细胞的制备和稳定化 【发明背景】
本发明涉及细胞的制备和稳定化，具体涉及一种新的多种细胞和单种细胞悬浮液尤其是全血及其成分的制备和稳定化方法，同时涉及新的稳定化的细胞制剂在UV显微镜检术和流式细胞计量术的，白细胞免疫表型技术等分析技术的质量控制中的应用以及在固定化抗体/抗原检测系统、血液学分析仪和含锌原卟啉(ZPP)、红细胞叶酸盐和血糖测定等血液检测技术中的应用。
UV显微镜检术和流式细胞计量术是用于诊断血液恶性肿瘤的技术。它们还被用于监测感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的病人的病情发展，是无症状还是患有AIDS相关综合症(ARC)或成熟的AIDS。这两项技术的质量控制(QC)对正确诊断和监测有效的治疗方法是极端重要的。现有的QC方法使用新鲜抽取的血液或包被有荧光染料的微球体。
每天使用新鲜血液不能提供技术或设备的日常变动信息。而且，包被有荧光染料的微球体虽然可提供对流式细胞仪操作的日常监测，但不能用于UV显微镜检术。另外，它们都不能用于为白细胞的标记技术提供质量控制。
利用诸如醛类化合物进行的正常白细胞的固定虽然可提供5—7天的稳定性，但增加了细胞地自身荧光。这使得制剂不适合用于作为长期的质量控制物质。而且，利用全血裂解技术进行的红细胞裂解需要一种可对该过程进行质量控制的制剂。现有的白细胞固定技术会抑制此裂解过程，导致干扰测试的细胞碎片的显著增加。
在国际申请No.PCT/US91/03236(全文在此公开引用作为参考)中，描述了一种用于白细胞差异测定的血液稀释液和裂解剂，其中以重氮烷基脲(diazolidinyl urea)为稳定剂。这类白细胞制剂还不曾被提作质量控制制剂，可能是因为对于需要评估来自大量实验室结果的日常质量控制方法而言，它们不够稳定而且缺乏特异性抗原活性。国际申请No.PCT/US92/03758。(全文在此公开引用作为参考)揭示了将不含醛的重氮烷基脲、咪唑烷基脲、二甲基醇-5，5-二甲基乙内酰脲、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇和季金刚烷(quaternary adamantane)用作组织稳定剂。这些制剂中可含有媒染剂，诸如锌、锶、钙、钡和铬盐。但是，并未提及这些盐都具有稳定特性。
其他需要使用全血样品或血制品来校准的QC设备包括血液学分析仪，目前由于无法获得合适的稳定化的人血液源而在其中使用固定的牛血或驴血和火鸡血。含锌原卟啉(ZPP)和红细胞叶酸盐检测技术也需要用新鲜的红细胞悬浮液来校准，仍然是因为没有合适的稳定化的血液源。最终，缺乏用于校准的稳定的人全血源限制了糖尿病患者在家进行血糖监测的可能性。
由上可知，需要有一种可用于各种质量控制、检测和校准的稳定细胞尤其是全血和血制品的改进方法。发明目的
本发明目的之一是提供改良的稳定化的细胞制剂和一种稳定细胞的改进方法。
本发明目的之二是提供一种稳定化的全血制剂和一种该制剂的生成方法。
本发明目的之三是提供一种在全血中将白细胞与红细胞分离的改良的裂解方法。
本发明的另一目的是提供可广泛用于质量控制、分析和检测技术的稳定的质量控制材料。发明概述
现在发现，许多细胞可通过加入含有有效量重金属的化合物来稳定，而且这类稳定化的细胞维持活性的时间比迄今为止所知的细胞要长得多。
所以，本发明的一方面内容是提供一种稳定化的细胞制剂，其中的稳定剂含有有效量的重金属化合物。
本发明的另一方面内容提供了一种通过加入有效量的含有重金属化合物的稳定剂稳定细胞的方法。
本发明对全血和血制品的稳定化尤其具有实用性，所以将就此作更具体的描述。但是，必须理解，本发明并不限于这些物质的稳定化，而是可广泛适用于各种细胞物质，特别是细胞悬浮液。
