来自人类血液的CD4+CD25+调节性T细胞 本发明提供了抑制性和/或调节性的人类CD4+CD25+T细胞，用于增殖(expanding)该细胞的方法，和抑制性和/或调节性人类CD4+CD25+T细胞，及相应增殖T细胞作为调节性药剂的用途。
【发明背景】
免疫自身耐受性对自身免疫性的预防和免疫内环境稳定的维持是关键性的。免疫系统识别自身和非自身的能力是由中枢和外周耐受性机制控制的。中枢耐受性包括在发育早期胸腺中自身反应T淋巴细胞的缺失(Rocha，B.和von Boehmer，H.，Science 251：1225-1228(1991)；Kisielow，P.等，Nature 333：742-746(1988))。一些外周耐受性机制已经被描述过，包括T细胞无反应性和忽视(Rocha，B.和von Boehmer，H.，Science 251：1225-1228(1991)；Kisielow，P.等，Nature，333：742-746(1988)；Schwartz，R.H.，Science 248：1349-1356(1990)；Miller，J.F.A.P.和Heath，W.R.，Immunol.Rev.133：131-150(1993))。正在进行的、对啮齿类动物超过十年的研究提供了有力的证据，证实了“专业的(professional)”调节/抑制T细胞的独特CD4+CD25+群体的存在，该群体活跃地并占主导地阻止了脱离其它耐受机制的自身反应性T细胞的激活及效应器功能(Sakaguchi，S.等，J.Immunol.1 55：1151-1164(1995)；Takahashi，T.等，Int.Immunol.10：1969-1980(1998)；Itoh，M.等，J.Immunol.162：5317-5326(1999))。这些细胞的清除或失活会导致严重的自身免疫性疾病，并且发现也会增强对同种抗原、甚至肿瘤的免疫应答(Sakaguchi，S.等，J.Immunol.155：1151-1164(1995)；Itoh，M.等，J.Immunol.162：5317-5326(1999)；Shimizu，J.等，J.Immunol.163：5211-5218(1999))。最近的研究表明CD4+CD25+调节性T细胞构成一个相当同源的群体(Thornton，A.M.，Shevach，E.M.，J.Immunol.164：183-190(2000))，来源于胸腺(Itoh，M.等，J.Immunol.162；5317-5326(1999))，对经由TCR的刺激是自然非增殖的(即无反应性地)，但需要通过它们的TCR激活，才具有抑制性，并抑制CD4+或CD8+T细胞的增殖。然而，一旦被激活，它们的调节/抑制功能是完全抗原非特异性的，不依赖细胞因子，而依赖细胞接触(Thornton，A.M.，Shevach，E.M.，J.Immunol，164：183-190(2000))。抑制的确切机制，特别是涉及T-T相互作用的细胞表面和/或短距离可溶性分子，仍然需要被表征。新的体外数据表明CD4+CD25+T细胞是通过抑制它们的IL-2产生，而抑制响应物增殖的(Thornton，A.M.，Shevach，E.M.，J.Exp.Med.188：287-296(1998))。最近的体内研究表明：CD4+CD25+T细胞的功能关键性地依赖通过CTLA-4/CD152分子的信号传导，该分子被发现在CD4+CD25+T细胞上组成型表达(Read，S.等，J.Exp.Med.192：295-302(2000)；Salomon，B.等，Immunity 12：431-440(2000)；Takahashi，T.T.等，J.Exp.Med.192：303-310(2000)))。
多年来，尽管很明显，在啮齿动物中，CD4+CD25+T细胞群体构成了一个“专业的”调节性/抑制性T细胞的独特谱系，该谱系对自发性自身免疫性疾病的预防是至关重要的(Sakaguchi，S.等，J.Immunol，155：1151-1164(1995))，然而迄今未知，在人类中，显示类似功能特性的CD4+4T细胞是否自然发生。小鼠体内这些细胞的清除和/或功能性损伤，例如通过抗CD25和/或抗CTLA-A4 mAb处理动物，会诱发多种自发性自身免疫性疾病及肿瘤的排斥。机制是这些细胞的清除/损伤消除了它们的自身反应性T细胞的负控制，所以这些T细胞变得活跃起来。如果通过过继性转移将CD4+CD25+T细胞输回这些动物体内，调节作用便恢复了，并且自身免疫性/肿瘤排斥也停止了。
如上所述，迄今为止，还完全不知道在人类中，显示类似功能特性的CD4+T细胞是否天然存在。制备具有调节特性的人类T细胞的方法在本领域内已为人所知，不过，CD4+CD25+T细胞并不为人所知。如Jonuleit，H.等，J.Exp.Med 192：1213-1222(2000)所述的，通过未成熟树突细胞的反复刺激，从人类原初(naive)T细胞中诱导调节性T细胞。这项工作的大部分是采用脐血的T细胞进行的，脐血是真正原初T细胞的最丰富的来源。应当指出，从早期开始，在人类血液中就可组成性地检测到CD4+CD25+T细胞。Jonuleit等人的研究对象不是天然存在的群体。De Jong，P.等，Int.Immunol.6：631-638(1994)描述了TGF-β1在原初和记忆CD4+T细胞上的作用。其显示了不同的效应，在初级活化的CD45 RA+CD4+T细胞上显示了刺激效应。CD45 RO+CD4+T细胞或次级激活CD45 RO+细胞的增殖被抑制。在CD45 RA+T细胞的情况中，TGF-β导致CD25荧光平均数增加。此处描述的效应仅与T细胞的增殖相关。原初的经TGF-β处理的T细胞的调节能力未显示。
