一种使用微孔识别DNA突变的方法及为此提供的试剂盒 发明背景发明领域
本发明涉及一种使用微孔识别DNA突变的方法及为此提供的试剂盒，更具体地说，涉及一种使用微孔、用于识别单碱基突变的经济、简便及安全的方法及为此提供的试剂盒，单碱基突变包括置换、插入和缺失。发明背景
在该领域中，通过基因识别确定生物的物种以及诊断疾病的技术已广泛采用(请参见《临床微生物学学报》(J.Clin.Microbiol.)，34：130-133，1996)。根据疾病地种类和类型，通过使用多种药物可以治疗疾病。然而，在疾病是由于感染了可能发生突变的微生物所引起的情况下，常规药物的使用就受到了限制。
检测微小突变如DNA序列的置换、插入和缺失的常规技术包括点渍法、RFLP(限制性片段长度多态性)分析、SSCP(单链构象多态性)分析和DNA测序。
首先，点渍技术利用DNA印迹法原理，其中在一特定温度以上，即使一个单碱基对失配也会引起DNA双链体的破坏。点渍法可以通过检测由一个靶序列代表的寡核苷酸探针产生的信号确定突变的存在，当该寡核苷酸探针与固定在膜上的核酸杂交时，预先用连接到显色应答体上的放射性同位素、荧光染料或酶标记(请参见《英国皮肤病学报》(British J.Dermatol.)，131：72-77，1994)。也可以通过将一个寡核苷酸探针固定在膜上，并将一个靶向DNA进行预扩增，由被固定的寡核苷酸和扩增的DNA之间双链体的形成确定突变。
其次，RFLP分析利用了只切割特定序列的限制酶的特性。换句话说，一个被PCR扩增的正常核苷酸序列可以用一种限制酶切割，而识别部位发生突变的相应的核苷酸序列却不能被相同的酶切割。用一种限制酶处理正常的和发生突变的DNA样品后，将所得到的DNA片段的混合物一起在相同的凝胶上进行电泳，可以通过比较每个样品的DNA片段的数目测定突变的存在(请参见《分子细胞生物学》(Mol.CellBiol.)，279-281，1995)。
第三，SSCP分析利用单链DNA的特性，其中其由即使一个单点突变引起的构象的变化引起非变性凝胶中片段迁移的变化。在一种称为SSCP的技术中，当正常DNA以及突变DNA的限制切割方式保持相同时，有时也可能通过序列变化对单链DNA的短片段的迁移的影响检测序列的变化。通过比较非变性凝胶中突变DNA和未突变DNA链的迁移方式，可以确定突变的存在与否(请参见《分子细胞生物学》，289，1995)。
除了上面提到的几种技术外，也可以由通过凝胶电泳或使用仪器进行的直接DNA测序检测突变(请参见《分子细胞生物学》，245-248，1995)。所说的典型包括使用放射性物质、荧光染料或酶检测信号的技术具有一些缺点，如安全问题，并且在使用放射性标记的情况下，处理废物的成本很高，而在不使用放射性标记的情况下，由于使用膜或进行丙烯酰胺凝胶电泳而使操作麻烦并且费时。
同时，也可通过利用识别特异性核苷酸序列的方法，使用已经用于由识别抗体蛋白质，或用于通过与DNA或寡核苷酸杂交识别一种特异核苷酸序列的微孔板来确定突变的存在与否。例如，将一个样品DNA固定到微孔上，然后使用与待识别的正常DNA序列对应的寡核苷酸探针识别：即，将一个通过PCR技术扩增的样品DNA固定到一个微孔上，用一个结合了生物素的探针进行杂交，然后使用一种酶对杂交进行评价(请参见《分子细胞生物学》，6(1)：79-85，1992)。但是，在先技术方法在几个方面被证明不能令人满意：由于在从病人采集样品DNA后，样品DNA必须被固定到微孔上，因此分析样品DNA很费时；由于DNA的长度，由PCR扩增的样品DNA可能还会有抑制与探针杂交的第二结构；长度较长的DNA分子可能会阻止其与孔的结合(请参见《分析生物化学》(Anal.Biochem.)，138-142，1991)；以及，由于使单链变性后一个样品DNA固定到一个微孔上，在实验期间内很容易发生单链DNA的复性，这降低了样品DNA与探针结合的能力。本发明概述
按照本发明，发现DNA序列突变的识别可以一种经济、简便和安全的方式，通过使用微孔和能够结合到生物素上的降解酶进行。
因此，本发明的一个主要目的是提供一种通过用PCR扩增靶(样品)DNA并使用微孔，识别其相应的正常序列已经被测定的DNA序列的突变的方法。
本发明的另一个目的是由此提供一种方便使用的试剂盒。附图的简单说明
通过以下的描述并结合附图，本发明的上述及其它目的和特征将变得十分明显，其中：
图1为显示使用本发明方法识别DNA突变的结果的图形。本发明的详细说明
