收集和稳定生物样品的方法和装置发明领域
本发明涉及收集、储存、运输和稳定生物样品尤其是一个直接从病人那里得
到的全血样品的方法和装置。更具体地，本发明涉及抽真空的液体样品的容器，
其中含有一种起稳定作用的添加剂，以在收集生物样品的过程中立即稳定核酸并
抑制在储存过程中发生体外基因诱导和降解。
发明背景
样品收集容器已被普遍使用多年，用于收集和储存血样和其它体液或样品。
典型的收集容器是玻璃或塑料试管并有一个弹性塞。这些玻璃或塑料试管通常被
用于收集血样。
在试管抽真空时可利用血样收集管吸入一定体积的血样。试管可含有各种添
加剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)，它可制备血样供特定的测试。一种普通添加剂是
抗凝剂。典型的抗凝添加剂是一种柠檬酸盐或肝素缓冲水溶液。柠檬酸盐水溶液
与血样以规定量混合可决定在进行一些试验时所需的抗凝剂的量。这些装置仅被
用于血清学测试因为添加剂并不能稳定样品中的核酸。在运送过程中，不稳定RNA
分子被酶降解以致后续的RNA分离和分析变得困难。而且，机械剌激或是物理环
境的变化如，举例来讲，温度的影响或采血和运送时细胞的破坏会诱导基因转录
而使某些mRNA种类产生过量或不足。
常用的添加剂包括抗凝剂以使血样品保持一种抗凝状态，使其可被用于进行
不同的处理步骤中。例如，抗凝剂典型地用于血样，然后离心而把血分离成细胞
层。含有一种抗凝剂的这种类型样品管的一个实例公开在Smith等的美国专利
5,667,963号。
近年，在生物、医学和药学领域中有越来越多的兴趣研究基因活性和生物样
品中所得到的核酸。特别是，核糖核酸能提供广泛的遗传起源的信息和细胞功能
活性的信息。这些信息可用于临床诊断传染病，检测表达癌基因的细胞是否存在，
检测遗传疾病，监测宿主防御机制的状态，研究和诊断代谢疾病，研究药物在病
人体内对基因表达的影响，研究药物的副作用和毒性，以及确定HLA类型或其他
特殊的标记。
在把细胞破坏、把RNA释放入溶液后有很多方法用于分离RNA。另一些方法
用于保护RNA以防被内源性RNA酶所降解。然后，RNA能从DNA和蛋白中分离出来，
后者和RNA一起被增溶。溶解细胞、溶解RNA和抑制RNA酶的过程通常是逐步进
行的而不是同时进行的。已知一些溶解细胞和抑制RNA酶活性的方法是使用胍的
离液盐(chaotropic salt)。
一个常用的分离RNA的方法包括在异硫氰酸胍盐中搅匀细胞，然后依次加入
乙酸钠和酚，以及氯仿/异戊醇。离心之后，在加入乙醇后RNA从上层沉淀下来。
另外的方法包括在细胞悬液中加入热的酚，然后用酒精沉淀。
阴离子和阳离子表面活性剂可用于溶解细胞和释放细胞质RNA。这种溶解细
胞并同时把溶液中的DNA和RNA沉淀下来的方法的一个实例在美国Macfarlane的
专利5010183中得到揭示。在此过程中，使RNA不能溶解。在细胞悬液中加入2％
的表面活性剂氯化苄基二甲基正十六烷基铵溶液和40％的尿素以及其它添加剂。然
后，将悬液离心，回收不溶物粒状沉淀。把沉淀再悬浮在乙醇中并加入盐使RNA
和DNA沉淀下来。
一种分析从血液分离的RNA的方法是使用扩增的方法，包括聚合酶链反应，
以检测微量RNA的序列。分析RNA的一个困难是在RNA被核酸酶降解之前把RNA
从细胞中的蛋白和DNA分离出来。血液中存在足够量的RNA酶和其他核酸酶以破
坏未受保护的RNA。因此，这就需要使用一种能从细胞中分离出RNA而又不让核酸
酶水解RNA的方法。
当今，常规使用的血液收集方法能够收集和保留血液在一段时间之后用于分
析。这个收集装置包括一种抗凝剂以防止在储存过程中发生凝结。然而，当有机
械剌激或物理环境的变化如温度或血液采集时细胞破裂会导致一些RNA的种类被
诱导，血液中的核酸酶在储存和运输时会水解一些RNA的种类。这些分析样品之
前的操作因素会导致mRNA过低或过量表达以及最终可用分子诊断检测方法测定的
总RNA发生降解。而且，基因诱导能导致样品中RNA水平的上升，这就会引起错
误的结果。因此，在工业中就有持续的要求希望有一种改进的方法和收集血液和
其他生物样品的装置以便在基于核酸的测试中维持体内的转录状况。
发明概要
本发明涉及收集生物样品的方法和装置。更为特别的是，本发明涉及一种收
集容器和一种收集生物样品的方法以及立即使样品与一种稳定剂接触以封闭样品
中基因的体外诱导，因而维持了体内转录的情况。
因此，本发明的首要方面是提供一种收集生物样品特别是在稳定剂存在时直
接从患者中得到的全血样品的方法和装置，以在储存过程中通过抑制或阻抑样品
中的基因诱导而稳定和保存RNA。这种稳定剂存在的量能有效的稳定核酸，尤其是
RNA，并能抑制和封闭基因诱导。
本发明的一个方面是制备一个能在室温下长时间保持稳定的生物样品而很少
或者是不发生基因诱导。因此，提供了一种方法可以获得在储存过程中在室温稳