现在，在人类血液，特别是成年健康志愿者的外周血液中令人惊讶地发现存在有CD4+CD25+，主要是CD45RO+T细胞(平均占CD4+T细胞的6％)，下文简称为“CD4+CD25+T细胞”。过去多年，具有该表型的T细胞(即抑制性/调节性CD4+CD25+T细胞)已经为人们所了解，但是它们被误认为常规记忆细胞(Kanegane，H.等，Int.Immunol.，3：1349-1356(1991)；Taka，K.等，Immunol.72：15-19(1990)；Jackson，A.L.等，Clin.Immunol.Innunopathol.54：126-133(1990))。与以前的报告相反，人类CD4+CD25+T细胞不是常规记忆细胞，而是调节性细胞，该调节性细胞显示的功能特性与它们的啮齿类对应物一致。例如，对CD4+CD25+T细胞的体内抑制活性必不可少的CTLA-4(CD152)，是组成型表达的，并且受激后仍维持强烈的正调节。这些细胞对于经由其TCR进行的刺激而言，是非增殖的，但是该无反应性状态被IL-2和IL-15部分逆转。在经由异源(而非同源)成熟树突细胞或培养板结合的抗CD3+抗CD28刺激时，CD4+CD25+T细胞释放IL-10，并且在共培养试验中抑制CD4+和CD8+T细胞的活化与增殖。抑制作用证明和在小鼠体内一样，也不依赖IL-10，而依赖细胞接触。对于人类耐受性的研究而言，识别调节性CD4+CD25+T细胞具有重要的含义，特别是在自身免疫性、移植术及癌症范围内。
发明概述
本发明提供了
(1)抑制性和/或调节性人类CD4+CD25+T细胞；
(2)一种增殖如上文(1)中所定义的CD4+CD25+T细胞的方法，该方法包括：以T细胞刺激物，或是抗原呈递细胞，于间接体内(exvivo)和体内(in vivo)刺激细胞；
(3)增殖的人类CD4+CD25+T细胞，可通过如上文(2)中所定义的方法获得，优选的是通过如上文(2)中定义的间接体内方法。
(4)一种含有如上文(1)或(3)所定义的人类CD4+CD25+T细胞的药物组合物；
(5)如上文(1)或(3)所定义的CD4+CD25+T细胞在制备调节性药物上的用途；
(6)一种于间接体内或体内识别、监控和/或将CD4+CD25+T细胞从人类血液及其它组织中清除的方法，该方法包括：
(i)利用可与T细胞上的CD4、和/或CD25、和/或CTL-A4(CD154)实体(entities)特异性结合的药剂/配体，优选的是抗CD4和/或抗CD25、和/或抗CTL-A4抗体，和/或
(ii)利用免疫吸附方法；和/或
(iii)利用如上文(2)所定义的刺激物或抗原呈递细胞；
(7)如上文(2)所定义的T细胞刺激物或抗原呈递细胞在制备一种可体内诱导调节性CD4+CD25+T细胞的药剂上的用途，优选的是用于制备治疗患者自身免疫性疾病的药剂；
(8)如上文(1)或(3)所定义的CD4+CD25+T细胞的以下用途：
(a)用于识别其它生长和/或功能性修饰(抑制/增强)/凋亡或抗凋亡因子的分析上
(b)用于识别通过CD4+CD25+T细胞表达的分子上，包括识别在该细胞上的新分子，或者识别被认为具有药物活性的呈递分子，或者
(c)用于识别调节性CD4+CD25+T细胞的前体细胞或后代；
(9)上文(1)中富集的CD4+CD25+T细胞或上文(3)中增殖的T细胞在制备用于过继性转移治疗的药剂；用于治疗与免疫性增强相关、包括但不仅限于自身免疫性疾病的药剂；或者用于预防/治疗移植反应，如移植物抗宿主疾病和移植排斥的药剂上的用途，
(10)用于过继性转移治疗的方法，包括：将如上文(1)或(3)所定义的富集/增殖的自身或非自身调节性CD4+CD25+T细胞注射/输回患者体内，以预防或治疗任何过强和/或致病的免疫反应，或者预防/治疗移植反应，如移植物抗宿主疾病和移植排斥；
(11)一种制备具有特定要求的抗原特异性T细胞受体的CD4+CD25+T细胞的方法，包括：
(i)采用抗原呈递细胞活化/刺激/增殖上文(1)的CD4+CD25+T细胞，优选的是未成熟或成熟树突细胞(DC)，在体外(in vitro)或体内呈递该抗原；或者
(ii)利用一种在CD4+CD25+调节T细胞(的亚型)上表达的特定T细胞受体的配体/抗体，或者一种与CD4+CD25+T细胞(的亚型)上的特定T细胞受体结合的MHC-肽复合物；
(12)通过如上文(11)所定义的方法，或者通过将具有希望的抗原特异性的T细胞受体转染进间接体内分离或增殖的T细胞的方法获得的CD4+CD25+T细胞；
(13)包括上文(12)的T细胞的药物组合物，优选的药物组合物适用于治疗与免疫性增强相关的疾病，包括但不仅限于自身免疫性疾病，移植物抗宿主疾病和移植排斥；及
(14)特异性地结合到T细胞上的CD4和/或CD25和/或CTL-A4(CD154)实体上的药剂，包括但不仅限于配体/抗体，如抗CD25和/或抗CTL-A4 mAb；或者是与CD4+CD25+T细胞(的亚型)上的T细胞受体结合的抗体或MHC-肽复合物或其它配体，在制备一种用于体内CD4+CD25+T细胞的清除或功能性损伤的药物上的用途，用以增强免疫反应，包括通过体内CD4+CD25+T细胞的阻抑调节，例如增强肿瘤免疫性。
附图简述
图1显示CD4+CD25+T细胞表现出与CD4+CD25-T细胞明显不同的表型。
图2显示对异源和多克隆刺激，CD4+CD25+T细胞均无增殖/无反应性，通过添加IL-2和/或IL-15可部分逆转这一情况，但通过中和抗IL-10抗体则不可以。
图3显示如果通过TCR刺激，CD4+CD25+T细胞将以细胞接触和剂量依赖方式抑制CD4+和CD8+T细胞的活化。
图4显示CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞的细胞因子特征不同。
图5显示活化的和固定的CD4+CD25+细胞仍然显示调节能力。
发明详述
下文将更详细地描述本发明的实施方案(1)～(14)：
(A)现在，人类CD4+CD25+T细胞的表型特征使得可以于间接体内(下文有时表示为“体外”)或体内，从人类血液和其它组织中识别、监控(如通过FACS)、分离和清除这些细胞。可于间接体内采用合适的药剂接触人类血液或其它组织实现这种分离或清除。抗CD4、抗CD25、抗CTL-A4(CD154)抗体等是尤其合适的药剂。
