本发明基于发现人血小板因子-4的一种新的N-末端区域的加工形式，即下文的修饰的血小板因子-4（MPF-4）。本发明也包括一种经蛋白质水解裂解、非还原形式的血小板因子-4，即下文的裂解血小板因子-4（CPF-4）。从脂多糖刺激的外周血白细胞耗尽的培养基中可分离到MPF-4和CPF-4。 经氨基酸测序揭示了MPF-4与以Ser-17开始的血小板因子-4（PF-4）同源，因而推断MPF-4是PF-4的一种自然发生的裂解产物。CPF-4具有与PF-4相同的氨酸酸顺序，但因在16与17残基间的肽键不存在而不同。然而，产生的两个肽仍通过二硫桥键合。最有意义地是，本发明的化合物是内皮细胞增殖的有效抑制因子，并且无论怎样都比天然的PF-4活性高出10-100倍，这有赖于PF-4来源及报道的实验室。
PF-4是正在扩大的小地可诱导蛋白质组成的家族的一个原型成员，当用有丝分裂原或细胞因子刺激后可从各种各样的细胞型中释放出来。这个蛋白质家族，被认为是“intercrines”，发现它调节各种生物过程，例如血管生成、细胞增殖、凝结、炎症和组织修复。参见Oppenheim等，《新的前炎症超基团“intercrine”胞质族的性质》，Ann.Rev.Immunol.9：617-648，1991;Taylar等，《精氨酸为血管生成的抑制剂》，Nature 297：307-312，1982;以及Maione等，《由重组人血小板因子-4和相关肽抑制血管生成》，Science 247：77-79，1990）。
intercrine家族的其它成员包含白细胞介素-8（IL-8）、黑素细胞生长刺激活性（hGro/MGSA）、β-血栓球蛋白（β-TG）、中性白细胞激活蛋白（NAP-2）、IP-10和巨噬细胞炎性蛋白（MIP-2）。参见Lindley等，《基团编码的单核细胞衍生的中性白细胞激活因子在大肠杆菌中的合成和表达：天然的和重组的中性白细胞激活因子之间的生物等价性》，Proc.Natl.Acad.Sci.85：9199-9203，1988;Walz等，《在受刺激的单核细胞培养物中形成的β-血栓珠蛋白的新的裂解产物激活人中性白细胞》，Biochem.Biophys.Res.Commun.159：969-975，1989;Luster等，《γ-干扰素转录调节含同源性的基因对血小板蛋白质的早期反应》，Nature315：672-676，1985;以及Wolpe等，《巨噬细胞炎性蛋白质2的识别和表征》，Proc.Natl.Acad.Sci.86：612-616，1989）。
PF-4完整的一级结构在本领域是熟知的（Poncz等，《由人红白血病细胞系衍生的血小板因子-4 cDNA的克隆和表征》，Blood69：219-223，1987）。PF-4的类似物和片段也是熟知的，并在美国专利4，545，828和4，737，580中称作“制瘤素-A”，在此引用作为参考。研究显示了intercrine蛋白家族在N-末端区域含有特征的半胱氨酰-X-半胱氨酸（CXC）基元。CXC基元通过与Cys-36和Cys-51残基形成分子内二硫键参与产生天然PF-4的二级及三级结构（St.Charles等，《牛血小板因子-4的三维结构在3.0-A的分辨》，J.Biol.chem.264：2092-2098，1989）。
再者，基于公布的牛PF-4三维结构，确定了N-末端Gln-9到Val-19残基形成一个巨大的开环，Thr-16与Cys-51以氢键缔合。这些N-末端结构已表明对PF-4的免疫调节活性是重要的。（Katz等，《血小板因子-4的蛋白酶诱导的免疫调节活性》，Proc.Natl.Acad.Sci.83：3491-3495，1986）。
虽然PF-4主要在血小板的α-粒中发现，但是基因组克隆揭示了这样一个事实，即产生不同形式的PF-4（即PF-4 varI和PF-4alt）的人PF-4基团的复制（Doi等，《大白鼠血小板因子-4基因结构：巨核型分辨标记》，Mol.Cell Biol.7：898-912，1987）。变异体的推断氨基酸序列显示在N-末端先导序列和C-末端富赖氨酸结构域存在重要差别（Green等，《人血小板因子-4的基因变异体，PF4var 1的识别和表征》，Mol.Cell.Biol.9：1445-1451，1989;Eisman等，《人血小板因子4和PF4alt的基因结构和功能比较》，Blood 76：336-344，1990）。先导序列的变化提示其分泌方式和表达的组织类型所在有区别。因此，PF-4的替代品形式也可能是由细胞产生的而非血小板。
