皮肤剥脱综合征新的致病基因及其编码蛋白质和应用.pdf

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1、10申请公布号CN104293813A43申请公布日20150121CN104293813A21申请号201410510241022申请日20140928C12N15/57200601C12N9/64200601C12Q1/68200601C07K16/40200601A61K39/395200601A61P17/0020060171申请人深圳华大基因科技有限公司地址518083广东省深圳市盐田区北山路146号北山工业区综合楼11F372发明人戴兰兰张建国谌于蓝杨勇林志淼赵嘉惠汪慧君徐讯74专利代理机构广州三环专利代理有限公司44202代理人郝传鑫付静54发明名称皮肤剥脱综合征新的致病基因及其。

2、编码蛋白质和应用57摘要本发明鉴定了与皮肤剥脱综合征相关的新的隐性致病基因。具体地，发明人以皮肤剥脱综合征患病家系为研究对象，对该家系中的患病个体和非患病个体进行了外显子组测序和比较，在CAST基因中发现一个移码突变C607_608INSAFS，该突变造成CAST蛋白质翻译提前中断。在此基础上，本发明提供了突变的CAST基因及其编码蛋白质和应用，包含突变的CAST基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。利用该突变的CAST基因，可以对皮肤剥脱综合征进行分子诊断和患病风险评价。该突变基因及其编码蛋白质还可作为治疗皮肤剥脱综合征的药物靶点。51INTCL权利要求书1页说明书9页序列表3页附图3页19中华人。

3、民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表3页附图3页10申请公布号CN104293813ACN104293813A1/1页21一种突变的CAST基因，其特征在于所述突变的CAST基因序列与SEQIDNO1相比具有至少1个非沉默突变，且所述突变的CAST基因导致皮肤剥脱综合征的发生；所述非沉默突变选自插入、缺失和置换中的一种或多种。2如权利要求1所述的突变的CAST基因，其特征在于所述非沉默突变为SEQIDNO1的第607位和608位之间插入一个碱基A，其序列如SEQIDNO2所示。3一种如权利要求2所述的突变的CAST基因编码的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序。

4、列如SEQIDNO3所示。4一种载体，其特征在于所述载体含有如权利要求1或2所述的突变的CAST基因。5一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为权利要求4所述的载体转化或转导的宿主细胞。6如权利要求1或2所述的突变的CAST基因在作为治疗皮肤剥脱综合征的药物靶点或制备皮肤剥脱综合征疾病诊断试剂盒中的应用。7一种用于诊断皮肤剥脱综合征的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含能够特异性扩增CAST基因的引物，或能够特异性检测CAST基因突变的探针。8如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述引物或探针序列为SEQIDNO1或2所示的序列中第607位或第608位前后1530BP长的序列。9一种抗体。

5、，其特征在于所述抗体与权利要求3所述的蛋白质特异性结合，且不作用于正常的CAST基因所编码的蛋白质。10一种皮肤剥脱综合征治疗剂，所述治疗剂包含权利要求9所述的抗体。权利要求书CN104293813A1/9页3皮肤剥脱综合征新的致病基因及其编码蛋白质和应用技术领域0001本发明涉及一种人体变异的基因，尤其涉及一种皮肤剥脱综合征新的致病基因CAST基因。本发明还涉及突变的CAST基因及其编码蛋白质和应用，包含突变的CAST基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。背景技术0002皮肤剥脱综合征PEELINGSKINSYNDROME,PSS是一组罕见的遗传性皮肤病，临床表现以持续性皮肤角质层或者表皮浅层剥脱。

