一种高温β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途 【技术领域】
本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说，本发明涉及一种编码嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4的β-葡萄糖苷酶DNA序列，还涉及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)可以催化水解多种β葡萄糖苷键，具有底物广谱性。在医药、食品、调味品、能源等工业具有重要应用价值。如在酒精发酵工业，从纤维素质农业废弃物生产酒精成为目前人们关注的热点[Bothast等，现代应用微生物学(Adv.Appl.Microbiol.)44：261-286，1997；Pemberton等，加拿大化学工程杂志(Can.J.Chem.Eng.)58：723-729，1980]。利用生物酶转化纤维素为葡萄糖，需要三种酶协同作用，包括：纤维素酶(EC3.2.1.4)、外切纤维素酶(EC3.2.1.91)、和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。纤维素酶(EC3.2.1.4)、外切纤维素酶(EC3.2.1.91)协同作用于纤维素产生纤维二糖，之后纤维二糖被β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)水解为葡萄糖。通常纤维二糖抑制纤维素酶对纤维素的降解，而β-葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖从而解除其对纤维素酶的抑制作用，因此β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中起重要作用。
β-葡萄糖苷酶已从不同的微生物中分离，如Aspergillus[Kwon等，FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)97：149-154，1992]，Humicola[Peralta等，FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)146：291-295，1997]，Fusarium[Christakopoulos等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)224：379-385，1994]，Volvariella[Cai等，应用和环境微生物学(Appl Environ Microbiol)65：553-559，1999]，Candida[Christopher等，应用和环境微生物学(Appl EnvironMicrobiol)61：518-525，1995].具有一定热稳定性的β-葡萄糖苷酶主要来自嗜热菌，如Sulfolobus solfataricus[Aguilar等，分子生物学杂志(J Mol Biol)，271：789-802，1997]，Pyrococcus furiosus[Kengen等，欧洲生物化学杂志(EurJ Biochem)213：305-312，1993]，Thermotoga maritime[Gabelsberger等，FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)，109：131-138，1993]，Thermosphaeraaggregans[Chi等，FEMS通讯(FEBS Letters)，445：375-383，1999]，Clostridium thermocellum[Ait等，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)128：569-577，1982]。
关于β-葡萄糖苷酶基因已有专利和文献报道。如：Dion等报道了Thermus thermophilus的β-葡萄糖苷酶基因[糖共轭物杂志(GlycoconjugateJ)，16：27-37，1999]；Gonzalez等报道了芽胞菌Bacillus polymyxa的β-葡萄糖苷酶基因[生物化学和生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)，194：1359-1364，1993]；Wright等报道了Microbispora bispora的β-葡萄糖苷酶基因[应用和环境微生物学(Appl.Environ Microbil)，58：3455-3465，1992]；Paavilainen等报道了Bacillus circulans的β-葡萄糖苷酶基因[应用和环境微生物学(Appl Environ Microbiol)，59：927-932，1993]；Breves等报道了Thermoanaerobacter brockii的β-葡萄糖苷酶基因[应用和环境微生物学(Appl Environ Microbiol)，63：3902-3910，1997]；Lieb等报道了Thermotoga mariti的β-葡萄糖苷酶基因[分子普通遗传学(Mol Gen Genet.)242：111-115，1994]；Tonouchi等报道了Acetobacter xylinum的β-葡萄糖苷酶基因(美国专利USP6316251，2001年11月31日)。
微生物产生β-葡萄糖苷酶种类多，不同来源的β-葡萄糖苷酶具有多方面不同性质，从而导致各具特色的应用范围。因而需要持续不断地开发新特性β-葡萄糖苷酶以更好地满足工业需要。耐热酶在应用上具有很大优越性，可以提高反应速度、减少污染、增强对化学试剂的耐受力等。因此开发高温β-葡萄糖苷酶酶已成为热点。
【发明内容】
本发明提出的一种新的高温β-葡萄糖苷酶，其一级结构与已知的β-葡萄糖苷酶不同，它的特性也与已知的β-葡萄糖苷酶不同。
因此，本发明的目的是提供一种新型β-葡萄糖苷酶、及其编码结构基因、重组质粒和重组菌体，该基因表达产物β-葡萄糖苷酶在高温条件下显示活性，可应用于纤维素降解工艺和其他工业过程。同时本发明提供了一种方法，即通过分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它受体菌，由其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的β-葡萄糖苷酶。
本发明研究证明，嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)(薛燕芬等，系统与环境微生物国际杂志IJSEM，51：1335-1341，2001)在高温条件下产生高温β-葡萄糖苷酶，该酶水解纤维二糖形成葡萄糖。
本发明从嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)得到β-葡萄糖苷酶的基因，它是1578bp地DNA，编码一个由526个氨基酸组成的蛋白质。通过分子生物学方法获得了含有该基因的重组质粒，转化大肠杆菌使重组菌株表达β-葡萄糖苷酶。因此本发明同时提供了一种可能性，即通过遗传工程或分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它受体菌，由其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的β-葡萄糖苷酶。
为达到本发明的目的，实现本发明的具体技术步骤如下：从嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)中提取总DNA，利用shot-gun技术，得到所需要的DNA片段，连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌DH5 α，获得含高温葡萄糖苷酶基因的重组质粒pGLUB及重组大肠杆菌菌株DH5αGLUB。该重组菌表达高温葡萄糖苷酶活性。在可使上述β-葡萄糖苷酶基因表达的条件下培养该重组菌，经活性测定，证明该重组菌表达高温β-葡萄糖苷酶活性。该蛋白质具有高温β-葡萄糖苷酶活性，作用温度60-80℃，pH6-7，可水解纤维二糖产生葡萄糖。测序表明，目的基因含有1578bp，编码一个由526个氨基酸组成的蛋白质。
