一种呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用.pdf

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒(RSV)病毒样颗粒(VLPs)亚单位疫苗、制备方法及应用。本发明涉及的疫苗组分是以乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)为载体、与RSVG蛋白的中和抗原表位或同时与M2蛋白T细胞抗原表位融合表达的嵌合抗原蛋白。抗原蛋白能在大肠杆菌高效表达，经体外纯化、变性和复性制备了高纯度抗原组分，并自组装成病毒样颗粒(VLPs)。VLPs所含的RSVG蛋白与M2蛋白T细胞抗原表位同时表达，增强了疫苗诱导特异性免疫应答和抗RSV感染免疫保护的能力，并能诱导平衡的Th1/Th2类免疫应答和防止RSV疫苗增强疾病发生。应用所发明的VLPs疫苗免疫接种动物，诱导机体产生高水平RSV中和抗体、增强的Th1类细胞因子水平和针对RSV攻击感染的有效保护。

1.  一种呼吸道合胞病毒（RSV）病毒样颗粒，其特征在于，以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白氨基酸序列中第1-144位氨基酸为载体，包含嵌合其中的RSV G蛋白中和抗原表位，可自主装配的病毒样颗粒。

2.  根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，其特征在于，在乙型肝炎病毒核心蛋白C末端还融合了RSV M2蛋白的CTL 表位。

3.  根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述的RSV G蛋白中和抗原表位是G蛋白的氨基酸序列中第144-204位氨基酸所示的序列，其氨基酸序列为Seq NO.1。

4.  根据权利要求2所述的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述的RSV M2蛋白的CTL 表位是M2蛋白的氨基酸序列中第82-90位氨基酸所示的序列。

5.  根据权利要求3所述的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，其特征在于，经密码子优化设计，获得了由HBc1-144aa 与RSV G144-204aa编码序列融合的基因片段HBc-tG，其核苷酸序列为Seq NO.2。

6.  根据权利要求4所述的呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，所述的RSV G蛋白中和抗原表位是G蛋白的氨基酸序列中第144-204位氨基酸所示的序列，其氨基酸序列为Seq NO.3。

7.  根据权利要求6所述的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，其特征在于，经密码子优化设计，获得了由HBc1-144aa 与RSV G144-204aa及M2(82-90aa)编码序列融合的基因片段HBc-tG/M2_82-90，其核苷酸序列为Seq NO.4。

8.  含有编码权利要求1-7任一所述呼吸道合胞病毒病毒样颗粒的核酸的重组表达载体。

9.  转化了权利要求8所述的重组表达载体的宿主细胞。

10.  权利要求1-9任一所述呼吸道合胞病毒病毒样颗粒用于制备预防、诊断和治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的用途。