6、、鳞屑、红斑为主要特征，类似“蜕皮”现象。PSS分为肢端型和系统型两种不同类型，其中肢端型仅累及手、足末端，表现为手、足反复脱屑及红斑；系统型可累及全身皮肤，根据是否合并炎症性改变及过敏性症状分为炎症型及非炎症型。肢端型通常合并其他疾病，而系统型可以合并过敏性鼻炎、哮喘等其他疾病。患者的“蜕皮”症状可以随季节发生变化，夏重冬轻。组织病理学表现为角化过度，以及角质层与颗粒层，或者颗粒浅层出现裂隙。本病导致可患者皮肤出现明显瘙痒、外观严重受损，以及合并各种过敏性疾病。既往研究认为，PSS为常染色体隐性遗传，主要致病基因为TGM5、CDSN、CSTA或者CHST8，这些基因在表皮终末分化过程中起到重。

7、要的作用。0003最近，外显子组测序EXOMESEQUENCING被成功地应用于发现稀有单基因疾病的致病基因，如FREEMANSHELDON综合症的MYH3基因，SCHINZELGIEDION综合征的SETBP1基因，以及严重大脑畸形的WDR62突变等。全外显子测序技术已被证明为降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段，仅通过对几个很少的个体包括患者及正常对照的全外显子进行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。发明内容0004本发明的主要目的在于鉴别皮肤剥脱综合征PSS的新的致病基因，定位出该疾病的基因突变位点。在此基础上，提供PSS致病基因及其编码蛋白质和应用，包。

8、含PSS致病基因的载体、宿主细胞以及试剂盒，以对皮肤剥脱综合征进行分子诊断和患病风险评价，为进一步治疗该病提供设计药物的靶点，同时为阐明该病的致病机制提供理论基础。0005因此，一方面，本发明提供了突变的CAST基因，所述突变的CAST基因序列与SEQIDNO1相比具有至少1个非沉默突变，且所述突变的CAST基因导致皮肤剥脱综合征的发生；所述非沉默突变选自插入、缺失和置换中的一种或多种。0006在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变为SEQIDNO1的第607位和608位之间插入A，其序列如SEQIDNO2所示。该突变属于移码插入突变，使得CAST基因编码的氨基酸序列第203位的异亮氨酸变成了。

9、天冬酰胺，第203位以后的氨基酸序列也发生改变，直至第210位谷氨酸密码子突变为终止密码子，使得多肽链合成中断。0007第二方面，本发明还提供了SEQIDNO2序列编码的蛋白质，该序列从203位发生变化，到第210位出现终止，所述蛋白质只有209个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO3所示。而野生型的CAST蛋白具有750个氨基酸，因此该突变型的CAST蛋白质的结构与功说明书CN104293813A2/9页4能不同于野生型的CAST蛋白，无法在机体中起到正常的作用0008在本发明的第三方面，提供了含有上述突变CAST基因的载体。0009在本发明的第四方面，提供了被上述载体转化或转导的宿主细胞或。

10、者被上述突变的CAST基因直接转化或转导的宿主细胞。0010在本发明的第五方面，提供了上述的突变的CAST基因在作为治疗皮肤剥脱综合征的药物靶点或制备皮肤剥脱综合征疾病诊断试剂盒中的应用。0011在本发明的第六方面，提供了一种用于诊断皮肤剥脱综合征的试剂盒，所述试剂盒包含能够特异性扩增CAST基因的引物，或能够特异性检测CAST基因突变的探针。0012在一个优选的实施方案中，所述引物或探针序列为SEQIDNO1或2所示的序列中第607位或第608位前后1530BP长的序列。0013在本发明的第七方面，提供了一种抗体，所述抗体与上述突变型的CAST蛋白质特异性结合，且不作用于正常的CAST基因所。

11、编码的蛋白质。0014在本发明的第八方面，提供了一种皮肤剥脱综合征治疗剂，所述治疗剂包含上述所述的抗体。0015本发明通过外显子组测序技术首次发现了CAST基因突变可以导致皮肤剥脱综合征的发病。一方面，通过检测受试者是否携带有CAST基因致病突变，可以早期筛查皮肤剥脱综合征突变基因携带者，提供优生优育指导；也可为皮肤剥脱综合征患者提供分子诊断依据。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断皮肤剥脱综合征。另一方面，CAST基因首次在人类疾病中被认识，为复杂的皮肤角质化生理过程提供全新通路；第三方面，本发明可以为治疗皮肤剥脱综合征提供可能的药物靶点。附图说明0016图1是某六代。

