治疗癌症的抗体和方法.pdf

治疗癌症的抗体和方法
关于序列表
本申请与序列表一起以电子形式递交。序列表以文件名BIONO.002WO_Sequence.txt提供，文件大小为约31kb，创建于2012年10月26日。电子形式序列表的信息通过引用以其整体并入本文。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年11月1日递交的名称为“治疗癌症的方法(METHODS OF TREATING CANCER)”的美国临时专利申请61/554,436的优先权，且本申请还要求于2011年11月1日递交的名称为“抗-GPR49抗体(ANTI-GPR49ANTIBODIES)”的美国临时专利申请61/554,440的优先权，它们均通过引用在此整体并入本文。
技术领域
本申请总体涉及癌症生物学领域。更具体地，实施方案涉及抗-GPR49的抗体和这类抗体的应用。一些实施方案涉及抗-GPR49的单克隆抗体、人源化抗体或完全的人抗体，表达这类抗体的杂交瘤或其他细胞系，编码这类抗体的核酸和包含编码这类抗体的核酸的载体，以及用这类抗体治疗癌症的方法。
发明背景
G蛋白偶联受体49(GPR49)也称LGR5/HG38/FEX，属于结构上类似于糖蛋白激素受体的包含富含亮氨酸重复单元的G蛋白偶联受体(LGR)。LGR分为3个亚组：(1)糖蛋白激素受体，其包括促甲状腺激素(TSH)受体、促卵泡激素(FSH)受体和促黄体激素(LH)受体；(2)松弛素受体LGR7和LGR8；以及(3)GPR48、GPR49和LGR6。GPR49表达于一些组织包括肠、骨骼肌、胎盘、脑和脊髓中。然而，关于GPR49的功能所知甚少。
发明概述
一些实施方案涉及治疗哺乳动物的癌症的方法，包括将治疗量的以K_d小于1x10^-9M结合G-蛋白偶联受体49(GPR49)多肽的单克隆抗体给予至哺乳动物，其中所述GPR49多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，且所述治疗量足以治疗癌症。在一个方面，所述治疗量的抗体足以减少哺乳动物的肿瘤生长。在另一个方面，所述减少的肿瘤生长测量为减少的肿瘤体积。在又一个方面，相比对照，所述治疗量的抗体足以增加哺乳动物的存活。在另一个方面，所述抗体以K_d小于1x10^-12M结合GPR49多肽。
在其他方面，所述抗体为IgG类抗体、IgG1类抗体、人抗体或小鼠抗体。在另外的方面，所述GPR49多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
在又一方面，所述抗体为单克隆抗体78F05、5D6.3、1B3.5、14A8.1、76C12、18G7.1、5B10.1、14F7.1、5F2.5或7C3.4。
在不同的方面，所述抗体竞争性抑制选自71C10、86C11、66D05、76C12、78F05和76B04的单克隆抗体，或由杂交瘤细胞产生的选自以下的单克隆抗体：单克隆抗体2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2。
某些实施方案涉及制备特异性结合GPR49的抗体或其片段的方法，包括培养含有包含编码权利要求1所述抗体的多核苷酸序列的载体的宿主细胞；以及回收所述抗体或其片段。
附图说明
图1为显示通过ELISA的抗-GPR49Fab与人GPR49-Fc结合的柱状图。
图2为显示通过FACS的抗-GPR49Fab与人GPR49-HA转染的HEK293E细胞结合的柱状图。
图3的图显示了通过FACS结合的CHO-GPR49细胞(图3A)或亲本CHO细胞(图3B)上3个候选Dyax Fab的EC50值。
图4为显示通过几何平均值(图4A)或阳性细胞百分比(图4B)测量的GPR49Fab与SW620结肠肿瘤细胞结合的一系列柱状图。
图5A为显示通过FACS几何平均值测量的GPR49Fab与SW480结肠肿瘤细胞结合的柱状图。
图5B为显示通过FACS阳性细胞百分比测量的GPR49Fab与SW480结肠肿瘤细胞结合的柱状图。
图5C为用于结合SW480结肠肿瘤细胞的不同浓度的76C12Fab的一组FACS直方图。
图6A为显示通过FACS几何平均值测量的GPR49Fab与HCT116结肠肿瘤细胞结合的柱状图。
图6B为显示通过FACS阳性细胞百分比测量的GPR49Fab与HCT116结肠肿瘤细胞结合的柱状图。
图6C为用于结合HCT116结肠肿瘤细胞的不同浓度的76C12Fab的一组FACS直方图。
图7A-C为显示通过FACs的鼠GPR49抗体与表达CHOGPR49-Flag-His的细胞结合的曲线图。
图8A和8C为显示通过FACs的鼠GPR49抗体与表达CHOGPR49-Flag-His的细胞结合的曲线图。图8B和8D的表格分别显示图8A和8C的抗体的EC50。
图9A、9C、9E和9G为显示通过直接ELISA的第二代小鼠抗体与GPR49结合的曲线图。图9B、9D、9F和9H的表格分别显示图9A、9C、9E和9G的抗体的EC50。
图10A为显示来自分选的GPR49+、分选的GPR49-或未分选的结肠肿瘤细胞的肿瘤球平均数的柱状图。图10B为肿瘤球测定中GPR49+和GPR49-细胞的显微图像。
图11为显示接种至小鼠的GPR49+MoFlo分选的结肠肿瘤细胞随时间的肿瘤体积(图11A)和体重(图11B)曲线图。
图12A为显示小鼠中GPR49抗体76C12随时间的血清浓度曲线图。图12B为显示小鼠中每周一次给药剂量的抗-GPR49抗体76C12随时间的模拟血清浓度曲线图。图12C为显示单次腹腔内给药后小鼠中抗-GPR49抗体C12IgG1的药代动力学参数的表格。
图13A为显示用IgG1对照mAb、抗-GPR49mAb76C12(C12)或伊立替康(Irinotecan)处理的小鼠中原代结肠肿瘤体积随时间的曲线图。图13B为显示第62天的T/C值的图。
图14为显示用IDEC152对照抗体、76C12(ET CSC mAb)、带化疗媒介物对照的mAb对照，或带化疗媒介物对照的ET CSC mAb处理的小鼠中肿瘤体积随时间的一系列曲线图。
图15为显示未处理的小鼠或用伊立替康和IgG1对照、76C12(ETmAb)，或伊立替康和76C12(ET mAb)处理的小鼠随时间的存活百分比的Kaplan-Meier曲线。
图16A为显示用IDEC152对照抗体、伊立替康和IDEC152对照抗体，或76C12(C12)抗体处理的小鼠中DLD-1结肠异种移植物肿瘤生长随时间的曲线图。
图16B为显示用葡萄糖对照、伊立替康和对照IgG1，或伊立替康和76C12(ET12)抗体处理的小鼠中DLD-1结肠异种移植物肿瘤生长随时间的曲线图。
图17为显示具有K-Ras、PI3K、PTEN和p53突变的原代结肠癌模型中肿瘤生长抑制的曲线图。
图18为显示肿瘤生长抑制百分比的图表。
图19为显示通过GPR49mAb+伊立替康组合处理的、具有K-Ras、PI3K、PTEN和p53突变的CRC肿瘤的肿瘤抑制百分比的图表。
图20为显示具有K-Ras、PI3K、PTEN、H-Ras、APC、TP53、FGFR2、VANGL2、STK11、JAK2和RB1突变的原代结肠癌模型中肿瘤生长抑制的曲线图。
图21A为显示在具有K-Ras、PI3K、PTEN和p53突变的结肠癌肿瘤中抗-GPR49抗体降低癌症干细胞频率的图表。
图21B为显示抗-GPR49抗体处理抑制具有K-Ras、PI3K、PTEN和p53突变的CRC肿瘤在移植到第二受体小鼠时再形成新肿瘤的能力的图。
图22为显示GPR49mAb18G.7.1处理减少来自具有K-Ras、PI3K、PTEN、H-Ras、APC、TP53、FGFR2、VANGL2、STK11、JAK2和RB1突变的CRC肿瘤的癌症干细胞数目的图表。在用此前已按文中所述处理的原代CRC肿瘤细胞进行的一系列再移植、有限稀释检测中测量CSC频率。
图23为显示抗-GPR49抗体+伊立替康处理抑制具有K-Ras、PI3K、PTEN、H-Ras、APC、TP53、FGFR2、VANGL2、STK11、JAK2和RB1突变的CRC肿瘤在再移植到第二受体小鼠后生长的能力的曲线图。
发明详述
本申请的一些实施方案涉及抗-GPR49的抗体和用这类抗体治疗癌症。不同的实施方案涉及抗-GPR49的人源化抗体或完全的人抗体、表达这类抗体的杂交瘤或其他细胞系，编码这类抗体的核酸和包含编码这类抗体的核酸的载体，以及用这类抗体治疗癌症的方法。
抗-GPR49抗体
数个实施方案涉及抗-GPR49抗体。如本文所用，GPR49包括但不限于，人GPR49，包括NCBI登录号NP_003658.1(SEQ ID NO:1)所示的多肽，其由NM_003667.2(SEQ ID NO:2)中的编码性核苷酸序列或其片段所编码。NCBI登录号NP_003658.1的氨基酸序列和NM_003667.2的核苷酸序列通过引用以其整体完整并入本文。本文涉及的GPR49片段的实例包括GPR49胞外域、跨膜结构域或胞内域和其部分。
如本文所用，术语“抗体”包括但不限于，合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链Fvs(scFv)、Fab片段、F(ab′) 片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)(包括双特异性sdFv)和抗-独特型(抗-Id)抗体，以及上述中任一个的表位结合片段。本文提供的数个实施方案的抗体可具有单特异性、双特异性、三特异性或具有更大的多特异性。多特异性抗体可具有针对多肽的不同表位的特异性，或者可具有针对多肽以及异源表位，如异源多肽或固体支撑材料的特异性。参见，例如，PCT公开WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt,et al.,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利第4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819号；Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992)；其各自通过引用以其整体并入本文。
本文涉及的其他抗-GPR49抗体包括“寡克隆”抗体。如本文所用，术语“寡克隆”抗体是指不同单克隆抗体的预定的混合物。产生寡克隆抗体的方法为本领域已知。参见，例如，PCT公布WO95/20401“实施例部分”的实施例1；美国专利第5,789,208和6,335,163号；其各自通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中，寡克隆抗体由单个细胞中产生的针对一个或多个表位的预定的抗体混合物组成。在其他实施方案中，寡克隆抗体包含能够与普通轻链配对的多条重链，以产生具有多特异性的抗体(例如，PCT公布WO04/009618，其通过引用以其整体并入本文)。当预期靶向单个目标分子(例如，GPR49)上的多个表位时，寡克隆抗体尤其有用。本领域技术人员能够了解或确定哪种类型的抗体或抗体混合物适用于预期的目的和需要。具体地，数个实施方案的抗体包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即包含特异性结合GPR49抗原的抗原结合位点(例如，抗-GPR49抗体的一个或多个互补决定区(CDR))的分子。本文还具体地涉及，数个实施方案的抗体包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即包含特异性结合GPR49抗原的抗原结合位点(例如，抗-GPR49抗体的一个或多个互补决定区(CDR))的分子。
数个实施方案涉及按照下文实施例中所述制备的抗-GPR49的人Fab，包括抗体71C10、86C11、66D05、76C12、78F05和76B04，其结合人GPR49-Fc胞外域(GPR49-RFc)(SEQ ID NO:3)。如在实施例中所述，数个实施方案涉及这些Fab的全长的人IgG。
如在下文的实施例中所述，数个实施方案涉及针对人GPR49胞外域(GPR49-His)(SEQ ID NO:4)培育的小鼠单克隆抗体，包括抗体2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5和6G10.1。
如在下文的实施例中所述，数个实施方案涉及针对全长人GPR49培育的小鼠单克隆抗体，包括抗体14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2。
数个实施方案的抗-GPR49抗体可为免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可具有重链和轻链。一系列的IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY重链可与κ或λ形式的轻链配对。
数个实施方案涉及产生抗-GPR49抗体的轻链和/或重链的杂交瘤，所述抗体包括在下文的实施例中产生和描述的、命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个。在一个方面中，所述杂交瘤产生人源化或完全的人单克隆抗体的轻链和/或重链。
一些实施方案涉及编码抗-GPR49抗体的轻链或重链的核酸分子，所述抗体包括在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和 10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个。在一个方面，核酸分子编码人源化或完全的人单克隆抗体的轻链或重链。
不同的实施方案涉及包含一个或多个编码抗-GPR49抗体的轻链和/或重链的核酸分子的载体，所述抗体包括在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个。
其他实施方案涉及制备抗-GPR49抗体的方法，包括用至少一种编码抗-GPR49抗体的核酸分子转染至少一个宿主细胞，在所述宿主细胞中表达所述核酸分子，并分离所述抗体。在数个方面，该抗-GPR49抗体包括在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个。
在数个实施方案中，抗体能特异性结合GPR49和其抗原性片段，其解离常数或K_d(k_解离/k_结合)小于10^-5M，或小于10^-6M，或小于10^-7M，或小于10^-8M，或小于10^-9M，或小于10^-10M，或小于10^-11M，或小于10^-12M，或小于10^-13M。
在另一实施方案中，所述抗体能结合GPR49和/或其抗原性片段，其K_解离小于1×10^-3s^-1。在其他实施方案中，所述抗体结合GPR49和其抗原性片段，其K_解离小于10^-3s^-1、小于5×10^-3s^-1、小于10^-4s^-1、小于5×10^-4s^-1、小于10^-5s^-1、小于5×10^-5s^-1、小于10^-6s^-1、小于5×10^-6s^-1、小于10^-7s^-1、小于5×10^-7s¹、小于10^-8s^-1、小于5×10^-8s^-1、小于10^-9s^-1、小于5×10^-9s^-1或小于10^-10s^-1。
在另一实施方案中，所述抗体结合GPR49和/或其抗原性片段，其结合速率常数或k_结合速率为至少10^-5M^-s^-1、至少5×10^-5M^-1s^-1、至少10^-6M^-1s^-1、至少5×10^-6M^-1s^-1、至少10^-7M^-1s^-1、至少5×10^-7M^-1s^-1，或至少10^-8M^-1s^-1，或至少10^-9M^-1s^-1。
另外的实施方案包括具有某些优选的生化特征如特定的等电点(pI)或熔解温度(Tm)的抗体。
在一个实施方案中，所述高亲和力抗体具有的pI范围为5.5-9.5。在一个实施方案中，数个实施方案的高亲和力抗体的Tm范围为约65℃至约120℃。
数个实施方案的抗体还包括那些抗体，其在哺乳动物(例如，人)中具有的半衰期(例如，血清半衰期)为：大于1天、大于2天、大于3天、大于4天、大于5天、大于6天、大于7天、大于8天、大于9天、大于10天、大于15天、大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月，或大于5个月。所述抗体在哺乳动物(例如，人)中增加的半衰期导致所述抗体或抗体片段在哺乳动物中具有更高的血清滴度，从而降低所述抗体或抗体片段的给药频率和/或降低所述抗体或抗体片段的给药浓度。具有增加的体内半衰期的抗体可通过本领域技术人员已知的技术制备。例如，可通过修饰(例如，替换、缺失或添加)被确定为与Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用有关的氨基酸残基来制备具有增加的体内半衰期的抗体(参见，例如，国际公开第WO97/34631号；第WO04/029207号；美国专利第6,737,056号和美国专利公开第2003/0190311号，且在下文有更详细的讨论)；其各自通过引用以其整体并入本文。