一种呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种嵌合表达呼吸道合胞病毒多表位抗原的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，属于生物技术领域，用于人和易感动物呼吸道合胞病毒感染的免疫预防。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是全球范围内引起婴幼儿下呼吸道感染并导致其罹患细支气管炎和肺炎，严重可导致支气管哮喘甚至死亡的重要病原体之一，几乎所有儿童两岁前感染过至少一次RSV(Black,2003)。年龄越小病情越重，再感染率高，与哮喘发生密切相关；免疫缺陷者更易感染，临床症状更为严重，常致死亡(Holt and Sly,2002；Meissner et al.,2004)。老年人和免疫缺陷病人也是RSV的易感染人群。人感染RSV后不能产生针对RSV感染的有效免疫保护，因此，RSV易反复感染引起疾病。近年来，因RSV感染住院并导致死亡的病例逐年上升。
RSV属于副粘病毒科、肺炎病毒属中的成员，其基因组为非节段的单负链RNA，由15225个核苷酸组成。RSV基因组编码至少11种蛋白质，基因组RNA从3’至5’端编码的蛋白依次为NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2(M2-1、M2-2)和L等，其中表面蛋白糖蛋白G和融合蛋白F是主要中和抗原成分。机体感染RSV后，病毒编码的G和F抗原蛋白能刺激机体免疫应答，产生血清IgG中和抗体和呼吸道黏膜的分泌型IgA抗体。血清中和抗体和呼吸道分泌型IgA是抗RSV感染的主要物质。此外，M2蛋白第82-90位氨基酸是一个有效的细胞毒T淋巴细胞表位(Cytotoxic T lymphocyte epitopes，CTL)，能够显著激活CD8⁺ T细胞免疫应答，抑制Th2类反应，降低疫苗增强性疾病(Vaccine Enhance Disease,VED)发生，在抗RSV感染和减轻VED中具有重要作用。
目前，针对RSV感染疾病治疗的主要药物是利巴韦林(Ribavirin)，一类鸟嘌呤核苷类似物，可以阻止病毒RNA的合成及病毒mRNA的加帽，但该药物治疗效果有限。用于预防高危婴幼儿感染RSV的药物有帕利珠单抗(palivizumab)，一种针对RSV表面融合蛋白F的单克隆抗体。该药物生产成本高，需要提前注射且持续注射5个月才能达到预防效果，因此难以推广应用。与其它病毒性传染病一样，疫苗接种应该成为预防RSV感染有效策略。在上世纪60年代，人们制备了用福尔马林灭活RSV的传统灭活疫苗(Formalin inactivated RSV vaccine，FIV)，临床试验证实，该FIV疫苗接种后不仅没能防止婴幼儿感染RSV，疫苗接种个体在随后的RSV自然感染中，支气管炎和肺炎发生率及疾病的严重程度均大大增加，入院治疗人数明显上升，出现疫苗接种儿童死亡病例(Kim et al.,1969)。随后，RSV疫苗研制一直是RSV感染性疾病防治的重点，但至今仍无有效的RSV疫苗获得批准上市使用。世界卫生组织(WHO)也将RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展疫苗之一。
FIV疫苗接种不能诱导机体有效的抗病毒免疫应答和引起VED，是当前RSV疫苗研发的主要障碍。其原因在于，FIV接种不能诱导机体产生高水平中和抗体，未能诱导抗病毒效应CD8⁺T细胞免疫应答，宿主Th1/Th2比例及Th1、Th2产生的细胞因子比例失衡等所致。而FIV接种诱导机体产生的IgE抗体，以及IL-4、IL-5和IL-10等为主的Th2偏向的CD4⁺T细胞应答在导致VED中起重要作用。提高疫苗诱导产生中和抗体能力、诱导更高效的CD8⁺T细胞免疫应答，以及更平衡的Th1/Th2比例，是发展新型RSV疫苗的关键(Murata,2009)。
亚单位疫苗是发展RSV疫苗的重要方向之一，近年来有诸多文献报道。已有相关的专利报道包括：有发明人以无毒型大肠杆菌热不稳定肠毒素LT为佐剂，融合表达RSVG蛋白aa130-230区域，并将其中的aa182-186之间氨基酸替换成RSVM蛋白的TCL表位(YLEKESIYY)，发明了G_CTL亚单位疫苗(专利号：200710066476.5)。另有发明人采用DsbA为载体蛋白，表达RSVF/M2肽段，制备用于预防RSV感染的亚单位疫苗(专利号：200510009119.6)。特别是近来，有发明人以腺病毒为载体，将RSV的M、F和G蛋白基因重组至基因组中制备了重组腺病毒，该重组腺病毒感染哺乳动物Vero细胞后，表达M、F和G蛋白并组装产生病毒样颗粒，免疫动物能诱导机体抗RSV感染的有效保护(专利申请号：201310667523.7)。
病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白颗粒，缺乏病毒核酸，无感染性。VLPs表面能够重复高密度展示外源抗原表位，从而诱导高效免疫应答。近来的研究表明，一些VLPs能有效通过MHCI类和MHCII类抗原递呈途径递呈抗原，诱导CTL应答，激发Th1和Th2型细胞免疫反应，一些病毒的VLPs可诱导树突状细胞和单核巨噬细胞群的成熟和细胞因子的表达。因此，应用嵌合病毒样颗粒抗原制备疫苗具有安全高效的特点。
人乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原(HBc)在病毒感染过程能够自发组装成病毒样颗粒，包裹病毒的核酸。HBc自发形成的病毒样颗粒有两种大小，分别为由180个和240个单体核心抗原组成的二十面体(Wynne et al.,1999)。HBc全长为183AA，其中75-82AA为抗原显现区，展示在病毒样粒子表面，构成中间穗状区。HBc的C末端39个AA富含精氨酸，具有结合包装病毒核酸的功能，去 除后不影响HBc形成病毒样颗粒。截短后的HBc能在大肠杆菌中高效表达，并自主装配成病毒样颗粒，HBc的中间穗状区和截短后的C末段都暴露在病毒粒子的表面，该区域可融合表达外源的抗原表位(Birkett et al.,2002)。一些融合外源B细胞抗原表位或T细胞抗原表位的HBc仍可组装成嵌合VLPs，诱导免疫动物产生强烈的免疫应答(Pumpens and Grens,2001)。采用大肠杆菌表达的HBc能形成具有天然结构的HBc颗粒，可用于构建表达不同抗原片段的VLPs疫苗。作为一种新型的抗原表位递呈系统，HBc载体蛋白已应用于流感病毒，艾滋病毒和结核分枝杆菌等病原体的疫苗研制(De Filette et al.,2006；Gonzalez et al.,2009；Yin et al.,2011)。
本发明在充分借鉴已有成果的基础上，通过优化设计、实验筛选，发明了基于HBc为载体蛋白，包含有RSVG蛋白保守抗原结构和M2蛋白CTL表位，在大肠杆菌中表达形成病毒样颗粒的亚单位疫苗，该病毒样颗粒亚单位疫苗可用于预防人和动物抵抗RSV的感染，具有重要的科学和应用价值。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种新型的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。该疫苗安全高效，不含感染性病毒核酸，抗原纯度高，模拟抗原蛋白的天然结构，免疫接种能诱导机体产生抗呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫应答。用于人和动物呼吸道合胞病毒感染引起的呼吸道疾患的免疫预防。