所以，本发明还进一步提供了一种稳定化的全血制剂，其中的稳定剂含有有效量的重金属化合物，同时提供了一种通过加入有效量的该化合物来稳定全血制剂的方法。
以从裂解的全血制得的白细胞制剂为例，本发明还提供了通过加入有效量的重金属化合物进行的全血的细胞组分的稳定化方法。
所以，本发明还进一步提供了一种稳定化的白细胞制剂，其中的稳定剂含有有效量的重金属化合物，同时提供了通过加入有效量的含有重金属化合物的稳定剂来稳定白细胞制剂的方法。
本发明这一方面内容中的稳定化的白细胞制剂可被加入分去了白细胞的全血(红细胞)以形成稳定化的全血制剂，所以，本发明还进一步包括一种含有通过加入有效量稳定剂而稳定的白细胞的稳定化的全血制剂和将稳定化的白细胞制剂加入分去了白细胞的全血来产生稳定化的全血制剂的方法。
本发明的另一方面内容提供了一种含有稳定化的白细胞和未处理过的红细胞的稳定化的全血制剂。
本发明还提供一种用于细胞物质尤其是血液和血制品的新的稳定剂，它含有重金属化合物和甲醛的水溶液。
本发明还提供了一种白细胞差异化的裂解剂，它含有铵或季铵盐和尿素的溶液，溶液中尿素的浓度和pH足以抑制单核细胞负调节(down-regulating)CD14抗原以使它们能被免疫方法检测出来。本发明的详细说明
现在本发明将具体就用于实验室质量控制过程的稳定化的全血制剂的产生进行描述，虽然必须理解，本发明并不仅限于此，例如，稳定化的全血制剂可能还具有其他用途，稳定化的白细胞制剂也可能具有作为质量控制物质的用途，所述的稳定化过程可能被用于从血液以外的其他来源例如甲状腺内淋巴细胞中产生稳定化的白细胞。此外，所述的稳定化过程可以用于从血液以外的其他来源例如微生物细胞、植物细胞和来自活组织的类似物质中产生稳定化的细胞。
本说明中的全血制剂包括基本含有新鲜血液全部组分的制剂和基本含有除血浆以外的新鲜血液全部组分的制剂。
实现全血稳定化的方法使用了一系列包含了加入有机和无机化合物的步骤。开始时抽取一定单位量血液的方法在文献中有充分记载而且可以是任何一种用于静脉切开放血术工艺的方法。最好使用抗凝血液，几种合适的抗凝剂可以购得。但是，最好使用EDTA钾盐。
根据本发明的第一种过程，稳定化的全血制剂的制备可先从红细胞中分离白细胞，稳定白细胞，然后将稳定化的白细胞加入分去了白细胞的全血中。在第二种过程中，取消了白细胞分离步骤，而且将稳定剂加入只去除了血浆的全血中。这两种过程将被分别描述。
过程I
稳定白细胞的过程通常在静脉切开放血术后24小时内进行，但最好在2小时内进行。为了从红细胞中分离白细胞，使用了一种新的红细胞裂解方法。
先将含有抗凝剂的新鲜血液离心，离心后在血沉棕黄层进行裂解。裂解剂含有一种铵盐例如氯化铵或季铵盐和尿素或合适的取代尿素或尿素衍生物的溶液，最好是水溶液。季铵盐的浓度范围最好为0.05—0.5M，尿素的浓度低于1.0M，而且最好在0.05—0.5M范围内。溶液的pH以6.8—7.8为宜。裂解时间以5—20分钟为宜，在此之后用等渗盐水溶液洗涤所得的白细胞以去除裂解的细胞碎片。
用一种含有重金属化合物、具体说是重金属盐的第一稳定剂处理白细胞。合适的重金属是那些具有络合特性且原子量大于20的重金属，例如过渡金属，尤其是周期表中IVa至VIIa族的过渡金属，例如锰、铬、钼、钒和钛；Ib族，例如铜；Ib族，例如锡。尤其优选VIa族和VIIa族的过渡金属，特别是铬和锰。合适的化合物包括这些金属的水溶性盐，特别是无机酸盐，例如硫酸盐，特别是氯化物。使用铬化合物，例如氯化铬(CrCl3)已获得特别好的结果，这些是用于本发明的优选的第一稳定剂。