(B)可通过合适的T细胞刺激物或抗原呈递细胞(下文简称为“APCs”)的刺激，间接体外增殖CD4+CD25+T细胞。适用于上文(2)和(6)方法的合适的T细胞刺激物包括，但不仅限于含有下列物质的组合物：
(a)抗CD3和/或抗CD28配体/单克隆抗体(mAb)，包括超激动抗体；(b)CD4+CD25+T细胞表面的T细胞受体的配体/抗体，或者是T细胞受体组分的配体/抗体；或(c)与调节性T细胞表面表达的T细胞受体结合的MHC-肽复合物；或(d)PMA(及其它佛波醇酯)+离子霉素(或其它钙离子载体)。
本发明的“配体”涉及所有种类的、可结合到特定分子上的化合物(包括多聚核苷酸和多肽，如细胞受体，CD25，CTL-A4等)。优选的配体是单克隆抗体或其片断。术语“配体”和“抗体”在整篇申请中可互换使用。
合适的APCs包括自身或非自身或人工抗原呈递细胞(如树突细胞(树突细胞的制备方法见例如WO 93/20185、WO 97/29182和EP-A-0922 758)等)。该T细胞刺激物和抗原呈递细胞可连同IL-2或IL-15或其二者的组合一起应用。除了IL-2/IL-15，也可采用其它的细胞因子，这些细胞因子利用若干细胞因子受体共有的γ链(包括，但不仅限于，IL-7和IL-9)。此外，已知可促进其它调节细胞产生的IFNα和IL-10(Groux，H.等，Nature 389：737-742(1997)；Roncarolo，M.G.，J.Exp.Med，193：F5-F9(2001))也可促进这些细胞的产生/增殖。最后，其它用于多克隆或寡克隆(如通过超抗原)T细胞刺激的方法也是可以应用的(抗CD3和/或抗CD28配体/抗原包括超激动抗体；PMA+离子霉素等)。可用于大量增殖的这些刺激物或抗原呈递细胞已为本领域的技术人员熟知。
(C)CD4+CD25+T细胞的识别使得可以体内监控和增殖CD4+CD25+T细胞(如通过对患者施用上文定义的T细胞刺激物，如IL-2+IL-15或IL-10+IFNα，同时加入或不加入树突细胞/抗原呈递细胞)，以诱导调节性T细胞，如抵抗自身免疫性疾病。
(D)上文(1)或(3)的CD4+CD25+T细胞或增殖的CD4+CD25+T细胞可被用于识别其它生长和/或功能性修饰(抑制/增强)/(凋亡或抗凋亡)因子，这些因子可被用于体外或体内(如刺激或清除或功能性地干扰CD4+CD25+T细胞)。这些T细胞也适合通过如下方法识别CD4+CD25+T细胞表达的分子，这些方法例如但不局限于mAb生成、蛋白质组学(proteomics)、DNA芯片分析、扣除杂交(尤其是(a)“新物质”，即迄今未知的物质、分子的识别，或(b)如这些分子具有合适的药物靶结构，便可用其开发新的刺激性、抑制性或凋亡诱导性药物，用于体外和体内CD4+CD25+T细胞的“打开”或“关闭”)，这些T细胞也适用于识别调节性CD4+CD25+T细胞的前体细胞或后代。
(E)上文(1)或(3)中的CD4+CD25+T细胞或增殖的CD4+CD25+T细胞可应用于过继性转移治疗，即将富集的/增殖的自身的或非自身的调节性T细胞注射/输回患者体内，以预防或治疗任何过强和/或致病的免疫反应，即治疗最广泛意义的自身免疫性(包括但不仅限于典型自身免疫性疾病，如红斑狼疮、风湿性关节炎、多发性硬化症、寻常型天疱疮或甲状腺炎，及发病机理中至少有一些自身免疫性特征的疾病，如白癫风、遗传过敏性皮炎、牛皮癣等)。也预防/治疗移植反应，如GVHD(移植物抗宿主疾病)和移植排斥。
(F)为了在体外或体内活化/刺激/增殖CD4+CD25+T细胞，而产生/增殖具有特定所需抗原特异性TCR(T细胞受体)的CD4+CD25+T细胞，上文(1)或(3)中的CD4+CD25+T细胞或增殖的CD4+CD25+T细胞(以及上文(2)中定义的增殖方法，(4)中的药物组合物，及(5)和(7)～(9)中的应用)可与未成熟或成熟树突细胞(DC)(或其它抗原呈递细胞包括人工抗原呈递细胞)联合使用，该DC事先采用或不采用组织或任何其它抗原(限定的或未限定的)进行脉冲/加载/补料(pulsed/loaded/fed)接触。限定抗原的实例是自身抗原(如寻常型天疱疮中的桥粒芯糖蛋白3、白癜风中的melanA或酪氨酸酶、甲状腺炎中的甲状腺球蛋白)或外源抗原(如来源于病原体的抗原如丙肝等)或同种抗原/移植抗原。未限定抗原的实例是来源于组织或细胞的抗原(如以坏死或凋亡细胞、或来源于组织的RNA、或目的细胞与树突细胞/抗原呈递细胞杂交的形式，或以其它将未限定抗原导入树突细胞或其它抗原呈递细胞的形式)或来源于病原体的抗原。可以采用自身或非自身CD4+CD25+T细胞和/或树突细胞。
(G)如上文(14)定义的、特异性地与T细胞上的CD4和/或CD25和/或CTL-A4(CD154)实体结合的药剂，可被用于在体内清除和监控CD4+CD25+T细胞的清除，如通过抗CD25和/或抗CTL-A4 mAb(未修饰的或修饰的，如与毒素结合)或通过免疫吸附(血液是流经色谱柱的，且CD4+CD25+T细胞是通过针对CD4+CD25+T细胞表面表达分子的固相结合抗体，如抗CD25，而得以清除)以增强免疫反应，如通过体内CD4+CD25+T细胞的阻抑调节，例如，增强肿瘤免疫性。
(H)在本发明的另一个优选实施方案中，上文(3)增殖的(即活化的)CD4+CD25+T细胞(以及上文(1)和(12)中的T细胞)可以被固定。可通过采用合适的固定剂，包括但不仅限于多聚甲醛等，于间接体内处理(增殖的)T细胞，以获得这种固定的T细胞。优选的固定方式是通过将细胞悬浮于0.5～5％(w/w)多聚甲醛水溶液来完成，最优选的是在大约2％(w/w)多聚甲醛溶液中，15min～3h，最优选的是1h，继而是适当洗涤步骤。
(I)上文(5)的药物、(9)和(14)的药剂、或(10)的方法中所采用的CD4+CD25+T细胞可以是自身或非自身调节性T细胞。在非自身调节性T细胞的情况中，优选的是T细胞以上文(H)提到的方法被固定。
(J)上文(4)和(13)的药物组合物、(5)的药物、(7)、(9)和(14)的药剂，以及(6)、(8)和(10)的方法中利用的T细胞可进一步含有为本领域的技术人员所熟知的成分，诸如药用/诊断用载体、溶剂、稀释剂和添加剂。这些成分的浓度由本领域的技术人员根据相应的用途采用。
