎选择以补充或替代上述的目测。例如，PCT申请No.PCT/US 00/40720(WO01/13702)公开了一种用于人造种子的胚胎传送系统，包括一个获得并数字储存胚胎图像的成像相机。随后图像被输入到计算机中，根据胚胎可用性(例如发芽和长成正常植株的可能性)在预定参数(轴对称，子叶发育，表面纹理，颜色等)的基础上，利用PCT申请No.PCT/US99/12128(WO99/63057)公开的方法将胚胎分类。一般是对胚胎(一般长达大约5mm)的三个直角视图进行成像和分析，即顶视图，侧视图和端视图。因此，这两篇PCT申请所披露的内容被特别地引入作为参考。
本发明涉及一种方法和系统以补充现有的仪器成像分析，从而提高了根据胚胎的可用性，特别是用于接入人造种子地可用性，而将其分类的全过程处理的效率和效力。
发明概述
本发明提供了一种对植物胚胎圆形顶部进行三维成像的方法和系统。本发明的基础是对圆形顶部(尺寸，体积，形状等)多方面的生态学特征的测定，这些是胚胎推定的发芽力(即发芽后上胚轴快速发育的潜力)可信的指标。本方法通常包括三个步骤。首先，获取植物胚胎的圆形顶部的三维信息。第二步，在三维信息的基础上，确定圆形顶部的生态学特征。第三步，在确定的生态学特征的基础上，根据胚胎推定的发芽力将其分类。
可以利用不同的系统来获取圆形顶部的三维信息。在一个具体实施方式中，系统中包括一个安置在植物胚胎圆形顶部相对位置的成像探测器。沿着胚胎的轴向设置成像探测器，从而分别在各个变焦平面上对圆形顶部进行多次成像。由此得到的多个二维图像随后被组合到一起产生圆形顶部的三维信息。
在另一个具体实施方式中，用于获取圆形顶部三维信息的系统包括以共聚焦方式设计的多次成像探测器，其中多次成像探测器目标平面彼此之间有一个夹角。由这些多次成像探测器拍摄到的图像经处理后可获得圆形顶部的三维信息。
还是在另一个具体实施方式中，用于获取圆形顶部三维信息的系统包括彼此相对设置的一个多色光源，一个分光镜，一个具有色差的透镜和一个分光计，这样从光源发出的多色光经过分色镜和透镜照射到圆形顶部上，从圆形顶部反射的光线经过分色镜和透镜照射到分光计上。操作中，光源被用来以多色光线照射圆形顶部。由于透镜有色差，多波长的光线是在沿着胚胎轴向的多焦点平面上被聚焦的，所以在沿轴视野中任何已给出的点上，只有一种波长完全聚焦并反射回分光计。因此，通过对反射光的处理，可以获得圆形顶部的精确的高度信息。
本发明的用于对每个胚胎圆形顶部三维成像的任何一个系统可被用在上文背景部分所描述的二维成像分析阶段的上游或下游，使得目前的胚胎仪器成像分析得以补充。特别的是，本发明与传统的图像分析相结合，提高了依据胚胎可用性将其分类的全过程处理的效率和效力，因此在规模化选择适于接入人造种子的所需的胚胎中是很有用的。
附图简要描述
当结合附图，通过参考下面的详细描述，将更容易领会和更好地了解前述的情况和许多本发明所呈现的优点，其中：
图1A和1B采用多张沿胚胎轴向在不同变焦平面上的圆形顶部的图像，阐明用于获得植物胚胎圆形顶部三维信息的方法和系统的一种具体实施方式；
图2分别用多个以共聚焦方式设置的相机来拍摄多张圆形顶部图像，阐明获得植物胚胎圆形顶部三维信息的方法和系统的另一种具体
实施方式；
图3仍然是阐明获得植物胚胎圆形顶部三维信息的方法和系统的另一种具体实施方式，分别以多波长聚焦在多焦点平面，同时拍摄多张圆形顶部的“图像”。
优选具体实施方式的详细描述