重金属化合物最好以合适溶剂的溶液形式使用。这种溶剂通常为水，或一种水性介质，但并不特别排除加入少于10％的少量合适的有机溶剂，这些溶剂基本不会抑制白细胞的抗原活性或影响它们的完整性。
但大量有机溶剂的存在通常是有害的。
溶剂最好是缓冲至pH6.5—7.0的等渗水溶液。合适的缓冲水溶液包括，例如磷酸盐缓冲液。
重金属化合物最好溶于溶剂并在使用前静置，例如至少6小时，以12小时为宜，24小时更好，最好48小时，例如1周。静置改善溶液性能的原因尚不明了，但可能是因为在溶液中形成了水合的金属羟基离子物质。在某些铬化合物的缓冲溶液中已经观察到，例如，在24小时后新鲜制备的溶液在形成可能是铬羟化物聚合体的沉淀同时由绿色变为紫色，这表明络合离子发生了变化。使用前最好将该沉淀从溶液中滤处。沉淀的形成当然会降低溶液中重金属离子的浓度，如果这种现象发生，当然就必须对溶液进行分析决定第一稳定剂的浓度是否还在优选范围内。
重金属化合物的溶液最好以浓缩液形式贮存，例如以1％w/v浓度，在使用前用合适的缓冲液稀释。稀释时会因为pH的升高而产生沉淀，必须在使用该溶液前静置足够的时间以产生这一沉淀。
虽然重金属化合物的陈溶液可在相当长的时间后仍保持其作用，但仍以在12个月后丢弃为宜，最好是在6个月后。
第一稳定剂的存在可防止白细胞表现出过度的自身荧光，同时可在长于25天的时间内保持白细胞稳定。第一稳定剂最好以等渗溶液的形式加入白细胞制剂中，其中第一稳定剂的最适终浓度以低于1％w/v为宜，以0.005％—0.75％w/v更好，以0.01％—0.5％w/v还要好，以0.05％—0.25％w/v最好，例如0.1％w/v。该溶液最好是0.85％的磷酸盐缓冲液。PH以调节至6.5—7.0为宜。白细胞与第一稳定剂接触的培育时间以5分钟至18小时为宜，但最好是60分钟。培育温度以0℃—8℃为宜，例如约4℃。
在初培育之后，最好以第二稳定剂处理白细胞，它可以是例如醛类，以甲醛为宜，最好是聚甲醛，它可以，例如，以0.1％—0.5％w/v的终浓度例如0.35％w/v溶于某溶液中。
当细胞的自身荧光不成为问题时，例如在某些组织学技术中，任何合适的醛均可使用，但是通常地，特别是在制备用于流式细胞计量术的样品时，需要将自身荧光减至最小。在这种情况下中优选聚甲醛，因为一般地它产生的自身荧光最小。在制备聚甲醛溶液时最好将温度保持在60℃以下，以免聚甲醛向甲醛逆转。
已发现当使用生金属化合物和醛作为第二稳定剂时，获得了非常好的结果。这种组合的第二稳定剂单独地用于细胞物质的稳定，因此是本发明的一个方面。
重金属化合物可以是前述的任何一种，在溶液中的含量可以是0.01％—0.5％w/v。醛的含量可以是0.1％—0.5％w/v，而且溶液中重金属化合物与醛的比值以在5∶1—1∶50范围内为宜。最好溶液的pH为6.5—7.0，并且含有某种合适的等渗缓冲液。优选溶液可以是例如0.85％的磷酸盐缓冲液。溶液中最好还含有一种抗凝剂，而优选的抗凝剂是EDTA和肝素。与第二稳定剂的接触最好在前述温度下进行6至24小时。
虽然在单独使用时，重金属化合物被发现在某些情况下可在20多天中提供显著的稳定效应，但一般未发现它们可提供60天的稳定性，而这正是所需的商品化保存时间。
进一步的改进是通过使用某种重金属化合物和某种醛的组合溶液(实际上，是单独使用的前述第二稳定剂)来达到的，但该处理仍被发现无论如何无法提供所需的60天的稳定性。
另一方面，如在此之前所描述的，先后使用第一和第二稳定剂可提供白细胞超过220天的稳定性。第一和第二稳定剂处理的间隔以至少30分钟为宜，更好的至少1小时，最好至少12小时，例如24小时。
在用等渗磷酸盐缓冲液洗涤后，稳定化的白细胞被重新加入分去了白细胞的全血中。该分去了白细胞的全血可以但不必需通过将原血液滤过可购得的白细胞过滤器而制得。最好再向最终制剂中加入细菌生长抑制剂。使用前将该溶液在0℃—8℃保存1—5天。