定而很少发生或不发生基因诱导的生物样品。
本发明的另一方面是提供一种抑制生物样品中的核酸基因诱导的方法和装
置，并溶解细胞、细菌、病毒和网织红细胞。
本发明的另一方面是提供一种用于接受和收集生物样品的收集容器，此容器
预先装有定量的基因诱导封闭剂。
本发明的又一方面是提供一种稳定生物样品特别是直接从患者身上收集的全
血样品以抑制或防止当样品在室温下储存时引起的基因诱导。
本发明的再一方面是提供一种稳定生物样品特别是直接从患者身上收集的全
血样品的方法，该法能抑制或防止当样品在低于室温，典型的在2℃到约8℃，或
在适于将样品存档的温度例如在-20℃到-80℃时发生的基因诱导或核酸降解。冻
结的样品可以在室温融化以分离核酸。
本发明的还有一方面是提供一种在收集生物样品时立即封闭体外基因诱导的
方法。
本发明的又一方面是提供一种已预先加入有效量的基因诱导封闭剂的抽真空
的收集容器。
本发明的又一方面是提供一种血液收集容器，该容器的内压足够低，而能将
预定体积的生物样品抽吸入容器。以收集一定量的血液，并在收集时将血样和基
因诱导封闭剂混合而通过防止基因诱导使之在室温下稳定，以便于以后对能样品
进行核酸分析。
本发明的另一方面是提供一种在含有基因诱导封闭剂和缓冲液的容器中收集
血样从而稳定血样的方法。此种基因诱导剂可以是一种去垢剂、离液盐、RNA酶抑
制剂、螯合剂、或它们的混合物。混合物的pH调整后可抑制或封闭核酸降解或基
因诱导并便于有效地回收分析物。
本发明的还有一方面是提供一种在从约pH2到约pH5并至少存在一种基因诱
导封闭剂的收集装置中稳定血液样品的方法。
本发明的各方面基本是通过提供一种收集生物样品的装置而获得的。这个装
置包括一个容器，它包含有一个侧壁，一个底壁以及一个确定内室界限的开口端
和一个关闭开口端的盖子。这个容器包括至少一种基因诱导封闭剂其量能有效地
保护生物样品和封闭或抑制体外基因诱导。这种容器预先装有稳定剂。
本发明的各方面更进一步是通过提供一种制备一种在室温下稳定存在的生物
样品的方法而达到，它所包括的步骤有：提供一个含有一个侧壁，一个底壁和一
个确定内室界限的开口端的样品收集容器，容器至少包含一定量和一定浓度的某
种基因诱导封闭剂能有效地封闭体外基因诱导以保护生物样品。生物样品获得后
立即引入容器中并与基因诱导封闭剂混合而形成稳定的生物样品。
本发明的各方面也是通过提供一种收集和稳定全血样品或其他生物样品的方
法而达到的。此方法包括提供一个样品收集容器，此容器包括一个侧壁，一个底
壁以及形成内室的一个盖子。此容器预先放有有效量的核酸稳定剂水溶液或分散
体以稳定和保护核酸和/或全血样品的转录状况。内室的压力比大气压要小。收集
容器中的全血样品是直接从患者收集的，并且血样品中混有稳定剂以形成一个稳
定的全血样品。
本发明的这些方面、优点和其他突出的特征通过附图和随后的发明的细致描
述会更加清楚。
附图简述
以下简短的描述一下附图：
图1是本发明一个实施方案中容器的剖面侧视图；
图2是显示第一个供血者mRNA含量变化的图；
图3是显示第二个供血者mRNA含量变化的图；
图4是显示第三个供血者mRNA含量变化的图；
图5是显示第四个供血者mRNA含量变化的图；
图6是显示保存五天且不加稳定剂的血样中某种白细胞介素和其他种类mRNA
数量的图；
图7是显示保存五天且不加稳定剂的血样品中的TL-8和TL-10mRNA的含量变
化；
图8是显示在室温下储存五天并加有草酸十四烷基三甲基铵和酒石酸的全血
样品中的某些种类的mRNA数量的图；
图9是一份显示图8样品中的IL-8和IL-10含量经五天的变化。
发明详述
本发明涉及一种稳定和保存生物样品从而能更精确的测定体内基因转录物数
量的方法和装置。更为特别的是，本发明涉及在收集、运输和储存过程中抑制或
封闭生物样品中基因诱导的方法和装置。在本发明的优选实施方案中，装置是一
个预先装有一定量的基因诱导封闭剂并在收集样品时立即与生物样品混合的容
器。包含的基因诱导封闭剂的量优选能有效混合和稳定生物样品的量。生物样品
优选直接从动物特别是人收集。
生物样品可以是从动物特别是患者身上抽取的体液。在一个具体实施方案中，
生物体液是全血样品。另外一些生物样品的例子包括含细胞的组分如红血细胞浓
缩物、血小板浓缩物、白细胞浓缩物、癌细胞、骨髓、吸出物、组织、细针吸出
物和宫颈样品。在另一个具体实施方案中，生物样品是体液，如血浆、血清、尿、
脑脊液和痰液。生物样品也可以是细菌和真核微生物。在一项实施方案中，生物
样品选自体液、组织、机体擦拭物和机体涂片。本发明的基因诱导封闭剂是一种
能抑制、防止或减少在生物样品储存时的体外基因诱导的适当试剂。这种试剂能
稳定生物样品如血样，以产生在室温下稳定的能抑制和防止生物样品的核酸发生
诱导转录的组合物。
在一种实施方案中，装置10是一种直接从动物中特别是患者身体中抽取血样