技术方案
本发明提供了一种呼吸道合胞病毒样颗粒，包含以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc1-144aa)为载体，嵌合其中的RSV G蛋白中和抗原表位，可自主装配 的病毒样颗粒。
本发明进一步提供一种在上述乙肝病毒核心蛋白C末端还融合了RSV M2蛋白的CTL表位，可自主装配的病毒样颗粒。
其中以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc1-144aa)为载体，将RSV编码的G蛋白保守B细胞表位的抗原片段(G144-204aa)(Plotnicky-Gilquin et al.,1999)插入HBc肽段的Asp78与Pro80之间；或同时将RSV编码的M2蛋白的CTL表位82-90aa(M2_82-90)融合在截短蛋白HBc1-144aa的C末端，该M2_82-90表位能有效激活机体CD8⁺T淋巴细胞免疫反应(Srikiatkhachorn and Braciale,1997)。经密码子优化设计、筛选，获得了由编码HBc的1-144aa与RSVG蛋白的144-204aa核苷酸序列融合的基因片段(HBc-tG，SeqNO.2)和由编码HBc的1-144aa与RSV G蛋白的144-204aa及M2蛋白82-90aa核苷酸序列融合的基因片段(HBc-tG/M2_82-90，SeqNO.4)，将其分别克隆到表达载体pET28中，构建重组表达质粒pHBc-tG和pHBc-tG/M2_82-90。将pHBc-tG和pHBc-tG/M2_82-90转化大肠杆菌，筛选用于病毒样颗粒(VLPs)疫苗生产、特性稳定的工程菌株；经优化培养条件，高效表达了融合蛋白HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90。采用包涵体分离、蛋白质亲和层析纯化及体外复性自组装等相结合的技术路线，纯化制备用于免疫接种的VLPs制品。
呼吸道合胞病毒样颗粒抗原用PBS稀释至适当浓度，制备成本发明所述的呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗。
本发明获得的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒抗原还可用于呼吸道合胞病毒感染诊断试剂或诊断试剂盒。
有益效果
呼吸道合胞病毒颗粒疫苗接种小鼠诱导产生病原特异性中和抗体，第三次免疫2周后，小鼠获得抵抗致死剂量(3×10⁶PFU/只)呼吸道合胞病毒攻击感染的效力，并显示出较强的免疫记忆，诱导高效的CD8⁺T细胞应答，平衡的Th1/Th2比例和对呼吸道合胞病毒强毒攻击感染小鼠100％保护效率。
附图说明
图1为设计合成的RSV嵌合抗原蛋白基因克隆载体质粒(为本发明设计，委托商业公司合成)。
图2为重组表达质粒pHBc-tG和pHBc-tG/M2_82-90构建示意图。
图3为本发明设计的HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90重组疫苗蛋白组分鉴定。
A、工程菌表达HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90重组疫苗蛋白组分SDS-PAGE分析(M：分子量Marker；1、3为表达HBc-tG工程菌加IPTG诱导前后的菌体蛋白；2、4为表达HBc-tG//M2_82-90工程菌加IPTG诱导前后的菌体蛋白)；B、SDS-PAGE检测纯化的疫苗成分(M：分子量Marker；1：HBc-tG；2：HBc-tG/M2_82-90)；C、Western Blot检测疫苗成分的免疫反应性(anti-tG抗体；M：分子量Marker；1：HBc-tG；2：HBc-tG/M2_82-90)。
图4为磷钨酸负染后病毒样颗粒(VLPs)透射电镜TEM观察。
A、HBc-tG颗粒；B、HBc-tG/M2_82-90颗粒；
图5为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠体液免疫应答检测(A、血清总IgG和IgG1及IgG2a亚类抗体滴度；B、亚类IgG2a/IgG1比值；C、中和抗体滴度。
图6为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞分 泌Th1、Th2类细胞因子水平。
A、Th1类细胞因子；B、Th2类细胞因子；
图7为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染后肺组织分泌Th1和Th2类细胞因子水平。
A、Th1类细胞因子；B、Th2类细胞因子；
图8为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染后肺组织RSV滴度比较。
图9为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染后肺组织病理分析(肺组织切片HE染色观察)。
A、UV灭活RSV疫苗免疫小鼠；B、HBc-tG颗粒疫苗免疫小鼠；C、HBc-tG/M2_82-90颗粒疫苗免疫小鼠；D、正常小鼠；
具体实施方式
现结合以下实施例来更加详细地描述本发明。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明，不能将其理解为是对本发明的范围和实质的限制。
下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
【实施例1】呼吸道合胞病毒病毒样颗粒(VLPs)的构建与检测
1.1、质粒pUC57(HBc-tG/M2_82-90)的结构示意图
质粒pUC57-HBc-tG/M2_82-90是包含有本发明经密码子优化设计、筛选的RSVG蛋白保守抗原区与M2的CTL表位嵌合编码基因序列的质粒载体。该基因序列所编码的蛋白质是将RSV编码的G蛋白保守B细胞表位的抗原片段(G144-204aa)(Plotnicky-Gilquin et al.,1999)插入HBc肽段的Asp78与Pro80之间，同时将RSV编码M2蛋白的CTL表位82-90aa(M2_82-90)融合在截短蛋白HBc1-144aa的C末端，M2_82-90表位能有效激活机体CD8⁺T淋巴细胞免疫反应(Srikiatkhachorn and Braciale,1997)。由发明人委托商业公司合成，知识产权归发明人所有，如图1所示。
1.2、重组表达载体pHBc-tG和pHBc-tG/M2_82-90构建
1)重组表达质粒pHBc-tG构建
(1)以质粒pUC57-HBc-tG/M2_82-90为模板，以P1’和P2’为引物，PCR扩增目的基因片段HBc-tG(序列见SEQIDNO.2)；引物由上海生物工程有限公司合成。
P1’(上游引物)：5’-ATCGAATTCATGGATATCGACCCG-T3’(SEQ ID NO.5)，下划线标注序列为EcoR Ⅰ酶切位点；
P2’(下游引物)：5’-TGCACTCGAGTTACTACGGTGGTTTCC-3’(SEQ ID NO.6)，下划线标注序列为Xho Ⅰ酶切位点。
(2)按照下表列出的PCR扩增体系组成依次加入各组分。
表1 PCR扩增体系