使用微孔识别DNA突变的方法包括以下步骤：通过PCR，使用一个结合了生物素的引物，准备一个待识别的部分核苷酸序列的被扩增的、生物素化的DNA片段；准备一个与待识别的DNA序列对应的正常序列的探针；将如此制备的探针固定到微孔的胺基上；将如此制备的生物素化的DNA片段加入到固定了探针的微孔中；将一种连接了链霉抗生物素的降解酶加入到微孔中以将降解酶结合到探针的生物素部分上；以及，加入一种与降解酶反应的底物并检测由底物的降解所引起的颜色或吸光度变化。
用于识别DNA突变的试剂盒包括一个微孔，其内部含有胺基、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亚胺(EDC)溶液和1-甲基咪唑溶液，pH值为7.0用于固定探针；0.4M NaOH/0.25％吐温-20溶液用于除去未固定的探针；一种包含dH2O、20×SSPE/0.0167％Triton X-100和鲑鱼精子DNA(10mg/ml)的溶液用于保护微孔的表面；一种0.5×SSC/0.1％吐温-20的溶液用于除去未杂交的生物素化的样品DNA片段；一种将与生物素结合的、连接了链霉抗生物素的降解酶；一种包含150mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液用于将链霉抗生物素与生物素结合；一种包含150mM NaCl/0.1％吐温-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液用于除去未结合的链霉抗生物素；以及一种连接了链霉抗生物素的降解酶的底物。
在本说明书的描述中，使用术语“突变”是指一种序列变化，如置换，其中一个或多个核苷酸被另外的核苷酸置换；缺失，其中一个或多个现存的核苷酸被除去；和插入，其中插入一个或多个另外的核苷酸。
微生物体内经常发生由一个或多个核苷酸变化所引起的突变。例如，已知具有在特定部位的核苷酸变化的结核杆菌对利福平有抗药性(请参见《柳叶刀》(Lancet)，341：647-650，1993)。因此，检测突变的存在与否，以及识别发生变化的核苷酸序列可能对医治病人很有用。
按照本发明，该识别DNA突变的方法不仅可用来检测突变的存在，而且也可以容易地识别突变的类型，如核苷酸的置换、插入和缺失。该方法包括以下步骤：准备扩增的样品DNA，准备一个探针，将探针固定到一个微孔上并通过将样品DNA与探针结合来检测突变。
步骤1：样品DNA的扩增
通过使用一种结合了生物素的引物产生扩增的、生物素化的样品DNA片段的聚合酶链反应(PCR)，将待进行突变识别的部分DNA序列扩增：由于PCR是通过使用一种结合了生物素的引物进行的，因此被PCR扩增的产物为一种由互补的生物素化的和未生物素化的核苷酸序列组成的混合物。
步骤2：探针的制备
制备含有与待识别的DNA序列相对应的正常序列的DNA探针：如此制备的探针含有10个以上核苷酸，并包含一个处于5’端位的磷酸酯部分，该磷酸酯部分使探针能够固定到微孔的胺基上。
步骤3：探针的固定
将如此制备的探针固定到微孔内表面的胺基上：由于所合成探针的核苷酸序列可能自发地重退火，因此可通过在90-100℃，最优选94℃下加热该探针5-15分钟，最优选10分钟维持单链探针，然后立即在冰水中冷却。将催化寡核苷酸的磷酸酯部分与微孔的胺基之间的共价键合反应的pH值为7.0的冰冷的10mM 1-甲基咪唑溶液和pH值为7.0的10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亚胺(EDC)溶液加到单链DNA探针上。将含有混合物的探针加到胺基衍生化的微孔中，并用胶带将微孔密封以防止反应混合物的蒸发，然后在40-60℃，最优选50℃下温育5-9小时，最优选7小时。通过这种方式，探针被共价固定到微孔的内表面上。室温下用0.4M NaOH/0.25％吐温，然后用蒸馏水洗涤固定了探针的微孔。
步骤4：将样品添加到微孔中
将在前面步骤中获得的生物素化的PCR片段加到固定了探针的微孔中：首先，将一种含有dH2O、20×SSPE/0.067％ Triton X-100和鲑鱼精子DNA的溶液(10mg/ml)加入到微孔中，并在40-60℃，最优选50℃下温育10-20分钟，最优选15分钟，以防止生物素化的样品与微孔表面的游离胺基结合。为使在步骤1中得到的生物素化的双链DNA片段变性以与探针杂交，将片段在90-98℃，最优选94℃下加热5-15分钟，最优选10分钟，并立刻在冰水中冷却。然后，将一种含有dH2O、20×SSPE/0.067％ Triton X-100和鲑鱼精子DNA的溶液(10mg/ml)加入到单链DNA样品中。将混合物引入到微孔中，在50-70℃，最优选60℃下温育5-15小时，最优选10小时。温育以后，除去残余的混合物，并用0.5×SSC，0.1％吐温-20洗涤微孔。核苷酸序列发生变化的样品将显示出对于固定在微孔上的探针的较低的亲和性，而具有正常序列的样品将显示高亲和性。因此，样品DNA片段的生物素可以收集到微孔中，并且发生突变的和未发生突变的序列对探针的亲和性的差别可以按照与微孔结合的生物素的密度的差别测定。