参照图1A，发明人确定位于胚胎14的子叶末端12上的圆形顶部10的生态学特征是胚胎发芽力的可信指标，也就是发芽后上胚轴快速发育潜力。圆形顶部，或者苗的顶部分生组织是大多数长成植物躯干的细胞的形成位点。本说明书中采用的“苗”是指发育成植物地上部分的全能性植物组织单元的一部分，包括子叶，上胚轴，和/或下胚轴。在生长活跃的苗中，细胞以非常快的速度分裂，而且这些细胞依次延长或膨胀，其结果是苗的高度的生长。原始叶片11长在圆形顶部的侧面。由于已经发现圆形顶部对发芽后的上胚轴快速发育至关重要，所以它的生态学特征(尺寸，形状，颜色，表面纹理等)被确定为胚胎质量的可信的指标。特别地，圆顶的生态学特征被确定为对其发芽后，大约第一个月中的早期生长速率具有预言性。大体上已经确定的是，越大和越匀称的圆顶，胚胎发芽后的快速生长越有可能，尽管圆形顶部的其它生态学特征也有可能被用作胚胎可用性的指标。
本发明涉及对植物胚胎的圆形顶部的三维成像，目的在于在确定的圆形顶部的生态学特征的基础上，根据胚胎的可用性(例如发芽后上胚轴迅速发育的可能性)对其分类。依照本发明的方法，首先，对位于植物胚胎子叶末端的圆形顶部进行三维成像。然后，在三维成像的基础上，利用本领域技术人员已知的合适的图像识别/分析软件来确定圆形顶部的各种生态学特征。圆形的生态学特征包括尺寸(体积)，形状，颜色，表面纹理等。最后，利用确定的生态学特征根据胚胎的可用性将其分类。最后一步可以根据上面讨论过的PCT申请No.PCT/US99/12128(WO99/63057)披露的分类方法来进行。该PCT申请在对已知生态学特征和已知品质的植物胚胎样品进行分析的基础上，描述了一种开发分类模型的方法。
对圆形顶部三维成像的各种方法都是可能的。依然参考图1A，在一个具体实施方式中，方法包括使用通常沿胚胎14的轴17并且面向圆形顶部10而设置的相机16。相机16在第一个焦点平面18a聚焦，拍摄圆形顶部10的第一张图像20a，然后在第二个焦点平面18b聚焦，拍摄圆形顶部10的第二张图像20b，等等。可以设置适当的排列将任何散焦信息(在焦点平面的两侧)减到最少。沿胚胎14轴17在不同变焦平面上摄制的图像20a，20b和20c随后被传输到图像处理器21并被处理(例如组合)，以提供圆形顶部10的三维信息。举例来说，二维图像20a，20b和20c可被组合成显示圆顶10的高度和直径的单一三维图像。
可采用任何一种合适的相机16，优选带有电荷耦合装置(CCD)与数字储存装置相连的数字相机，这样可以对接下来获取的图像进行数字处理。进一步可以理解的是，圆形顶部10的图像可以通过任何图像探测器来拍摄(不局限于相机)，该探测器也许配有适当的图像处理或图像再现软件。例如，参照图1B，上面已描述过的多聚焦平面方法的一个特殊应用是激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)，正如本领域知晓的，它是使用光电探测器或光电倍增管22在不同的变焦平面18上探测来自物体的反射光。在LSCM中，激光扫描样品，利用图像再现软件完成样品的三维重建。具体而言，从光源26发出的照射光(激光)穿过照明针孔27照到双色镜(光线分离器)28上，它改变了光线的方向使之照到物镜30上。透镜30将光线在焦点平面18上聚焦成一个焦点，该焦点的图像被反射回来，经透镜30被传输，穿过双色镜28到达探测器针孔32，由光电探测器22来接收。这时，任何散焦的信息，以虚线31表示，大体上被探测器针孔32挡住。光电探测器22所接收的焦点内的反射光随后被转换成数字信号，产生象素基点的数字图像。激光扫描可以在不同的变焦平面18上进行(以箭头34表示)，通过计算机控制的细小幅度马达以0.1微米这样小的增量移动显微镜载物台。样品的三维重建可以通过将连续获取的二维切片重叠起来而生成。