12、常染色体皮肤剥脱综合征家系图，其中正方形表示男性，圆圈表示女性；带斜线为死亡，实心为患病个体，空心为正常个体。0017图2是PSS患者症状图。0018图3是PSS患者CAST基因的突变位点序列图。0019图4为PSS患者和正常对照的CAST基因的MRNA表达QRTPCR结果。0020图5为透视电镜法检测钙蛋白酶抑制蛋白结果。0021图6为CAST基因在体内的表达和功能研究分析结果。具体实施方式0022以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本发明的保护范围以权利要求书限定的范围为准。0023在本发明中，除非另有说。

13、明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。0024在本发明中，“CASTCALPASTATIN基因”为蛋白酶抑制蛋白的靶基因，它是钙蛋白说明书CN104293813A3/9页5酶水解系统成员之一。其编码的蛋白质为钙蛋白酶抑制蛋白CAST是内源性专一抑制钙蛋白酶CAPN活性的蛋白质，可专一识别CAPN与钙结合引起的构象变化，并能与之结合。活性CAST含有5个结构域，第一个结构域即L结构域，其功能还不。

14、是很清楚。第25个结构域是4个结构相似的重复单位。0025在本发明中，术语“外显子”是指在成熟MRNA中被保留下的部分，即成熟MRNA对应于基因中的部分。内含子是在MRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟MRNA中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。0026在本发明中，术语“外显子捕获”与“芯片杂交”可互换使用，指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。DNA分子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变。

15、性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。0027在本发明中，“高通量测序”是指采用三种第二代测序平台进行高通量测序454FLXROCHE公司、SOLEXAGENOMEANALYZERILLUMINA公司和APPLIEDBIOSYSTEMS公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列，根据平台的不同，读取长。

16、度从25BP到450BP不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数。0028在本发明中，术语“DNA文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的DNA片段混合物。DNA文库的制备方法为本领域技术人员所熟知。在一个优选例中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。0029在本发明中，术语“突变”是指野生型的CAST多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。在本发明中，某一种变异体可以通过多种方式。

17、实现，例如，要得到野生型基因编码不完全的变异体，可以通过在野生型基因序列中插入碱基，使某个密码子变为终止密码子，或者直接缺失部分序列的方式实现。在本发明中，术语“非沉默突变”是指除了沉默突变以外的基因突变，包括但不限于错义突变、无义突变和移码突变等。0030本发明还涉及与所述的CAST核苷酸杂交且两个序列之间具有至少80，较佳地至少90，更佳地至少95，至少99同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。0031本发明野生型或突变型CAST核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核。

18、苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的CDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的CDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。说明书CN104293813A4/9页60032本发明中，“载体”包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，所述载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在一个优选的实施方案中，所述载体是商购可得的。在一个优选的实施方案中，所述载体包含与上述突变的CAST基因可操作地连接的表达控制序列，例如但。

19、不限于启动子，增强子和终止子。在一个优选的实施方案中，所述载体任选地还包含选择标记。0033包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等。本发明的宿主细胞还可以是细胞系。0034本发明还涉及到CAST突变蛋白质，由于在SEQIDNOL所示核苷酸序列中第607位和第608位的核苷酸之间插入了A图3，使得CAST基因编码的氨基酸序列第203位的异亮氨酸变成了天冬酰胺，第203位后的氨基酸序列也。

20、发生改变，并致使第210位的谷氨酸密码子突变为终止密码子，本发明的CAST突变蛋白质具有SEQIDNO3所示的序列，与野生型CAST氨基酸序列的不同之处为只有209个氨基酸，缺失了后部分的541个氨基酸，因此不具有CAST蛋白质正常的功能。本发明的CAST突变蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质，即使用重组技术从原核或真核宿主例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中产生。0035在本发明中，CAST突变蛋白质还涉及具有与CAST突变蛋白质相同功能的、SEQIDNO3序列的变异形式。变异形式包括同源序列、保守性变异体、诱导突变体等。发明还涉及CAST突变蛋白质类。