步骤5：添加一种降解酶
为使降解酶与探针捕获的样品DNA片段的生物素部分结合，将连接了链霉抗生物素的降解酶加到微孔中：为检测突变的和未突变的DNA样品的结合到微孔上的生物素密度的差别，降解酶与生物素结合。降解酶水解一种生色底物，并可以测定由此而产生的颜色强度或吸光度变化。例如，可以使用链霉抗生物素-碱性磷酸酶；用含有150mMNaCl/0.1％吐温-20的100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)洗涤微孔，并将用含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)稀释的链霉抗生物素-碱性磷酸酶加到微孔中，并在35-45℃，最优选40℃下温育30-90分钟，最优选60分钟。除去残留的反应混合物后，加入含有150mMNaCl/0.1％吐温-20的100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)，在50-70℃，最优选60℃下温育5-15分钟，最优选10分钟，然后洗涤。
步骤6：检测酶反应
将连接了链霉抗生物素的降解酶的底物加到微孔中，并检测由酶反应引起的颜色或吸光度变化：表现颜色或吸光度变化的合成肽是由酶-底物反应引起的降解中的理想底物。例如，当使用链霉抗生物素-碱性磷酸酶作为降解酶时，将100μl pNPP(磷酸对硝基苯基酯)加到微孔中，并在室温下温育60-120分钟，最优选90分钟。加入1M NaOH使反应中止后，测量405nm处的吸光度。尽管可以使用常规的分光光度计测量吸光度，但对于测量微孔中酶-底物反应混合物的吸光度，ELISA读数器是一种更为理想的仪器。
另外，为实施上述方法，本发明还提供一种包含下述组成部分的试剂盒：一个微孔，其内部含有胺基、EDC溶液和1-甲基咪唑溶液的，pH值为7.0用于固定探针，0.4M NaOH/0.25％吐温-20溶液用于除去未固定的探针，一种包含dH2O、20×SSPE/0.0167％ Triton X-100和鲑鱼精子DNA(10mg/ml)的溶液用于保护微孔的表面的胺基，一种0.5×SSC/0.1％吐温-20的溶液用于除去未杂交的生物素化的样品DNA片段，一种要与生物素结合的、连接了链霉抗生物素的降解酶，一种包含150mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液用于将链霉抗生物素与生物素结合，一种包含150mM NaCl/0.1％吐温-20的100mM Tris-HCl(pH7.5)溶液用于除去未结合的链霉抗生物素，以及一种用于连接了链霉抗生物素的降解酶的底物。
按照本发明，可以通过测量与微孔结合的生物素密度区分突变的和未突变的DNA样品。这就是说，降解酶与生物素结合，可以通过添加与降解酶反应的底物测定结合酶的活性。因此，可以检测样品DNA中突变的存在，此外还可以识别突变的类型。因此，在任何检测DNA突变的试验中，都可以一种比任何其它常规方法更经济、更简便和更安全的方法获得结果，只要待识别的DNA部分可被扩增，并且可以制备一个包含与待识别的DNA相对应的正常序列的探针即可。
使用本发明的微孔识别DNA突变的方法优于常规方法的方面有：
1.由于可以使用比常规方法更少量的寡核苷酸获得同样的结果，因此本发明方法更经济。通过使用本发明方法，用100ng探针/孔可以获得类似的吸光度结果，而在先技术方法需要600ng/孔(请参见《分子细胞探针》(Mol.Cell Probes)，12：407-416，1998)。
2.在现有技术中，所提供的用于随后结合寡核苷酸的微孔要进行预处理。相反，在本发明中提供固定了寡核苷酸的微孔，这反过来又减少了合成寡核苷酸以及制备微孔的成本。
3.当通过使用一种含有寡核苷酸将要与之结合的胺基的常规微孔检测突变时，阴性对照的高吸光度是一个主要的问题。而通过使用本发明的微孔，阴性对照的吸光度显著下降。
4.将样品DNA固定到微孔上，检测DNA突变的常规方法存在一些问题，如由样品DNA的长度引起的二级结构、较弱的结合亲和力和样品核苷酸链之间的互补结合。在本发明中，通过预先将DNA探针固定到微孔上，解决了这些问题。
5.在先技术使用膜或凝胶，它们的处理很麻烦，并且在处理大量样品时，除了困难，还需要很多复杂的工作，而本发明方法通过在一个孔中进行全部步骤而变得简便。