(3)按照下述PCR扩增程序进行PCR扩增，扩增目的基因片段：

(4)PCR扩增完成后，2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，PCR扩增产物大小为756bp。采用DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，用于重组质粒构建。(PCR产物回收步骤按DNA胶回收试剂盒说明书所述方法完成。)
(5)目的基因片段HBc-tG和载体质粒pET28-a分别进行双酶切消化，按照下述体系(共20μl)依次加入各组分
表2 双酶切反应体系

混均，置于37℃水浴中酶切消化5-6小时。
(6)分别将上述酶切消化目的基因或载体DNA进行凝胶电泳，并按上述切胶回收方法回收DNA。
(7)将酶切消化目的基因与载体DNA连接，按照下述连接体系(共25μl)依次加入各组分。
表3 HBc-tG和pET28a连接体系


混均，置于16℃连接反应6h或4℃过夜。
(8)上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
①将冻存的大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置室温或冰浴上缓慢解冻。取5-10μl连接产物加入到感受态细胞保存管(EP管)中，轻轻混匀，于冰上放置30分钟。
②将上述含连接产物的感受态细胞EP管从冰浴上取出，放入42℃的水浴中精确反应90秒，反应过程中保持EP管静止。
③迅速将上述EP管转移至冰浴上放置2分钟，使菌体迅速冷却。
④无菌操作向EP管中加入800μl预热至37℃不含抗生素的LB培养基，置于37℃、80-90rpm转速摇床培养45分钟。
⑤取上述培养液50-100μl加到含卡那霉素LB琼脂平板上，用无菌玻棒将菌液涂布均匀，平板正置于37℃培养箱30分钟待培养液被完全吸收，然后将平板倒置培养过夜。
(9)菌落PCR鉴定、筛选转化了重组表达质粒pHBc-tG的阳性菌落。
按照下述方法进行PCR反应，鉴定、筛选目的基因重组表达质粒。挑取过夜培养在卡那霉素抗性的LB平板上长出的单菌落5-10个，分别接种于装有400μl卡那霉素抗性LB培养基的EP管中，37℃、220rpm培养4-5h。
取2μl菌液作为模板，以引物P1’和P2’为扩增引物，按下述体系依次加入各组分。
表4 pHBc-tG菌落PCR鉴定体系


PCR扩增程序为：

扩增完成后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(参考上述电泳方法)，根据是否有目的基因片段扩增鉴定、筛选阳性重组表达质粒pHBc-tG克隆。
(10)重组表达质粒pHBc-tG的小量提取及鉴定
按质粒小量提取试剂盒操作说明书描述的方法提取重组质粒。
①将阳性克隆培养菌液按1:100比例接种于6ml含卡那霉素的LB培养基中，于恒温摇床中在37℃、220rpm振荡培养过夜。
②将过夜培养物转至EP管中，10,000rpm离心1分钟，倾去上清，收集菌体。
向上述收集菌体的EP管中加入250μl溶液Ⅰ(4℃保存、含RNaseA)，用微量移液器反复吹打混匀，完全重悬菌体；向EP管中加入250μl溶液Ⅱ，盖紧管盖，轻柔反复颠倒EP管5-6次，室温静置2分钟；向EP管中加入350μl溶液Ⅲ，盖紧管盖，缓慢颠倒摇晃几次，至白色絮状沉淀不再增加。
③12,000rpm室温离心10分钟，小心吸取上清转移至套有收集管的DNA吸附柱中，10,000rpm室温离心1分钟；将收集管中的液体再次加至吸附柱中，10,000rpm室温离心1分钟；弃去收集管中的液体，向吸附柱内加入500μl Buffer HB，10,000rpm室温离心1分钟；弃去收集管中的液体，向吸附柱内加入700μl DNA  Wash Buffer，10,000rpm室温离心1分钟，重复1次；弃去收集管中的液体后，将吸附柱重新放回收集管中，10,000rpm离心2分钟以完全除去柱膜上的残余液体。
④将吸附柱放入另一个无菌EP管中，加入50μl试剂盒中的Elution Buffer或者同样体积的无菌ddH₂O，以溶解吸附在柱膜上的DNA，室温静置2分钟；10,000rpm室温离心1分钟，EP管中收集的液体即为质粒DNA溶液。取1μl质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检测DNA。
采用酶切对重组质粒进行鉴定，于250μl EP管中按下述体系依次加入各组分。
表5 重组表达质粒pHBc-tG双酶切反应体系(20μl)

混均，置于37℃水浴中酶切反应5小时，进行DNA琼脂糖凝胶电泳(参照上述电泳方法)，观察分析条带是否与预期相符。
将酶切正确的重组质粒pHBc-tG进行测序，确认插入片段HBc-tG序列(SeqNO.2)、插入方向和开放阅读框的正确性，如图2所示。
2)重组表达质粒pHBc-tG/M2_82-90的构建
按照上述的连接产物转化方法和质粒DNA提取方法将质粒pUC57-HBc-tG/M2_82-90转化DH5α感受态细胞，挑起单菌落接种到LB培养基中培养、扩增，收集菌体，提取质粒DNA，EcoR I和Xho I双酶切质粒。按下述双酶切体系依次加入各组分。
表6 双酶切反应体系(20uL)

混均，置于37℃水浴反应6小时，琼脂糖凝胶电泳检测。
按照上述切胶方法，分别回收目的基因片段(HBc-tG/M2_82-90)和线性化的载体DNA pET28-a，将目的基因片段与载体片段5:1比例混合，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆，提取重组表达质粒pHBc-tG/M2_82-90，双酶切及测序鉴定(Seq NO.4)，具体方法均可参照重组表达质粒pHBc-tG的操作进行，如图2所示。
3)基因工程菌制备
将测序结果正确的重组质粒pHBc-tG和pHBc-tG/M2_82-90转化到用于蛋白表达的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL感受态细胞中，筛选获得含pHBc-tG或pHBc-tG/M2_82-90的基因工程菌。具体操作如下：
(1)将冻存的感受态细胞从-80℃冰箱中取出，室温或冰浴上缓慢解冻。取1μl重组表达质粒加入表达菌感受态细胞EP管中，轻轻拍打EP管底部使其混匀，置冰浴30分钟。
(2)将上述EP管从冰浴上快速转入42℃的水浴中，精确反应90秒，反应过程中保持EP管静止。
(3)迅速将EP管转移至冰浴上放置2分钟。
(4)无菌操作向EP管中加入800μl预先加热至37℃的不含抗生素的LB培养基，转至37℃、80-90rpm转速摇床培养45分钟，使细菌表达抗性标记。
(5)取50-100μl培养液滴于卡那霉素、氯霉素抗性LB平板上，用无菌玻棒将菌液涂布均匀，正置放于37℃培养30分钟待培养液被吸收后，将平板倒置培养过夜，次日从平板上挑起5-10个单菌落接种到LB培养基中培养，菌落PCR鉴定、筛选含重组表达质粒的工程菌。
菌落PCR按下述体系依次加入各组分
表7 菌落PCR鉴定体系