人们也公认PF-4富含赖氨酸的C-末端区域与肝素和有关的氨基葡聚糖牢固结合（Rucinski等《人血小板因子4及其C-末端肽：肝素结合和从循环中清除》，Thrombos.Haemostas.63：493-498，1990）。
PF-4的突变形式已被公开作为利用突变体来治疗血管形成的疾病。见美国专利5，086，164和5，112，946，在此引用作为参考。这些专利揭示PF-4 C-末端区域的修饰而产生的类似物再也没有结合肝素的能力。本发明公开PF-4的加工后形式MPF-4及CPF-4。
本发明包含MPF-4成份和CPF-4成份，MPF-4实质上由具有序列SEQ.ID.No：1氨基酸顺序的一种蛋白质组成，CPF-4实质上由具有序列SEQ ID No：1的氨基酸顺序的蛋白质与具有序列SEQ.ID.No：2的氨基酸顺序的蛋白质以二硫键键合的蛋白质组成。CPF-4的两条蛋白质链是由SEQ.ID.No：1的Cys-20与SEQ.ID.No：2的Cys-10以及SEQ.ID.No：1的Cys-36与SEQ.ID.No：2的Cys-12以二硫键连接。本发明还包含纯化MPF-4及CPF-4的方法，包括反相色谱法→肝素亲合层析色谱法→反相色谱法。此外，服用抑制剂量的MPF-4及CPF-4以阻止血管形成的方法也是权利要求的。编码MPF-4和CPF-4的最终重组DNA化合物也包含在本发明中，它们是包含这些重组DNA化合物的载体和宿主细胞。
图1是一个浓度效应曲线，表示MPF-4、CPF-4及PF-4对内皮细胞增殖的抑制作用。
MPF-4是一个由54个氨基酸残基组成的自然存在的蛋白质，由SDS-PAGE测得其分子量约为七千道尔顿。MPF-4与PF-4C-端的54个残基100%同源，因而被认为是PF-4的一种加工形式。在SEQ.ID.No：1中陈述了MPF-4的氨基酸顺序。
CPF-4是一个天然存在的蛋白质，由一条含16个氨基酸链（SEQ.ID.No：2）和一条MPF-4的54个氨基酸链（SEQ.ID.No：1）组成。CPF-4由SDS-PAGE测得分子量约为7.8-8.0千道尔顿。CPF-4的两条蛋白链在SEQ.ID.No：1的Cys-20和SEQ.ID No：2的Cys-10间二硫键合，另一个二硫键桥在SEQ.ID.No：1的Cys-36和SEQ.ID.No：2的Cys-12之间。
普通的熟练技术人员会明白对这些序列作一些保守氨基酸的替换而不会对本发明造成有害的影响。保守氨基酸替换包括Gly和Ala间、Asp和Glu间、Asu和Glu间、Phe和Tyr间和Lys和Arg间的替换。
与亲本蛋白相似，MPF-4与CPF-4都与肝素结合并抑制内皮细胞的生长，这使它们成为用于治疗血管形成的及细胞增殖的疾病的有吸引力的候选者。肝素结合区域认为是SEQ.ID.No：1的Lys-45到Lys-50。
给予在此公布的序列资料和固相蛋白质合成的技术陈述，可通过化学合成获得基本纯的MPF-4和CPF-4。多肽的固相化学合成原理在技术上是已知的，并且可在此领域的一般教科书中找到，如Dugas，H.和Penney，C.，Bioorganic Chemistry（1981）Springer-Verlag，New York，54-92页。
例如，肽或蛋白质如MPF-4可通过固相方法利用Applied Biosystems 430A肽合成仪（Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln center Drive，Foster City，CA94404）以及Applied Biosystems提供的合成循环合成。Boc氨基酸及其它试剂可从Applied Biosystems以及其它的化学供应商店买到。将利用双连结法的有顺序的Boc化学过程应用于开始的对-甲基二苯甲基胺树脂以产生C-末端甲酰胺（carboxamides）。用相应的PAM树脂生成C-末端酸。用预先形成的羟基苯并三唑酯将天冬酰胺、谷氨酰胺及精氨酸连接起来。可使用下列侧链保护基团：
Arg，甲苯磺酰基
Asp，环己基
Glu，环己基
Ser，苄基
Thr，苄基
Tyr，4-溴苄酯基
Boc脱保护可在二氯甲烷中用三氟醋酸完成。合成完成后，肽可在含10%间甲苯酚的无水氟化氢（HF）中脱保护并从树脂上裂解下来。侧键保护基的裂解以及肽从树脂上的裂解可在摄氏零度甚至更低的条件下进行，优选在-20℃进行30分钟再在0℃进行20分钟。除去HF后，肽/树脂用乙醚洗涤，肽用冰乙酸提取出来并冷冻干燥。