并能在收集时立即稳定核酸和封闭基因转录的装置。根据图示，装置10包括一个
确定小室14界限的容器12。这个实施方案阐明了容器12是一个中空试管，它有
一个侧壁16，一个封闭的底端18和一个开口的顶端20。容器12的尺寸适于收集
适当体积的生物体液。有弹性的盖子22位于武器顶端20处用以关闭容器12。更
优选的是，盖22形成的封口能有效的关闭容器12并保留生物样品在小室14中。
一个起保护作用的护罩23覆盖了盖22。
容器12可由玻璃、塑料或其他合适的材料做成。塑料材料可以是不透氧的材
料或者是含有一层不透氧的层。另一种选择是，容器12可以由一种水和空气可透
过的塑料材料做成。更好的是，小室14维持了大气压的压差，压力低于大气压。
选择小室14的压力能把预定体积的生物样品吸入小室14。典型地，生物样品通过
用针24或用此领域中所知的插管刺入盖22抽入小室14。一个合适的容器12和盖
22的实例公开在Cohen等的美国专利号5,860,937上，在此全文并入，以供参考。
容器12首选是由透明材料做成的。合适的透明热塑性材料的例子包括聚碳酸
酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇对苯二酸酯。根据所收集的生物样品的体积要求，
选择容器12的合适尺寸。在一项实施方案中，容器12有一个轴向长度大约100mm
和一个直径大约13mm到16mm的管状形状。
盖22是由一种能维持内压低于大气压并能被针头或其他插管刺入而将生物
样品引入容器12的弹性材料做成的。合适的制作盖的材料包括，如硅橡胶、天然
橡胶、苯乙烯丁二烯橡胶、乙烯丙烯共聚物和聚氯丁二烯。
容器12也包含了一种基因诱导封闭剂26以稳定血样。这种基因诱导封闭剂
26优选含有一种稳定剂的液体，其量能有效地和生物样品混合并能稳定核酸和封
闭或抑制细胞或细胞中的核酸发生基因诱导。在一个实施方案中，选择容器12的
内压和稳定添加剂26的体积，使其能对所收集的生物样品体积提供所必需的稳定
剂浓度。在优选的一个实施方案中，选择容器12的内压，使之能抽吸大约2.5ml
预定体积的生物样品进入含有能稳定该体积生物样品的有效体积的基因诱导封闭
剂26的容器12。在另一实施方案中，容器12的内压基本上是大气压。优选的是，
容器12预先由制造商填充基因诱导封闭剂并被包装成容易使用的形式。典型地，
已包装的容器是无菌的且用无菌包装材料包装。
在一个实施方案中，容器12是由对水和气体具通透性的塑料制成的。稳定剂
的水丢失是透过容器壁而蒸发，这样增加了稳定剂的浓度并减少了容器中的压力。
氧气通过管壁扩散有减少容器中真空度的作用。选择容器对水和氧气的通透性以
便在容器的所要求的保存期之内维持容器中所要求的压力差。通过平衡氧的通透
性和水的丢失来优化保存期限。容器的保存期限至少约为一年，最好更长。
基因诱导封闭剂26是至少一种有效的稳定剂的固体或水溶液或分散体，它包
含在容器中成为预先填充的容器。固体基因诱导剂可以是一种干粉或微粒如喷雾
干燥或冻干的物质。此固体基因诱导剂可以是在容器中的松散的微粒物质或是在
容器内表面上的干涂层。
基因诱导阻抑试剂26优选包含至少一种稳定剂其浓度能稳定生物样品特别
是全血样品中的核酸。典型地，基因诱导封闭剂26是一种稳定剂或稳定剂的混合
物的水溶液。此种稳定剂优选能有效地稳定DNA和RNA包括mRNA、tRNA、snRNA、
低分子量的RNA(LMW RNA)、rRNA和cRNA并能封闭或抑制在室温保存过程中生物
样品中的体外基因诱导。合适的稳定和保护核酸及/或防止基因诱导的稳定剂的例
子包括阳离子化合物、去垢剂、离液盐、核糖核酸酶抑制剂、螯合剂、季铵以及
它们的混合物。一个合适的核糖核酸酶抑制剂是胎盘RNA酶抑制蛋白。离液盐的
例子包括尿素、甲醛、异硫氰酸胍盐、盐酸胍盐、甲酰胺、二甲亚砜、乙二醇和
四氟乙酸。在其他的实施方案中，此基因诱导剂是一种有机溶剂或有机还原剂。
适当的有机溶剂的例子选自酚、氯仿、丙酮和醇类。醇类一般是低级醇。有机还
原剂的例子选自巯基醇类，二硫苏糖醇(DTT)和它们的混合物。
稳定剂也可包括处理生物样品的另外一种成份。例如，在生物样品中用于渗
透或溶解细胞的化学试剂。优选的是，稳定剂能溶解网织红细胞、细菌、红血细
胞和白血细胞。其他成分包括蛋白水解酶、酚、酚/氯仿混合物、醇类、醛类、酮
类和有机酸。
去垢剂可以是阴离子去垢剂、阳离子去垢剂或非离子型去垢剂。阴离子去垢
剂可以是，例如，十二烷基硫酸钠。非离子去垢剂可以是，例如，环氧乙烷缩合
产物，如多羟基醇的乙氧基脂肪酸酯。优选的非离子型去垢剂是聚氧乙烯山梨聚
糖单十二酸酯，它的商品名是TWEEN 20，由Sigma Chemical Co.生产。另一种合
适的去垢剂是十二烷基硫酸钠。包括的去垢剂其量能有效地溶解细胞。去垢剂也