PCR扩增程序

扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳检测(参考上述电泳方法)筛选出含目的重组表达质粒的阳性克隆。并按下述方法保藏基因工程菌菌种。
(1)将PCR鉴定出的阳性克隆菌液按1:100转接至装有5ml含卡那霉素、氯霉素LB培养基试管中，37℃，220rpm旋转培养。
(2)待菌种生长进入对数期时，检测OD₆₀₀值达到0.6时，取出菌液。
(3)转移适量菌液于1.5mlEP管中，按1:1比例向菌液加入4℃预冷的30％甘油溶液，吹打混匀。
(4)将保存工程菌的EP管转至冻存盒中，冻存于-80℃至少6小时，然后可将工 程菌继续冻存-80℃或转移至液氮中长期保存。
1.3、基因工程菌小量表达HBc-tG或HBc-tG/M2蛋白与鉴定
1)IPTG诱导目的蛋白表达
(1)将表达重组蛋白的工程菌涂布含卡那霉素、氯霉素抗性LB平板上培养过夜，形成单菌落；挑起单菌落接种于含卡那霉素、氯霉素LB培养基中，37℃，220rpm旋转培养过夜。
(2)按1:100比例将培养菌液转接至含卡那霉素、氯霉素抗性LB培养基中，37℃，220rpm旋转培养，至工程菌生长进入对数期(OD₆₀₀)值达到0.6。
(3)将处于对数生长期的培养物从摇床中取出，加入IPTG使其终浓度为0.2mmol/L，于37℃、220rpm继续培养5小时。
(4)将诱导培养物转移至10ml离心管中，12,000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，收集菌体。
(5)用500μlPBS溶液重悬菌体，12,000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，收集菌体，PBS重复洗涤1次。
(6)用200μl裂解液重悬菌体，置冰浴上超声波破碎菌体。设置为输出功率为300W，超声3s，间歇8s，共30-50次。超声波破碎后，进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定重组蛋白表达。
菌体裂解缓冲液：
TritonX-100(v/v)  1％
Tris-Cl(pH8.0)    0.01M
NaH₂PO₄            0.1M
2)目的蛋白HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90鉴定
SDS-PAGE分析
(1)凝胶灌制
取洁净玻璃板和胶条固定在灌胶支架上，将新配制的15％的分离胶溶液小心灌加入灌胶槽中，避免产生气泡，分离胶溶液加至距上凹面2.5cm处即可。用移液器在分离胶溶液上覆盖1ml无水乙醇，水平静置，室温下聚合约20分钟，待胶聚合后倒去覆盖层液体，倒置1分钟去除残留液体。将新配制的5％的积层胶溶液加至分离胶上，立刻插入样品梳子，室温水平静置，待凝胶充分聚合。
15％分离胶溶液配制：

5％积层胶溶液配制：

(2)制样
将等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液与菌体样品液混匀，100℃煮沸5-10分钟，立即冰浴5分钟，室温12000rpm离心5-10分钟，收集上清样品保存备用。2×SDS凝胶加样缓冲液配制：


(3)电泳
凝胶制备好后，向电泳槽中加入电泳缓冲液。取样品上清10-30μl加入样品孔内，进行电泳。调电压至60V让样品在积层胶中迁移，当样品进入分离胶后，将电压调至120V继续电泳。观察蛋白分子量Marker迁移情况，待Marker达到最佳分辨时停止电泳。
5×蛋白电泳缓冲液配制：

(4)染色
电泳结束后取下凝胶，用自来水洗涤后将凝胶完全浸入考马斯亮蓝R-250染色液中，室温下在水平摇床上慢速摇动染色过夜。
考马斯蓝R-250染色液配制：

磁力搅拌1小时使染料溶解，用Whatman滤纸过滤，室温保存。
(5)脱色
染色后，回收染色液，将凝胶完全浸入脱色液中，室温慢速摇动脱色4-8小时，期间更换脱色液4-5次，待蛋白条带变清晰，弃去脱色液，把凝胶用自来 水清洗并浸入清水中，可进行拍照保存。
脱色液配制：
冰乙酸    100ml
甲醇      400ml
ddH₂O     500ml
结果显示，本发明制备的基因工程菌可以分别表达HBc-tG或HBc-tG/M2_82-90蛋白(如图3A)。
Westernblot检测工程菌表达目的蛋白
(1)按照前述的方法进行样品处理和蛋白质组分SDS-PAGE电泳分离。具体操作按《分子克隆，实验手册》进行。为便于比较，电泳加样时使用相同体积的各样品。
(2)转膜与抗体反应
待电泳结束，取出凝胶并用自来水洗涤。同时用转膜缓冲液浸泡PVDF膜和滤纸5分钟，按阴极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极顺序铺设凝胶和PVDF膜，放入电泳槽，88V电压低温条件下电泳2－3小时。取出PVDF膜用1×PBST(0.05％Tween-20的PBS)洗涤5分钟，加入含5％脱脂奶粉的PBST封闭缓冲液(blocking buffer)，37℃孵育2小时或4℃封闭过夜。PBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。加入兔抗(RSV)G蛋白多克隆抗体(由本实验室表达纯化的G蛋白免疫家兔制备，具体步骤参加柴枫硕士毕业论文，用PBST进行1:1000稀释)，37℃孵育2小时。PBST充分洗涤PVDF膜3-5次，每次10分钟。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体(Abbkine公司产品，用PBST进行1:5000稀释)，37℃孵育1小时，PBST充分洗涤PVDF膜3-5次，每次10分钟。加入DAB显色液(具体配方见《分子克隆，实验手册》)，室温避光显色5-10 分钟，暗室中X光片曝光、记录结果。
转移缓冲液配制：