所有上述步骤都宜在无菌条件下进行。
出于本发明的目的，主要含有红细胞的分去了白细胞的血液可以被认为是“未处理过的”，即，发现无需向分去了白细胞的血液加入稳定剂以获得稳定化的全血制剂。特别令人惊奇的是，可以仅对其中的白细胞组分进行稳定来制得稳定化的全血制剂。
在根据过程I进行的稳定化的全血制剂的工业生产中，可混合若干单位的不同血源的血液并分离和稳定白细胞。然后可混合其他单位的不同血源的血液并分去白细胞。最后，混合的稳定化的白细胞被加入分去了白细胞的血液中以形成稳定化的全血制剂。过程II
本过程与所述的过程I相似，除了如前所述外，省略了白细胞分离步骤。为此，稳定化的全血制剂的大规模生产常优选过程II。
全血样品的稳定化的过程通常在静脉切开放血术后24小时内进行，但最好在2小时内。
含有例如EDTA抗凝剂的新鲜全血先被离心，分离并保留血浆。
洗涤留下的细胞，然后用含有某种重金属化合物的第一稳定剂处理，该过程可与过程I中所述的相同。
第一稳定剂最好以溶液形式加入全血制剂中，溶液中第一稳定剂的最适终浓度以0.01％—0.5％w/v为宜。该溶液最好处于0.85％的磷酸盐缓冲液中。最好将pH调节至6.5—7.0。全血与第一稳定剂的接触时间与5分钟以18小时为宜，最好是60分钟。培育温度以0℃—8℃为宜，例如约4℃。
在初培养之后，最好以第二稳定剂处理全血，它可以是例如某种醛，最好是聚甲醛，使用过程I中所述的相同条件。第二稳定剂溶液的加入可将全血的稳定性延长至130天。与第二稳定剂的接触时间以6—24小时为宜，例如18小时，温度范围与过程I中所述的相同。
等渗磷酸盐缓冲液洗涤后，将血浆重新加入到稳定化的全血中。该血浆可以但并不必需由原血液制得。最好再在最终的制剂中加入细菌生长抑制剂和抗生素，例如庆大霉素。制剂在使用前在0℃—8℃保存1—5天。
所有上述步骤最好在无菌条件下进行，而且全过程最好在采集所供血液的静脉切开放血包中进行。
在根据过程II进行的稳定化的全血制剂的工业生产中，可以而且可能地最好混合不同血源的供者血液并稳定所得的混合血液。
在此所述的稳定化方法既可用于正常细胞也可用于白血病细胞，以提供一种已知的正常对照和异常(白血病的)对照。
本发明的稳定化的全血制剂可提供一种极稳定的质量控制和参比物质，可用于通过UV显微镜检术和流式血细胞计量术进行的白细胞免疫表型(分析)。该制剂在没有碎片的过度污染的全血裂解过程的质量控制方面很有价值。稳定化的样品中可含有全部正常的外周血白细胞(粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)或它们的子集合。在最适条件下，该过程可以保留白细胞的抗原分布格局以确保过程的表型(分析)和质量控制。可对常用抗原决定簇进行测定，这些值可在130多天内保持稳定。研究者还可以成功地得出可能具有特殊意义的其他抗原数据。而且，该制剂还可用于由流式细胞仪获得的差异的质量控制。这是一个检测HIV感染个体的抗病毒治疗的参数。
正在开发对血液样品进行表型(分析)的新方法，该方法在染色后无需用裂解剂处理样品。这些技术被称为非洗、非裂解技术。本发明的全血制剂可用于为这些技术提供质量控制，也可用在分析非洗、非裂解过程的流式细胞仪方面。
通常地，本发明的稳定化的全血制剂可用于UV显微镜检术和流式细胞计量术的免疫表型技术的质量控制中，可采用全血裂解和全血非裂解技术。