同样，分子生物学上的技术陈述给普通的熟练技术人员提供了另一种可获得基本纯的MPF-4和CPF-4的方法。虽然这两种分子都可用固相肽合成法、从耗尽的培养基中分离或者重组的方法来生产，但是如果想要一个高产量，重组方法是优选的。重组生产MPF-4或CPF-4的基本步骤包括：
a）编码MPF-4的天然DNA序列的分离或者构建合成或半合成DNA编码序列，
b）将编码序列放入一个表达载体中，使其能以适当的方式单独表达此蛋白质或表达一个融合蛋白质，
c）用表达载体转化一种合适的真核或原核宿主细胞，
d）在允许表达MPF-4或CPF-4的条件下培养转化的宿主细胞。
e）回收并纯化重组产生的蛋白质，（如果必要）使蛋白质再折迭到其天然构象。
正如前面叙述的那样，两蛋白质的编码序列可全合成或可对更大的、天然PF-4编码为DNA修饰后得到。编码天然PF-4的DNA序列在美国专利No.5，086，164上有描述，并且它可作为重组产生MPF-4的起始原料，或者通过改变天然序列得到前体蛋白质以获得预期结果。
合成的基因，在体内或体外经转录和翻译后将产生MPF-4或CPF-4，这些基因可由已知的技术构建。由于基因密码天然的简并性，技术人员会认出一个相当大的编码MPF-4或CPF-4的确定数目的DNA序列。
合成基因的构建方法学在技术上是已知的。参见Brown等，（1979）Methods in Enzymology，Academic Press，N.Y.，68卷，109-151页。编码MPF-4或CPF-4的DNA序列可根据在此公布的氨基酸顺序和公布的PF-4顺序来设计。一旦设计好后，序列本身可利用常规DNA合成仪器如Applied Biosystems Model 380A或380B DNA合成仪（Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City，CA94404）来产生。
为了实现MPF-4或CPF-4的表达，人们通过利用合适的核酸限制性内切酶，将设计合成的DNA序列插入到许多合适的重组DNA表达载体的任何一种中。通常参见Maniatis等（1989）Molecular Cloning;A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，N.Y.，1-3卷。核酸限制性内切酶裂解位点被设计在MPF-4编码DNA的任何一端以利于整合到已知的扩增和表达载体中以及从中分离出来。使用的特殊核酸内切酶是由使用的亲本表达载体的核酸限制性内切酶裂解图谱来确定的。限制性位点的选择是为了以控制调节使编码序列正确定向以获得正确的框架阅读以及目的蛋白质的表达。编码序列必须与启动子和表达载体的核糖体结合部位放在正确的阅读框架中，在表达此蛋白质的宿主细胞中后两者都是起作用的。
为了获得合成基因的高效转录，所述基因必须与一个启动子-操纵子区域相联接。因此，合成基因的启动子-操纵子区域要位于相对于合成基因的ATG起始密码子顺序相同的方向。
用于转化原核和真核细胞的各种表达载体在技术中是已知的。参见The Promega Biological Research Products Catalogue（1992）（Promega Corp.，2800 Woods Hollow Road，Madison WI，53711-5399）;和The Stratagene cloning Systems Catalogue（1992）（Stratagene Corp.，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA，92037。而且，美国专利No.4，710，473描述了环状DNA质粒转化载体，用于大肠杆菌中高水平表达外源基因。这些质粒用作重组DNA过程中的转化载体和
a）授与质粒在宿主细胞中自主复制的能力;
b）涉及维持宿主细胞培养的温度，调节质粒自主复制;
c）在宿主细胞群中稳定质粒的生长;
d）在宿主细胞群中指示质粒生长的一种蛋白质的直接合成;
e）提供只对质粒的几组核酸限制性内切酶识别位点;
f）终止mRNA转录
这些环状DNA质粒在重组DNA过程可作为有用的载体以获得外源基因的高水平表达。
构建好表达载体后，下一步是将载体放入一种合适的细胞中，从而构建了一个在目的基因表达中有用的重组宿主细胞。用重组DNA载体转化细胞的技术在技术中是已知的，并可在如Maniatis等（见上）类似的一般参考文献中找到。宿主细胞可由真核或原核细胞构建。真核宿主细胞能进行表达蛋白质的翻译后糖基化，有一些还能将目的蛋白质分泌到培养基中。