稀释缓冲液(TBS)配制：

3,3’-二氨基联苯胺(DAB)显色液配制：

结果显示，本发明制备的基因工程菌可以在加入IPTG诱导后，分别高水平表达HBc-tG或HBc-tG/M2_82-90蛋白(图3A)。
【实施例2】呼吸道合胞病毒病毒样颗粒(VLPs)疫苗的规模化制备及检定
2.1、呼吸道合胞病毒样颗粒(VLPs)疫苗的规模化制备
1)重组抗原蛋白HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90的大量表达
(1)将冻存的工程菌从-80℃冰箱中取出、解冻，取0.1ml菌液转接至5mlLB培养基中(含卡那霉素、氯霉素)，37℃220rpm旋转培养过夜。
(2)将过夜培养物按1:100比例接种至含卡那霉素、氯霉素的1LLB培养基中，37℃，220rpm振荡培养。待培养至对数生长期(菌液OD₆₀₀值达到0.6)，加IPTG 至终浓度为0.2mM，37℃，220rpm旋转培养5小时，诱导蛋白表达。
(3)将诱导培养物转移至250ml离心管，4℃、12,000rpm，离心30分钟，弃上清，收集菌体。菌体加100mlPBS悬浮，4℃，12,000rpm，离心30分钟，弃上清，收集菌体。重复加PBS洗涤2次，收集菌体用于蛋白纯化或保存-80℃备用。
2)重组抗原蛋白HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90的纯化
(1)菌体裂解处理
按4ml/g比例向菌体中加裂解液，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mM，室温裂解30分钟，期间多次搅拌混均。待裂解后，菌体置于冰浴中进一步超声波破碎。经超声波破碎的样品于4℃，12000rpm离心30分钟。收集上清，向沉淀中加适量结合缓冲液，混匀，置冰浴60分钟溶解沉淀，4℃，12000rpm离心30分钟，收集上清，合并备用。
裂解缓冲液配制：
TritonX-100(v/v)  1％
Tris-Cl(pH8.0)    0.01M
NaH₂PO₄            0.1M
结合缓冲液配制：
Tris-Cl(pH8.0)  0.01M
NaH₂PO₄          0.1M
尿素             8M
(2)亲和层析纯化
亲和层析介质Ni-NTA His-Bind树脂用2倍体积结合缓冲液洗涤，按50％加入缓冲液制备树脂悬液，按每4ml样品溶液加入1ml Ni-NTA His-Bind树脂悬液比例将两者混匀，4℃、200rpm旋转60分钟；将结合蛋白的树脂装入层析柱 中，依次用结合缓冲液(约5ml)-变性漂洗缓冲液(约20ml)洗涤树脂，然后用变性洗脱缓冲液Ⅰ(约2-5ml)-变性洗脱缓冲液II(约2-5ml)分步洗脱，依次分步收集层析柱流出液(0.5ml/管)，检测各组分蛋白质浓度，SDS-PAGE电泳检测各组分蛋白质纯度；收集合并纯化目的蛋白的组分用于后续制备VLPs。
变性漂洗缓冲液配制：
Tris-Cl(pH6.3)  0.01M
NaH₂PO₄          0.1M
尿素              8M
变性洗脱缓冲液Ⅰ配制：
Tris-Cl(pH5.9)  0.01M
NaH₂PO₄          0.1M
尿素               8M
变性洗脱缓冲液Ⅱ配制：
Tris-Cl(pH4.5)  0.01M
NaH₂PO₄          0.1M
尿素              8M
3)重组抗原蛋白HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90复性及VLPs制备
(1)样品透析袋处理剪取长10-20cm的透析袋，放在透析袋处理液Ⅰ中煮沸10分钟，用去离子水冲洗后，放入透析袋处理液Ⅱ煮沸10分钟，去离子水冲洗，浸没于复性溶液中。
透析袋处理液Ⅰ配制：
NaHCO₃         2g
EDTA(pH8.0)   0.029g
ddH₂O         100mL
透析袋处理液Ⅱ配制：
EDTA(pH8.0)  0.029g
ddH₂O          100mL
(2)蛋白复性与VLPs体外组装扎严实处理好的透析袋一端，将纯化的目的蛋白组分转移至透析袋中，扎紧透析袋另一端，按尿素浓度递减顺序，分别在复性缓冲液中，4℃条件下进行样品透析。复性缓冲液所含尿素浓度梯度依次为6M、5M、4M、3M、2M和1M，每间隔3-4小时换复性缓冲液1次，最后换成500ml PBS溶液透析2次。
复性缓冲液配制：