在数个实施方案中，所述抗体可包含在它们的Fc结构域内的修饰/替换和/或新的氨基酸，例如公开于下述文献中的那些：Ghetie et al.,1997,Nat.Biotech.15:637-40；Duncan et al,1988,Nature332:563-564；Lund et al.,1991,J.Immunol.147:2657-2662；Lund et al,1992,Mol Immunol29:53-59；Alegre et al,1994,Transplantation57:1537-1543；Hutchins et al.,1995,Proc Natl.Acad Sci USA92:11980-11984；Jefferis et al,1995,Immunol Lett.44:111-117；Lund et al.,1995,Faseb J9:115-119；Jefferis et al,1996, Immunol Lett54:101-104；Lund et al,1996,J Immunol157:4963-4969；Armour et al.,1999,Eur J Immunol29:2613-2624；Idusogie et al,2000,J Immunol164:4178-4184；Reddy et al,2000,J Immunol164:1925-1933；Xu et al.,2000,Cell Immunol200:16-26；Idusogie et al,2001,J Immunol166:2571-2575；Shields et al.,2001,J Biol Chem276:6591-6604；Jefferis et al,2002,Immunol Lett82:57-65；Presta et al.,2002,Biochem Soc Trans30:487-490)；美国专利第5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745、6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,194,551、6,737,056、6,821,505、6,277,375号；美国专利申请系列第10/370,749号以及PCT公开WO94/2935、WO99/58572、WO00/42072、WO02/060919和WO04/029207；其各自通过引用以其整体并入本文。Fc结构域的其他修饰/替换对本领域技术人员来说应为显而易见的。
抗体可在它们的Fc区包含修饰/替换和/或新的氨基酸残基，这可通过本领域技术人员熟知的众多方法产生。非限制性实例包括，分离抗体编码区(例如，来自杂交瘤的)，并在所分离的抗体编码区的Fc区内制作一个或多个所需的替换。可选择地，抗体的可变区可被亚克隆至编码包含一个或修饰/替换和/或新的氨基酸残基的Fc区的载体。
数个实施方案的抗体还可被修饰以改变糖基化，再次地，以改变所述抗体的一种或多种功能特性。
在不同的实施方案中，抗体的糖基化可被修饰。例如，可制备无糖基化(aglycosylated)的抗体(即，所述抗体缺乏糖基化)。糖基化可被改变，例如，以增加抗体对目标抗原的亲和力。这样的碳水化合物修饰，例如，可通过改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可制作一个或多个氨基酸替换而导致消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除在该位点的糖基化。这样的无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法详细描述于美国专利第5,714,350号和第6,350,861号，其各自通过引用以其整体并入本文。
此外或可选择地，数个实施方案的抗体可制备为具有改变的糖基化类型，如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化的抗体或具有增加的平分型GlcNAc结构的抗体。这类改变的糖基化方式已经证明能增加抗体 的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰，例如，可通过在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达所述抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域已有描述，且可用作宿主细胞，能在其中表达重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如，Shields,R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17:176-1，以及欧洲专利第EP1,176,195号；PCT公开WO03/035835、WO99/54342；其各自通过引用以其整体并入本文。
数个实施方案的抗体可单独使用或与其他组合物组合使用。所述抗体可在N-或C-末端进一步重组融合至异源多肽，或者化学缀合(包括共价或非共价缀合)至多肽或其他组合物。例如，抗体可重组融合或缀合至在检测分析中用作标记的分子和效应分子，如异源多肽、药物、放射性核素或毒素。参见，例如，PCT公开WO92/08495、WO91/14438、WO89/12624；美国专利第5,314,995号和EP396,387；其各自通过引用以其整体并入本文。
本文提供的抗体可包含修饰的衍生物，即，通过任何类型的分子共价结合至抗体而修饰，以便共价结合不阻止所述抗体结合至GPR49多肽或其片段和/或产生期望的应答。例如，但不以限制的方式，所述抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如，通过已知的保护/阻断基、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白等进行糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、衍生化而修饰的。可通过已知技术进行众多化学修饰中的任何一种，包括但不限于，特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，所述衍生物可含有一个或多个非经典的氨基酸。
在数个实施方案中，所述抗体特异性结合包含或由下述GPR49多肽组成的多肽，其与NCBI登录号为NP_003658.1(SEQ ID NO:1)的人GPR49多肽或其片段具有至少60％同一性，或至少70％同一性，或至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性，或至少97％同一性，或至少99％同一性，或100％同一性。该片段可为，例如，SEQ ID NO:1所示的至少约5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、 850或900个连续的或非连续的氨基酸，或者在上述任何长度之间的任何数目的连续的或非连续的氨基酸。
例如，通过比对用于最佳比较目的的序列(例如，可将空位引入第一序列的序列中)，可以确定两个氨基酸序列(或两个核酸序列)的同一性百分比。然后，比较在对应位置的氨基酸或核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比与所述序列共有的相同位置数目呈函数关系(即，％同一性＝相同位置的#/位置的总#×100)。可通过熟知的方法，例如使用数学算法来完成两个序列的实际比较。这种数学算法的具体的非限制性实例描述于Karlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)，其通过引用以其整体并入本文。该算法被整合至BLASTN和BLASTX程序(2.2版本)中，如Schaffer et al.,Nucleic Acids Res.,29:2994-3005(2001)中所描述，其通过引用以其整体并入本文。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，BLASTN)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov，提供于2002年4月10日。在一个实施方案中，所查找的数据库为非冗余(NR)数据库，并且用于序列比较的参数可设置为：无过滤器；预期值10；字段长度3；矩阵为BLOSUM62；空位存在罚分为11，而空位延伸罚分为1。
数个实施方案还包括以上描述的抗体的变体，所述抗体包括在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个，所述变体在可变轻链(V_L)结构域和/或可变重链(V_H)结构域中包含一个或多个氨基酸残基替换。一些还包括以上描述的抗体的变体，其在一个或多个V_L CDR和/或一个或多个V_H CDR中具有一个或多个另外的氨基酸残基替换。通过将替换引入至以上描述的抗体的V_H结构域、V_H CDR、V_L结构域和/或V_LCDR中而产生的抗体，可在体外和体内检测例如其结合GPR49的能力(例如，通过免疫测定，包括但不限于，ELISA和BIAcore)。
在其他实施方案中，抗体可具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个以上描述的抗体的CDR，所述上述抗体包括在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个。
不同的实施方案包括特异性结合包含抗-GPR49抗体的V_H结构域、V_H CDR、V_L结构域或V_L CDR的衍生物的GPR49的抗体，所述抗-GPR49抗体如在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个，其特异性结合至GPR49。可使用本领域技术人员已知的标准技术将突变(例如，添加、缺失和/或替换)引入至编码抗体的核苷酸序列，包括，例如，定点诱变和PCR-介导的诱变均被常规用于产生氨基酸替换。在一个实施方案中，相对于原来的V_H和/或V_L CDR，所述V_H和/或V_L CDR衍生物包含小于25个氨基酸替换、小于20个氨基酸替换、小于15个氨基酸替换、小于10个氨基酸替换、小于5个氨基酸替换、小于4个氨基酸替换、小于3个氨基酸替换，或小于2个氨基酸替换。在另一实施方案中，所述V_H和/或V_L CDR衍生物具有在一个或多个预期的非必需氨基酸残基(即，对于所述抗体结合GPR49不关键的氨基酸残基)处产生的保守氨基酸替换(例如，同上)。可选择地，可通过如饱和诱变将突变随机引入至所述V_H和/或V_L CDR编码序列的全部或部分，且可针对生物学活性对所得的突变体进行筛选，以确认出保留了活性的突变体。诱变以后，可表达所编码的抗体，并确定所述抗体的活性。
数个实施方案还包括特异性结合GPR49或其片段的抗体，所述抗体包含可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列，其与本文描述的任何抗体的可变重链和/或轻链氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性，所述本文描述的抗体包括在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个。
不同的实施方案还包括特异性结合GPR49或其片段的抗体，所述抗体或抗体片段包含一个或多个CDR的氨基酸序列，所述CDR与本文描述的抗体的一个或多个CDR的氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性，所述本文描述的抗体包括在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个。可通过本领域技术人员已知的任何方法，包括BLAST蛋白查找，确定两个氨基酸序列的同一性百分比。
另一实施方案包括将保守氨基酸替换引入至抗-GPR49抗体的任何部分，如在下文的实施例中产生和描述的命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、 2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个。在本领域众所周知的是，“保守氨基酸替换”是指替换功能上等同的氨基酸的氨基酸替换。保守氨基酸改变导致在所得的肽中氨基酸序列的沉默变化。例如，具有类似极性的一个或多个氨基酸用作功能等同物，并导致在肽中氨基酸序列的沉默变化。电荷中性且用更小的残基替换残基的替换也可认为是“保守替换”，即使所述残基在不同的组内(例如，用更小的异亮氨酸替换苯丙氨酸)。具有类似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经进行了定义。保守氨基酸替换的几个家族如表1所示。
表1保守氨基酸替换的家族

家族氨基酸非极性Trp,Phe,Met,Leu,Ile,Val,Ala,Pro无电荷的、极性Gly,Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys酸性/带负电荷Asp,Glu碱性/带正电荷Arg,Lys,Hisβ-分支的Thr,Val,Ile影响链方向的残基Gly,Pro芳香族的Trp,Tyr,Phe,His
术语“保守氨基酸替换”也指使用氨基酸类似物或变体。
产生抗体的方法
例如，可通过免疫测定、BIAcore或其他本领域技术人员已知的技术来确认特异性结合GPR49多肽的抗体。
数个实施方案的抗体可通过本领域已知的任何合适的方法来产生。可通过本领域熟知的各种方法来产生针对目标抗原的多克隆抗体。例如，可将GPR49多肽给予至各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导产生含有对所述抗原具有特异性的多克隆抗体的血清。根据宿主物种，各种佐剂可用于增加免疫学应答，并且包括但不限于，佛氏佐剂(完全和不完全的)、矿质凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，以及可能 有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。这类佐剂也是本领域熟知的。
可使用本领域已知的各种各样的技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或它们的组合。例如，可使用杂交瘤技术制备单克隆抗体，包括本领域已知的和例如，Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling,et al.:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中教导的那些，其各自通过引用以其整体并入本文。如本文所用，术语“单克隆抗体”(缩写为“mAb”)并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单一克隆的抗体，包括任何真核的、原核的或噬菌体克隆，而非指制备其的方法。“单克隆抗体”可包含两种蛋白即重链和轻链，或者可选地由其组成。
使用杂交瘤技术制备和筛选特异性抗体的方法为本领域常规的和熟知的。在一个非限制性实例中，可用GPR49多肽或表达该肽的细胞对小鼠进行免疫。一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到对所述抗原具有特异性的抗体，就收获小鼠的脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知的技术将所述脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞，例如来源于可从ATCC获得的细胞系SP20的细胞。选择杂交瘤并通过有限稀释进行克隆。然后通过本领域已知的方法，检测所述杂交瘤克隆中分泌能够结合GPR49多肽的抗体的细胞。可通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生通常含有高水平抗体的腹水。
因此，数个实施方案提供了产生单克隆抗体的方法以及通过所述方法产生的抗体，其包括培养分泌抗体的杂交瘤细胞，其中所述杂交瘤是通过将分离自以GPR49抗原免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合而产生，然后筛选产生自该融合的杂交瘤中分泌能够结合GPR49多肽的抗体的杂交瘤克隆。
可通过已知技术产生识别特异性表位的抗体片段。例如，数个实施方案的Fab和F(ab′)2片段可通过使用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割来制备。F(ab′)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域。
不同实施方案的抗体也可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示法中，功能性抗体结构域展示于携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。在具体的实施方案中，这样的噬菌体可用于展示表达自全部的或组合的抗体文库(例如，人或鼠)的抗原结合结构域。表达结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体，可用抗原，例如使用标记的抗原或结合至或被捕获至固体表面或珠子上的抗原来进行选择或确认。用于这些方法的噬菌体通常为包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结构域表达自具有重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的噬菌体。可用于制备数个实施方案的抗体的噬菌体展示方法的实例，包括公开于以下文献中的那些：PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公开WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；以及美国专利第5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108号；其各自通过引用以其整体并入本文。
如上述参考文献中所描述，选择噬菌体后，可分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生完整的抗体，包括人抗体或任何其他期望的抗原结合片段，并在任何期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如以下的详细描述中所述。例如，也可使用本领域已知的方法采用重组技术产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段，如在下述文献中公开的那些方法：PCT公布WO92/22324；Mullinax et al.,BioTechniques12(6):864-869(1992)；和Sawai et al.,AJRI34:26-34(1995)；以及Better et al.,Science240:1041-1043(1988)，其各自通过引用以其整体并入本文。