在过去几年中，对啮齿动物中一些调节细胞类型的更好描述已经更新了抑制物或免疫调节性T细胞的概念，它们之间的相互关系还未被最终定义。所谓的Tr1和Th3细胞介导旁立抑制-无需直接细胞接触-通过IL-10和TGF-β分别高水平分泌(Groux，H.等，Nature 389：737-742(1997)；Fukaura，H.等，J.Clin.Invest.98：70-77(1996))。迄今为止，已识别的，被最好地表征，并且显然最为重要的调节性T细胞群体是CD4+CD25+T细胞。它们天然存在于啮齿动物中(在淋巴器官中代表大约10％的CD4+细胞)，以CD25(IL-2R-α)的组成型表达为特征，且在维持耐受性和预防体内自身免疫性疾病方面，无疑具有十分重要的作用。令人惊讶的是，至今在人类体内尚未发现一种显示相同特性的细胞群体。此处，我们证实，在人类血液中，曾被认为可代表常规记忆T细胞的CD4+CD25+T细胞(Kanegane，H.等，Int.Immunol.3：1349-1356(1991)；Taka，K.等，Immunol.，72：15-19(1990)；Jackson，A.L.等，Clin.Immunol，Innunopathol.54：126-133(1990))实际看来就是独特的CD4+CD25+调节性T细胞的准确的人类的对应物，该T细胞是已知的，并于啮齿动物中进行了多年的研究。我们可以从成人血液中分离出相当量的CD4+CD25+T细胞(平均占CD4+T细胞的6％)，因而可以着手具体的研究，并与CD4+CD25-T细胞进行比较。这证明人类细胞与鼠CD4+CD25+免疫调节性T细胞共有关键表型和功能性的特征。最令人感兴趣且以前未识别的表型特征是：已经由人类CD4+CD25+T细胞组成型表达(细胞内高水平，细胞表面为低水平)的CTLA-4分子(CD152)，在经由TCR刺激后被进一步正调节，并维持高的表面水平至少长达一周(与下列文献所述的、受激后重新表达CTLA-4，并且仅维持非常短暂时间的CD4+CD25-T细胞形成鲜明对比(Thompson，C.B.，Allison，J.P.，Immunity，7：445-450(1998)；Chambers，C.A.等，Immunol.Rev.153：27-46(1996))。CD4+CD25-表达CTLA-4的模式已经证明了其与鼠CD4+CD25+调节性T细胞的关系，因为这些细胞组成型表达的CTLA-4是其体内抑制活性所必需的分子。(Read，S.等，J.Exp.Med.192：295-302(2000)；Salomon，B.等，Immunity，12：431-440(2000))。人类CD4+CD25+T细胞与其鼠类对应物相似，受刺激后几乎没有增殖，既不响应通过与培养板结合的抗CD3+抗CD28的多克隆活化作用，也不响应最有效的自然免疫刺激性细胞，即成熟(异源)DC的(甚至反复性地)刺激作用。当这些刺激物与高剂量的IL-2(500U/ml)联合使用时，如下面所引文献所述，无反应性在小鼠中被部分逆转(Thornton，A.M.，Shevach，E.M.，J.Immunol.，164：183-190(2000))。新的发现是高剂量的IL-15(50-100ng/ml)诱导相当的增殖，而且甚至较低剂量的IL-2和IL-15(分别为10U/ml和10ng/ml)的联合作用也有强烈的协同作用，并诱导有活力的增殖。这一点可能是重要的，因为对潜在的治疗应用，及为进一步更为具体的研究(包括机制的和分子的)，而针对这些细胞的克隆化而言，CD4+CD25+T细胞的增殖都是至关重要的。令人感兴趣的是中和抗IL-10 mAb无法促进增殖，这表明这些细胞释放IL-10不以自分泌方式引起无反应性。在共培养实验中，CD4+CD25+T细胞表现出另一种关键特征，即只能经由它们自己的TCR活化，才以依赖接触和剂量，但不依赖细胞因子的方式抑制CD25-CD4+或CD8+T细胞的增殖。我们的间接体内系统还不允许我们研究该抑制作用是否如最近利用TCR转基因小鼠显示的完全抗原非特异性(Thornton，A.M.，Shevach，E.M.，J.Immunol.，164：183-190(2000))。不过，通过采用我们用于增殖这些细胞的IL-2+IL-15方法，研究各自的机制是可能的。
最值得注意的是一份最近的报告显示：具有调节特性、实质上与我们从人类血液中间接体内分离出的CD4+CD25+T细胞表型一致的T细胞，可通过人类原初T细胞与未成熟DC的反复刺激于体外产生(Jonuleit，H.等，J.Exp.Med.，192：1213-1222(2000))。在小鼠中，CD4+CD25+调节性T细胞群体在胸腺中是持续产生的(Itoh，M.等，J.Immunol.162：5317-5326(1999))，然而，外周调节性T细胞的维持需要组织特异性抗原和IL-2(25，26)的存在。基于两个补充发现(Jonuleit，H.等，J.Exp.Med.，192：1213-1222(2000))，的确引人推测，通过摄取凋亡抗体，取样外周组织的未成熟DC(Steinman，R.M.等，J.Exp.Med.，191：411-416(2000)；Roncarolo，M.G.等，J.Exp.Med.193：F5-F9(2001))，和目前通用或组织特异性自身抗原，是迁移出的胸腺调节性T细胞的存活和可能的轻微增殖的原因。相信间接体内分离的CD4+CD25+调节性T细胞的存活可通过未成熟DC的相互作用被促进，并且最近报告的在体外通过未成熟DC从原初T细胞中CD4+CD25+T细胞的“产生”(Jonuleit，H等，J.Exp.Med.，192：1213-1222(2000))可能更代表在初始接种体中已存在的CD4+CD25+的存活的维持。也应当指出，间接体内分离的人类CD4+CD25+T细胞与同源成熟DC的相互作用不足以激活它们的抑制特性，而异源成熟DC为调节作用的有效诱导物。该观察结果再度提示可进行试验的假设。例如，相对于成熟同源DC，未成熟DC能激活CD4+CD25+T细胞(表明它们携带一些用于相互作用的特定配体)，或者仅在摄取凋亡体后激活CD4+CD25+T细胞(表明需要存在自身抗原)吗？此外，呈递标称回忆抗原(nominalrecall antigens)的成熟DC(如流感蛋白质/肽)于CD4+CD25-T细胞群体和CD4+CD25+T细胞群体中均刺激T细胞，这表明除了自身抗原以外，外源抗原的识别也可于炎性位点触发调节。