2.2、呼吸道合胞病毒样颗粒(VLPs)疫苗的检定
1)SDS-PAGE电泳检定蛋白纯度
具体操作参照实施例1中电泳方法进行。
2)Western blot检测重组蛋白抗原特异性
具体操作参照实施例1中鉴定方法进行。
3)电镜观察VLPs形态
取上述纯化蛋白复性后装配形成VLPs的样品50μl，蛋白质浓度稀释至100μg/ml，将样品滴加至铜网上，静止1分钟，用滤纸沿铜网边缘吸去多余溶液，向铜网滴加1-2滴2％醋酸铀溶液(蒸馏水配制，pH6.8)，染色1分钟，用滤纸沿铜网边缘吸去多余染色液，室温静止待铜网干燥，将铜网(负染样品)置透射电子显微镜下，于200kV，×25,000倍下观察颗粒形状，记录结果。
结果显示，本发明技术方法能制备高纯度HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90的疫苗组分蛋白(图3B)；抗RSVG蛋白抗体检测显示，所制备的疫苗组分蛋白具有与特异性抗体反应的特性(图3B)；所制备的疫苗组分HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90经纯化、复性后，均能自主装配成病毒样颗粒(图4A、4B)。
【实施例3】呼吸道合胞病毒病毒样颗粒(VLPs)疫苗的功能检测
试验方案
取5-6周龄雌性BALB/c小鼠40只，随机分成A、B、C和D等4组，每组10只，疫苗接种前小鼠断尾采血，分离血清用于抗体检测作为阴性对照血清。分别按下列设计免疫接种：A组注射紫外灭活的RSV(1×10⁵TCID50)；B组注射HBc-tG(VLPs)，剂量20μg/只；C组注射HBc-tG/M2_82-90(VLPs)，剂量20μg/只。采取肌肉注射途径免疫，各种疫苗均免疫三次，间隔三周；D组为对照组，采用相同途径和间隔注射PBS。免疫后两周，断尾采血并分离血清。各组小鼠接种疫苗后每日观察小鼠状态和称量体重，与注射PBS对照组小鼠比较，HBc-tG和HBc-tG/M2_82-90颗粒疫苗注射组小鼠未出现任何异常，体重增加与PBS组一致。
3.1、疫苗接种小鼠体液免疫应答检测
1)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清抗体及亚类(IgG、IgG1和IgG2a)
纯化后的RSV为包被抗原。具体步骤包括：
包被：用包被缓冲液(0.05MPH9.6的碳酸盐缓冲液)将纯化并经紫外线灭活的RSV稀释至3×10⁵TCID₅₀用作包被抗原溶液，加入到96孔ELISA酶标板(Corning公司产品，下同)每孔100μl，4℃包被过夜；
封闭：将包被RSV抗原的ELISA酶标板用PBST(PBS含0.05％Tween-20，pH7.5， 下同)洗涤5次，每次5分钟；加入封闭液到酶标板各孔中(100μl/孔，含3％BSA的PBST)，37℃封闭60分钟；PBST洗涤5次；
加待检血清：小鼠血清用含1％BSA的PBST作1:100梯度稀释，小鼠免疫前血清作为阴性对照血清，将稀释血清加入ELISA酶标板各孔中(100μl/每孔)，37℃孵育60分钟；PBST洗涤5次；
加酶标二抗：二抗分别为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体、抗IgG1或抗IgG2(Pierce公司产品)，羊抗鼠IgG用含1％BSA的PBST作1:5000稀释，羊抗鼠IgG1和IgG2用含1％BSA的PBST作1:2000稀释，加入ELISA板各孔中(100μl/孔)，37℃作用60分钟；PBST洗涤5次；
加入显示底物溶液：向酶标板各孔中加入显色底溶液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，100μl/孔，37℃避光显色15-30分钟；每孔加入50μl 2M H₂SO₄终止反应；
OD₄₅₀值测定：在酶标仪上波长450nm处测定每孔内光密度吸收值(OD₄₅₀)，血清样品OD₄₅₀值大于或等于阴性数值的2.1倍判定为阳性；
结果表明，本发明制备的VLPs疫苗免疫小鼠能诱导机体产生高水平特异性RSV IgG抗体和IgG1、IgG2亚类抗体(图5A、5B)。
包被缓冲液配制：
Na₂CO₃    0.159g
NaHCO    0.293g
3
调节pH为9.6用ddH₂O定容至100ml，4℃保存。
PBS配制：