可用于产生单链Fv和抗体的技术的实例，包括在下述文献中描述的那些：美国专利第4,946,778号和第5,258,498号；Huston et al.,Methods in Enzymology203:46-88(1991)；Shu et al.,PNAS90:7995-7999(1993)；和Skerra et al.,Science240:1038-1040(1988)，其各自通过引用以其整体并入本文。
人抗体和抗体的人源化
对于某些应用，包括抗体体内应用于人和体外检测分析，可取的是使用嵌合的、人源化的或人抗体。嵌合抗体为其中抗体的不同部分源自不同的动物物种的分子，如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。制备嵌合抗体的方法为本领域已知。参见，例如，Morrison,Science229:1202(1985)；Oi et al.,BioTechniques4:214(1986)；Gillies et al.,(1989)J.Immunol.Methods125:191-202；美国专利第5,807,715、4,816,567和4,816,397号；其各自通过引用以其整体并入本文。人源化抗体是来自结合期望抗原的非人物种抗体的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的骨架区。通常，在人骨架区的骨架残基将用来自CDR供体抗体的对应残基进行替换以改变，优选促进抗原结合。这些骨架替换通过本领域熟知的方法进行确认，例如通过CDR和骨架残基的相互作用的建模，以确定对于抗原结合具有重要性的骨架残基，并进行序列比较以确认特定位置的特别骨架残基。(参见例如，Queen et al.,美国专利第5,585,089号；Riechmann et al.,Nature332:323(1988)；其各自通过引用以其整体并入本文)。
人抗体避免了一些与具有小鼠或大鼠可变和/或恒定区的抗体相关的问题。这类源自小鼠或大鼠蛋白的存在，可导致所述抗体被迅速清除，或者可导致患者产生针对所述抗体的免疫反应。为了避免使用源自小鼠或大鼠的抗体，可使用多种本领域已知的技术将抗体人源化，包括例如，CDR-移植法(EP239,400；PCT公布WO91/09967；美国专利第5,225,539、5,530,101和5,585,089号；其各自通过引用以其整体并入本文)、镶饰或表面重塑(EP592,106；EP519,596；Padlan,Molecular Immunology28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering7(6):805-814(1994)；Roguska.et al.,PNAS91:969-973(1994))、去免疫化(美国专利公开第20030153043号)和链替换(美国专利第5,565,332号)，其各自通过引用以其整体并入本文。
完全的人抗体可用于人患者的治疗性治疗。可通过多种本领域已知的方法制备人抗体，包括以上描述的噬菌体展示方法，其使用了源自人免疫球蛋白序列的抗体文库。也参见，美国专利第4,444,887和4,716,111号；以及PCT公开WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741，其各自通过引用以其整体并入本文。
人抗体也可以使用转基因小鼠制备，所述小鼠能够表达功能性内源免疫球蛋白，但其能够表达人免疫球蛋白基因，例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可随机地或通过同源重组引入至小鼠胚胎干细胞。可选择地，除了人重链和轻链基因，也可将人可变区、恒定区和差异区引入至小鼠胚胎干细胞。可通过同源重组，单独地或与引入人免疫球蛋白基因座同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因成为非功能性的。具体地，JH区的纯合性缺失防止了内源抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞并显微注射至囊胚以产生嵌合小鼠。然后培育所述嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。使用选定的抗原，例如全部或部分的GPR49多肽以常规方式对所述转基因小鼠进行免疫。可使用常规杂交瘤技术，从所述免疫的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。由所述转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间发生重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用该技术有可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于该技术用于制备人抗体的综述，参见Lonberg and Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)，其通过引用以其整体并入本文。关于该技术用于制备人抗体和人单克隆抗体和制备该抗体的方案的详细讨论，参见，例如，PCT公开WO98/24893、WO92/01047、WO96/34096、WO96/33735；欧洲专利第0598877号；美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598号；其各自通过引用以其整体并入本文。此外，一些公司如Abgenix,Inc.(Fremont,CA)和Genpharm(San Jose,CA)可能致力于使用类似于以上描述的技术提供针对选定抗原的人抗体。Abgenix,Inc.(Fremont,CA)提供小鼠品系，其被改造为含有多达但小于1000kb大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系配置的片 段。参见Mendez et al.Nature Genetics15:146-156(1997)，以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.188:483-495(1998)。
在一种替代性方法中，其他人包括GenPharm International,Inc.已经使用了“小基因座”法。在所述小基因座法中，通过包含入来自Ig基因座的碎片(单个基因)模拟了外源性的Ig基因座。因此，将一个或多个V_H基因、一个或多个D_H基因、一个或多个J_H基因、一个_μ恒定区和通常地第二恒定区(优选γ恒定区)构成为构建体用于插入至动物。该方法描述于：Surani et al.的美国专利第5,545,807号；Lonberg和Kay的各自为美国专利第5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458号；Krimpenfort和Berns的美国专利第5,591,669和6,023.010号；Berns et al.的美国专利第5,612,205、5,721,367和5,789,215号；及Choi和Dunn的美国专利第5,643,763号；以及GenPharm International的美国专利申请系列：1990年8月29日递交的第07/574,748号、1990年8月31日递交的第07/575,962号、1991年12月17日递交的第07/810,279号、1992年3月18日递交的第07/853,408号、1992年6月23日递交的第07/904,068号、1992年12月16日递交的第07/990,860号、1993年4月26日递交的第08/053,131号、1993年7月22日递交的第08/096,762号、1993年11月18日递交的第08/155,301号、1993年12月3日递交的第08/161,739号、1993年12月10日递交的第08/165,699号、1994年3月9日递交的第08/209,741号；其公开在此通过引用并入本文。也参见欧洲专利第0546073B1号、国际专利申请第WO92/03918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852和WO98/24884号，以及美国专利第5,981,175号；其公开在此通过引用以其整体并入本文。也参见Taylor et al.,1992,Chen et al.,1993,Tuaillon et al.,1993,Choi et al.,1993,Lonberg et al.,(1994),Taylor et al.,(1994)和Tuaillon et al.,(1995),Fishwild et al.,(1996)；其公开在此通过引用以其整体并入本文。
从具有通过微细胞融合引入的染色体大碎片或整个染色体的转基因小鼠来制备人抗体。参见欧洲专利申请第773288号和第843961号，其 公开在此通过引用并入本文。此外，已经产生了作为Tc小鼠与Medarex’s小基因座(Humab)小鼠杂交结果的KM^TM–小鼠。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体(transchromosome)和Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida et al.,Cloning Stem Cells,(2002)4:91-102)。
可使用称为“定向选择”的技术来产生能识别选定表位的全人抗体。在该方法中，选定的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体被用于指导对识别相同表位的全人抗体的选择(Jespers et al.,Bio/technology12:899-903(1988)，其通过引用以其整体并入本文)。
而且，针对GPR49多肽的抗体进而可通过使用本领域技术人员熟知的技术，用于产生“模拟”GPR49多肽的抗-独特型抗体，参见，例如，Greenspan&Bona,FASEB J.7(5):437-444；(1989)，以及Nissinoff,J.Immunol.147(8):2429-2438(1991)；其各自通过引用以其整体并入本文。
在数个实施方案中，本文提供的抗体可用于体内治疗。因此，可修饰所述抗体以使其在个体中具有更小的免疫原性。例如，如果所述个体为人，则所述抗体可被“人源化”，其中所述抗体的互补决定区被移植到人抗体中(例如，如Jones et al.,Nature321:522-525,1986以及Tempest et al.,Biotechnology9:266-273,1991中所述)，其通过引用以其整体并入本文。
噬菌体展示技术也可用于选择抗体基因，其具有针对来自筛选的具有抗-GPR49抗体的人淋巴细胞v-基因的PCR扩增的全部产物或者来自天然(naive)文库的多肽的结合活性(McCafferty et al.,Nature348:552-554,1990；和Marks,et al.,Biotechnology10:779-783,1992，其通过引用以其整体并入本文)。也可通过链替换法来提高这些抗体的亲和力(Clackson et al.,Nature352:624-628,1991，其通过引用以其整体并入本文)。
制备抗体的方法
可通过本领域已知的任何用于合成抗体的方法来制备数个实施方案的抗体，具体地，通过化学合成，或优选地，通过重组表达技术。
抗体或其片段、衍生物或类似物(例如，抗体的重链或轻链，或者单链抗体)的重组表达，需要构建含有编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。 一旦获得了编码抗体分子，或者抗体的重链或轻链，或者其部分(优选含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，可使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生所述抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建包含编码抗体的序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因而，不同的实施方案提供了可复制的载体，其包含可操作地连接至启动子的、编码抗体分子或其重链或轻链，或者重链或轻链可变结构域的核苷酸序列。这类载体可包含编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，PCT公布WO86/05807、PCT公布WO89/01036，和美国专利第5,122,464号；其各自通过引用以其整体并入本文)，且抗体的可变结构域可被克隆至该载体用于表达整个重链或轻链。
通过常规技术将所述表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生抗体。因而，数个实施方案包括宿主细胞，其包含可操作地连接至异源启动子的、编码抗体、或者其重链或轻链、或者单链抗体的多核苷酸。编码重链和轻链二者的载体可在宿主细胞中共表达，以表达整个免疫球蛋白分子，如以下所详述。
多种宿主-表达载体系统可用于表达本文描述的抗体分子。这类宿主表达系统代表可通过其来制备并于随后纯化目标编码序列的载体，但也代表当被用合适的核苷酸编码序列转化或转染后可在原位表达抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的，或者用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0、3T3、PerC6细胞)，其包含含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自 哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。细菌细胞如大肠杆菌和真核细胞均可用于重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)连同载体如来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件，为抗体的有效表达系统(Foecking et al.,Gene45:101(1986)；Cockett et al.,Bio/Technology8:2(1990))。还参见，例如，美国专利第5,827,739、5,879,936、5,981,216和5,658,759号，其各自通过引用以其整体并入本文。
在细菌系统中，根据要表达的抗体分子所期望的用途，可有利地选择许多表达载体。例如，当要制备大量这类蛋白时，为了产生抗体分子的药物组合物，可取的是易于纯化的、指导表达高水平的融合蛋白产物的载体。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.,EMBO J.2:1791(1983))，其通过引用以其整体并入本文，其中所述抗体编码序列可单独地连接至载体，并与lacZ编码区在同一框内(in frame)，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985)；Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))，其各自通过引用以其整体并入本文；等等。pGEX载体也可用于表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。通常，这类融合蛋白为可溶的，且可通过吸附和结合至基质谷胱甘肽-琼脂珠然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱易于从溶解的细胞纯化。所述pGEX载体被设计为包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以便克隆的靶基因产物可从GST部分中释放出来。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)被用作载体以表达外源基因。该病毒生长于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。所述抗体编码序列可被单独地克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动宿主细胞中，可使用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒被用作表达载体的情况下，目标抗体编码序列可被连接至腺病毒转录/翻译控制复合体，例如，晚期启动子和三联先导序列。然后可将该嵌合基因通过体外或体内重组插入至腺病毒基因组。插入至病毒基因组的非必 需区(例如，E1或E3区)将产生有活力的重组病毒且能够在感染的宿主内表达抗体分子(例如，参见Logan&Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:355-359(1984)，其通过引用以其整体并入本文)。插入的抗体编码序列的有效翻译还需要特定的启动信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。而且，所述起始密码子必须与期望的编码序列同相，以确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可为多种来源的，即天然和合成的。可通过包含合适的转录增强元件、转录终止子等来提高表达效率(参见Bittner et al.,Methods in Enzymol.153:51-544(1987)，其通过引用以其整体并入本文)。