可能形成微团以及与核酸的其他复合物以通过其他机制保护RNA和/或DNA。
在优选的实施方案中，稳定剂是一种阳离子化合物，其通式为YR1R2R3R4X，其
中Y是氮或磷；R1、R2、R3、R4独立地选自分支或非支链烷基、C6-C20芳基或C6-C20
芳烷基，且X是有机或无机阴离子。在一实施方案中，R1、R2、R3和R4独立地为
C3-C20支链烷基或是C1-C20非支链烷基。
阴离子可以是一种无机酸如HX中的阴离子，这里的X是氟、氯、溴、碘，其
中氯、溴为优选。阴离子也可以是单、二、三羧酸中的阴离子。典型地，阳离子
化合物中的阴离子选自磷酸盐、酸盐、甲酸盐、醋酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二
酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、溴化物和氯化物。
当R1、R2、R3和R4是芳基时，此芳基可独立地是如苯基、低级烷基取代的苄
基，及或是卤代苄基。在一实施方案中，R1是C12、C14或C16的烷基，R2、R3和R4
是甲基。在优选的实施方案中，Y是氮并且稳定剂是一种季铵。合适的季铵包括烷
基三甲基铵，其中的烷基有12、14或16个碳原子。一种优选的阳离子化合物是
草酸十四烷基三甲基铵。其他合适的季铵包括烷基三甲基铵，其中烷基基团有12、
14、16或18个碳原子。一般希望R1、R2、R3和R4有20或更少的碳原子，因为烷
基基团有超过20个碳原子的话可能很难溶解和保持在溶液中。适合的季铵表面活
性剂的例子公开在Macfarlane的美国专利5,728,822，在此全文并入，以供参考。
在本发明的优选实施方案中，稳定剂是一种阳离子化合物且包括一种其量能
有效稳定核酸的质子供体。已发现把质子供体添加进阳离子化合物中会增加生物
样品中阳离子化合物稳定核酸的能力。合适的质子供体的例子包括单羧酸、二羧
酸、三羧酸、脂肪族酮基二羧酸、氨基酸、无机酸和它们的混合物。在一个实施
方案中，质子供体选自烯基羧酸、C1-C6脂肪族单羧酸、脂肪族C2-C6二羧酸、三羧
酸、羟基单羧酸、羟基二羧酸、羟基三羧酸、脂肪族酮基单羧酸、脂肪族酮基二
羧酸、氨基酸和它们的混合物。合适的脂肪族羧酸的例子包括C1-C6烷基羧酸如乙
酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸、2，2-二甲基丙酸、正己酸、
正辛酸、正癸酸和十二烷酸。烯基羧酸的例子包括丙烯酸、甲基丙烯酸、丁烯酸、
异丁烯酸以及它们的混合物。
在一实施方案中质子供体的二羧酸是选自草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、
己二酸以及它们的混合物。含羟基羧酸的例子包括酒石酸和苹果酸。合适的氨基
酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以及它们的混合物。质子供
体的三羧酸可以选自柠檬酸和异柠檬酸。
在容器12中基因诱导封闭剂26的量是由容器12的内部体积，内压和吸入容
器内的生物样品的体积所决定的。在一说明性实施方案中，容器12轴向长度大约
100mm、直径大约16mm，其内压可吸入大约2.5ml的生物样品。典型的稳定添加剂
26含有每毫升载液大约50mg到大约90mg。优选基因诱导封闭剂26是一种含有大
约60mg/ml到大约80mg/ml，更优选约70mg/ml的水性介质。容器12中的稳定添
加剂26的体积是大约6到8ml，优选约7ml。
在优选的实施方案中，基因诱导封闭剂26包括能封闭或抑制体外基因诱导的
大约70mg/ml核酸稳定剂，并和从患者中直接抽取的全血样品混合。这个血样与
该液体以大约1∶2到约1∶5的比例，优选大约1∶2.5到大约1∶3.1，最优选大
约1∶2.7到大约1∶2.8的体积比混合。
稳定剂的浓度足以稳定核酸和封闭或抑制体外基因诱导。在首选实施方案中，
生物样品是全血样品。与血样混合后的稳定剂的浓度是大约45mg/ml到大约
55mg/ml，优选大约50mg/ml到大约53mg/ml，更优选的是大约51mg/ml到大约
52mg/ml。
本发明的方法是通过获得生物样品并把样品引入含有基因诱导封闭剂的容器
中来实现的。在优选的实施方案中，制备生物样品并且立即直接引入收集容器中。
在优选的实施方案中，生物样品是直接从患者抽入收集容器而没有任何中间加工
或处理步骤，从而使样品与基因诱导封闭剂立即混合以防止或抑制核酸分解。已
发现直接从患者收集生物样品，如收集全血样品时，把样品直接引入含有稳定剂
的容器能防止或减少基因转录和核酸分解，否则在与稳定剂混合之前储存样品时
就会发生上述情况。已发现在收集时或样品制备时立即把生物样品与基因诱导封
闭剂混合会减少或防止在储存生物样品过程中的体外基因诱导。