总之，在正常人类成人的外周血液中存在着相当大群体(～6％)的CD4+CD25-T细胞，与以前的观念相比，它们不代表常规记忆性T细胞，而是调节性T细胞，这种调节性T细胞与在啮齿动物中已经研究多年的CD4+CD25-“专业的”抑制性/调节性T细胞的独特群体相当。现在，人类CD4+CD25+调节性T细胞的识别与特征化使得我们可以在多种疾病病症中对其监控，并且对理解和治疗自身免疫性，移植排斥，和癌症具有重要的意义。
通过以下附图和实施例进一步解释本发明，不过这些附图及实施例并不对本发明构成限制：
附图
图1：CD4+CD25+T细胞表现出明显与CD4+CD25-T细胞不同的表型。通过负MACS分类从PBMC中分离出CD4+T细胞，并产出高度纯化的未接触的CD4+T细胞。这些细胞由抗CD25磁珠标记并分类。
(A)：分类得到基本上纯的CD25+T细胞。该附图显示了从20次独立标准试验中得到的代表性结果。
(B)：采用如“材料与方法”中描述的方法分析CD4+CD25+、CD4+CD25-和活化的CD4+CD25-T细胞的表型。另外，采用固定化的抗CD3+可溶性抗CD28活化CD4+CD25-T细胞。活化后，细胞由抗CD25磁珠标记并分类。五次独立试验的结果相似。
(C)：采用抗CTLA-4抗体于37℃将CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞染色2h。在固定化抗CD3+可溶性抗CD28活化后的不同时间点，于体外进行该染色步骤。该附图显示了4次独立试验中的一个代表性结果。
图2：CD4+CD25+T细胞对异源和多克隆刺激均无增殖/无反应性，通过添加IL-2和/或IL-15可部分逆转，但添加中和抗IL-10抗体则无法逆转。
(A)：如图1通过MACS分类从成人血液中分离CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞。采用不同数目的成熟异源DC刺激1×105个T细胞/96孔。通过[3H]Tdr掺入测定T细胞(一式三份培养物)的增殖。6次独立实验的结果相似。
(B)：用如(A)描述的步骤处理全部CD4+、CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞。通过[3H]Tdr掺入测定三份培养物的增殖(该图显示的是5次独立实验的代表性结果)。
(C)：采用来自相同供体的成熟异源DC每周接触和再刺激经MACS分类的CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞(DC∶T细胞比例为1∶20)。通过[3H]Tdr掺入测定增殖(1×105个T细胞/96孔)。3次独立实验获得相似结果。
(D)：采用固定化抗CD3(10μg/ml)和可溶性抗CD28(10μg/ml)[上框]，或者如(A)所述的采用成熟异源DC[下框]刺激CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞。于培养开始时分别加入500U/mlIL-2、100ng/mlIL-15、10U/mlIL-2+1ng/mlIL-15的混合物或10μg/ml抗IL-10。培养5天后测[3H]Tdr的掺入。该图显示了3次独立实验中的一次。无多克隆或异源T细胞刺激物的情况下，加入IL-2和/或IL-15，在CD25+或CD25-T细胞亚型中不会诱导有意义的增殖(数据未显示)。
图3：如果由TCR刺激，CD4+CD25+T细胞将以依赖细胞接触和依赖剂量方式抑制CD4+和CD8+T细胞的活化
(A，B)：将经由MACS分类的总CD4+(A)和CD8+(B)T细胞(105个T细胞/96孔)按图示比例加入到CD4+CD25+T细胞中，并以DC/CD4+或CD8+T细胞1∶20的比例，采用异源DC刺激。5天后通过[3H]Tdr掺入测定增殖。该图显示了5次独立实验中的一次。
(C)：从相同供体(供体I)产生/分离DC和CD4+CD25+T细胞。另外，从另一供体(供体II)分离全部的CD4+T细胞和CD4+CD25+T细胞。将105个全部CD4+T细胞/96孔与5×103个DC/孔一起培养(即DC∶T＝1∶20；在DC∶T＝1∶100时结果是可比较的，该结果未显示)。然后分别加入来自供体I和供体II的CD4+CD25+T细胞。培养5天后，通过[3H]Tdr掺入测增殖。3次独立实验的代表性结果显示为三份培养的平均cpm值。
(D)：采用5×103个异源成熟DC刺激全部的CD4+T细胞或CD4+CD25+T细胞(105个T细胞/96孔)(DC∶T＝1∶20)(上部两框)。另外，全部的CD4+T细胞与CD4+CD25+T细胞以1∶1的比例共培养(105个T细胞/96孔培养板)，并于10μg/ml抗IL-10、2μg/ml TGF-β、500U/mlIL-2、50ng/mlIL-15或者10U/mlIL-2与1ng/mlIL-15的混合物存在或不存在的情况下再次由异源DC以DC∶T为1∶20的比例进行刺激。在平行Transwell方法中，在一个Transwell室中，由异源DC(DC/T细胞比例为1∶20)刺激CD4+CD25+T细胞，并将全部CD4+T细胞响应物再次与异源DC一起置入孔内，DC∶T比例为1∶20。通过[3H]Tdr掺入测培养5天后的增殖。该图显示了4次代表性实验中的一次结果。
图4：CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞的不同细胞因子廓型(profiles)。