此外，可选择能调控插入序列表达，或者以期望的特定方式修饰和处理基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这类修饰(例如，糖基化)和处理(例如，切割)可能对所述蛋白的功能非常重要。对于蛋白和基因产物的翻译后处理和修饰，不同宿主细胞具有特征性的和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统，以确保正确地修饰和处理所表达的外源蛋白。为此目的，可使用具有可恰当处理基因产物的初级转录、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞，包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、NS0、Per.C6，以及具体地，乳腺癌细胞系如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常乳腺细胞系如CRL7030和Hs578Bst。
为了长期、高产率地产生重组蛋白，可采用稳定表达。例如，可改造稳定表达抗体分子的细胞系。没有使用含有病毒复制起始点的表达载体，而是用由合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标记来转化宿主细胞。引入外源DNA后，可使改造的细胞在加富培养基中生长1-2天，然后转换至选择性培养基中。重组质粒中的可选择标记赋予了选择耐受性，并允许细胞稳定地将所述质粒整合至其染色体上，且生长形成集落，其进而可被克隆和扩增到细胞系中。该方法可有利地用于改造表达抗体分子的细胞系。这类改造的细胞系对于筛选和评估直接或间接与抗体分子相互作用的化合物尤其有用。
可使用很多选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.,Cell11:223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:202(1992))和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy et al.,Cell22:817(1980))基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。同样，抗代谢物耐受性可用作选择以下基因的基础：赋予对氨甲喋呤耐受性的dhfr(Wigler et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA77:357(1980)；O'Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527(1981))；赋予对霉酚酸耐受性的gpt(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072(1981))；赋予对氨基糖苷G-418耐受性的neo(Clinical Pharmacy12:488-505；Wu and Wu,Biotherapy3:87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan,Science260:926-932(1993)；以及Morgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)；May,1993,TIB TECH11(5):155-215)；以及赋予对潮霉素耐受性的hygro(Santerre etal.,Gene30:147(1984)，其各自通过引用以其整体并入本文。重组DNA技术领域通常已知的方法可常规用于选择期望的重组克隆，并且这类方法描述于，例如Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；以及Dracopoli et al.(eds),Current Protocols in Human Genetics的第12和13章,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)，其各自通过引用以其整体并入本文。
可通过载体扩增来增加抗体分子的表达水平(综述可参见Bebbington and Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Vol.3.(Academic Press,New York,1987)，其通过引用以其整体并入本文)。当表达抗体的载体系统中的标记为可扩增的时，增加宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因有关，抗体的产生也将增加(Crouse et al.,Mol.Cell.Biol.3:257(1983)，其通过引用以其整体并入本文)。
所述宿主细胞可与两个表达载体——编码源自重链的多肽的第一载体和编码源自轻链的多肽的第二载体共转染。所述两个载体可含有相同的可选择标记，其使得重链和轻链多肽均等表达。可选择地，可使用编码且能够表达重链和轻链多肽二者的单个载体。在这种情况下，轻链应置于重链之前以避免过量的有毒游离重链(Proudfoot,Nature322:562(1986)；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2197(1980)，其通过引用以其整体并入本文)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一旦通过动物、化学合成或重组表达产生了抗体分子，可使用本领域已知的任何纯化免疫球蛋白分子的方法对其进行纯化，例如，通过层析法(例如，离子交换层析、亲和层析，尤其是通过对于蛋白A后的特定抗原进行亲和层析，和尺寸柱层析)、离心分离、溶解度差异，或通过纯化蛋白的其他任何标准技术。此外，所述抗体或其片段可融合至本文描述的或者本领域其他已知的异源多肽序列以促进纯化。
而且，所述抗体或其片段可融合至标记序列如肽，以促进纯化。在某些实施方案中，标记氨基酸序列为六-组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中提供的标签等，其中的许多可商业购买。如Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所描述(其通过引用整体并入本文)，例如，六-组氨酸提供了所述融合蛋白的常规纯化。可用于纯化的其他肽标签，包括但不限于，对应于源自流感血球凝集素蛋白(Wilson et al.,Cell37:767(1984)，其通过引用以其整体并入本文)的表位的“HA”标签，以及“flag”标签。
本文描述的抗体包括修饰的衍生物(例如，任何类型的分子通过共价连接至所述抗体)。例如，但不以限制的方式，所述抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/阻断基衍生、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白等。可通过已知的技术，包括但不限于，特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等，进行众多化学修饰中的任一种。此外，所述衍生物可含有一个或多个非经典氨基酸。
可通过将聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)连接至所述抗体或抗体片段，产生体内半衰期增加的抗体或其片段。可通过将PEG位点特 异性结合至所述抗体或抗体片段的N或C-端，或者通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基，在具有或没有多功能连接子的情况下将PEG连接至所述抗体或抗体片段。可使用导致最小的生物学活性丧失的直链或支链聚合物衍生化。可通过SDS-PAGE和质谱分析法密切监测结合的程度，以确保PEG分子恰当地结合至所述抗体。可通过例如尺寸排阻或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG缀合物分离。
而且，抗体可缀合至白蛋白以便使抗体或抗体片段在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。这些技术为本领域熟知，参见例如，国际公开第WO93/15199、WO93/15200和WO01/77137号；以及欧洲专利第EP413,622号；其各自通过引用以其整体并入本文。本文提供的实施方案包括缀合至或融合至一个或多个部分(moieties)的抗体或其片段的应用，所述部分包括但不限于，肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子和有机分子。
不同的实施方案包括利用重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至外源蛋白或多肽(或其片段，特别是至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)的抗体或其片段以产生融合蛋白。在一些实施方案中，所述抗体或其片段可重组地融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至异源蛋白或多肽(或其片段，特别是至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个或至少约100个氨基酸的多肽)的抗体或其片段以产生融合蛋白。所述融合不一定需要是直接的，也可通过连接子序列发生。例如，通过使抗体融合或缀合至对特定细胞表面受体具有特异性的抗体，所述抗体可用于使异源多肽在体外或体内靶向特定细胞类型。融合或缀合至异源多肽的抗体也可用于体外的免疫检测和使用本领域已知方法的纯化方法。参见例如，国际公开第WO93/21232号；欧洲专利第EP439,095号；Naramura et al.,1994,Immunol.Lett.39:91-99；美国专利第5,474,981号；Gillies et al.,1992,PNAS89:1428-1432；以及Fell et al.,1991,J.Immunol.146:2446-2452；其各自通过引用以其整体并入本文。
数个实施方案包括含有融合或缀合至抗体片段的异源蛋白、肽或多肽的制剂。例如，所述异源多肽可融合或缀合至Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VL结构域、VH CDR、VL CDR或其片段。使多肽融合或缀合至抗体部分的方法为本领域熟知。参见，例如，美国专利第5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946号；欧洲专利第EP307,434和EP367,166号；国际公开第WO96/04388和WO91/06570号；Ashkenazi et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535-10539；Zheng et al.,1995,J.Immunol.154:5590-5600；以及Vil et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11337-11341；其各自通过引用以其整体并入本文。
特异性结合GPR49或其片段的抗体的其他融合蛋白(例如，同上)，可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总称为“DNA改组”)技术来产生。可使用DNA改组来改变抗体或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低离解速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利第5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458号，以及Patten et al.,1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson,et al.,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques24(2):308-313；其各自通过引用以其整体并入本文。抗体或其片段，或编码的抗体或其片段，可通过在重组前使其经历由易错PCR引起的随机诱变、随机核苷酸插入或其他方法来进行改变。编码抗体或抗体片段的多核苷酸的一个或多个部分(该部分可特异性结合C/CLP)，可与一个或多个异源分子的一个或多个元件、基序、分段(section)、部分、结构域、片段等重组。
而且，所述抗体或其片段可融合至标记序列如肽以促进纯化。在某些实施方案中，所述标记氨基酸序列为六-组氨酸肽，如在pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)等中提供的标签，其中许多可商购。如Gentz et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824中所描述(其通过引用以其整体并入本文)，例如，六-组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。可用于纯化的其他肽标签，包括但不限于， 血球凝集素“HA”标签，其对应于源自流感血球凝集素蛋白(Wilson et al.,1984,Cell37:767，其通过引用整体并入本文)的表位，以及“Flag”标签。
不同的实施方案还包括缀合至诊断剂或治疗剂的抗体或其片段。所述抗体可在诊断上用于例如，作为临床检测过程的一部分监测肿瘤的发展或进展，以例如，测定给定治疗方案的效力。可通过使抗体偶联至可检测物质来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射成像术的发射正电子的金属和非放射性顺磁金属离子。所述可检测物质可直接地或使用本领域已知技术通过中间物(例如本领域已知的连接子)间接地偶联或缀合至所述抗体(或其片段)。关于可缀合至抗体以用作诊断剂的金属离子，可参见例如，美国专利第4,741,900号，其通过引用以其整体并入本文。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括发光胺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和发光蛋白；并且合适的放射性材料的实例包括但不限于，¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹Tc，此外，使用各种正电子发射成像术的发射正电子的金属、非放射性顺磁金属离子和放射标记的或缀合至特定放射性同位素的分子可缀合至本文描述的抗体。
而且，抗体或其片段可缀合至治疗性部分如细胞毒素，例如，细胞抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，例如，α-发射体例如²¹³Bi。细胞抑制剂或杀细胞剂包括任何对细胞有害的试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢药(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥 (thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类药物(例如，柔红霉素(原道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(原放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))，以及抗-有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。治疗性部分(moieties)的更广泛的列举可参见PCT公布WO03/075957，其通过引用以其整体并入本文。
所述缀合物可用于修饰给定的生物应答，所述治疗剂或药物部分不应解释为限于典型的化学治疗剂。例如，所述药物部分可为具有期望的生物活性的蛋白或多肽。这类蛋白可包括例如，细胞凋亡剂或抗-血管生成剂。
抗体也可附着于固体支撑物，其对目标抗原的免疫检测或纯化特别有用。这类固体支撑物包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
将这类治疗性部分缀合至抗体的技术为众所周知的，参见例如，Amon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press1985)，以及Thorpe et al.,“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.62:119-58(1982)；其各自通过引用以其整体并入本文。
所述抗体可缀合至其他多肽。使抗体融合或缀合至多肽部分的方法为本领域已知。参见，例如，美国专利第5,336,603、5,622,929、5,359,046、 5,349,053、5,447,851和5,112,946号；EP307,434；EP367,166；PCT公开WO96/04388和WO91/06570；Ashkenazi et al.,1991,PNAS USA88:10535；Zheng et al.,1995,J Immunol154:5590；以及Vil et al.,1992,PNAS USA89:11337；其各自通过引用以其整体并入本文。抗体融合至部分(moiety)不一定需要是直接的，也可通过连接子序列发生。这类连接子分子通常为本领域已知，且描述于Denardo et al.,1998,Clin Cancer Res 4:2483；Peterson et al.,1999,Bioconjug Chem10:553；Zimmerman et al.,1999,Nucl Med Biol26:943；Garnett,2002,Adv Drug Deliv Rev53:171。可选择地，抗体可缀合至第二抗体以形成如Segal在美国专利第4,676,980号中所描述的抗体异源缀合物，其各自通过引用以其整体并入本文。