阳离子化合物是优选的稳定剂。阳离子化合物能得到在环境温度中或低于室
温时运输样品至可从样品分离核酸的实验室时仍然稳定的全血样品。这个稳定的
全血样品在低于室温时如约2℃到8℃时也可以被储存和被运输。此稳定的全血样
品也能在使它冻结的条件下储存。为了能更长地储存和存档，样品可以在大约-20
℃下保存。为了以后的核酸分离，样品可以融化和更进一步的处理。已发现为了
以后的RNA分离稳定剂能使血样品可靠地冷冻。生物样品特别是血样品在不加稳
定剂时冷冻，在融化过程中会出现核酸特别是RNA降解。在其他的实施方案中，
生物样品可以在大约0℃到大约-80℃之间储存，优选的是在大约0℃到大约-70℃。
已发现生物样品中核酸的回收和稳定化是依赖于生物样品的pH值和稳定剂
的。最终混合物的pH值的范围可以从约pH2到约pH12之间，优选的是约pH2到
pH10，更优选的是约pH3到约pH8之间。在这个范围内核酸寿命的变化将依赖于
生物样品，生物样品量和稳定剂量的比率和使用的特定的稳定剂。在此pH下稳定
的核酸的保存期限能在室温下从约24小时到几天的范围内变化。在此pH范围内
稳定的核酸的保存期限的范围在大约2℃到8℃的冰箱内可以达到几个星期。这种
稳定的核酸能冷冻存档在-20℃中或更低的温度，如-70℃到-80℃。
最终混合物的pH值将随着被稳定的生物样品而发生变化。本发明的一个实施
方案中，生物样品是全血样品，全血样品和稳定剂的混合物被调节至约pH2到约
pH5。用阳离子化合物稳定并调节至约pH2到约pH5的核酸放置在室温下几天或在
约2℃到约8℃的温度下放置几星期或冷冻存档在-20℃或更低的温度下都是稳定
的。已发现大约是在pH3.9到pH4.1之间，全血样品和稳定剂的混合物中核酸可
达到最佳的长时间稳定化。
在优选的实施方案中，收集容器中的稳定液在加入生物样品前的最佳pH值
大约在3.6到3.8之间。当把血样加入收集容器中并与稳定液混合后，最终混合
物的pH值大约为3.9到4.1。在优选的实施方案中，收集容器包括一定量的稳定
剂以便当与全血样品以血液与稳定剂大约1∶2.5到1∶3.1的体积比混合后，最
终混合物的pH值将达到约3.9到4.1。在其他生物样品中，pH应调节至恰好能稳
定混合物。例如，我们发现真核细胞培养物在约pH4到pH8之间，优选在约pH6
到pH8之间稳定。
生物样品和稳定剂的混合物能通过加入合适的缓冲液来调节pH值。有效的调
节生物样品的pH值的缓冲液的一个例子是酒石酸。在此领域中所知的其他缓冲液
和pH调节剂也能使用。缓冲液的pH值可以通过加入氢氧化钠而调节至所需范围
之内。
核酸无论是DNA或RNA都可以通过此领域中已知的各种处理方法而从稳定的
生物样品中分离出来。我们发现实验室中所用的纯化操作方案能分离核酸中的稳
定剂，从而得到纯核酸。
阳离子化合物导致样品中的细胞和病毒溶解并导致核酸以与该化合物的复合
物形式沉淀。沉淀的核酸可以通过此领域中所知的酚提取法或甲酰胺缓冲液从复
合物中抽提出来。在更进一步的实施方案中，可溶解去垢剂而使复合物解离，并
留下不溶性核酸。此化合物可以通过用浓的氯化锂溶液或其它高盐溶液如异硫氰
酸胍盐或盐酸胍盐处理复合物而使之溶解。其他分离和纯化核酸的方法公开在
Colpan等的美国专利5,990,301，在此全文并入，以供参考。
实施例1-稳定人血中的RNA
这个例子揭示血和稳定剂的比率的作用以及稳定剂浓度的作用。
本次比较准备了24个样品。每一个样品都是从2.5ml血制备的，用含有柠檬
酸钠的血液收集装置抽吸，并与含有3％(w/v)草酸十四烷基三甲基铵以及分别含
125mM和200mM的酒石酸的7.5ml稳定缓冲液混合，引入12ml聚乙烯试管。此缓
冲液的pH值分别由氢氧化钠调节至3.3、3.5和3.7。样品在室温下分别储藏25
小时和72小时。为了分离细胞中的RNA，试管以5000xg离心10分钟。弃去上清
液并用水洗沉淀一次。再用5000xg离心10分钟后，把沉淀溶于300μl的细胞溶
解缓冲液即RLT(QIAGEN GmbH)缓冲液，用360μl的水稀释再加入40μl蛋白酶K。
在55℃下用酶消化10分钟后，样品以20，000xg离心3分钟，把上清液转移入新
的试管中再加入350μl的98％乙醇。然后，以8000xg离心1分钟，使样品涂布于
含有硅胶膜的自旋柱。此自旋柱用含GITC的洗涤缓冲液样的缓冲液RW1(QIAGEN
GmbH)洗涤1次并用含乙醇的洗涤缓冲液样的缓冲液RPE(QIAGEN GmbH)洗涤两次。
然后用2×40μl不含RNA酶的水从硅胶膜洗脱RNA。所有样品都处理双份。
已分离的RNA的产量，用分光光度计测量260nm波长的光密度并按1 OD260
相当于40μg RNA/ml的浓度计算而确定。已分离的RNA的完整性是变性琼脂糖/甲
醛凝胶中使30μl洗脱液进行电泳，以溴化乙锭染色来证明的。RNA的产量列在表