原核宿主细胞通常以高速度生产蛋白质，它们容易培养但不能对最终蛋白质进行糖基化。在高水平细菌表达系统中表达的蛋白特征地聚集为颗粒或包涵体，其中含有高水平的过度表达蛋白。一般用已知的技术将这种蛋白质聚集体溶解、变性和再折迭，参见Kreuger等，（1990）Protein folding，Gierasch和King出版，136-142页，American Association for the Advancement of Science Publication No.89-18S，Washington，D.C.;以及美国专利No.4932967。
MPF-4和CPF-4还能从有丝分裂原刺激的PBL制品或产生它们的任何细胞株的耗尽培养基中分离得到。在人PBLs情形中，用技术上已知的任何一种方法将PBLs从全血的血沉棕黄层中分离得到。已发表的许多制备人PBLs方法中的一个例子是Singh等，《人单核细胞衍生的生长因子的纯化和生化性质》，Proc.Natl.Acad.Sci.85：6374-6378，1985。一旦分离后，PBL制品在平衡的盐溶液中充分漂洗以除去任何非细胞物质。
然后将PBL制品接种到含有有丝分裂原的规定的无血清生长培养基中。普通的技术人员会容易地意识到各种发表并可买到的适用于培养PBL制品的生长介质。类似地，许多能刺激PBL活性的有丝分裂原在技术中上也是已知的。下面是与主题发明一致的有丝分裂原的实例，它们只用来解释而不是限定：脂多糖（LPS）、植物血凝素（PHA）、伴刀豆蛋白A（ConA）、酵母多糖和一些有丝分裂原决定簇的直接抗体。
PBL制品然后在合适的条件下培养一段时间以生成MPF-4和CPF-4，通常培养一至数天，这取决于接种的初始浓度。耗尽的培养基再收集起来并通过过滤、离心或其它方法与细胞分开。
不管用什么方法生产MPF-4或CPF-4，都需要纯化。许多种蛋白质纯化技术在技术上均是已知的，其中很多对一般熟练的技术人员来说，按照这里公布的新教导明显是合适和容易的。一本叙述蛋白质纯化技术的基本教材是Janson和Ryden的Protein purification，VCH Publishers Inc.，New York，1989。
我们发现了一种非常有用的纯化方法，它包括先将耗尽的培养基加到一种反相纯化柱上。这种柱在技术中是已知的，并可从许多卖方买到，包括Pharmacia、Biorad和Amicon。在目的蛋白质与柱相互作用时，用逐渐线性增加的一种有机溶剂在三氟乙酸（TFA）中的溶液进行梯度洗脱。优选的有机溶剂是乙腈，含有MPF-4和CPF-4的组份在30-50%的乙腈梯度部分发现。更优选的梯度部分是33-39%的区域。
洗脱下的蛋白质然后与肝素亲合树脂接触。一般熟练的技术人员会容易地意识到这一步最好在柱上以色谱方式进行。肝素亲合柱可从上面提到的一些卖方中买到。在这一步，目的分子MPF-4或CPF-4与肝素柱结合并用逐渐线性增加的盐梯度溶液洗脱。NaCl是优选的盐，优选收集的梯度部分是0.1～2.0M部分。收集的更优选的梯度部分是0.7～2.0M部分。
最后一步是将0.7～2.0M部分洗脱液上到第二根反相柱并用溶于TFA的乙腈线性梯度洗脱。优选梯度是25-75%乙腈，而27-67%更好。柱中流出物用220nm处的吸收度监测。峰蛋白质部分进行细胞抗增殖活性（生物活性）检验。较早显示生活性的洗脱峰是CPF-4，后面的活性洗脱峰是MPF-4。
下面的实施例对指导纯化过程及理解本发明是有用的。这些实施例仅是为了说明的目的，绝不想以任何方式限制本发明。
实施例1
从州际血库购买健康供血者的血液制备得血沉棕黄层。PBL细胞制品是通过histopaqueTM（Sigma chemical Co.，St.Louis，Mo 63178）在4℃进行梯度离心，从汇集的血沉棕黄层中分离得到的。PBL制品用Hank′s平衡盐溶液（GIBCO;Grand Island，N.Y.）洗涤，以密度为3×106细胞/毫升（总体积为4升）接种到无血清最小基本培养基（GIBCO;Grand Island，N.Y.）中，并补充2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、0.8mM D-葡萄糖、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和20μg/ml的脂多糖（Sigma Chemical Co.;St.Louis，MO 63178）。PBL制品在37℃含5%CO2和95%空气中培养30小时。收集耗尽培养基，PBLs用0.2μm滤器过滤除去。
实施例2