用抗-GPR49抗体治疗癌症的方法
数个实施方案涉及用抗-GPR49抗体治疗对象中的癌症。不同的实施方案涉及用抗-GPR49抗体治疗对象中的结肠癌。在一些实施方案中，治疗癌症如结肠癌的方法，包括将足以治疗癌症的有效量的抗-GPR49抗体给予至对象。
如本文所用，“对象”包括能患可使用抗-GPR49抗体治疗的癌症的生物体，如人和非人的动物。优选的动物包括人对象。本发明的术语“非人的动物”包括所有脊椎动物、哺乳动物、啮齿类(例如小鼠和大鼠)和非人的灵长类(例如猴子和猕猴)。术语“给予”(administration/administering)包括将抗-GPR49抗体引入对象以发挥其预期功能的途径。
如关于治疗癌症所用，术语“有效量”是指足以治疗癌症的抗-GPR49抗体的量，其可通过许多不同的参数来测量，包括但不限于，相比对照，患癌症对象的肿瘤大小的减小、患癌症对象的肿瘤生长率或增殖速率的降低、患癌症对象中预防转移或降低转移程度或者延长存活。在数个实施方案中，有效量的抗-GPR49抗体将足以治疗对象的癌症，其测量的肿瘤大小减小了约5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％或者上述任何两个百分比之间的任何数。在一些方面，所述抗-GPR49抗体为在下文的实施例中产生和描述的、命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、 10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个或其组合。
在数个实施方案中，所述足以治疗对象的癌症的、有效量的抗-GPR49抗体，可以下述剂量给药：约1μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg、275mg/kg、300mg/kg、325mg/kg、350mg/kg、375mg/kg、400mg/kg、425mg/kg、450mg/kg、425mg/kg、450mg/kg、475mg/kg、500mg/kg、750mg/kg、1000mg/kg或者上述任何两个剂量之间的任何数(抗体质量/对象质量)。在一些方面，所述抗-GPR49抗体为在下文的实施例中产生和描述的、命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个或其组合。
在一些实施方案中，所述足以治疗癌症的、有效量的抗-GPR49抗体，在对象的血液或血清中的浓度为：约1nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、500nM、550nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、500μM、550μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM或 者上述任何两个浓度之间的任何数。在一些方面，所述抗-GPR49抗体为在下文的实施例中产生和描述的、命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个或其组合。
在另一实施方案中，所述有效量的抗-GPR49抗体可按固定剂量给药，而与对象的质量无关，例如，所述足以治疗对象的癌症的、有效量的抗-GPR49抗体可为以下固定剂量：约1μg、50μg、75μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、500μg、550μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1250mg、1500mg、1750mg、2000mg、2250mg、2500mg、2750mg、3000mg、3500mg、4000mg、4500mg、1000mg、1500mg、2000mg、2500mg、3000mg、3500mg、4000mg、4500mg、5000mg、5500mg、6000mg、6500mg、7000mg、7500mg、8000mg、8500mg、9000mg、9500mg、10,000mg或者上述任何两个固定剂量之间的任何数。在一些方面，所述抗-GPR49抗体为在下文的实施例中产生和描述的、命名为2B5.5、7F8.2、1B3.5、9C6.4、6H5.4、10A6.7、10A9.2、2G8.1、6C10.5、6G10.3、8H8.1、6B10.2、3B8.11、2F12.5、5G2.11、1F10.5、10E1.1、7C3.4、2H9.2、5B12.4、3G8.1、5F2.5、6G10.1、14H9.1、12G5.1、6E10.1、14F7.1、4A10.2、3F11.1、11F6.1、5B10.1、14A8.1、8E9.1、9C7.1、4F6.2、1B8.1、18G7.1、12E3.1、6H5.1、2P69.2、17C9.1、2H5.1和10A9.2的抗-GPR49抗体中任一个或其组合。
给药和药物剂型
在本文提供的治疗癌症的实施方案中，所述抗-GPR49抗体可以多种方式和药物剂型给药。鉴于此，数个实施方案涉及包含在上文和在下文 的实施例中描述的抗-GPR49抗体中的任何一种或其组合，,以及药学上可接受的载体或视给药途径和形式而定的稀释剂的药物组合物。
可使用的给药途径的实例包括注射(经皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、囊内)或经口途径。所述药物制剂可以适于每种给药途径的形式进行给药。例如，这些制剂可以片剂或胶囊剂形式、通过注射或经口给药。所述注射剂可为单次快速注射或可为连续性输注。所述抗-GPR49抗体可单独给药，或者与另外一种或多种本领域已知的治疗癌症的药剂，或与药学上可接受的载体，或二者一起给药。
如本文所用，“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所用剂量和浓度下对暴露于其的对象无毒。通常，所述生理学上可接受的载体pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN、聚乙二醇(PEG)。
用于经口给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，所述抗体可与至少一种惰性的药学上可接受的载体如蔗糖、乳糖或淀粉混合。按常规应用，这类剂型也可包括除惰性稀释剂外的其他物质，例如润滑剂如硬脂酸镁。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可包含缓冲剂。另外所制备的片剂、丸剂可具有本领域已知的肠溶衣。
用于经口给药的液体剂型包括药学上可接受的乳状液、溶液、悬浮液、糖浆，其具有含有本领域常用的惰性稀释剂如水的酏剂。除了这类惰性稀释剂，组合物还可包含佐剂如湿润剂、乳化剂和悬浮剂，以及甜味剂、调味剂和香味剂。
所述抗-GPR49抗体也可经肠胃外给药。如本文所用，词语“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”包括例如，除肠内和外用给药以外的给药方式，通常通过注射给药，且包括但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、 囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输液。肠胃外给药可包括无菌的含水或无水溶液、悬浮液或乳状液。无水溶剂或媒介物的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和玉米油、明胶和可注射的有机酯如油酸乙酯。这类剂型也可含有佐剂如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。它们可通过，例如经细菌截留滤膜过滤、将灭菌剂掺入组合物、辐照组合物或加热组合物来灭菌。它们也可使用无菌水或一些其他无菌可注射媒介物在使用前即时制备。
对于肠胃外给药，所述抗体可例如与药学上可接受的肠胃外媒介物一起配制为溶液、悬浮液、乳状液或冻干粉。这类媒介物的实例为水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和无水媒介物如固定油。所述媒介物或冻干粉可含有维持等渗性(例如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如，缓冲剂和防腐剂)的添加剂。所述制剂通过常用技术灭菌。例如，适于通过注射来肠胃外给药的组合物，是通过将1.5％根据重量的活性成分溶解于0.9％的氯化钠溶液中来制备的。
本文描述的药物组合物可作为单次剂量或多次剂量给药；作为单独的治疗剂或与其他治疗剂组合给药；以及与常规治疗剂组合，其可依次或同时给药。
联合治疗
以上描述的任何抗-GPR49抗体均可彼此组合和/或与已知可用于治疗癌症的任何治疗剂组合给药。可与以上描述的抗-GPR49抗体组合的治疗剂的非限制性类别，包括但不限于，烷化剂、抗代谢药、抗生素、源自植物的抗肿瘤剂、喜树碱衍生物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、激素治疗剂、抗体和干扰素。
烷化剂包括但不限于，氮芥N-氧化物、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、白消安、二溴甘露醇、卡波醌、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、AMD-473、六甲蜜胺、AP-5280、阿帕兹酮(apaziquone)、布罗他辛(brostallicin)、苯达莫司汀、卡莫司汀、雌氮芥、福莫司汀、葡磷酰胺、异环磷酰胺、KW-2170、马磷酰胺和二溴卫矛醇；铂配位的烷基 化化合物，包括但不限于，顺铂、卡铂、依铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂或塞曲铂(satrplatin)。
抗代谢药包括但不限于，单独的氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤核苷、巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)，或与以下物质组合：亚叶酸、喃氟啶、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、依诺他滨、S-1、吉西他滨、氟达拉滨、5-氮杂胞苷、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、地西他滨、依氟鸟氨酸、乙炔基胞嘧啶核苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、羟基脲、TS-1、美法仑、奈拉滨、诺拉曲塞、十八烷基磷酸盐、培米曲塞二钠(disodium premetrexed)、喷司他丁、吡利曲索(pelitrexol)、雷替曲塞、曲阿平(triapine)、三甲曲沙、阿糖腺苷、长春新碱或长春瑞滨。
抗生素包括但不限于：阿柔比星、放线菌素D、氨柔比星、安那霉素(annamycin)、博来霉素、道诺霉素、阿霉素、依沙芦星、表柔比星、加柔比星、伊达比星、丝裂霉素C、奈莫柔比星(memorubicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、培洛霉素、吡柔比星、蝴蝶霉素、司丁拉米(stimalamer)、链脲菌素、戊柔比星或净司他丁。
激素治疗剂包括，依西美坦、阿那曲唑、度骨化醇、法倔唑、福美坦、抗雌激素剂如他莫昔芬柠檬酸盐和氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、来曲唑、或抗雄激素如比卡鲁胺、氟他胺、米非司酮、尼鲁米特和4'-氰基-3-(4-氟苯基磺酰基)-2-羟基-2-甲基-3'-(三氟甲基)丙酰苯胺)。
源自植物的抗-肿瘤物质包括例如选自有丝分裂抑制剂的那些，例如长春花碱、多烯紫杉醇和紫杉醇。
具有细胞毒性的拓扑异构酶抑制剂包括一种或多种选自以下的药剂：阿柔比星、氨萘非特(amonafide)、贝洛替康、喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、二氟替康(diflomotecan)、伊立替康、edotecarin、表柔比星、依托泊苷、依喜替康、吉马替康、勒托替康、米托蒽醌、吡柔比星、匹杉琼(pixantrone)、卢比替康、索布佐生、SN-38、他氟泊苷(tafluposide)和拓扑替康及其组合。
免疫学物质包括干扰素和许多其他免疫增强剂。干扰素包括干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a或干扰素γ-n1。
其他抗癌剂包括PF3512676、非格司亭、香菇多糖、西佐喃(sizofilan)、乌苯美司、WF-10、阿地白介素、阿弗珠单抗(alemfuzumab)、BAM-002、氮烯唑胺、达利珠单抗、地尼白介素、吉妥单抗-奥佐米星、替伊莫单抗、咪喹莫特、来格司亭、香菇多糖、莫拉司亭(melgramostinm)、沙格司亭、他索纳明(tasonermin)、替西白介素(tecleukin)、胸腺法新(thymalasin)、托西莫单抗、维如利金(Virulizin)、Z-100、依帕珠单抗、米妥莫单抗、奥戈伏单抗(oregovomab)、培妥莫单抗(pemtumomab)、阿利维A酸、安普利近(ampligen)、阿曲生坦-贝沙罗汀、硼替佐米、骨化三醇、依昔舒林(exisulind)、非那雄胺、福莫司汀、伊班膦酸、米替福新、米托蒽醌、L-天冬酰胺酶、甲基苄肼、氮烯唑胺、羟基脲、培门冬酶、喷司他丁、他扎罗汀(tazarotne)、TLK-286或维甲酸。
抗-血管生成化合物包括，阿维A、芬维A胺、沙利度胺、唑来膦酸、血管抑素、阿普立定(aplidine)、西仑吉肽(cilengtide)、康普瑞汀A-4、内皮抑制素、常山酮、瑞比玛斯特(rebimastat)、瑞莫伐(removab)、角鲨胺和ukrain。
可用于与抗-GPR49抗体组合的治疗剂的更广泛的列举可参见PCT公布WO03/075957，其通过引用以其整体并入本文。
尽管为清楚和理解的目的，较详细地描述了目前的实施方案，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本发明真实范围的情况下可作出各种形式上和细节上的改变。
实施例
已总体描述的实施方案涉及抗-GPR49抗体、表达这类抗体的杂交瘤或其他细胞系、编码这类抗体的核酸和包含编码这类抗体的核酸的载体，以及用这类抗体治疗癌症的方法，参考一些具体实施例可得到进一步理解，提供这些实施例仅用于说明目的，而非旨在限制本发明。
实施例1
从噬菌体展示文库选择对人GPR49具有特异性的人Fab
使用噬菌体展示技术分离了特异性识别人GPR49受体的胞外结构域的人抗体。
第I部分：噬菌体展示淘选
方法：使用重组人GPR49-Fc胞外域(GPR49-Fc)(SEQ ID NO:3)筛选含有3.5x10¹⁰个独特克隆的天然人噬菌粒Fab文库(Hoet,R.M.,et al.NatBiotechnol.23(3):344-8(2005))。在用噬菌体文库孵育以前，将生物素化的抗-Fc抗体捕获于磁珠上，然后捕获GPR49-Fc融合蛋白。按Hoet et al所描述进行选择。经3轮淘选后，通过Mlul消化移除479bp基因III残余部分(stump)，且将载体用于TGI细胞中的可溶Fab表达。
结果：在该淘选中分离出61个独特克隆。随后纯化独特克隆并再次确认结合。
第II部分：ELISA
通过ELISA证明了Fab结合至重组人GPR49-Fc胞外域。方法：简而言之，以2.5μg/ml浓度将可溶GPR49-Fc融合蛋白溶于pH9.6的0.025M碳酸盐缓冲液中，将其以50μl/孔的量涂覆96-孔板(IMMULON2HB,Dynex Technologies,Inc.,Cat.#3455)，并于4℃孵育过夜。在Skan Washer300(Skatron Instruments)中，用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS,Irvine Scientific,Cat#9240)加0.025％吐温20洗涤所述板，用于PBS中的含有1％脱脂奶、0.05％吐温20、pH7.4的缓冲液封闭，然后在室温下孵育1h。孵育后，在Skan Washer300中用PBS加0.025％吐温20洗涤所述板。对于检测，然后将涂覆有GPR49的板用对照和不同浓度的测试抗体孵育，其以50μl/孔的量稀释于PBS中的1％脱脂奶、0.05％吐温20。在室温下孵育1h后，在Skan Washer300中用PBS加0.025％吐温20洗涤所述板。将于PBS中的1％脱脂奶、0.05％吐温20中进行2000-倍稀释的山羊抗-人κ—HRP(Southern Biotech Cat#2060-05)以50μl/孔的量加入每个孔中，以检测结合的Fab。在Skan Washer300中，将在室温下孵育1h的板用PBS加0.025％吐温20洗涤。将TMB溶液(KIRKEGAARD&PERRY LABS,INC.cat:50-76-00)以100μl/孔的量加入每个孔中，2min后用50μl/ 孔的4N H2SO4(LabChem,Cat#LC25830-l)停止反应。使用Molecular Devices平板读取仪在450nm处测量吸光度，TMB的背景值在540nm处测量。使用SOFTMAX PRO软件包的4.3LS版本(Molecular Devices Corp.)分析数据(图1)。