6.在先技术有很多变化，如收集样品和进行实验的不同方法，这对于以重现性方法进行实验是一个障碍。本发明的试剂盒不仅提供了实验条件的一致性，而且还可以储存一段较长的时间，这使得可以同时检测大量的样品。特别是由于通过使用仪器可以避免实验误差，因此可以统计方法分析实验数据或样品类型。
7.可以通过视觉识别结果。这就是说，可以用肉眼检测由酶反应而产生的颜色变化，因此，由于结果很明显，研究人员就可以相信结果。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应视为对本发明范围的限制。实施例1：使用微孔识别DNA突变
本发明识别DNA突变的方法包括通过将一个含有与待识别的DNA相对应的正常序列的探针固定到微孔上，然后评价一个DNA样品与一个固定在微孔上的互补寡核苷酸探针之间杂交的稳定性以检测病人的DNA突变的存在的步骤。作为一个有代表性的实施例，本发明者使用了一个已知仅在结核杆菌BCG(卡介杆菌)基因组中发现的直接测序区，并评价病人的一个样品DNA的双链体和多种探针的稳定性，其中的多种探针包括一个直接测序区的正常核苷酸序列的探针，包含在直接测序区的不同类型突变的探针，和一个作为阴性对照的与直接序列无关的探针。实施例1-1：含有正常核苷酸序列的探针的使用
首先，通过常规方法合成含有结合生物素的核苷酸序列5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’(SEQ ID：1)的引物a和5’-CCGACAGGGGACGGAAAC-3’(SEQ ID：2)的引物b。然后，在含有DNA(包含BCG的直接序列)的PCR混合物中进行PCR直到最终浓度为200ng/μl，0.5μl引物a(100pmol/μl)、0.5μl引物b(100pmol/μl)、0.4μl dNTP(25mM)、10×Taq缓冲液、3μl MgCl2(25mM)、0.2μl Taq(5单位/μl，美国Promega)和40.4μl ClH2O，变性循环30次(94℃，1分钟)，退火(55℃，1分30秒)并延伸(72℃，1分30秒)。
随后，合成含有正常核苷酸序列5’-TTGACCTCGCCAGGAGAGAAGATCA-3’(SEQ ID：3)的探针#1和含有正常核苷酸序列5’-TCCGTACGCTCGAAACGCTTCCAAC-3’(SEQ ID：4)的探针#2。将每个探针的10pmol等分量在94℃下加热10分钟，在冰水中冷却10分钟，离心浓缩。然后，pH值为7.0的EDC和1-甲基咪唑的溶液加到探针的每个等分量中，至终浓度为10mM。将100μl如此制备的每个探针混合物引入到置于冰上的微孔(丹麦Nunc)中，在50℃下温育7个小时。除去残余的探针混合物后，将一种含有138μl dH2O、20×SSPE/0.0167％ Triton X-100和2μl鲑鱼精子DNA(10mg/ml)的溶液加到微孔中，并在50℃下温育20分钟，以将微孔表面上的游离胺基保护。
除去保护溶液后，向每个微孔中加入一种含有68μl dH2O、30μl20×SSPE/0.0167％ Triton X-100、1μl鲑鱼精子DNA(10mg/ml)的样品混合物和1μl前面制备的PCR扩增的样品DNA，并在60℃下温育约10个小时。除去混合物后，用200μl 0.5×SSC，0.1％吐温-20洗涤每个微孔三次，然后加入相同的溶液并在60℃下温育15分钟。用同样的溶液洗涤三次后，将100μl用含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)稀释3000倍制备的链霉抗生物素-碱性磷酸酶加到微孔中，并在40℃下温育1个小时。
随后，用含有150mM NaCl/0.1％吐温-20的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤微孔三次，并三次在60℃下温育5分钟，并且相同的溶液洗涤。向每个微孔中加入100μl pNPP(N7653，美国Sigma)，温育90分钟，然后测量405nm处的吸光度(请参见图1)。实施例1-2：带有一个置换核苷酸的探针的使用
为识别置换突变，通过用A置换探针#1的第十四核苷酸G合成探针#11 5’-TTGACCTCGCCAGAAGAGAAGATCA-3’(SEQ ID：5)，以及通过用G置换探针#2的第十四核苷酸A合成探针#21 5’-TCCGTACGCTCGAGACGCTTCCA AC-3’(SEQ ID：6)。然后以与实施例1-1类似的方式进行DNA突变的识别，不同之处在于使用探针#11和#21而不是探针#1和#2(请参见图1)。实施例1-3：带有一个插入的核苷酸的探针的使用