1和表2中。
以上结果表明2.5ml体积的血样与含有3％(w/v)草酸十四烷基三甲基铵和分
别含有125mM和200mM酒石酸，pH3.7约是使总RNA产量和稳定性最佳的选择。在
所有的pH值下，由核糖体RNA的完整性来判断的RNA稳定性是非常好的，但是已
分离的RNA的产量当缓冲液的pH值分别调至3.3和3.5时都比当缓冲液的pH值
调至3.7时要低。然而，即使是在稳定缓冲液的pH值是3.3时得到的较低产量也
与用对照方法即用QIAamp RNA血样小试剂盒(QIAGEN目录号为52303)得到的产量
相当或稍好一点，而这种对照方法表明了每2.5ml的血样得到平均产量为6.8μg
RNA。
表1
125mM酒石酸
样品
pH
存储时间(小时)
产量(μg)
1
3.3
24
8.4
2
3.3
24
7.6
3
3.5
24
9.5
4
3.5
24
9.8
5
3.7
24
13.3
6
3.7
24
17.2
7
3.3
72
7.2
8
3.3
72
6.8
9
3.5
72
10.3
10
3.5
72
10.9
11
3.7
72
14.8
12
3.7
72
16.1
表2
200mM酒石酸
样品
pH
存储时间(小时)
产量(μg)
13
3.3
24
5.9
14
3.3
24
7.4
15
3.5
24
10.6
16
3.5
24
10.9
17
3.7
24
17.2
18
3.7
24
18.5
19
3.3
72
5.1
20
3.3
72
5.3
21
3.5
72
7.2
22
3.5
72
7.1
23
3.7
72
13.3
24
3.7
72
16.6
实施例2-Northern印迹分析
这个实例表明对从三个不同供血者身上获得的、在室温下分别储存了1小时，
24小时，48小时和72小时的血样品进行Northern印迹分析的结果。
2.5ml用含有柠檬酸钠的血收集装置抽吸的血样品与16×100mm聚乙烯试管
中含有4％(w/v)草酸十四烷基三甲基铵和200mM酒石酸的6.9ml稳定缓冲液混合。
样品在室温下分别储存1小时、24小时、48小时和72小时。为了分离细胞RNA，
这些试管以5000xg离心10分钟。弃去上清液并用水洗沉淀一次。再以5000xg离
心10分钟后，把沉淀溶解于300μl溶解缓冲液即RLT缓冲液(QIAGEN GmbH)，加
360μl水稀释并加40μl蛋白酶K。当在55℃时用蛋白酶消化10分钟后，样品以
20,000xg离心3分钟，将上清液转移入一个新试管并加入350μl的98％乙醇。
通过以8000xg离心1分钟，使样品涂布于含有硅胶膜的自旋柱。用含GITC
的洗涤缓冲液样的缓冲液RW1(QIAGEN GmbH)洗自旋柱一次，并用含乙醇的洗涤缓
冲液样的缓冲液RPE(QIAGEN GmbH)洗涤两次。然后RNA用2×40μl的不含RNA酶
的水从硅胶膜上洗脱。每一个变数制备一个样品。将2.5μg已分离的RNA加样在
变性琼脂糖/甲醛凝胶上，并在凝胶电泳之后将RNA转移到尼龙膜上。尼龙膜然后
与一个放射性标记的RNA探针杂交，此探针包含有一段IFNγ可诱导基因序列
(GeneBank登录号为L07633)，在60℃下过夜，并在60℃下用含有2×SSC/0.1％SDS
到0.5×SSC/0.1％SDS的洗涤缓冲液洗涤几遍。然后，尼龙膜使一张X-线胶片曝光。
作为对照，相同供体的RNA是在如上所述抽取血样并分析后立即用TRIzolTM LS试
剂(Life Technologies)提分离。
这些结果表明用作探针使已分离的RNA杂交的IFNγ可诱导基因的转录物水平
在整个时间中都受到了保护，表达水平没有明显的变化。此转录物水平等于
TRIzolTM LS对照。这些对照代表了在抽取血样时样品的体内条件，这是因为TRIzol
试剂含有酚并混有异硫氰酸胍盐，该试剂被认为能立即破坏细胞，使蛋白变性以
及因此能完全抑制任何生物活性。用TRIzol对照储存的样品在Northern-印迹分
析中信号强度的比较指出了在把稳定缓冲液加入血样中后，IFNγ可诱导基因的转
录物水平立即被“冻结”，且在储存过程中不再变化。
实施例3-血样收集装置与常规的EDTA试管的比较
此实例比较了本发明的收集装置与常规的含EDTA试管中RNA的稳定性。
从一个供体抽取2.5ml的血样至血收集装置中，此装置在盖有HEMOGARDTM盖
的一个16×100mm聚乙烯试管(Becton Dickinson and Company)中含有6.9ml的
稳定缓冲液(4％(w/v)草酸十四烷基三甲基铵，200mM酒石酸，pH3.7)并在与供体
静脉相连接时抽至一定的真空度以抽取2.5ml的血样。在室温下分别储存样品1
小时、1天、3天、7天和10天。
为了分离细胞RNA，试管以5000xg离心10分钟。弃去上清液并用水洗涤沉