21、似物。这些类似物肤与CAST突变蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。0036本领域技术人员公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本发明提供的突变CAST基因的用途包括但不限于用作治疗皮肤剥脱综合征的药物靶点；制备皮肤剥脱综合征的诊断试剂盒中；用于产生疾病动物模型；为治疗皮肤剥脱综合征提供新的药物作用途径。0037本发明所述的“试剂盒”是指本领域技术人员以CAST野生型或突变型核苷酸为基因探针，根据基因杂交的原理，可以检测生物样本中是否存在与该探针序列互补的核苷酸序列，因此使用这种试剂盒可以检测出样本中是否存在着本发明的基因突变位点。试剂盒一。

22、般包括引物、探针、核酸芯片、说明书等，还可能包括与活性成分相容的缓冲液、载体或媒介等。0038在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CAST基因是指，在PCR反应中。

23、引物只扩增CAST基因，而不扩增其他基因，此类引物的设计是本领域技术人员公知的。0039在本发明中，术语“特异性检测CAST基因突变的探针”是指探针能够区分出含有突变的CAST基因基因与不含有突变的CAST基因。一般而言，可以通过控制杂交条件的严紧性，使得探针能够区分出含有突变的基因与不含有突变的基因。例如，在高度严紧条件下，说明书CN104293813A5/9页7与CAST基因精确互补的探针可以与不含有突变的CAST基因基因杂交，而不与甚至只包含一个点突变的突变的CAST基因杂交，从而将二者区分开。同样，还可以设计与突变的CAST基因基因精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与突变的CAST。

24、基因杂交，而不与不含有突变的CAST基因杂交。在分子生物学领域中，探针的设计和杂交技术是熟知的。0040本发明涉及对突变的CAST蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于突变的CAST蛋白质。较佳地，指那些能与突变的CAST蛋白质产物或片段结合但不识别和结合于野生型的CAST蛋白质相关抗原分子的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如FAB，或FAB2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链FV分子或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。0041本发明的突变的CAS。

25、T蛋白质抗体可以用来鉴定突变的CAST蛋白质。例如，可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸FITC来标记突变的CAST蛋白质特异抗体，然后让突变的CAST蛋白质特异抗体与样品接触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与突变的CAST蛋白质特异抗体结合的样品，从而为预测或诊断患者是否存在特发性皮肤剥脱综合征提供依据和指导。0042本发明的突变的CAST蛋白质抗体还可以用来中和突变的CAST蛋白质。如果有足够的数据表明某个体的PSS与本发明突变CAST蛋白质的存在相关，可以考虑用突变的CAST蛋白质特异性抗体中和这些致病突变CAST蛋白质分子，从而缓解患者的病症。0043实施例1样本获取0044发明。

26、人发现并鉴定了一个常染色体隐形遗传的皮肤剥脱综合征家系如图1所示。患者图1中黑色实心所示个体来自近亲婚育的家族中，父母表型正常，患者除了典型PSS症状以外，患者还合并出现浅表性水疱、白甲、掌跖角化、干燥性唇炎以及指节垫损害，组织病理学表现为表皮角化过度，颗粒层及棘细胞层上部角质形成细胞松解如图2所示。患者未合并其他系统异常，神经系统及智力发育正常。0045发明人以这位患者及其父母作为研究样本，并采集每位研究对象的外周血作为研究样品，加入EDTA抗凝，80保存。所有血样均签属知情同意书，并获得伦理委员会批准。0046实施例2样本DNA制备0047采集皮肤剥脱综合征患者及其父母的外周血，采用OME。

27、GABLOODDNAMIDIKIT全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA,提取步骤如下00481取2ML全血样本，加入150ULOBPROTEASE，21MLBUFFERBL和20ULRNASEA，最大速度漩涡1分钟，彻底混匀。0049265摄氏度水浴1520分钟，并在水浴过程中漩涡5次。00503加入22ML无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀。00514将35ML裂解液移入带过滤柱的15ML离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。00525将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15ML离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。0053。