(A)：采用PMA(20ng/ml)和A23187 Ca2+离子载体(500μg/ml)刺激经MACS分类的CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞6h。后5h加入莫能菌素(2μM)。进行CD3表面表达的染色。将细胞洗涤、固定、透化并染色，以采用FITC结合或PE结合的特异抗体检测细胞内细胞因子。该图显示了具有相似结果的5次独立实验中的一次。当T细胞由与培养板结合的抗CD3+可溶性抗CD28AB刺激时，结果是一样的(未显示)。
(B)：采用与培养板结合的抗CD3+可溶性抗CD28活化CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞。培养48h后，通过核糖核酸酶保护分析进行RNA表达分析。
(C)：通过ELISA测定上清液中的细胞因子(该图显示5次独立实验中的一次)。
材料与方法
培养基：将补充有1％热灭活的自身血浆、20μg/ml艮他霉素(Merck)和2mM谷氨酸盐(Bio Whittaker)的RPMI1640(BioWhittaker)用于树突细胞(DC)的增殖，将补充有1％热灭活单供体人类血清、20μg/ml艮他霉素(Merck)和2mM谷氨酸(Bio Whittaker)的X-VIVO-20(Bio Whittaker)用于T细胞培养。
细胞因子：所有用于该研究的细胞因子均为重组人类蛋白质。最终浓度为：GM-CSF 1,000U/ml(LeukomaxTM；Novartis)，IL-4 800U/ml(Sandoz)，IL-2(Proleukin；Chiron Corp.)和IL-15(Pepro Tech)以指示浓度使用；对DC的成熟而言，我们采用含有IL-1β2ng/ml(Sigma)、IL-6 1000U/ml(Sandoz)、TNF-α 10ng/ml(Bender，Vienna)、及PGE21μg/ml(Sigma)的混合物(cocktail)。
抗体：对免疫染色而言，应用的是抗CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD19、CD25、CD28、CD45 RA、CD45 RO、CD56、CD62L、CD80、CD83、CD86、CD95、CD95L、CD122、CD152、CD154、HLA-DR的PE-和FITC结合抗体(Ab)(均来自BD Pharmingen)，及各自的小鼠和大鼠同种型对照。用于细胞内细胞因子染色的抗体是FITC-和PE-结合抗IL-2(MQ1-17H12)、抗IL-4(8D4-8)、抗IL-10(JES3-19F1)和抗IFN-γ(4S，B3)，均来自BD Pharmingen。未结合抗IL-10(JES3-19F1)(Pharmingen)和抗TGF-β(R&D Systems)被用于中和实验。抗CD3(UCHT1)和抗CD28(CD28.2)用于T细胞的多克隆激活。
细胞因子分析：由异源DC，或由X-VIVO-20+1％血清中的与培养板结合的抗CD3(10μg/ml)+可溶性抗CD28(10μg/ml)刺激T细胞。通过采用适用于人类IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β(BD Pharmingen)的市售ELISA试剂盒对上清液进行分析的方法，于不同时间点进行细胞因子分析。对细胞内细胞因子产生而言，T细胞由PMA 20ng/ml和Ca2+离子载体A23187 500μg/ml(均来自SIGMA)刺激6小时，或由培养板结合抗CD3和可溶性抗CD28 Ab刺激6小时。于培养最后4小时加入2μM的莫能菌素(SIGMA)。收集、洗涤、固定并皂苷透化细胞(Fix/perm溶液，BD Pharmingen)，并由细胞因子特异Ab或同种型进行染色。
对细胞因子mRNA分析而言，T细胞是由与培养板结合的抗CD3和可溶性抗CD28 Ab刺激。通过核糖核酸酶保护分析模板装置(BDPharmingen)分析细胞。
细胞分离和DC生成：如(18，19)所述，DC产生自血沉棕黄层，或除去白细胞后的产物中(均获得自the Department of Transfusionmedicine，经健康供体同意后获得)。简言之，通过Ficoll密度梯度离心分离PBMCs。通过塑料吸附分离单核细胞，并将其培养在补充有IL-4和GMCSF的RPMI培养基中。第6天，加入一种成熟混合物(IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα)。第7天，收获未吸附细胞，并且构成对协同分子(CD80、CD86)和CD83而言，为＞90％双阳性的成熟DC。
采用阴性CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)从PBMC中分离CD4+T细胞。采用CD25 Microbeads(Miltenyi Biotech)从纯的、未接触的CD4+T细胞中分离CD4+CD25+T细胞。采用阴性CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)进行CD8+T细胞的分离。纯度由FACS评定。
流式细胞仪分析：为进行免疫荧光检验，将染色细胞洗涤，再采用每种Ab的最优稀释液于4℃将其染色20min。再次洗涤细胞，并通过流式细胞仪(FACS ScanTM和CELLQuestTM软件；Becton Dickinson)分析。为进行细胞表面CD152表达的分析，细胞需经恰当的抗体于37℃染色2小时。
增殖分析：为评估不同CD4+亚型的增殖，于96孔培养板中的、含有不同数目的DC或不同浓度的与培养板结合的抗CD3+可溶性抗CD28的X-VIVO-20中培养105个分类T细胞。为评估调节特性，需在96孔培养板中，采用5×103个(有些实验中也可采用1×103)DC培养105个CD4+T细胞。加入不同浓度、已纯化的CD4+CD25+或CD4+CD25-T细胞。培养4～5天后，加入[3H]Tdr(37KBq/孔)并继续培养16h。采用液体闪烁记数器测定增殖。