参照图2，在另一个具体实施方式中，圆形顶部的三维成像方法包括分别用一定角度设置的双相机36和38以共聚焦方式拍摄圆形顶部10的图像。这里“共聚焦方式”是指一种两个成像系统(例如两个相机)共有一个焦点的设置。具体而言，设置双相机36和38以使它们各自的目标平面(也就是要被成像的含有目标的平面)彼此之间呈一个夹角。双相机36和38得到的图像随后可以由图像处理器21组合处理从而提供圆形顶部10的三维信息。应该知道的是，可以使用两个或更多的相机，其目标平面设置成彼此之间呈一定的夹角。
仍然是在另一个具体实施方式中，参照图3，植物胚胎圆形顶部的三维成像方法包括本领域知晓的准共聚焦延展场表面检测(QCEFSS)。该方法实质上是当采用多色点光源时，在传统的共聚焦设备，如图1B描述的LSCM中通常所遇到的色差。具体而言，从多色点光源42发出的白色光线40穿过照明针孔27和光线分离器28到达物镜(具有色差)30上并被聚焦。这时，光线以变换波长λ1，λ2和λ3被分别聚焦在变换的焦点平面18a，18b和18c上。但是，在沿轴视野任何已给出的点上，只有一个波长完全聚焦。例如，在用来举例说明的具体实施方式中，只有波长为λ2的光线被聚焦在目标物O的表面P点上，该点与焦点平面18b相交。因此波长为λ2的聚焦光线透过透镜30和光线分离器28被反射回针孔(立体过滤罩)44，然后到达分光计46，而所有的散焦信息(例如波长为λ1和λ3的光线)被针孔44挡住。因此，通过用该方式二维扫描目标物O，QCEFSS可以获得一系列的单色图像，每个单色图像与目标物一定的高度H相对应。合适的图像处理器21可以被用来组合这些单色图像，以此得到目标物准确的高度信息，其分辨率等级为1nm。不像图1B所示的传统的共聚焦设备那样，QCEFSS方法不需要改变焦点平面，因为多波长的光线是同时在多个焦点平面上聚焦的(尽管实际上只有一个波长在被观察物体表面的一个特殊点上聚焦)。合适的QCEFSS设备可获自Sciences et Techniques Industrielles de la Lumiere of France。
很明显，本领域技术人员应该能理解，其它的光学测量法或微地型测量方法可被用来获取植物胚胎的圆形顶部的三维信息，包括使用差示干扰仪，光谱反射仪等。
在另一个具体实施方式中，本发明的用于获取植物胚胎圆形顶部三维信息的系统可以被加到一个自动的人造种子输送/制造作业线上，正如上面讨论过的PCT申请No.PCT/US00/40720(WO01/13702 A2)中所披露的。例如，上面描述过的任何一个获取圆形顶部三维信息的具体实施方式，可以安装在用于输送胚胎的传送带上，作为整个胚胎输送/制造作业线的一部分，这样的胚胎圆形顶部可以被三维成像用于分析。正如上面所描述的，一般地，该输送/制造作业线包括一个获取并数字储存胚胎二维图像(例如每个胚胎的顶视图，侧视图和端视图)的成像相机，用米根据胚胎的可用性将其分类。本发明的用于对每个胚胎圆形顶部三维成像的系统可以用在二维成像阶段的上游或下游，从而对目前的仪器成像分析进行补充，以提高胚胎分类整个处理的效率和效力。特别地，本发明对于大规模筛选适于接入人造种子的所需的胚胎，并由此大规模生产人造种子是很有用的。
当本发明的优选具体实施方式被阐明和描述时，很明显，其中可以进行各种改变并不脱离本发明实质和范围。