28、6加入3MLHBBUFFER，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。说明书CN104293813A6/9页800547加入3MLDNAWASHBUFFER，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。00558再次加入3MLDNAWASHBUFFER，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。005694000转离心15分钟，甩干过滤柱。005710将过滤柱移至新的15ML离心管，加入500UL70摄氏度的ELUTIONBUFFER，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。005811再次将过滤柱移至新的。

29、15ML离心管，加入500UL70摄氏度的ELUTIONBUFFER，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。005912利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1720之间，浓度不少于200NG/UL，总量不少于30G。0060实施例3外显子捕获与测序0061发明人用NIMBLEGENSEQCAPEZEXOME64M结合SOLEXA高通量测序技术对选取的实施例1的患者的外显子组序列进行了测序，具体如下00621将基因组DNA随机打断成200300BP左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库参见HTTP/W。

30、WWILLUMINACOM/提供的ILLUMINA/SOLEXA标准建库说明书。00632文库经纯化后经过连接介导PCRLIGATIONMEDIATEDPCRLMPCR的线性扩增与BIOTINYLATEDDNALIBRARY进行杂交富集，再经过LMPCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为ILLUMINAHISEQ2000，读取长度为90BP,每个样本的平均测序深度最少为50。00643测序后获得的原始数据由ILLUMINABASECALLINGSOFTWARE17进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPALIGNER220比对参考基因组可参考LIR,LIY,KRISTIANSENK,ETAL,。

31、SOAPSHORTOLIGONUCLEOTIDEALIGNMENTPROGRAMBIOINFORMATICS2008,245713714；LIR,YUC,LIY,ETAL,SOAP2ANIMPROVEDULTRAFASTTOOLFORSHORTREADALIGNMENTBIOINFORMATICS2009，251519661967，通过参考的方式将其全文并入本文，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPSNP可参见LIR,LIY,FANGX,YANGH,ETAL,SNPDETECTIONFORMASSIVELYPARALLELWHOLEGENOMERESEQUENCINGGENO。

32、MERES2009,19611241132，通过参考的方式将其全文并入本文确定靶区域的基因型。INDELINSERTIONDELETION，插入/缺失标记采用BWA通过BURROWSWHEELER变换比对VERSION059R16比对到参考基因组HG19SNP132，然后利用GATKGENOMEANALYSISTOOLKITVERSIONV104705确定INDEL的类型。可参见LIH,DURBINRFASTANDACCURATELONGREADALIGNMENTWITHBURROWSWHEELERTRANSFORMBIOINFORMATICS2010；265589595；MCKENNA,A,。

33、HANNAM,BANKSE,ETALTHEGENOMEANALYSISTOOLKITAMAPREDUCEFRAMEWORKFORANALYZINGNEXTGENERATIONDNASEQUENCINGDATAGENOMERESEARCH2010；20912971303。0065结果，在样本中分别发现患者有130437个单核苷酸多态性SNPS和10738处的插入/缺失INDEL；随后通过DBSNP数据库HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/PROJECTS/SNP/SNP_SUMMARYCGI,千人基因组数据库WWW1000GENOMESORG/、HAPMAP数据库说明书CN1042938。

34、13A7/9页9HTTP/HAPMAPNCBINLMNIHGOV/等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0005的变异。通过比对正常样本，去掉所有已知变异、同义突变以及非编码区的变异，影响蛋白功能较小的位点，包括INTRON、INTERGENIC、UTR、同义突变，并利用SIFT软件进行SNP功能预测0066然后根据遗传模式是常染色体隐性且假设为全外显率的情况，结合近亲结婚纯合区域定位方法，发明人最终确定了该例患者的致病基因为CAST基因，其突变位点为C607_608INSAFS,PI203NFS8如图3所示，即在该基因的第607位和第608位之间插入了一个碱基A，该位。