对本发明的稳定化的全血制剂的研究表明它们还适合用于诸如碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)的免疫细胞化学技术分析中，并可用于例如测定外周血涂片上的白细胞的抗原分布格局。它可被用作日常参比物质或外部的(实验室内)质量控制。可预先制备多个涂片，然后保存于-20℃直至使用。这些涂片可进行日常染色或在染色其他涂片时用作参比。
本发明的稳定化的全血制剂还可用作酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫放射测定技术中的标准参比物。
本发明的稳定化的全血制剂在实验室中的其他应用还包括作为血液分析仪的质量控制和校准物，作为利用含锌原卟啉(ZPP)进行的缺铁性检测的质量控制物质和作为红细胞叶酸盐技术中的质量控制物质。最后，更广泛地说，本发明的稳定化的全血制剂可用于血糖水平测定的质量控制，由此可使糖尿病人可在自己的家中进行该项测定。
以下实施例说明本发明。
实施例1
如下配制一种稳定化的全血制剂并与一种与之相似的未处理过的全血样品比较其衰老特性。
制备
1.利用静脉切开术将500ml血液采入含有溶于50ml磷酸盐缓冲液(PBS)的600mg乙二胺四乙酸(二钠盐或三钾盐)的无菌静脉切开放血包中。
2.将抗凝血液分成两分(每分250ml)。
3.取一分(250ml)通过白细胞过滤器分去白细胞。然后保存于4℃。
4.将留下的一分(250ml)在800g离心1小时。
5.移去血沉棕黄层(白细胞层)。
6.用裂解液将血沉棕黄层定容至250ml。
裂解溶液
10×贮存液pH7.4
89.9g 氯化铵
10.0g 碳酸氢钠
370mg EDTA二钠
将上述物质溶于1000ml的蒸馏水(1.68M NH4Cl)中，并用蒸馏水稀释至2×浓度，然后加入等体积的0.2M尿素(溶于蒸馏水中)，形成的pH7.5的1×裂解终溶液。
7.在室温下避光裂解5分钟。
8.在800g离心3分钟并倾析上清液。
9.用磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤3次。倾析最后的上清液。
10.将细胞重悬于20ml的PBS中。
11.加入60ml已过滤的、储存期超过1个月的0.1％六水合氯化铬(pH6.7)的PBS溶液，并在4℃避光培育1小时，间断地加以搅拌。
12.在800g离心3分钟并倾析上清液。
13.将沉淀重悬于20mlPBS，并加入60ml已过滤的、储存期超过1个月的0.1％六水合氯化铬pH6.7且同时含有0.35％聚甲醛的PBS溶液。在4℃避光培育16—22小时。
14.在800g离心3分钟并倾析上清液。
15.如步骤9所述洗涤3次。
16.将白细胞重悬于步骤3所述的无白细胞全血中。加入庆大霉素、环丙氟哌酸之类的广谱抗生素。
17.使用前在4℃放置2—3天。
磷酸盐缓冲液pH7.2
7.83g/l 氯化钠
0.36g/l EDTA二钠
0.28g/l 氯化钾
0.26g/l 磷酸二氢钾(单碱)
2.35g/l 磷酸氢二钠(二碱)
比较结果由附图说明，其中：
图1所示为“新鲜”血液染色后对抗原CD3、CD4、CD8、CD20的流式细胞计量术特性。使用全血裂解技术进行染色，阳性水平与阴性对照的关系(a)前向和侧向散射(FSC和SSC)特性，(b)CD3磷脂酰乙醇胺(PE)和CD20异硫氰酸荧光素(FITC)，(c)CD3异硫氰酸荧光素(FITC)和CD4磷脂酰乙醇胺(PE)，(d)CD3异硫氰酸荧光素(FITC)和CD8磷脂酰乙醇胺(PE)。
图2所示为8天内“新鲜”未稳定化血液的流式细胞计量术FSC和SSC的衰老效应。(a)第一天，(b)第二天，(c)第三天，(d)第八天。
图3a和图3b所示为10天内图1b、c和d中描述的抗原表达的衰老效应。3a(i)(ii)(iii)第一天，3b(i)(ii)(iii)第十天。