结果：这导致了6个Fab的可滴定结合：71C10、86C11、66D05、76C12、78F05和76B04。
第III部分：FACS分析
方法：以1:20、1:40和1:80稀释这6个GPR49Fab，并通过FACS检测与HA-GPR49转染的HEK293E的结合。转染后24-48h，将细胞收集在悬浮液中，并于冰上用抗-GPR49抗体或对照IgG孵育。洗涤所述细胞，并用缀合至荧光发色团的抗-小鼠第二抗体检测第一抗体。然后通过FACS分选标记的细胞，以确认特异性识别天然的细胞表面GPR49蛋白表达的抗-GPR49抗体。
结果：所有6个预期的FACS阳性GPR49Fab均随Fab稀释的增加显示与HA-GPR49-HEK293E结合的降低，且均没有显示与HEK293E的结合(图2)。低几何平均值可能是由于Fab表位不太易于接近、细胞表面GPR49的低表达，或者Fab可能为低亲和性的。通过FACS，相比亲本CHO，GPR49Fab(稀释2倍，从400nM低至零)针对CHO-GPR49(50nMMTX)的其他检测揭示了，约EC50<10nM的3个Fab：76C12、76B04和78F05(图3A和3B)。通过FACS，Fab针对抗肿瘤细胞系(SW480、SW620和HCT116)的检测揭示了，仅Fab76C12能够结合(图4A、4B、5A-C和6A-C)。
第IV部分：Biacore分析
方法：通过FACS，3个特定的Fab(76C12、78F05和76B04)被确认为以小于10nM的亲和力特异性结合人GPR49受体。为分析结合动力学，将生物素化的抗-人IgG Fc抗体固定于Biacore SA芯片上，至水平为2950RU。然后以流动池1作为参照，在流动池2中捕获GPR49-Fc，至密度为～400RU。将纯化的Fab(于HSP-EP中100、50、25nM)以30μl/min 的速率注入7min，允许解离20min。用BIA评估软件(v4.1)分析数据，假设为1:1模型。为检测Fab与Fc结构域的交叉反应性，然后以流动池1作为参照，在流动池2中捕获IgG1Fc，至密度为～250RU。然后在与上述相同的条件下检测所有Fab。所有Biacore实验均在25℃于BIAcore3000仪器上进行。
结果：Fab76C12和Fab78F05分别以K_D3.4nM和1.7nM结合。Fab76B04表现出弱的结合。
实施例2
构建全长抗-GPR49IgG
方法：将3个Fab转变为人IgG1并在CHO细胞中表达。针对重组人GPR49胞外域-Fc融合蛋白，通过生物淘选从人抗体噬菌体文库(Dyax Corp)中分离出了编码3个不同的抗-GPR49Fab(76C12、78F05和76B04)的DNA序列。将所述Fab基因序列用于构建编码全长抗体的表达质粒，其使用pV90AS表达载体系统以在哺乳动物细胞中产生抗体。pV90AS为修饰的pV90表达载体，其被设计用于通过改变初级转录物的剪接方式，从单个启动子生成两个转录物(参见：USPTO申请WO2005/089285)。天然CMV剪接供体被剪接为部分受损的剪接受体以产生编码抗体轻链的转录物，或者被剪接为天然CMV剪接受体以产生编码抗体重链的转录物。所述部分受损的剪接受体已被改造而产生类似量的重链和轻链转录物。轻链可变(VL)区和恒定(CL)区通过PCR扩增。根据描述于Nakamura T,et al.,Int J Immunopharmacol.22:131-41(2000)(其通过引用以其整体并入本文)中的方法，5'轻链PCR引物在编码免疫球蛋白轻链信号肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:5)的序列前包含Sfi I限制内切酶位点，其与对应于VL区氨基末端的序列在同一框内。通过琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，并用QIAquick GelExtration试剂盒方案(QIAGEN CA)进行提取，用限制性内切酶Sfi I和Asc I消化，并用Sfi I/AscI消化的pHLP025载体(Holly Prentice)连接。除天然的CMV剪接供体位点序列、部分受损的剪接受体位点序列和聚腺苷酸信号序列以外，所述pHLP025载体还含有Sfi I/Asc I限制性内切酶位点以作为Sfi I/Asc I消化 的PCR片段接受抗体轻链(信号肽-VL-CL)(参见USPTO申请WO2005/089285)。
通过PCR扩增每个抗-GPR49Fab(76C12、78F05、76B04)的重链可变(VH)区。5'重链VH PCR在编码合成重链信号肽MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO:6)的序列前包含Nco I限制内切酶位点，其与对应于如上所述的VH区氨基末端的序列在同一框内。3'重链VH PCR引物包含对应于VH区羧基末端的序列和Sfi I位点。通过琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，并用QIAquick GelExtration试剂盒方案(QIAGEN CA)进行提取，用限制性内切酶Nco I和Sfi I消化，并用NcoI/Sfi I消化的pHLP029载体(Holly Prentice)连接。除上游聚腺苷酸信号序列、天然CMV剪接受体位点序列和下游聚腺苷酸信号序列以外，所述pHLP029载体还含有Nco I/Sfi I位点以作为Nco I/Sfi I消化的PCR片段接受抗体信号肽-VH序列(参见USPTO申请WO2005/089285)。
使用上述的5'轻链和3'重链VH PCR引物，通过两个载体中存在的普通重叠序列经PCR扩增，将pHLP025中编码Sfi I位点-轻链信号肽-抗-GPR49VL和CL以及pHLP029中编码重链信号肽-抗-GPR49VH-Sfi I位点的基因序列组装至单个DNA片段中。通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得的PCR产物，并用QIAquick GelExtration试剂盒方案(QIAGEN CA)进行提取，用限制性内切酶Sfi I消化，并用Dra III消化的IgG1亲本载体连接。
结果：所得的质粒产生双顺反子前体转录物，其在选择性剪接后以约化学计量的量产生具有翻译活性的抗体重链和轻链mRNA。通过DNA序列分析确认正确序列。哺乳动物细胞中的全长表达导致稳定的人IgG1抗体的产生。
实施例3
构建全长抗-GPR49IgG用于增加哺乳动物细胞中的表达
为提高抗体表达产量和产物质量，对来自抗-GPR49Fab76C12、78F05、76B04的原始的VH基因序列进行修饰。
方法：首先，用公用序列识别程序分析抗-GPR49VH序列的含有推定的剪接位点的序列(www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html(The Institute for Genomic Research,9712Medical Center Drive,Rockville,Md.20850),www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)(Martin G.Reese and Frank H.Eeckman,Lawrence Berkeley National Laboratory,Genome Informatics Group,1Cyclotron Road,Berkeley,Calif,94720；也参见，Reese M G,Eeckman,F H,Kulp,D,Haussler,D,1997."Improved Splice Site Detectionin Genie".J Comp Biol4(3),311-23)。其次，将抗-GPR49Fab的重链可变区密码子用来自抗体的对应于相同Kabat位置的密码子进行替换，该抗体已在CHO细胞中成功表达且在原始抗-GPR49VH多肽序列中没有发生任何变化。该第二步主要去除推定的剪接位点，但进行了另外的剪接位点分析以及随后的同义密码子互换，以降低推定的剪接位点存在的预期可能性。
作为来自供应商(Blue Heron Biotechnology,Inc.Bothell Wash.)的化学合成的双链DNA序列，获得了编码与抗-GPR49Fab的序列优化的VH序列在同一框内的合成重链先导序列的DNA片段。在合成片段的5'和3'端包含有Nco I和Sfi I限制性内切酶位点。按上述实施例2中所述，将先导序列和抗-GPR49序列优化的VH区片段克隆至Nco I/Sfi I消化的pHLP029载体中。按上述实施例2中所述，与pHLP025的合适的对应轻链重组，并于随后克隆单一片段。通过DNA序列分析确认正确序列。
结果：在哺乳动物细胞中，来自该质粒系列的全长抗体的表达引起稳定的人IgG1抗体的产生增加。
实施例4
瞬时表达和GPR49抗体的定征
方法：将质粒DNA用于转化CHO DG44细胞以瞬时产生抗体蛋白。将20μg质粒DNA与4x10⁶个细胞在体积为0.4mL的lxPBS中混合。将混合物加入至0.4cm小杯(BioRad)中并置于冰上15min。将所述细胞在600μF和350伏特下用基因脉冲电转化仪(BioRad)进行电穿孔。将所述细胞放入含有CHO-SSFM II培养基加100μM次黄嘌呤和16μM胸苷的 T-25烧瓶中于37℃孵育4天。此外，还将质粒DNA用于转染293E细胞用于抗体蛋白的瞬时表达。用Qiagen's Effectene转染方案(Qiagen,CA)，将1.2μg各(重链和轻链)质粒DNA转染至2x10⁶个细胞中。将细胞于37℃孵育3天。
结果：收集上清液，并通过蛋白质印迹和ELISA法确认全长抗体。通过ELISA确认了全长IgG1与GPR49结合的能力。
实施例5
开发产生抗-GPR49抗体的CHO细胞系
本实施例给出了包含Fab76C12的结合结构域、作为全长IgG1的抗-GPR49抗体表达的详细描述。本文描述的其他Fab，即实施例1中所列举的那些，以类似方式表达。
方法：76C12的可变区和恒定区为人序列来源。通过DYAX噬菌体展示技术，从针对人GPR49产生的Fab获得了整个轻链和重链可变区。将可变区和轻链恒定区亚克隆至替代的剪接表达载体中。所述替代的剪接构造通过使用单个剪接供体和两个剪接受体连接所述轻链和重链，其中每个剪接受体产生编码两条链之一的转录物。编码免疫球蛋白基因的表达载体DNA经电穿孔注入非胰岛素依赖性的中国仓鼠卵巢细胞(CHO DG44i)中。选择CHO转染瘤用于生产目的。
将来自对应的76C12的轻链基因的可变(VL)和恒定(CL)结构域及76C12的重链基因的可变(VH)结构域的互补DNA克隆至表达载体。所述载体包含用于直接在人重链恒定区上游插入完整轻链和可变区重链cDNA的克隆位点。除了Ig基因，该表达载体还包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，其可用于哺乳动物细胞中的选择。然后将所得的表达载体转染至CHO细胞，以开始产生分泌抗-GPR49的CHO细胞系。
将所述表达载体经电穿孔注入CHO细胞。将免疫球蛋白轻链特异性PCR引物用于PCR扩增所述Fab轻链cDNA。5'特异性寡核苷酸序列包含来自Biogen Idec抗-CD23分子的轻链的天然信号肽。5'和3'寡核苷酸分别含有Sfi I和Asc I限制性内切酶识别序列，用于亚克隆至中间载体中。使用包含合成重链信号肽的5'寡核苷酸，对VH cDNA进行PCR扩 增。5'和3'寡核苷酸分别含有Nco I和Sfi I限制性内切酶识别序列，用于亚克隆至中间载体中。
使用轻链5'和VH3'寡核苷酸作为模板进行重叠PCR，用于将轻链和VH区组合为一个cDNA片段。将所得产物亚克隆至Dra III位点，从而产生最终的替代性剪接表达载体。所述替代性剪接构造通过对初级转录物的替代剪接从一个启动子产生两种转录物。所述天然CMV剪接供体被剪接至次最优的剪接受体以产生编码轻链的转录物，或者被剪接至天然CMV剪接受体以产生编码重链的转录物。所述次最优的剪接受体被设计为产生类似数量的两种转录物。
在经电穿孔注入CHO细胞前，以700ng/μL的浓度在HEBS缓冲液中制备最终DNA载体。用不同浓度的DNA(15、20、30、40和45μg)进行5种电穿孔。在含有于0.7ml无菌HEBS缓冲液中的4x10⁶个对数期CHO细胞和于0.1mL HEBS中的的DNA(0.8mL总体积)的一次性0.4cm小杯(Invitrogen)中进行每种电穿孔。使用Bio-Rad Gene Pulser XCELL震荡细胞，设置为290伏特，950微法拉第。然后将震荡后的细胞在室温下静置10min，然后与10mL室温的无胰岛素CHOM16培养基混合，离心(3'@1000rpm)并抽吸。然后将细胞重悬于12mL无胰岛素的CHOM16培养基(RT)中，并转移至T-75组织培养烧瓶中。
细胞和培养基：电穿孔前，使CHO细胞在添加有lx核苷酸的无血清培养基(CHOM24)中生长。CHOM24是化学成分确定的室内培养基配方，其不含任何动物成分。在无核苷的CHOM16和化学成分确定的CHOM24培养基中进行氨甲喋呤选择。
电穿孔后，将4x10⁶个CHO细胞汇合至T-75烧瓶中。当细胞被接种至无核苷培养基中时，立即开始针对DHFR表达的选择。将细胞在CHOM24中逐渐扩增至125mL摇瓶(～3周)。为分离克隆的细胞系，将转染的稳定汇合物稀释于200μL CHOM16中，并以1个细胞/孔的量接种至4个96-孔板上。将板维持在37℃，直到针对抗体滴度进行筛选。
通过使用对人κ链具有特异性的ELISA分析细胞上清液，针对免疫球蛋白产生筛选CHO克隆(接种后第21天至第28)。用于ELISA的捕获抗体为多克隆山羊抗-人IgG(SouthernBiotech)，而检测抗体为缀合至辣根 过氧化物酶的多克隆山羊抗-人κ(SouthernBiotech)。对分泌最高数量的免疫球蛋白的克隆扩增。
结果：开发了高表达的CHO细胞系，其产生适于规模化和生产的、具有期望的生物化学和生物物理特性的抗-GPR49mAb。
实施例6
全人抗-GPR49IgG1抗体的纯化和定征
通过以下描述的方法对CHO细胞产生的抗体进行纯化和定征。
方法：蛋白A捕获：用3倍柱容积的lxPBS(平衡缓冲液)以100-150cm/h的流速对蛋白A柱进行预平衡。以150cm/h的流速用每毫升树脂最大10mg GPR49mAb的量将上清液上样。上样后，用5倍柱容积的平衡缓冲液洗涤柱。然后，用100mM甘氨酸、pH3.0以上流方向对柱梯度洗脱。收集所需级分，并用2M Tris碱滴定至pH为中性。将收集的级分对lxPBS透析，并浓缩材料以为尺寸排阻步骤作准备。尺寸排阻聚集物移除步骤包括用1.5倍柱容积的lxPBS以36cm/h的流速平衡SUPERDEX200，然后将蛋白上样并收集所需的级分。
按如下进行鉴定检测：
1)通过质谱法进行完整质量分析，其中在电喷射质谱仪(ESI-MSD)上进行分子质量测量。分析之前，将样品还原以去除二硫键。去卷积的质谱表示重链和轻链的质量。
2)通过埃德曼(Edman)降解使用配有在线PTH分析仪的ABI蛋白测序仪进行N-末端序列分析。确认轻链和重链的起始氨基酸序列。
3)以质谱分析绘制肽图谱：通过分析每个肽产生的LC/MS数据，绘制胰蛋白酶或/和EndoLysC肽图谱以获得完整的序列覆盖。此外，检测了位点的确定以及氧化和脱酰胺化的量。
通过以下进行纯度测定：1)SDS-Page或CE-SDS：还原的和非还原的样品，该技术用于测量抗体片段化、聚集和杂质；2)使用LS和RI技术的SEC-HPLC被用于测量聚集和片段化，并且光散射确定样品组分的摩尔质量；3)SDS凝胶或毛细管IEF法被用于确定等电聚集方式和可能 起因于C-末端和N-末端异质性和/或脱酰胺作用的电荷亚型的pi分布。最后，通过鲎变形细胞溶解物(LAL)动态浊度测定法测量内毒素浓度。
结果：抗-GPR49mAb的纯化产生大于99％单体的、无内毒素的mAb，其达到克级数量，具有适于规模化和生产的特性。
实施例7
产生针对人GPR49胞外域的小鼠抗体
第I部分：杂交瘤选择
方法：为产生针对GPR49胞外域的抗体，采用标准技术用纯化后且无内毒素的GPR49-His(SEQID2)免疫小鼠3次。采用ELISA和FACS分析针对抗原识别筛选来自单只小鼠的血液。然后选择具有最高抗体滴度的动物用于最终的抗原加强免疫，此后分离脾细胞用于杂交瘤制备。从4x24-孔融合平板将约1,000个克隆转移至10x96-孔培养平板。通过GPR49-Fc捕获ELISA选择了199个阳性克隆，并转移至48-孔平板。这些当中有100个阳性克隆没有被选择，因为通过FACS，它们显示了GPR49-CHO阴性或阳性结合至亲本CHO。然后根据同种型选择99个阳性克隆中的50个。
结果：对36个克隆进行了亚克隆(单独的或混合的IgG条带如，IgG1/k、IgG2a/G和IgG1/2b/k)。8个克隆在从亲本至亚克隆中失去了表达。采用蛋白A或蛋白G琼脂糖层析从杂交瘤上清液中纯化来自24个选择的亚克隆的单克隆抗体(mAb)，并按如下所述通过FACS检测抗体。
第II部分：FACS分析
方法：将24种鼠GPR49mAb系列稀释，并通过FACS检测与GPR49-Flag-His转染的CHO和亲本CHO的结合(标准方法)。
结果：其结果概括于表2中(数据显示于图7A-C中)
表2
GPR49ms mAbFACs EC50(nM)2B5.5～0.27F8.2～0.2
1B3.50.81299C6.40.82976H5.4～110A6.71.42810A9.24.5222G8.19.7666C10.59.9786G10.3～108H8.111.196B10.211.23B8.1112.142F12.514.645G2.1120.941F10.524.5410E1.129.497C3.434.512H9.243.275B12.443.563G8.163.835F2.5530.56G10.12658