用ddH₂O定容至1L。
2)血清中和抗体检测
免疫噬斑法，具体操作如下：
细胞单层：将Vero细胞悬液接种至24孔细胞培养板各孔中，次日待Vero细胞长至95％单层备用；
血清中和抗体检测：
病毒吸附：无血清DMEM培养液稀释RSV至浓度为75-100PFU/100μl，与等体积倍比稀释的实验小鼠血清混匀，37℃孵育60分钟；吸去单层细胞孔中的培养液，无血清DMEM培养液洗涤细胞单层1次，加入病毒-血清混合液(100μl/孔)，37℃，5％CO2培养箱中吸附2小时；另以RSV与非免疫阴性血清混合液作为阳性对照；
细胞培养：吸附后，吸去病毒-血清混合液，加入1％琼脂糖的覆盖液(0.5-1ml/孔)，37℃，5％CO2培养箱中培养3-5天，吸去覆盖液；
细胞固定：细胞用PBS洗涤3次，加入预冷的固定液(甲醇:丙酮-60:40)4℃固定20分钟，空气中干燥，向细胞孔中加入含3％BSA的PBS封闭液(100μl/孔)，室温作用30分钟，用PBST(0.5％Tween20)洗涤3次；
抗体反应：加入抗RSVF蛋白的鼠单克隆抗体(一抗、Millipore公司产品，用PBST进行1:1000稀释、100μl/孔)，37℃孵育2小时，用PBST洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗、Pierce公司产品，用PBST进行1:5000稀释、100μl/孔)，37℃孵育1小时；
显色：细胞孔加入PBST洗涤3次，加入DAB底物显色(100μl/孔)，室温反应15-30分钟，吸去显色液，计数免疫蚀斑数量，以比阳性对照孔减少60％蚀斑数量的最高血清稀释度记为中和抗体滴度。
结果表明，本发明制备的VLPs疫苗免疫小鼠能有效诱导机体产生RSV病毒中和抗体，中和抗体水平与UV灭活的RSV相同(图5C)。
3.2、疫苗接种小鼠细胞免疫检测
ELISA检测细胞因子，具体操作步骤包括：
小鼠脾淋巴细胞分离：
各组小鼠于第3次免疫后第21天乙醚麻醉处死，浸泡于75％乙醇中3-5分钟，在超净工作台中无菌操作，取小鼠脾脏，在35mm细胞培养皿中放入4-5ml的1×淋巴细胞分离液(4℃保存、用前温度恢复至室温、摇匀)，剪碎脾组织，用5ml注射器胶头吸吹使组织破碎，释放细胞收集脾细胞悬液，将其立即转移到15ml离心管中，沿管壁缓慢加入200-500μl的RPMI-1640培养基、保持液面分界明显；室温、1500rpm，离心30分钟，离心后细胞分层；吸出淋巴细胞层，加入10ml RPMI-1640培养基，颠倒混匀，室温，1000rpm，离心10分钟，吸去上清，收集细胞，用无血清RPMI-1640或DMEM培养基重悬细胞，作适当稀释后滴入细胞计数板显微镜下观察或采用细胞自动计数仪进行细胞计数。
刺激细胞因子分泌：
制备的小鼠脾细胞悬液用含10％胎牛血清的DMEM稀释至1×10⁷浓度，接种至24孔细胞培养板各孔中，100μl/孔(1×10⁶细胞/孔)，每孔加入10⁴PFU热灭活RSV作为刺激物，另设不加RSV刺激物为阴性对照孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养72小时，收集细胞培养上清液，4℃、2000rpm离心20分钟，收 集上清、分装至1.5ml EP管中，冻存于-80℃，用于各种细胞因子浓度测定。
细胞因子浓度测定：
酶标板和各种检测试剂均为美国BioLegend公司检测试剂盒所提供组分。分别检测两种类型细胞因子(Th1类，IFN-γ,TNF-α和IL-2；Th2类，IL-4，IL-5和IL-10)共6种(结果参见附图及附图说明)。具体参照细胞因子检测试剂盒(BioLegend)说明书介绍的方法步骤。
包被：用1×包被液稀释捕获抗体(1：2000)，加入96孔酶标板中，100μl/孔，4℃包被过夜(16-18小时)；将包被液弃去，每孔加入300μl洗涤液，振摇酶标板，弃去洗涤液，用力拍干，重复洗涤4次；向酶标板各孔中加入1×Assay Diluent A(200μl/孔)，200rpm、室温振摇孵育1小时；洗涤液洗涤酶标板4次；
加待检样本：用1×Assay DiluentA将标准品细胞因子进行2倍系列倍比稀释，将倍比稀释的标准品及样品加入上述酶标板各孔中，100μl/孔，每份样品重复2个孔。200rpm、室温振摇孵育2小时；
加检测抗体：酶标板用洗涤液洗涤4次，向各孔中加入检测抗体(1:5000稀释)，100μl/孔，200rpm、室温振摇孵育1小时；酶标板用洗涤液洗涤4次，向各孔中加入Avidin-HRP溶液，100μl/孔，200rpm、室温振摇孵育30分钟；
显色：酶标板用洗涤液洗涤5次，向各孔中加入TMB显色液，100μl/孔，置于暗处，室温显色20分钟，呈蓝色为阳性反应；向各孔中加2M H₂SO₄终止液终止反应，100μl/孔。终止反应的30分钟内读取450nm吸光值OD₄₅₀；根据标准品浓度和OD₄₅₀值绘制标准曲线；读取各样品OD₄₅₀值，根据各细胞因子标准曲线计算样品中相应细胞因子浓度。
结果表明，本发明制备的VLPs疫苗免疫小鼠脾细胞能诱导机体产生增强的Th1 类细胞因子(FN-γ,TNF-α和IL-2)应答，下调Th2类细胞因子(IL-4，IL-5和IL-10)的分泌(图6A、6B)。
3.3、VLPs疫苗接种小鼠感染RSV后的肺组织病毒滴度测定和病理损伤检测
1)VLPs疫苗免疫小鼠的RSV感染：
将VLPs疫苗免疫小鼠用吸入乙醚方式轻微麻醉约40～50秒，小鼠保持仰卧位固定，取50μl稀释的RSV病毒液(3×10⁶PFU)经滴鼻途径接种，待病毒液被完全吸收、小鼠苏醒后将其放回鼠笼内饲养。
2)小鼠肺组织病毒滴度测定
肺组织研磨液制备：小鼠用RSV攻毒感染后第4天断颈处死，浸泡于75％乙醇5-10分钟；在超净工作台中无菌操作取出肺组织，放入研磨器中，加入1ml预冷的无血清DMEM培养基，充分研磨，使肺组织研磨彻底；4℃、12000rpm、离心20分钟，收集上清、分装冻存于-80℃，用于细胞因子浓度和病毒滴度检测。VLPs疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染后肺组织中细胞因子浓度测定：取上述制备冻存的肺组织研磨液，用ELISA试剂盒检测两种类型共6种细胞因子(Th1类，IFN-γ，TNF-α和IL-2；Th2类，IL-4，IL-5和IL-10)浓度。具体同上述脾淋巴细胞因子检测操作步骤。
结果表明，本发明制备的VLPs疫苗免疫小鼠在感染RSV后，肺组织能分泌高水平Th1类细胞因子(特别是IFN-γ)分泌；同时产生低水平Th2类细胞因子(图7A、7B)，这有利于机体清除RSV感染和降低VED形成。
肺组织RSV滴度测定：将Vero细胞悬液接种至24孔细胞培养板中，次日待Vero细胞长至95％单层，吸去DMEM培养液，无血清DMEM培养基洗涤2次；取50μl肺组织研磨上清液加入至150μl无血清DMEM培养基中，充分混匀，将 混合液加入无血清DMEM培养基洗涤的24孔板Vero细胞单层上，于37℃，5％CO2培养箱吸附2小时，吸去混合液，向孔中加入1％琼脂糖的覆盖液(0.5-1ml/孔)，另设正常小鼠肺组织研磨液作为阴性对照；37℃培养3-5天，吸弃覆盖液，PBS洗涤3次。加预冷固定液(甲醇：丙酮/60:40)4℃固定10分钟。空气干燥，加入含3％BSA的PBS，室温作用30分钟，用PBST(0.5％Tween20)洗涤3次；加入鼠抗RSVF蛋白的单克隆抗体(一抗，1:1000)，37℃孵育2小时，PBST洗涤3次。加入HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体(二抗，1:2000)，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，加入DAB底物显色液(100μl/孔)，室温显色15-30分钟，吸去底物显色液，计数蚀斑，计算小鼠肺组织病毒滴度。
结果表明，本发明制备的VLPs疫苗免疫小鼠能抑制感染RSV在小鼠体内复制或加速RSV的清除，使免疫小鼠获得抗RSV感染的免疫保护(图8)。
3)小鼠肺组织HE染色
每组取5只小鼠，于RSV感染后第4天，乙醚麻醉处死小鼠，取全肺组织，放入4％福尔马林溶液中固定24小时，脱水、石蜡包埋、切片和HE染色，显微镜下观察分析小鼠肺组织病理变化。
结果表明，本发明制备的VLPs疫苗免疫小鼠能抑制RSV感染后肺组织肿胀、炎性渗出和炎症细胞侵润等病理变化，降低RSV感染造成的肺组织病理损伤(图9)。
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