4升无细胞耗尽培养基加入0.1%（V/V）三氟乙酸（TFA）酸化，然后以约为15ml/min的流速直接上到反相C4-RP-304TM（250×21.5mm）半制备柱（BioRad，Richmond，CA 94804）上。柱子用在0.1%TFA中的0-50%乙腈线性梯度洗脱约40分钟，然后用含有50%乙腈的0.1%TFA洗脱10分钟。流速为15ml/min。大约50分钟可收集15ml组分。洗脱过程在220nm处监测，收集并汇集用33-39%乙腈洗脱的组份（C4-池）。
实施例3
C4-池进一步在Econo-pacTM5ml肝素-琼脂糖cartridge（BioRad，Richmond，CA 94804）上通过肝素亲合色谱进行分级。结合的蛋白质以流速为2.0ml/min通过含有0-2.0M NaCl的磷酸盐缓冲液（PBS）线性梯度洗脱。从柱上洗脱的蛋白质汇集为3个部分：（1）不与肝素结合部分（流过）（2）与肝素低亲合性结合部分（0-0.7M NaCl）和（3）与肝素高亲合性结合（0.7M-2.0M NaCl）部分。
实施例4
将与肝素高亲合性结合部分（3）（0.7M-2.0M NaCl）上到预先用含27%乙腈的0.1%TFA平衡的VydacTM0.46×10cm C-4高压液相柱（The Marshall Co.;Worthington，OH 43085）。该柱用0.1%TFA中线性梯度为27%-67%的乙腈洗脱约40分钟。监测220nm处吸收度并人工收集峰蛋白质组分，然后再依实施例5的方法进行生物活性检测。两个峰说明了抑制细胞增殖的能力。根据常规氨基酸顺列分析，发现较早洗脱下的生物活性峰为CPF-4，后面洗脱下的生物活性峰是MPF-4。
实施例5
实际按Buzney等，《视网膜脉管内皮细胞和周细胞：体外的不同生长特点》，Invest.Ophthalmol.Visual Sci.24：470-483（1983）叙述的方法制备原代视网膜毛细管内皮细胞培养物，并按Voyta等，《基于其增加摄取低乙酰化密度脂蛋白的内皮细胞的识别和分离》，J.Cell.Biol.99：2034-2040（1981）叙述的方法分离污染的细胞。
也可以制备牛心脏内皮细胞（American Type CultureCollection;Rockville MD 20852）用作检测。无论哪种来源，内皮细胞都接种到24孔组织培养板中，细胞密度为10000细胞/孔，用Dulbecco′s Modified Eagle培养基（GIBCO;Grand Island，N.Y.），补充了5%牛血清白蛋白、1%青霉素-链霉素、1%L-谷氨酰胺和20ng/ml成纤维生长因子。接种细胞后，立即将各种量的PF-4（Sigma Chemical Co.;St.Louis，MO 63178）、MPF-4或CPF-4（按上述实施例中的方法分离得到）加到各个培养孔中。MPF-4和CPF-4试验终浓度从0.001至1μg/ml。天然PF-4作为对照，试验浓度为0.001至3μg/ml，并且从只补充培养基作为阴性对照。内皮细胞培养物可在含5%CO2的37℃潮湿组织培养箱中培养4天。然后培养物分别用胰酶消化收集，并用Zm-Coulter计数器（Coulter Electronics.Inc.;Opa Locka FL 33054）计数。
结果绘制在图1中，图中每一点代表四个数据点的平均值，也就是每个培养孔是一个数据点。结果表明PF-4抑制内皮细胞的增殖，半数有效抑制浓度（IC50）约为800-1000ng/ml（大约130nM）。这些结果与最近发表的关于重组PF-4抗增殖活性的研究（Science，247：77-79（1990）有很好的相关性。数据还表明在相同的条件下，MPF-4和CPF-4都是内皮细胞增殖更有效的抑制剂。证明MPF-4的半数抑制浓度为30-50ng/ml（约7nm），CPF-4的半数抑制浓度约为150ng/ml（20nm）。MPF-4的抑制浓度与人血浆中PF-4的生理范围接近（同上）。
序列目录
SEQ ID No：1数据
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：54个氨基酸残基
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：1：
SEQ ID No：2数据：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：16个氨基酸残基
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：2：