淀一次。再以5000xg离心10分钟后，沉淀溶解于360μl含有乙酸铵的再悬浮缓
冲液中，然后加300μl的溶解缓冲液即RLT缓冲液(QIAGEN GmbH)，和40μl的蛋
白酶K。在55℃下用蛋白酶消化10分钟后，样品以20,000xg离心3分钟，把上
清液转移入新的试管中并加350μl 98％乙醇。然后样品以8000xg离心1分钟涂布
于含硅胶膜自旋柱。此自旋柱用含GITC的洗涤缓冲液样的缓冲液RW1(QIAGEN GmbH)
的洗涤一次，并用含乙醇的缓冲液样的缓冲液RPE(QIAGEN GmbH)洗涤两次。
消化可能和小量RNA一起共纯化的残余基因组DNA是在硅胶膜上并根据无RNA
酶的DNA酶试剂盒(QIAGEN GmbH目录号为79254)的操作手册的指导进行的。RNA
从硅胶膜上用2*40μl的洗脱缓冲液洗脱。所有的样品用双份进行处理。为了分析，
洗脱液按1∶125稀释然后通过实时TaqMan RT-PCR分析1μl已稀释的洗脱液。由
应用生物系统公司(ABI)发展起来的分析方法对GAPDH基因的mRNA进行扩增。在
TaqMan RT-PCR扩增时每一个样品都分析双份。
作为对照，同一个供体的血样用Becton Dickinson Vacutainer EDTA试管抽
吸并如上所述储存在这种试管中相同时间。1ml的储存的血样在每一个时间点用
TRIzolTM LS试剂(Life Technologies)分离RNA。随后根据专门用于RNA(clean up)
的RNeasyTM Mini方案(QIAGEN目录号为74103)对已分离的RNA进行提纯。用2×
40μl无RNA酶的水洗脱RNA。按1∶50的比例稀释洗脱液以补偿在用TRIzol方法
处理时造成的样品与在样品管中2.5ml的血样相比时的体积过低。这些样品也是
用应用生物系统公司(ABI)的GAPDH TaqMan RT-PCR系统来分析的。
表3说明了人血样中细胞RNA稳定性的结果。实时RT-PCR的结果表明在未受
保护的EDTA血样中，转录物水平随着时间而下降(由在TaqMan分析中ct值增加
说明)在7到10天后降解程度达到不再能检出mRNA。另一方面，在受保护样品中
GAPDH mRNA不显示拷贝数的下降，这考虑了TaqMan的分析存在±1ct值的误差
范围。在此误差范围内，ct值的所有变化都被认为是扩增系统正常的波动且没有
明显的降解。这个结果清楚地表明了新发展起来的血样收集装置比EDTA血样收集
试管有优势并且还说明RNA的稳定性是对样品材料进行分子分析的先决条件。
表3
在室温下储存
NA稳定装置/ct值
平均值/ct
EDTA管/ct值
平均值/ct
1小时
33.38
31.48
30.17
30.58
|
31.42
29.63
31.06
32.29
30.06
30.24
1天
31.28
30.11
30.18
31.26
|
28.62
29.35
30.34
33.2
30.19
32.32
3天
31.27
30.91
33.33
36.32
|
31.92
32.37
30.15
40
30.3
39.58
7天
33.03
32.58
40
38.4
|
31.16
39.01
34.21
37.67
31.9
36.12
10天
34.2
32.58
40
38.97
|
32.47
40
32.36
38.38
31.29
37.48
实施例4-全血样品中基因组DNA的稳定性
也可能从稳定的血样中分离基因组DNA。用含有柠檬酸钠的血收集装置抽取
2.5ml的血样并与装在16×100mm聚乙烯管中的含有4％(w/v)草酸十四烷基三甲基
铵和200mM的酒石酸的6.9ml稳定缓冲液混合。样品在室温下分别储存24小时和
72小时。为了分离基因组DNA，把试管以5000xg离心10分钟。弃去上清液并用
水洗沉淀一次。再以5000xg离心10分钟后，沉淀溶解于300μl含有EDTA和氯化
钠的缓冲液和400μl的溶解缓冲液，即AL(QIAGEN GmbH)缓冲液，并加入20ul蛋
白酶K。当在65℃时用蛋白酶消化10分钟后，加入420μl的98％乙醇。然后将样
品以8000xg离心1分钟涂布于含有硅胶膜的自旋柱上。用含盐酸胍的洗涤缓冲液
样的缓冲液AW1(QIAGEN GmbH)洗涤自旋柱一次，并用含乙醇的缓冲液样的缓冲液
AW2(QIAGEN GmbH)洗涤一次。然后用300μl的tris缓冲液洗脱硅胶膜上的DNA。
用溴化乙锭染色的0.8％琼脂糖/TBE凝胶来分析5μl的洗脱液。用分光光度计
测量260nm波长的光密度并胺1 OD260相当于50μgDNA/ml的浓度来计算已分离
的DNA产量。在室温下储存24小时和72小时后，分离的基因组DNA是高分子量
的。主带的迁移超过20kb。产量是每2.5ml血样中有47到80μg，此结果是在这