本发明涉及的β-葡萄糖苷酶是一新型的β-葡萄糖苷酶。新的β-葡萄糖苷酶的一级结构与已知的β-葡萄糖苷酶的不同，与其它已报道的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列相比，相似性小于51％。应当指出的是，对本发明的β-葡萄糖苷酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而本发明也包括与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有β-葡萄糖苷酶的活性的功能类似物。根据酶的氨基酸序列相似性，目前已知的β-葡萄糖苷酶分属于糖苷水解酶第1和3两个家族。通过对本发明涉及的β-葡萄糖苷酶基因推导的氨基酸序列比较分析，本发明涉及的β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶第3家族中的一员。
本发明涉及的β-葡萄糖苷酶可以在化工、纺织、食品、医药工业方面应用。
本发明涉及的β-葡萄糖苷酶，主要特性如下：
(1)来源于高温厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)或其它衍生菌。衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株；
(2)它的基因具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列；
(3)它具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列；
(4)具有β-葡萄糖苷酶活性，作用温度60-80℃，pH6-7，分子量59000道尔顿。
进一步按照本发明所述，本发明涉及一DNA序列，该DNA序列编码本发明涉及的β-葡萄糖苷酶，此DNA核苷酸序列：
(1)由SEQ NO.1中的DNA序列组成。
(2)编码一蛋白质，其氨基酸序列如SEQ NO.2中的氨基酸序列。
本发明涉及的DNA序列，除了编码本发明涉及的β-葡萄糖苷酶SEQNO.1外，还应当包括：编码对本发明的β-葡萄糖苷酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的DNA核苷酸序列，因而本发明也包括编码与SEQNO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有β-葡萄糖苷酶活性的功能类似物的DNA核苷酸序列。
【附图说明】
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
图1.pGLUB质粒的构建图。
【具体实施方式】
实施例1.
嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)总DNA的提取
采用从中国云南腾冲热泉分离的嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis MB4)，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mMEDTA(pH8.0)，混匀后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。β-葡萄糖苷酶基因的克隆
取前面所述的总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2-10kbDNA片段。取2μl(5μg)Sau3AI酶解DNA片段与1μl(1μg)经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pUC18DNA在20μl连接体系进行连接反应，其中含2μl(10X连接缓冲液)，1μl T4DNA连接酶，14μl水。连接体系在16℃反应16小时，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50ug/ml Amp(氨苄青霉素)，0.01％5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucopyranoside的LB固体培养基上。37℃培养16-18小时，然后在60℃培养1-5小时，菌落变蓝色的即为阳性克隆。阳性克隆在Amp-LB培养基中37℃培养16-18小时，经活性测试具有耐热β-葡萄糖苷酶活性。对阳性菌落用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片段插入质粒，其大小约为3.5kb。含该DNA片段的重组质粒称为pGLUB，含此重组质粒pGLUB的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DH5αGLUB.
此重组质粒pGLU可高频转化大肠杆菌表达β-葡萄糖苷酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜热菌MB4的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，证实重组质粒pGLUB中插入的DNA片段来自嗜热菌MB4的染色体DNA。
采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示插入片段含有一个长1578bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个由526个氨基酸组成的蛋白质。属β-葡萄糖苷酶家族，最高相似性同Clostridiumacetobutylicum的β-葡萄糖苷酶基因(51％)。
实施例2.
重组β-葡萄糖苷酶的纯化和特性
重组菌E.coli DH5αGLUB的菌体悬于50mM醋酸缓冲液(pH6.5)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组β-葡萄糖苷酶的粗酶液。此上清酶液70oC加热15分钟，离心去除变性蛋白，上清酶液经离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组β-葡萄糖苷酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为60000道尔顿，与理论上推算的分子量(59000道尔顿)相似；重组酶作用温度为60-80℃，pH6-7。
实施例3
重组β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖
向2％的纤维二糖溶液(用pH6，0.2M的磷酸钠缓冲液配制)中，加0.1V酶液，升温至60℃保温6小时。高压液相色谱法测得重组高温β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生葡萄糖。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一种高温β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其应用
<130>IM021103
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<170>PatentIn version 3.1
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<212>DNA
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Val Gly Glu Ile Ala Gly Arg Glu Leu Arg Thr Ile Gly Ile Asn Ile
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Asn Phe Ala Pro Val Met Asp Val Asn Asn Asn Pro Leu Asn Pro Val
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