Transwell实验：于24孔培养板中进行Transwell实验。采用5×103个DC刺激106个CD4+T细胞。另外，既可将106个CD4+CD25+或CD4+CD25-T细胞直接加入培养物中，也可将其置于Transwell室(Millicell，0.4μm；Millipore)中。共培养5天后，将一式三份的T细胞转移至96孔培养板中(105个细胞/孔)。经[3H]Tdr 16h的脉冲标记后，采用液体闪烁计数器测定增殖。
实施例
实施例1：CD4+CD25+T细胞对异源和多克隆刺激均显示增殖减少响应。
低增殖潜力是在鼠科系统中，被很好地特征化的调节CD25+CD4+T细胞的一个显著的特性(Sakaguchi S.等，J.mmunol.，155：1151-1164(1995))。为分析人类CD4+亚群的增殖能力，将CD4+T细胞根据其CD25的表达进行磁性分类。通过采用MACS CD4阴性选择试剂盒，并且随后进行CD25阳性选择，获得了超过95％纯度的CD4+CD25+T细胞群体(图1A)。这些细胞包括了约6％(2.8-17.2％，n＝20)的，存在于我们所研究的健康成人的血液中的外周CD4+T细胞。
成熟DC是已知的最有效的抗原呈递细胞(Bancherau，J.，Steinman，R.M.，Nature，392：245-252(1998))。然而，与CD4+CD25-T细胞(图2A，B)、或整个CD4+群体(图2B)形成对比，当体外采用充分成熟异源DC刺激时，CD4+CD25+T细胞实质上不显示增殖响应。有趣的是，与整个CD4+群体相比，当采用异源DC刺激时，除去了CD25+T细胞的CD4+群体(图2B)显示出较高的增殖。
接着确定了CD4+CD25+T细胞是否可能仅通过成熟DC反复刺激而增殖。再刺激后，CD25-T细胞的增殖响应稍微增加，然而CD25+T细胞的响应仍然很低(图2C)。通过异源成熟DC激活(priming)和再刺激，在2个循环的再刺激后引起CD25-群体30～50倍的增殖。相反，CD25+群体无明显的增加(数据未显示)。反复刺激后，在明显缺乏凋亡或坏死的情况下，收获了与初始接种体相比绝对数目有轻微(～10％)减少的CD4+CD25+T细胞(数据未显示)。
当这些细胞群体经由与培养板结合的抗CD3+可溶性抗CD28多克隆刺激时，CD4+CD25+T细胞的极低增殖响应也是明显的。为验证T细胞生长因子IL-2和IL-15是否能影响增殖潜力，将二者以不同剂量加入到CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞中，这些T细胞已经用固定化抗CD3+可溶性抗CD28(图2D，上框)，或用成熟异源DC(图2D，下框)进行了刺激。一系列试验研究显示IL-2仅在高剂量(100-1000U/ml)下增强CD25+T细胞的增殖。IL-15有相似的效果，也仅在50-100ng/ml的高剂量下增强CD25+T细胞的增殖。当两种细胞因子混合使用时，它们具有强的协同效应，并且10U/mlIL-2加10ng/ml IL-15的剂量就足以促进CD4+CD25+T细胞的增殖。在不存在多克隆或异源T细胞刺激物的情况下，加入IL-2和/或IL-15，在CD25+或CD25-T细胞亚型中不引起明显的增殖(数据未显示)。
实施例2：CD4+CD25+T细胞表现出与CD4+CD25-T细胞明显不同的表型。
为进一步特征化CD25+CD4+T细胞群体，将CD4+CD25+、CD4+CD25-不同表面分子的表达，与受激的CD4+CD25-T细胞不同表面分子的表达(图1B)相比较。三个群体均显示CD3和CD4的同源表达。通过FACS分析检测不到污染细胞，如单核细胞、B细胞、CD8+T细胞或NK细胞(数据未显示)。无预先刺激，即间接体内，CD25+群体高水平表达细胞内，低水平表达细胞表面CTLA-4(CD152)。间接体内分离的CD4+CD25+T细胞进一步组成型表达CD122(IL-2Rβ链)、HLA-DR(～50％)，并组成CD45RO细胞的主要成分(～80％)，该CD45RO细胞类似一种记忆T细胞表型。形成鲜明对比的是，间接体内分离的CD4+CD25-T细胞不表达CTLA-4(既不在细胞内，也不在细胞表面)、CD122、或HLA-DR，并且更多的细胞表达CD45RA而不是表达CD45RO。然而在用培养板结合抗CD3+可溶性抗CD28激活后，正如所预期的，大部分CD4+CD25-优势地成为CD25+(CD25表达水平与CD4+CD25+T细胞相比，约高出1log，数据未显示)，并且显示高水平的HLA DR和CD122(与CD4+CD25+T细胞相比，也约高出1log)。另外，如预期的，细胞内和表面CTLA-4均于24～48h内被正调节，但其后被迅速地负调节(图1C)。当CD4+CD25+T细胞受激后，CTLA-4/CD152表达的动力学显示出显著的差异。这些细胞也正调节其(已经组成型存在但水平很低)CD152的表面表达，然而CD152的强表达仍保持不变超过1周(图1C)。用其它一些诸如抗CD28、CD62L、CD69、CD95、CD95L、CD154(CD40L)的mAb染色，在CD4+CD25+与CD4+CD25-T细胞之间不显示出可重现的和显著的差异。
实施例3：如果通过TCR刺激CD4+CD25+T细胞会以细胞接触和剂量依赖的方式抑制CD4+和CD8+T细胞的活性。
为分析CD25+T细胞的推定的调节特性，进行了协调培养试验。在首个系列的试验中，我们从特定供体分离出了CD4+总群体和CD25+及CD25-片断。然后将全部的CD4+T细胞与CD4+CD25+或CD4+CD25-T细胞亚群体以所示比例混合，并采用异源成熟DC进行刺激(图3A)。CD4+CD25+T细胞明显抑制全部CD4+T细胞的增殖，并且在1∶1比例时实质上阻断其增殖(cpm表示CD25+T细胞增殖的本底水平，见图2A-D)。加入CD25-T细胞替代CD25+T细胞轻微地加强增殖(未显示)。由于CD4+CD25-在多克隆(见图1B)以及异源DC的刺激下，迅速表达CD25和CD122，即IL-2R的双链(数据未显示)。这个发现表明CD4+CD25+T细胞亚型的抑制活性不是简单地由于通过它们的IL-2R对IL-2的消耗或被动吸收。CD4+CD25+T细胞在全部CD8+T细胞上发挥了抑制活性虽然负调节不够强烈(图3B)。