第III部分：Biacore分析
通过Biacore分析了小鼠mAb的结合动力学。
方法：将生物素化的抗-人IgG Fc抗体固定于Biacore SA芯片上，至水平为2950RU。然后，以流动池1作为参照，在流动池2中捕获GPR49-Fc，至密度为～400RU。将纯化的鼠mAb(于HSP-EP中100、50、25nM)以30μl/min的速率注入7min，允许解离20min。用BIA评估软件(v4.1)分析数据，假设为1:1模型。所有Biacore实验均在25℃于BIAcore3000仪器上进行。
结果：鼠mAb以64nM至小于1nM的亲和力(K_D)结合至GPR49-Fc。数据显示于表3中。
表3
 BIAcoremAbK_D nM1B3-51.115B12.47.526C10.50.689C6.41.445G2.111.596G10_32.7210E1_13.987F8.20.9110A9.2<100pM6B10_23.052H9-20.712G8.1N/A6H5.40.1710A6_7<100pM3B8-113.92uM3G8.10.997C3_46.322B5-51.678H8_11.542F12.51.291F10.564.05F2_55.526G10.10.14
实施例8
产生针对全长人GPR49的小鼠抗体
第I部分：杂交瘤选择
方法：为产生针对全长受体的抗体，用混合有金颗粒的编码GPR49基因全长cDNA克隆的DNA载体以10μg/小鼠的量免疫小鼠3次。初次免疫后约75天，针对抗原识别，采用ELISA和FACS分析筛选来自单只小鼠的血液。然后选择具有最高抗体滴度的动物用于最终的抗原加强免疫(25μg GPR49-Fc、10μg GPR49-DNA/金颗粒和5x10⁶个GPR49-CHO细胞)，此后分离脾细胞用于杂交瘤制备。产生了约10,000个克隆，其中通过GPR49-CHO捕获ELISA选择了约200个阳性克隆。
结果：通过ELISA和GPR49-CHO FACS确认了67个克隆。然后，对22个阳性克隆进行了亚克隆(单独的或混合的IgG条带如，IgG1/k、IgG2a/G和IgG1/2b/k)。采用蛋白A或蛋白G琼脂糖层析从杂交瘤上清液中纯化来自19个选择的亚克隆的单克隆抗体(mAb)，并按如下所述通过FACS检测抗体。
第II部分：FACS分析
方法：将19个鼠GPR49mAb系列稀释，并通过FACS检测与GPR49-Flag-His转染的CHO和亲本CHO的结合(标准方法)。
结果：小鼠mAb以17nM至小于1nM(EC50值)结合至GPR49。结果概括于表4中(数据显示于图8A-D中)。抗体10A9.1用作对照。
表4
mAbEC50(nM,CHO-GPR49)14H9.10.912G5.11.26E10.11.314F7.11.54A10.21.73F11.11.811F6.11.95B10.11.9
14A8.12.18E9.12.29C7.12.24F6.22.21B8.12.218G7.12.512E3.12.66H5.13.02P69.25.117C9.112.52H5.117.510A9.2(第1代mAb)6.2
第III部分：GPR49直接结合ELISA
为了定征小鼠抗体与GPR49的结合，进行了直接结合ELISA分析。
方法：将于pH9.6的0.025M碳酸盐缓冲液中的2.5μg/ml的可溶GPR49-Fc融合蛋白，以50μl/孔的量涂覆96-孔板(IMMULON2HB,Dynex Technologies,Inc.,Cat.#3455)，并于4℃孵育过夜。在Skan Washer300(Skatron Instruments)中，用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS,Irvine Scientific,Cat#9240)加0.025％吐温20洗涤所述板，用于PBS中的含有1％脱脂奶、0.05％吐温20且pH7.4的缓冲液封闭，然后在室温下孵育1h。孵育后，在Skan Washer300中用PBS加0.025％吐温20洗涤所述板。对于该检测，然后将涂覆有GPR49的板用对照和不同浓度的测试抗体孵育，其以50μl/孔的量稀释于PBS中的1％脱脂奶、0.05％吐温20中。在室温下孵育1h后，在Skan Washer300中用PBS加0.025％吐温20洗涤所述板。将于PBS中的1％脱脂奶、0.05％吐温20中进行2000倍稀释的山羊抗-小鼠-Fc—HRP(Southern Biotech Cat#2060-05)以50μl/孔的量加入，以检测结合的Fab。将在室温下孵育1h的板在Skan Washer300中用PBS加0.025％吐温20洗涤。将TMB溶液(KIRKEGAARD&PERRY LABS,INC.cat:50-76-00)以100μl/孔的量加入，并于2min后用50μl/孔的4N H2SO4 (LabChem,Cat#LC25830-l)停止该反应。使用Molecular Devices平板读取仪于450nm处测量吸光度，TMB的背景值在540nm处测量。使用SOFTMAX PRO软件包的4.3LS版本(Molecular Devices Corp.)分析数据。结果获得为EC50值。
结果：鼠mAb以224nM至小于1nM范围的EC50值结合GPR49-Fc(表5；图9A-D)。
表5


实施例9
可用抗-GPR49抗体标记癌症肿瘤
方法：通过流式细胞术(FACs)使用抗-GPR49mAb76C12和78F05测量GPR49在结肠肿瘤和其他肿瘤细胞中的表达。
结果：发现GPR49被表达于多种结肠肿瘤(CT1、CT3、LS174T、Sw480、HCT116、SW620、DLD-1、Lovo)、胃肿瘤N87、肺肿瘤A549和阳性对照GPR49-CHO稳定转染子中。此外，通过LS174T细胞中GPR49的RNAi敲低确认了抗-GPR49mAb与GPR49的结合特异性，其大大抑制了GPR49mAb76C12、76B04、78F05与LS174T细胞的结合。
实施例10
证明GPR49可作为结肠癌干细胞(CSC)标记
第I部分：
方法：通过FACs，使用GPR49mAbs76C12对维持在癌症干细胞肿瘤球条件下的CT1原代结肠肿瘤细胞进行分选。将GPR49阳性(GPR49+)、GPR49阴性(GPR49-)和未分选的活PI(碘化丙啶)阴性细胞以1个细胞/孔的量接种到96孔平板中，并于3周后分析球体形成能力(即癌症干细胞的数目)。
结果：相比GPR49阴性和未分选的细胞，分选的GPR49阳性(GPR49+)结肠肿瘤细胞高度富含癌症干细胞活性(图10A和10B)。在2个分别的独立实验中，GPR49分选的LS174T结肠肿瘤细胞类似地也高度富含癌症干细胞。
第II部分：
方法：为进一步证实这些结果，我们又进行了实验，其中将结肠癌干细胞肿瘤球用GPR49或对照RNAi-1处理，然后以250个细胞/孔的量接种到96孔平板中。
结果：在处理后14天测量到，用GPR49RNAi-1而非对照RNAi处理，大大降低了结肠癌干细胞数目。
实施例11
GPR49阳性结肠肿瘤细胞在体内具有癌症干细胞特性
方法：为表明分离的GPR49+细胞具有癌症干细胞特性，进行了体内癌症干细胞分析以比较GPR49+相对于GPR49–细胞的体内生长。采用MoFlo用76C12分选来自原代结肠肿瘤系CT1的GPR49+细胞，并以1000个细胞/小鼠的量植入。在此后的50天，分析小鼠的肿瘤形成和体重减轻。
结果：在原代肿瘤异种移植研究中，GPR49+原代结肠肿瘤细胞造成侵袭性肿瘤生长(图11A)和体重迅速减轻(图11B)。相比之下，GPR49-细胞生长非常缓慢且没有造成体重迅速减轻。这些发现证明，高度表达GPR49的结肠肿瘤细胞为高度致瘤的，其为癌症干细胞的重要特征。
实施例12
R-spondin以高亲和力结合GPR49，但不激活GPR49-介导的信号转导
第I部分：
GPR49是与糖蛋白激素受体家族(例如FSH、TSH、LH的受体)相关的孤儿G蛋白偶联受体(GPCR)，且是通过在肠内筛选Wnt靶基因确认的肠和胃干细胞标记(Barker et al.,Nature,2007)。为确认GPR49的天然配体，结合研究集中于已知的Wnt通路调节剂Noggin、Gremlin1、DAN、腱蛋白样1、Cerberus1、PRDC、斯钙素-1、COCO、腱蛋白、R-spondin1-3、BMP2和BMP4。
方法：在基于生物层干涉测量的检测中确定了针对GPR49-Fc的配体结合活性。简而言之，将GPR49-Fc和测试配体(均购自R&D systems)均稀释于OB缓冲液中(PBS,pH7.4,0.01％(w/v)NaN3,1mg/ml BSA,0.02 ％(v/v)吐温20)。采用Octet Red系统(ForteBio,Inc.,Menlo Park,CA)，将GPR49-Fc捕获于抗-人IgG Octet尖端(tip)(ForteBio,Inc.,Menlo Park,CA；Part#18-5001)上。在OB缓冲液中洗涤尖端，并移至含有于OB缓冲液中的测试配体的孔内。在结合阶段(120秒)和解离阶段(120秒)期间，将测试配体与GPR49-Fc的结合记录为生物干涉测量(interometry)信号。此外，针对鼠GPR49-Fc测试了所述配体。
结果：R-spondin(RSPO)家族成员与人GPR49-Fc相互作用，但显示了难以解释的非特异性组分。尤其是，观察到的两阶段结合和解离暗示了存在多个结合事件。RSPO家族成员不与小鼠GPR49-Fc[88％同一性(91％相似)]相互作用。
第II部分：
尽管所用的GPR49-Fc是GPR49胞外域在溶液中的二聚体(由于相互作用的Fc等分)，由于GPR49-Fc固定于尖端和测试RSPO分子的单体状态，该两阶段结合不能通过这个来解释。因此，通过溶液亲和表面等离子共振检测进一步研究了RPOS与GPR49-Fc结合的两阶段性质。
方法：采用溶液亲和表面等离子共振分析了RSPO与GPR49的结合(Day ES,et al.Biochemistry.2005Feb15；44(6):1919-31.)。该方法利用所谓的“质量传输限制性”结合条件，其中配体结合(蛋白结合至传感器芯片)的起始速率与配体在溶液中的浓度成正比(BIApplications Handbook(1994)Chapter6:Concentration measurement,pp6-1-6-10,Pharmacia Biosensor AB)。在这些条件下，相比分析物扩散至芯片表面上的葡聚糖基质中，可溶分析物与芯片上被固定的蛋白的结合更快(蛋白流过芯片表面)。因此，分析物的扩散特性和溶液中流过芯片表面的分析物浓度决定了分析物结合芯片的速率。在该实验中，溶液中游离RSPO-1的浓度取决于与含有固定的GPR49-Fc的CM5Biacore芯片结合的起始速率。向这些RSPO-1溶液中滴定竞争性的GPR49-Fc。
结果：从原始的传感图数据获得了起始结合速率。R-spondin-1显示了两阶段结合谱，暗示了GPR49上存在针对RSPO的多个协同结合位点。
第III部分：
为测试RSPO对于GPR49信号转导的作用，采用了多种检测方法。
方法：通过标准方法进行环AMP、钙通量和β-抑制蛋白(arrestin)检测。此外，β-连环蛋白/TCF报告子检测为基于转录的报告子检测，其特征为Wnt/β-连环蛋白信号转导通路。β-连环蛋白/TCF报告子检测利用转染了SAbioscience TCF/LEF报告子或阴性构建体的细胞。转染后24h，将细胞计数，并等分(2x10⁴个细胞/孔)至96孔平板中。使用Opti-MEM+0.5％FBS+0.1mM NEAA+1mM丙酮酸钠+1x抗生素培养基使细胞饥饿6h。用滴定量的RSPO和mWnt3a(200ng/ml)在有或没有抗体下处理细胞18h。用Promega的双荧光素酶试剂盒发展双荧光素酶活性。此外，使用GPR49RNAi测定GPR49对于RSPO依赖性β-连环蛋白/TCF报告子活性的具体贡献。
结果：在针对RSPO的cAMP、钙通量或β-抑制蛋白活性检测中没有观察到可测量的活性。然而，RSPO以剂量依赖性方式驱动通过GPR49RNAi敲低的β-连环蛋白/TCF报告子活性。
实施例13
用R-spondin-1刺激GPR49-3T3细胞
方法：为测试R-spondin对于过表达GPR49细胞增殖的作用，将用GPR49(GPR49-3T3克隆50)稳定转染的2500NIH3T3成纤维细胞细胞与R-spondin1一起孵育2天，并使用Cell Titer Glo ATP检测来评估细胞增殖。使用抗-GPR49mAb76C12通过FACs，GPR49-3T3克隆50此前被证明能表达高水平的细胞表面GPR49。
结果：相比在无血清条件下用斯钙素刺激的对照，R-spondin1刺激造成GPR49-3T3细胞的增殖增加25-40％。使用不同的克隆——GPR49-3T3克隆28，在第二个独立实验中确认了该结果，其相比斯钙素刺激的对照细胞，显示了响应R-spondin1的增殖的4倍的增加。
实施例14
通过GPR49mAb抑制R-spondin结合
确定了本发明详细描述的抗-GPR49mAb阻抑RSPO结合可溶性GPR49-Fc的能力。
方法：通过溶液相竞争表面等离子共振检测，确定了抗-GPR49抗体的配体阻抑能力。简而言之，将所述抗体(1μM)与200nM RSPO在冰上共孵育45min。然后，使仅RSPO克隆(200nM)或与孵育的抗体的组合流过固定有GPR49-Fc的CM5Biacore芯片(如实施例1中所详述)。Rmax为60秒结合阶段末期的结合信号(Rmax)，其被用作以稳定状态/平衡状态结合的级分的度量。
结果：抗-GPR49抗体3B8.11、10A6.7、2B5.5、6C10.5的Rmax均降低超过20％。3G8.1、6H5.4和7F8.2的Rmax均降低小于20％。
实施例15
GPR49mAb的交叉反应性和对相关的家族成员GPR48(LGR4)和LGR6的特异性
方法：为确定本发明详细描述的抗-GPR49抗体对相关的家族成员GPR48(LGR4)和LGR6的特异性，在哺乳动物胞(HEK293T)中独立地表达了重组GPR48、GPR49和LGR6。通过FACS评估了抗体与过表达受体细胞的结合(标准方法)，并与对照载体(pV100)转染的细胞进行比较。
结果：76C12抗体结合GPR48，但不结合在哺乳动物细胞中表达的LGR6。检测的其他抗体均不结合GPR48或LGR6(表6)。
表6


实施例16
通过全人抗-GPR49抗体内化GPR49
方法：在染色程序前48h，将Lovo结肠肿瘤细胞以50,000个细胞/孔的量接种至8孔带腔室的载玻片(1型Becton Dickinson胶原质涂覆的培养载玻片,BD BioCoatTM#354630)上。按常规维持细胞在20代以下。在实施染色程序当天，从每孔中去除培养基，并用500μl冷的孵育缓冲液替代(MEM Eagle ATCC#30-2003+1％BSA)。用该缓冲液洗涤细胞2次，每次洗涤3min。然后，将250μl的各待测mAb(76C12、78F05和鼠10A9.2)以10μg/ml浓度加入至合适的孔内，在孵育培养基中稀释，并于冰上孵育1h。将人的抗-人-IGF-lR抗体用作阳性对照以比较内化程度。将抗体5A7(抗-Id mAb)、IDEC152(抗-CD23IgG1mAb)和无抗体用作阴性对照。在冰上孵育45min后，用500μl冷洗涤缓冲液(PBS+1％BSA+2％山羊血清)将时间为零(t＝0')的载玻片洗涤3次，每次洗涤3min(载玻片一直放在冰上)。然后，用500μl14％多聚甲醛(从16％母液用PBS稀释；EMS#15710)将t＝0的载玻片在室温下固定15min。然后将t＝0的载玻片用冷洗涤缓冲液再洗涤3次，每次洗涤3min，然后放在冰上。同时，按其设定的时间点(15和60min)将剩余的载玻片放入37℃恒温箱。在其孵育时间最后，按上述相同的方案对每个载玻片进行操作—洗涤和固定并置于冰上。然后将所有载玻片用200μl冷透化缓冲液(洗涤缓冲液+0.5％Triton-X)在冰上透化10min。然后用500ml冷洗涤缓冲液洗涤所有载玻片3次，每次洗涤3min。最初将母液小瓶于4℃以10,000rpm离心10min后，在洗 涤缓冲液中以1:1000稀释制备第二抗体(AlexaFluor488山羊-抗-小鼠IgG(H+L)，针对mAb和AlexaFluor488山羊-抗-人IgG(H+L)的分子探针#A11029，针对G4抗体的分子探针#A11013)。将250μl稀释的第二抗体加入至每孔种，并在室温下于黑暗中(覆盖的)孵育40min。用500μl冷洗涤缓冲液再次洗涤载玻片3次。最后一次洗涤时，倒掉缓冲液，并空出所有孔。然后，用提供的拆卸工具将腔室从载玻片上拆下，并用含有DAPI(Vector#H-1500,Hard SetTM)的Vectashield封固剂安装上盖玻片。于4℃保存载玻片，于黑暗中过夜以使封固剂干燥。使用共聚焦显微镜、采用LaserSharp2000程序(BioRad v5.2)采集载玻片的图像，并表示为来自Kalman10平均值的蓝色和绿色组分的融合。
结果：在60min内，76C12、78F05和10A9.2均显示GPR49的快速内化。如所预期，阳性对照IGF1R C06显示了IGF1R受体的内化，而同种型匹配的阴性对照(小鼠5A7、IDEC152(灵长类源化的(primatized)抗-CD23抗体))没有结合或内化。
实施例17
GPR49抗体结合鼠GPR49
方法：为确定本文描述的抗-GPR49抗体对鼠GPR49的特异性，将重组鼠GPR49在哺乳动物细胞(HEK293T)中表达。通过FACS(标准方法)评估抗体与过表达受体细胞的结合，并与对照载体(pV100)转染的细胞进行比较。
结果：76C12以高亲和力结合哺乳动物细胞中表达的鼠GPR49。多种其他GPR49mAb结合鼠GPR49(表7)。
表7


实施例18
抗-GPR49mAb的表位分组
进行平衡结合检测，并用于确定针对本发明详细描述的GPR49抗体组的一般表位结合组。与GPR49结合的交叉阻抑被用于确定结合GPR49的不同结合表位的抗体组。