为识别插入突变，通过在探针#1的第13和第14核苷酸之间插入T合成探针#12 5’-TTGACCTCGCCAGTGAGAGAAGATCA-3’(SEQID：7)。然后，以与实施例1-1类似的方式进行DNA突变的识别，不同之处在于使用探针#12而不是探针#1和#2(请参见图1)。实施例1-4：使用一个被除去一个核苷酸的探针
为识别缺失突变，通过将探针#1的第14核苷酸G除去合成探针#13 5’-TTGACCTCGCCAGAGAGAAGATCA-3’(SEQ ID：8)。然后，以与实施例1-1类似的方式进行DNA突变的识别，不同之处在于使用探针#13而不是探针#1和#2(请参见图1)。实施例1-5：使用阴性对照探针
作为阴性对照，合成含有仅在一种结核杆菌H37Rv中发现的核苷酸序列的探针#C 5’-GGAGCTTTCCGGCTTCTATCAGGTA-3’(SEQID：9)。然后，以与实施例1-1类似的方式进行DNA突变的识别，不同之处在于使用探针#C(请参见图1)。
图1表示一个基于仅在结核杆菌的基因组中发现的直接测序区BCG的图形，通过评价从病人获得的样品DNA的双链体和多种探针的稳定性显示DNA突变的识别，其中的多种探针包括含有一个直接测序区的正常核苷酸序列的探针、在直接测序区含有不同类型的突变的探针和作为阴性对照与直接序列无关的探针。在图1中，No DNA表示没有探针的对照；No.1为阴性对照探针#C；No.2为正常序列探针#1；No.3为置换突变体的探针#11；No.4为缺失突变体的探针#13；No.5为插入突变体的探针#12；No.6为正常序列探针#2；No.7为置换突变体的探针#21。
如图1所示，由于样品DNA与正常序列的探针的杂交所得的OD值显示最高值，经证明从病人获得的样品DNA包含正常序列。另一方面，尽管样品DNA与突变序列的探针的杂交对于每个突变的探针的OD值来讲多少有些差异，但这些值大大低于正常序列的探针，因此确保通过本发明方法可以清楚地识别突变的存在。
运用本发明，使通过包含具有一个或多个核苷酸变化的每个突变的序列的探针识别突变的位置和类型成为可能。
如上清楚的示例和论证说明，以比任何常规方法更经济、更简便和更安全的方式，本发明不仅可以用来识别一个或多个突变的存在，而且也可用来识别突变的类型，如置换、缺失和插入。
序列表<110> 黄丞镛<120> 一种使用微孔识别DNA突变的方法及为此提供的试剂盒<160> 9<170> KOPATIN 1.5<210> 1<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 1ggttttgggt ctgacgac 18<210> 2<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 2ccgacagggg acggaaac 18<210> 3<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PCR产物<400> 3ttgacctcgc caggagagaa gatca 25<210> 4<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PCR产物<400> 4tccgtacgct cgaaacgctt ccaac 25<210> 5<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PCR产物<400> 5ttgacctcgc cagaagagaa gatca 25<210> 6<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PCR产物<400> 6tccgtacgct cgagacgctt ccaac 25<210> 7<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PCR产物<400> 7ttgacctcgc cagtgagaga agatca 26<210> 8<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PCR产物<400> 8ttgacctcgc cagagagaag atca 24<210> 9<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PCR产物<400> 9ggagctttcc ggcttctatc aggta 25