在一组进一步的试验中，确定了同源DC对CD4+CD25+T细胞的活化作用，对它们的调节特性的诱导是否足够。为此目的，将成熟DC和CD4+CD25+T细胞从相同供体(供体I)中产生/分离出来。另外，从另一供体(供体II)中分离出全部CD4+T细胞及CD4+CD25+T细胞亚型。然后在缺乏(图3C，仅为CD4+)或存在从供体I或供体II中分离出的、不同数目的CD4+CD25+T细胞的情况下，采用异源成熟DC(供体I)刺激全部CD4+T细胞(供体II)(图3C)。当采用异源的、来自供体I的DC刺激时，获得自供体II的全部CD4+T细胞如预期一样旺盛地增殖(图3C，仅CD4+)。在供体I来源的CD4+CD25+T细胞存在的情况下(即与所用DC同源)，获得自供体II的全部CD4+T细胞的增殖(即同种反应性)根本不受抑制(图3C)。然而，当加入供体II来源的CD4+CD25+T细胞(即与所用DC异源)会发生潜在的抑制作用(图3C)。抑制作用也可在有分别来源于三个不同供体的DC、全部CD4+T细胞、CD4+CD25+T细胞的实验中观测到。这些数据表明为使CD4+CD25+T细胞发挥调节作用，需要TCR介导的CD4+CD25+T细胞激活，也表明同源DC不足以诱导它们的抑制活性。
下一步，为了研究CD4+CD25+T细胞的调节功能是否主要通过可溶性因子介导或者需要细胞间接触，进行了Transwell室实验(图3D)。如图3D所示，在异源DC存在的情况下，CD4+CD25+T细胞几乎完全地抑制全部CD4+T细胞的增殖。在Transwell室中两种群体的分离，实际上破坏了它们的抑制效应。这些观测结果提示：直接的细胞接触对于CD4+CD25+T细胞的抑制能力是必要的，因为Transwell室的半透膜允许可溶性因子自由通过，却排斥直接细胞接触。Transwell实验也证明通过CD4+CD25+T细胞的IL-2的消耗不是造成抑制的机理。
尽管调节性细胞和响应细胞之间的密切接触是明显需要的，但是通过Transwell实验既不能排除抗原呈递DC的定向也不能排除可溶性因子的作用。因此，与培养板结合的抗CD3 Ab(与可溶性抗CD28 Ab结合)也被用作为一种不依赖抗原呈递细胞的和多克隆T细胞刺激物。在这种刺激下，单独的全部CD4+T细胞显示了强的增殖。如上文所述(图2D)，CD4+CD25+T细胞不增殖。在两种群体的共培养中，与对照相比在比例为1∶1时至少有75％的降低(数据未显示)。这些数据提示，该调节作用不是主要通过APC功能的调节而发生的。细胞因子IL-10和TGF-β的中和抗体(分别对所谓的Tr1和Th3的抑制活性是关键性的(Groux，H.等，Nature，389：737-742(1997)；Fukaura，H.等，J.Clin.Invest.，98：70-77(1996))不破坏CD4+CD25+T细胞的调节活性，这证明这些细胞因子至少在我们着眼的分析中不扮演主要的抑制角色。以高剂量将IL-2和/或IL-15加入到共培养物中，促进了CD4+CD25+T细胞的增殖(见图2D)，降低了它们的抑制作用。然而，抑制活性很可能并没有被破坏，因为说明数据时必须将CD4+CD25+T细胞的显著增殖考虑在内。
实施例4：CD4+CD25+T细胞占优势地分泌IL-10
为了分析并比较细胞因子特征，采用与培养板结合的抗CD3+抗CD28激活刚刚分选的CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞。然后通过ELISA分析上清液，并且通过核糖核酸酶保护分析研究RNA表达。另外，进行细胞内细胞因子染色，以测定释放一定细胞因子的细胞的百分数。如图4所示，CD4+CD25-T细胞占优势地分泌IFN-γ和IL-2，少量分泌IL-10和IL-4，类似Th1样特征。另一方面，CD4+CD25+T细胞中占优势地分泌IL-10，并且仅分泌低水平的IL-2、IL-4及IFN-γ，类似Tr1细胞。两种亚群体在RNA水平上的比较表明：与CD25-T细胞相比，CD25+T细胞表达更多的IL-10，较少的IFN-γ，类似水平的IL-2mRNA。在CD4+CD25+T细胞占优势地发现IL-1受体拮抗物(IL-1Ra)mRNA，而显著的IL-1βmRNA水平仅存在于CD4+CD25-T细胞中。在两种细胞类型中，TGF-β以类似的低水平表达。
实施例5：激活的并随后固定的CD4+CD25+T细胞仍然显示调节能力。
通过所述的MAC分选方法，从来自成人血液的全部CD4+T细胞中分离出CD4+CD25-和CD4+CD25+T细胞。将CD4+CD25+T细胞分为三份。其中一份由10μg/ml与培养板结合的抗CD3和10μg/ml可溶性抗CD28抗体活化过夜。第二天，将该部分与另一部分未活化CD4+CD25+T细胞用2％甲醛固定1小时。第三部分不进行处理。洗涤细胞三次。
单独的未固定CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞，及每一部分的CD4+CD25+T细胞与CD4+CD25+T细胞以1∶1的比例混合后得到的混合物，均采用固定的抗CD3和可溶性抗CD28活化。5天后，通过[3H]Tdr掺入法测定增殖。图5显示的是5次独立实验中的一个代表，图中符号意义如下：
CD4+CD25-未固定的CD4+CD25-细胞
CD4+CD25+未固定的CD4+CD25+细胞
Reg.1∶1未固定的CD4+CD25+与CD4+CD25-T细胞以1∶1混合
Reg.1∶1
CD25+stim fix活化的固定CD4+CD25+T细胞和未固定的CD4+CD25-T细胞以1∶1混合
Reg.1∶1
CD25+fix未活化的固定CD4+CD25+T细胞与未固定的CD4+CD25-T细胞以1∶1混合