图4a和图4b所示为由流式细胞计量术测定的稳定化的全血制剂57天内的FSC、SSC和阴性对照特性的稳定性。4a第二天，4b第57天。
图5a和图5b所示为由流式细胞计量术测定的57天内的图1b、c和d中描述的抗原的稳定性。5a第二天，5b第57天。
图6所示为8天中“新鲜”血液流式细胞计量术白细胞差异的贮存效应。由于样品严重变质，无法进行8天后的进一步分析。使用FACScan流式细胞仪进行分析。
图7所示为稳定化的血液制剂22天流式细胞计量术的(白细胞)差异的稳定性。使用FACScan流式细胞仪进行分析。
图1中的流式细胞计量术图显示了在红细胞裂解后淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的正常位置。图1b、c、d和e还显示了抗原染色特性。流式细胞计量术和抗原表达特性随样品贮存时间增加而改变。8天时的碎片量令人无法进行满意的分析。如图3所示，荧光标记特性也变差。
图4显示了稳定化的样品在第2天和第57天的前向和侧向散射特性及其阴性对照。一经稳定化后，各(细胞)群体保持它们各自的位置。第57天后制剂的流式细胞计量术的前向和侧向散射特性维持原样(图4b)。另外，这段时间后的抗原表达特性仍保持不变(图5)。
稳定化的血液制剂可用于检测白细胞差异。使用直接抗CD14和CD45抗原的特异性组合抗体可形成三组群体差异。图7显示了这一参数的稳定性，而图6则显示了8天中“新鲜”全血的不稳定性。这段时间后的分析由于过量碎片的污染而被放弃。实施例2
如下配制一种稳定化的全血制剂并与一种与之相似的未处理过的全血样品比较其衰老特性。制备
1.利用静脉切开术将500ml血液采入含有溶于50ml磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.2的600mg乙二胺四乙酸(二钠盐或三钾盐)的无菌静脉切开放血包中，如前述实施例1。
2.在800g离心1小时。移去并保留血浆。
3.以无菌磷酸盐缓冲液将留下的细胞洗涤2次。
4.除去上清液PBS。
5.加入300ml已过滤的、储存斯超过1个月的0.1％六水合氯化铬(pH6.7)的PBS溶液，并在4℃避光培育1小时，间断地加以搅拌。
6.在800g离心45分钟并倾析上清液。
7.将沉淀重悬于300ml已过滤的、储存期超过1个月的0.1％六水合氯化铬pH6.7且同时含有0.35％聚甲醛的PBS溶液。在4℃避光培育16—22小时。
8.在800g离心45分钟并倾析上清液。
9.用磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤2次。倾析最后的上清液。
10.将稳定化的全血重悬于步骤2所述的血浆中。加入庆大霉素、环丙氟哌酸之类的广谱抗生素。
11.使用前在4℃放置2—3天。
比较结果由附图说明，其中：
图8a和8b显示了由流式细胞计量术测定的有关稳定化的全血制剂60天的FSC、SSC和阴性对照特征的稳定性。4a第三天，4b第60天。
图9a和9b显示了由流式细胞计量术测定的抗原CD3、CD4、CD8、CD19和CD16＋CD5657天的稳定性。5a第三天，5b第57天。
图10所示为稳定化的血液制剂25天流式细胞计量术的差异(细胞)的稳定性。使用FACScan流式细胞仪进行分析。
图11所示为某稳定化的全血制剂样品中含锌的原卟啉(ZPP)含量36天的稳定性，单位为μmolZPP/mol血红蛋白。
图12所示为用Toa(Sysmex)NE8000血液学分析仪测定的某稳定化的全血制剂样品中的全部白细胞量和全部淋巴细胞量117天的稳定性。
最后，图13所示为50天内稳定化的全血制剂样品和新鲜贮存的全血样品中红细胞叶酸盐的测定值。