方法：在基于生物层干涉测量的检测中，将GPR49-Fc与测试抗-GPR49mAb的结合活性与用第二测试mAb(自身或不同的mAb)预孵育的GPR49-Fc的结合活性进行了比较。用Thermo Scientific EZ-LinkSulfo-NHS-Biotin(Thermo Scientific,#21425)按照生产商的方案将第一抗-GPR49测试mAb(第一mAb)生物素化。将生物素化的第一mAb、GPR49-Fc以及GPR49-Fc加第二测试抗-GPR49mAb(第二mAb)均稀释于OB缓冲液(PBS,pH7.4,0.01％(w/v)NaN3,1mg/ml BSA,0.02％(v/v)吐温20)中。采用Octet Red系统(ForteBio,Inc.,Menlo Park,CA)，将生物素化的第一mAb捕获于链霉亲和素Octet尖端(ForteBio,Inc.,Menlo Park,CA；Part#18-5001)上。在OB缓冲液中洗涤尖端，并移至含有于OB缓冲液中的GPR49-Fc的孔内。在结合阶段(120秒)期间，将GPR49-Fc与尖端上的第一mAb的结合记录为饱和的生物干涉测量信号，并将在结合阶 段末期的结合信号(Rmax)用作以稳定状态/平衡状态结合的级分的度量。也记录了解离阶段(120秒)期间的结合。为测量各种mAb彼此间的交叉阻抑能力，进行了第二个结合实验，其中将上述指出的GPR49-Fc与超出5倍摩尔的第二测试mAb(未生物素化的)预孵育。然后使其结合预先装载有生物素化的第一mAb的尖端以测定Rmax’。然后将所述Rmax’主要数(prime)与Rmax比较，并计算Rmax’/Rmax百分比，以确定第二mAb具有的对GPR49-Fc与预先结合于尖端上的第一mAb结合的能力的阻抑量。第二mAb相对第一mAb的交叉阻抑(Rmax’/Rmax x100)记录如下：0-25％完全交叉阻抑，25-50％部分交叉阻抑，50-75％低交叉阻抑，75-100％无交叉阻抑。所有mAb均针对自身进行了测试(第一和第二mAb为同样的测试mAb)，以确保正确的分析。
结果：针对测试的抗-GPR49mAb，观察到6个不同的表位结合组。这些组为：组1(76C12,1B3.5,6B10.2,4F6.2)、组2(18G7.1,14A8.1,5B10.1,14F7.1,11F6.1,14E3.1,1B8.1)、组3(5F2.5,6B10.2)、组4(3F11.1)、组5(10A.2)和组6(6E10.1)。自身-mAb的交叉阻抑如表8和9所示。
表8
 18G7.11B3.576C1214A8.15B10.114F7.15D6.35F2.518G7.111％100％100％20％28％14％62％100％1B3.5100％4％7％100％100％100％47％100％76C12100％4％5％100％100％100％25％100％14A8.15％100％100％6％9％4％99％100％5B10.113％100％100％16％11％14％76％100％14F7.17％100％100％7％11％5％100％100％5D6.3100％96％81％100％100％100％66％97％5F2.5100％100％100％100％100％100％79％13％11F6.19％100％100％    93％3F11.178％68％100％    100％14E3.15％88％95％    83％1B8.16％85％96％    85％
表9
 11F6.13F11.114E3.11B8.110A9.26B10.24F6.26E10.118G7.1        1B3.5        76C12    100％4％6％100％14A8.1        5B10.1        14F7.1        5D6.3        5F2.5    100％8％100％100％11F6.14％99％0％1％100％100％100％100％3F11.1100％5％86％75％100％100％100％100％14E3.14％87％2％0％    1B8.15％86％2％3％    
实施例19
GPR49 mAb76C12的药代动力学特性
方法：为确定GPR49抗体76C12在小鼠中的药代动力学特性和为下述在CT1模型中用76C12进行的研究确定合适的给药方案，将单次剂量的76C12以15或30mg/kg的量经腹腔(I.P)给药至CRL SCID Beige小鼠。在15min、30min和60min、2、6、24和48h时，以及4、7、9、11和14天后采血。通过ELISA测定血清浓度。
结果：76C12展现的半衰期为约4天(图12A-C)。
实施例20
原代结肠癌模型中原代肿瘤生长的体内抑制
方法：使用CT1(原代结肠癌)细胞，在原代结肠肿瘤异种移植模型系统中评估76C12IgG1抗体的单一药剂体内效力。CT1为源自结肠肿瘤患者样品的结肠肿瘤细胞系，并被用于建立结肠癌干细胞(肿瘤球)系。因为其为新近获自患者原始样本的低传代(<10代)细胞系，而被认为是“原 代”系。因为其培养于已确定的癌症干细胞条件(无血清培养基)和低附着平板(细胞在悬浮液中生长)，而被认为是癌症干细胞系。对CRLSCID-beige雌性小鼠接种1000个细胞并监测肿瘤生长。治疗开始时的平均肿瘤体积为约130mm³。将76C12mAb以30和15mg/kg的量经腹腔内给药(i.p.)，每周给药一次，为期4周。还将76C12mAb以15和7.5mg/kg的量进行了测试，每周两次为期4周。将同种型匹配抗体CE9.1(IgG1)作为阴性对照以15mg/kg的量给药，每周一次，为期4周；而将伊立替康以15mpk的量给药，每周一次，为期4周。接种后按照指示的间隔提取肿瘤，并测量总肿瘤体积。
结果：全人76C12抗体以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长(图13A&13B)。以30mg/kg的量每周给药为期4周，所述抗体表现出统计学显著的单一药剂效力。
实施例21
采用联合治疗在体内抑制原代肿瘤生长
方法：使用CT1(原代结肠癌)细胞，在原代结肠肿瘤异种移植模型系统中评估76C12IgG1抗体的单一药剂体内效力。对CRL SCID-beige雌性小鼠接种1000个细胞并监测肿瘤生长。治疗开始时的平均肿瘤体积为约130mm³。按照当前护理标准(即每7天125mg/m²，为期4周)作为单一药剂和与伊立替康组合给药，将76C12mAb以30和15mg/kg的量经腹腔内给药(i.p.)，每周两次为期4周。将未处理的同种型匹配抗体IDEC152(IgG1)、化疗媒介物对照以及IDEC152加伊立替康(针对组合的对照)作为阴性对照以15mg/kg的量给药，每周一次，为期4周；而将伊立替康以15mpk给药，每周一次，为期4周。接种后按照指示的间隔提取肿瘤并测量总肿瘤体积。
结果：抗-GPRR49mAb76C12抗体和伊立替康作为单一药剂(即单独给药)显示了类似的效力。相比单一药剂处理，76C12抗体以30mg/kg(图14)和15mg/kg的量与伊立替康组合，每周两次给药的方案，显示了附加的效力。此外，以15mg/kg量组合也显示了附加的效力。
实施例22
采用联合治疗在体内抑制原代肿瘤生长
方法：来自实施例21。
结果：GPR49抗体处理，观察到对小鼠的总存活数(来自实施例21中描述的实验)的附加益处。GPR49抗体76C12处理在恶病质CT1模型中大大降低了体重减少，并增加了50％的动物存活(图15)。此外，抗-GPR49mAb处理(来自实施例16和18，76C12与内源性小鼠GPR49交叉反应并结合)未观察到毒性；该发现以及GPR49mAb处理小鼠增加的存活数支持了GPR49抗体在癌症阻抑中的高潜力和安全性。
实施例23
采用联合治疗在体内抑制肿瘤系DLD-1生长
方法：在结肠肿瘤异种移植模型DLD-1中评估76C12IgG1抗体的单一药剂体内效力。对CRL SCID-beige雌性小鼠接种1000个细胞并监测肿瘤生长。治疗开始时的平均肿瘤体积为约130mm³。按照当前护理标准作为单一药剂和与伊立替康组合给药，将76C12mAb以15mg/kg的量经腹腔内给药(i.p.)，每周两次为期4周。将化疗媒介物对照以及IDEC152加伊立替康(针对组合的对照)作为阴性对照以15mg/kg的量给药，每周一次为期4周。接种后按照指示的间隔提取肿瘤并测量总肿瘤体积。
结果：76C12抗体显示了抑制肿瘤生长。与伊立替康组合观察到增强的效力(图16A&16B)。
实施例24
用抗-GPR49抗体治疗人癌症
本实施例描述了治疗癌症的方法，其使用抗-GPR49抗体靶向其中已检测到GPR49表达的恶性细胞，例如癌症干细胞或肿瘤起始细胞。
在某些实施方案中，将本发明的抗-GPR49抗体纯化并与合适的药物媒介物配制用于注射。将多个剂量的本实施方案的全人抗-GPR49抗体或人源化抗-GPR49抗体，按约1mg/kg体重至约100mg/kg体重的量通过静脉输注对患过度增生症的人患者给药，例如，每两周一次或每月一次， 为期至少6个月。按照测量的患者预后指标所指示的，间隔也可为不规则的。
可在标准放射疗法方案之前、同时或之后用抗体给药。监测患者以确定处理是否产生了抗-肿瘤应答，例如基于肿瘤退化、新肿瘤发生的降低、更低的肿瘤抗原表达、提高的无预后存活或延长的总存活，或者其他评估疾病预后的手段。
实施例25
用GPR49抗体在体内抑制具有K-Ras、PI3K、PTEN和p53突变的原代结肠癌肿瘤
我们进行了实验以确定是否GPR49抗体能在体内有效地抑制结肠癌，所述结肠癌具有能引起对已知癌症治疗的抗性的特定突变。例如，具有KRAS突变的患者可能对帕尼单抗和西妥昔单抗治疗结肠直肠癌的应答较差。因此，我们想确定是否GPR49抗体能够提供对具有这些已知的治疗性抗性标记的结肠癌的有效治疗。
方法：在原代结肠肿瘤异种移植模型系统中，使用CT1原代异种移植细胞评估鼠抗体14F7.1、18G7.1、5B10.1、14A8.1、1B3.5的单一药剂体内效力。CT1为从CRC患者新鲜肿瘤样品建立的原代结肠直肠癌(CRC)体内异种移植肿瘤。通过Ion (Life Technologies,Carlsbad,CA)深度测序，测定肿瘤细胞的突变状态以确认癌基因突变。约5-15％的CT1肿瘤表达GPR49。用CT1肿瘤细胞接种SCID beige雌性小鼠并监测肿瘤生长。当平均肿瘤体积达175mm³时，将小鼠随机分为10组。将所述抗体以15mg/kg的量经腹腔内(i.p.)给药，每周两次为期4周。将同种型匹配的抗体IgG1作为阴性对照以15mg/kg的量给药，每周两次为期4周。每周测量肿瘤体积和体重两次。
结果：相比对照，所述抗体抑制肿瘤生长高达40％(图17和18)。抗体14F7和18G7表现了最高的肿瘤生长抑制(分别为40％和34％的肿瘤抑制)。所述抗体的34％和40％肿瘤生长抑制为“特大的”效果，因为GPR49仅表达于约5-15％的肿瘤细胞。该特大的效果表明，抗体抑制GPR49阳性癌症干细胞是靶向体内肿瘤细胞增殖的源头。
实施例26
通过GPR49抗体与化学治疗药伊立替康组合在体内抑制具有K-Ras、PI3K、PTEN和p53突变的原代结肠肿瘤
我们还进行了实验以确定是否GPR49抗体与公知的癌症治疗剂组合能在体内有效抑制结肠癌，所述结肠癌具有能引起对已知癌症治疗抗性的特定突变。
方法：在原代结肠肿瘤异种移植模型系统中，使用CT1原代异种移植细胞评估鼠抗体14F7.1、18G7.1、5B10.1、14A8.1、1B3.5的单一药剂体内效力。CT1为从CRC患者新鲜肿瘤样品建立的原代结肠直肠癌(CRC)体内异种移植肿瘤。通过Ion Torrent深度测序，测定突变状态以确认癌基因突变。约5-15％的CT1肿瘤表达GPR49。用CT1肿瘤细胞接种SCID beige雌性小鼠并监测肿瘤生长。当平均肿瘤体积达175mm³时，在第0天将小鼠随机分为10组。将化学治疗药伊立替康经IP以10mg/kg的量给药，头5天每天一次。将所述抗体以15mg/kg的量经腹腔内给药(i.p.)，每周两次为期4周。接种后在所指示的间隔测量肿瘤的总肿瘤体积。
结果：相比单独伊立替康的45％肿瘤抑制，抗-GPR49抗体与伊立替康组合抑制了57％至65％的肿瘤生长(图17、图19)。因此，在已知对某些可用治疗具有抗性的结肠癌中，GPR49抗体将伊立替康的抗肿瘤活性增加了27％至44％。
实施例27
体内抑制具有K-Ras、PI3K、PTEN、H-Ras、APC、TP53、FGFR2、VANGL2、STK11、JAK2和RB1突变的原代结肠癌肿瘤
我们进行了实验以确定是否GPR49抗体作为单一的结肠癌肿瘤抑制剂是有效的，所述结肠癌肿瘤具有能引起对已知癌症治疗的抗性的特定突变。上述我们已经确定GPR49抗体与熟知的癌症治疗剂组合是有效的。在本实验中，我们确定了相比未处理的对照，用GPR49抗体处理后肿瘤生长的相对抑制。
方法：在原代结肠肿瘤异种移植模型系统中，使用CT3(原代结肠癌)细胞评估鼠抗体18G7.1和7C3.4的单一药剂体内效力。CT3为源自CRC患者新鲜肿瘤样品的原代结肠肿瘤异种移植物，并以低的传代数目(p<4)在体内维持。通过Ion Torrent深度测序，测定突变状态以确认癌基因突变。约15-20％的CT3肿瘤表达GPR49。用CT3细胞接种CB17-Scid雌性小鼠并监测肿瘤生长。当平均肿瘤体积达130mm³(第0天)时，将小鼠随机分为10组。然后将抗体以15mg/kg的量经腹腔内给药(i.p.)，每周两次为期4周。将同种型匹配的抗体IgG1作为阴性对照以15mg/kg的量给药，每周两次为期4周。每周测量两次肿瘤体积和体重，直到研究完成。
结果：相比对照处理，所述抗体抑制肿瘤生长高达43％(图20)。鉴于GPR49抗体仅结合CT3肿瘤细胞15-20％的亚群，该>40％肿瘤生长抑制为“特大的”效果。该特大的效果表明，对GPR49阳性癌症干细胞的抑制是靶向体内肿瘤细胞增殖的源头。
实施例28
GPR49mAb处理在具有K-Ras、PI3K、PTEN和p53突变的原代结肠肿瘤中降低体内癌症干细胞频率
我们进行了实验以分析GPR49抗体在源自结肠癌肿瘤的细胞中对于癌症干细胞频率的影响，所述结肠癌肿瘤具有能引起对已知癌症治疗的抗性的特定突变。我们已经观察到，相比所结合的肿瘤细胞的比例，GPR49抗体显示了对肿瘤生长的“特大的”相对影响。该实验旨在确定这些抗体对于癌症干细胞频率的影响。
方法：对从来自实施例1和2中描述的体内研究的对照、GPR49mAb、伊立替康以及GPR49mAb与伊立替康组合的处理组和对照组分离的CT1肿瘤细胞，进行收集、汇合、解离，并在有限稀释第二移植检测中再植入以测量癌症干细胞频率。对于每个处理组，对8只小鼠植入30、100和300个细胞。监测肿瘤形成(即肿瘤获取量(tumor take))和生长速率，每2周一次为期8周。为计算每个处理组的癌症干细胞频率，用Prism GraphPad^TM进行线性回归分析以计算每个处理组的癌症干细胞频率。该检测被认为是测量CSC的黄金标准，因为它是测量能在第二宿主中产生 新肿瘤的任何给定肿瘤中CSC克隆频率的功能性CSC检测。在该检测中，在有限稀释检测中将含有待测CSC的肿瘤系列移植到第二受体。因此，该检测是自我更新能力—任何干细胞的关键组成的体内功能性测量。它不基于对通常用于体外测量CSC的细胞表面标记或酶检测的至今不完整的理解和定征。
结果：来自GPR49mAb以及GPR49mAb与伊立替康组合预处理肿瘤的肿瘤再生长被显著抑制(图21)。超过62％的植入有GPR49mAb或GPR49mAb+伊立替康预处理的肿瘤的小鼠(5/8)，在植入后8周没有显示肿瘤形成(即无肿瘤)。相比之下，仅1/8植入有用对照处理的肿瘤的小鼠(13％)，在植入后8周保持无肿瘤。线性回归分析显示，相比对照，GPR49抗体处理后CSC数目减少为3分之一(图21)。
实施例29
GPR49mAb处理在具有K-Ras、PI3K、PTEN、H-Ras、APC、TP53、FGFR2、VANGL2、STK11、JAK2和RB1突变的原代结肠肿瘤中降低体内癌症干细胞频率
我们进行了实验以确定是否GPR49抗体对于包含能引起对已知的癌症治疗抗性的更大数目的突变的癌细胞具有类似的影响。在上述结果上进行扩展，我们在含有更大数目突变的癌细胞系中，测定了这些抗体对癌症干细胞频率的影响。
方法：对从来自实施例3中描述的体内研究的处理组和对照组的对照、GPR49mAb、伊立替康以及GPR49mAb+伊立替康组合处理的肿瘤分离的CT3原代肿瘤细胞，进行收集、汇合、解离，并在有限稀释第二移植检测中再植入以测量癌症干细胞频率。对于每个处理组，对8只小鼠植入10、30、100个细胞。监测肿瘤形成和生长速率，每2周一次为期12周。为计算每个处理组的癌症干细胞频率，用Prism Graph Pad进行线性回归分析以计算每个处理组的癌症干细胞频率。该检测被认为是测量CSC的黄金标准，因为它是测量能在第二宿主中产生新肿瘤的任何给定肿瘤中CSC克隆频率的功能性CSC检测。在该检测中，在有限稀释检测中将含有待测CSC的肿瘤系列移植到第二受体。因此，该检测是自我 更新能力—任何干细胞的关键组成的体内功能性测量。它不基于对通常用于体外测量CSC的细胞表面标记或酶检测的至今不完整的理解和定征。
结果：相比对照，GPR49mAb处理后CSC频率减少为5分之一(图22)。
实施例30
GPR49mAb处理结合化学治疗药伊立替康能防止结肠肿瘤细胞在第二受体中形成新的肿瘤
我们进行了实验以确定是否用GPR49mAb与伊立替康组合在体内处理结肠肿瘤异种移植物能防止结肠肿瘤细胞在第二受体中形成新的肿瘤。在植入有预先处理的肿瘤细胞的对象中，新的二次肿瘤形成是在癌细胞群中肿瘤干细胞频率的替代性测量。我们想测定在接受了预先处理的结肠肿瘤细胞的对象中，GPR49抗体和伊立替康组合对二次肿瘤形成的影响。
方法：对从来自实施例3中描述的体内研究的对照或GPR49mAb+伊立替康处理的肿瘤分离的肿瘤细胞，进行收集、汇合、解离，并在有限稀释第二移植检测中再植入以测量癌症干细胞频率。对于每个处理组，对8只小鼠植入10、30和100个细胞。监测肿瘤形成，每2周一次为期12周。
结果：经140天随访后，GPR49mAb+伊立替康组中未观察到肿瘤生长(0/8的小鼠有肿瘤)。相比之下，5/8的用对照伊立替康处理的小鼠形成了平均大小1729mm³的肿瘤(图23)。这表明，用GPR49抗体处理去除了肿瘤，并大大降低了癌症干细胞继续增殖的能力，甚至在GPR49抗体处理中断后仍能如此。