一数量的血样所期望的产量范围内。此DNA也可在酶反应如限制性内切酶反应消
化和PCR扩增反应中使用。
基因组DNA也可在酶反应如限制性内切酶反应和PCR扩增反应中使用。在限
制性内切酶消化反应中，2μgDNA分别用6U EcoRI(E)和HindIII(H)酶在37℃下消
化3小时然后用0.8％琼脂糖TBE凝胶分析。在RCR扩增时，把150和300ng的DNA
加入50μl总体积的PCR反应混合物中并扩增巨大幼虫基因的人同系物的1.1kb片
断。用1.2％琼脂糖/TBE凝胶分析PCR产物。
实施例5
此实施例证明了当样品在没有稳定剂时储存在室温下，生物样品中RNA的内
在不稳定性和转录。全血样品是从四个供体(被命名为供体1、2、3、4)收集来的。
对于每一位供体，第一组的样品是用EDTA血样收集管抽取的并在-70℃下存放。
第二组的样品是用同样的EDTA血样收集管收集并在室温下存放。
第二组样品在室温下相同的条件中存放并在1、3、5和7天后用定量
TaqManRT-PCR分析总γ干扰素的mRNA含量。第一组的样品是在-70℃相同的条件
中存放并用定量TaqManRT-PCR分析总γ干扰素的mRNA含量。供体1-4每一种样
品测定的mRNA含量分别在图2-5中表示。如图所示，第一天后储存在-70℃的血
样中γ干扰素mRNA总含量有很小的减少。存储在-70℃的三个样品在第一天到第
五天之间mRNA的量有一个微量的增加，这可以用该技术的误差范围内的变化来解
释。
三天后在室温下用EDTA储存的血样中总γ干扰素的mRNA含量有显著的提升，
表明存在一个很高的基因诱导率。在第三天后，样品中总γ干扰素的mRNA含量有
了下降，表明存在显著的分解。此样品的数据表明在室温下用EDTA处理的全血样
品是不稳定的，且基因诱导和分解会导致样品中总mRNA的持续变化。样品中总
mRNA的持续变化妨碍了对血样品中原始mRNA的精确测定和分析。
实施例6
本实施例对混有EDTA并储存在室温下的全血对照样品，以及用草酸十四烷基
三甲基铵和酒石酸稳定的并保存在室温下的全血测试样品中的某些种白细胞介素
mRNA和其他种类mRNA随时间而发生的变化作了比较。这些血样是直接从相同的个
体得到的并立即与各稳定剂混合。最终样品在室温下于相同的条件中储存。
此收集装置是一个含有4％(w/v)草酸十四烷基三甲基铵和200mM酒石酸的
6.9ml稳定缓冲液的16×100mm聚乙烯试管。血样直接从供体抽取放入收集装置并
在那里立即与草酸十四烷基三甲基铵和酒石酸混合。对照样品是用2.5ml新鲜抽
取的血放入一个Becton Dickinson Vacutainer的EDTA试管中来制备的。经选定
的时间间隔，用定量TaqMan RT-PCR像前面实施例一样的方法来分析对照样品和
测试样品。
图6-9显示了血样中特定白细胞介素mRNA和其他mRNA的量随时间而产生的变
化。样品的分析是用标准方法在收集完血样后立即对其mRNA量进行测试以确定基
线。
样品在室温下储存并在4小时、8小时、24小时、3天、5天后分析。图6表
明检测储存了5天的与EDTA混合的血样中mRNA量离基线的变化。测定的特定mRNA
种类标注在图表沿着横轴的底部。纵轴是表示各种mRNA的量的变化，变化按数量
级计量。如图6所示，5天后几种mRNA只显示很少或没有变化，然而另几种mRNA
却显示了显著的增加或减少。这些增加可以理解为是基因诱导的结果，而减少则
是降解的结果。
图7的图表显示了以EDTA稳定的血样中IL-8和IL-10转录物的量的变化。
在图中以每一鉴条表示4小时、8小时、24小时、3天和5天后测定的转录物量。
如图所示，在样品中存在的IL-8mRNA的量在一开始的三天内由于基因诱导以一个
稳定的速率增加，然后因为分解而开始下降。与此相比，在一开始的三天中，
IL-10mRNA的水平出现下降，然后第五天与第三天相比有小幅上升。图7中的数据
证明了在室温下储存时混有EDTA的血样的不稳定性。
用草酸十四烷基三甲基铵和酒石酸稳定的血检测样品在收集后立即分析测定
各种mRNA的量并确定基线。三天后对储存在室温(大约18-22℃)的样品进行分析。
图8的图表提供的结果，表明各种mRNA的变化。这些数据证明了血样品中各种mRNA
比用EDTA稳定的血样显示明显更小的变化。
图9显示了4小时、8小时、24小时、3天和5天后检测时，五天中IL-8mRNA
和IL-10mRNA量的变化。这些数据表明了IL-8mRNA水平只有很小的变化，而图7
所描述的加EDTA的全血样品却有很显著的变化。IL-10mRNA的量在五天后呈现出
逐渐上升，然而EDTA全血样品(图7)却呈现了很显著的变化。
已选择各种不同的实施方案来证明本发明，本领域中熟练的专业人员会理解，
可以作出各种改进和补充而并不偏离所附权利要求所确定的本发明的范围。