图1中的流式细胞计量术图显示了在红细胞裂解后淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的正常位置。图1b、c、d和e还显示了抗原染色特性。流式细胞计量术和抗原表达特性随样品贮存时间增加而改变。8天时的碎片量令人无法进行满意的分析。如图3所示，荧光标记特性也变差。
图8a和8b显示了第3天和第60天稳定化的样品的前向和侧向散射特征及其阴性对照。一经稳定化后，各(细胞)群体保持它们各自的位置。保存了60天后，制剂的流式细胞计量术的前向和侧向散射特征维持原样(图4b)。另外，这段时间后的抗原表达特征仍保持不变(图9a和9b)。全过程中仪器的设定保持不变。这些结果显示了本发明的稳定化的血液制剂比图1—3所示的非稳定化“对照”血液制剂具有显著的优越性。
稳定化的全血制剂可用于检测白细胞差异。使用直接抗CD14和CD45抗原的特异性组合抗体可形成三组群体差异。图10显示了这一参数25天的稳定性，而图6则显示了8天中“新鲜”全血的不稳定性。这段时间后的分析由于过量碎片的污染而被放弃。
如图11所示，稳定化的全血制剂中ZPP含量基本恒定，只在36天后略有升高。同样，如图12所示，在117内，全部白细胞量和全部淋巴细胞量基本不受时间的影响。
图13显示了根据本发明使用稳定化的全血制剂后，红细胞叶酸盐值稳定性的显著改进。
实施例3
重复实施例2的过程，但在第5步中使用在0.85％w/v的磷酸盐缓冲液中含有各种金属盐形成的0.1％w/v溶液。使用流式细胞仪测定由FSC、SSC和阴性对照特征决定的所得血液制剂8天和12天后的稳定性。通过对形成的斑点的目测和使用Becton-DickinsonSimulset软件3.2版以好、合格或不合格估计结果。化合物 不合格 合格 好CrCl3(＞1天) XCrCl3(存储了16个月) XCr2(SO4)3 XCrF3 XCr(NO3)3 XCr(乙酸)3 XMnCl2 XPtCl2 XScCl2 XVCl3 XWCl4 XSnCl2 XZnCl2 XCeCl3 XMgCl2 XAlCl3 XCuCl2 XCuSO4 XMoCl3 XPb(NO3)2 X FeCl3 XTiCl3 XK2Cr2O7 X
12天后的结果CrCl3(＞1天) XCrCl3(存储了16个月) XCr2(SO4)3 XCrF3 XCr(NO3)3 XCr(乙酸)3 XMnCl2 XPtCl2 XScCl3 XVCl3 XWCl4 XSnCl2 XZnCl2 XCeCl3 XMgCl2 XAlCl3 XCuCl2 XCuSO4 XMoCl3 XPb(NO3)2 XFeCl3 XTiCl3 XK2Cr2O3 X
这些结果表明了VIa族和VIIa族金属化合物比其他重金属化合物具有显著的优越性，虽然后者中的有些被认为是可用的。从这些比较中获得比未稳定化的、4天后基本变质的对照更高的稳定性。
储存了16个月的氯化铬溶液的效果被发现比新配(＞1天)溶液差，估计是因为溶液中水合铬离子络合物的形成或不溶性铬羟化物聚合体沉淀的形成导致了溶液中铬离子的减少。
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在本说明中揭示的所有特征(包括所附的权利要求、摘要和附图)和/或任一方法中的所有步骤可以任何方式组合，除了那些至少有部分这样的特征和/或步骤是互不相容的组合。
在本说明中的每一特征(包括所附的权利要求、摘要和附图)，除非有明确的声明，都可以被可达到相同、相当或相似目的的不同特征所取代。所以，除非有明确的声明，所揭示的每一特征只是普通的一系列相当或相似特征中的一个举例。