35、点在家族中符合与疾病共分离父母为杂合子。在定位方法中，利用外显子数据检测纯合片段区域，选择在DBSNP135中记录的SNPS或者REFERENCE参考位点作为MAKERS标记,参考等位基因或者变异等位基因的READS支持率大于等于95的位点被考虑为纯和MARKERS，非参考等位基因READS支持率在3070之间的位点考虑为杂合MARKERS,非参考等位基因READS支持数在530或者7095的位点被丢弃。对于纯合MARKERS，要求位点的覆盖度大于等于10X，对于杂合MARKERS要求位点的覆盖度大于等于5X。以上。我们采用包含500个MARKERS作为一个滑动窗口，每个滑动窗口允许2个以内的。

36、杂合MAKERS，允许MAKERS间的最大间距为500KB。合并所有合格的滑动窗口，如果该区段大于等于1M的长度，则认为该区域为纯合区域。通过REALTIMEPCR方法，发明人确定了患者的CAST基因的MRNA表达较正常患者明显减少如图4所示。通过透视电镜法，发明人确定了患者缺乏钙蛋白酶抑制蛋白如图5所示。因此，发明人预测CAST是PSS的致病基因。0067实施例4致病突变基因SANGER法验证0068由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，因此我们进一步验证，对实施例1中的PSS患者及其正常父母、另一家族的PSS患者和200位无关正常个体的CAST基因进行检测，具体步骤如下00691DNA提取。

37、0070根据实施例2中所述的方法分别采集实施例1中的患者及其父母、另一家族的PSS患者和200位无关正常个体的外周血，提取基因组DNA。00712引物设计及PCR反应0072引物设计参考人类基因组序列数据库HG19/BUILD363，具体见下。0073对步骤1所提取的样本基因组DNA进行CAST基因突变位点C607_608INSAFS,PI203NFS8检测，针对该位点设计引物，引物设计方案符合本领域引物设计的一般原则即可，可采用PRIMERPREMIER或OLIGO等常用引物设计软件。0074PCR反应体系0075说明书CN104293813A8/9页100076反应条件007700783D。

38、NA测序0079将获得的PCR扩增产物用QIAQUICKPCR扩增试剂盒QIAGEN公司进行纯化，然后进行DNA测序。0080在患者家族成员中对CAST基因的移码插入突变位点进行突变排查，患者为携带相应的移码插入突变，患者父母均为携带相应的杂合突变，符合复合共分离原则，在另一例类似表现的患者中也发现了该致病基因突变位点，在200例同种族正常人群均未发现该致病突变。因此，发明人认为CAST基因是PSS的致病基因。0081发明人还对蛋白酶抑制蛋白靶基因在体内的表达和功能进行的研究分析，结果如下如图6中的A、B所示，PSS患者相对于正常对照，会出现中间丝相关蛋白断裂和表达减弱的现象；如图6中的C、D。

39、所示，PSS正常对照皮肤表现出兜甲蛋白正常表达的现象；如图6中的E所示，PSS患者的细胞间隙变大了；如图6中的F所示，PSS患者的核染色质凝聚和断裂的现象很明显；如图6中的G、H所示，PSS患者大腿皮肤中存在大量的凋亡细胞带荧光核，而正常对照的凋亡细胞在颗粒层的最上层。说明书CN104293813A109/9页110082实施例5体外检测PSS患者的CAST基因的试剂盒0083为了检测其它PSS家系该基因的致病突变，可以设计该基因编码区所有外显子和外显子与内含子交界处的引物序列。在该实施例中，试剂盒引物和扩增测序条件如实施例4。00841、试剂盒组成0085引物如实施例4所示；0086TAQ酶。

40、0087缓冲液0088DNTP0089从待检测的生物体样本中提取和纯化基因材料DNA样本00902、使用方法00911基因组DNA提取使用美国PROMEGA公司的WIZARDGENOMICDNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。00922先采用上述PCR引物、TAQ酶、样本基因组DNA、缓冲液、DNTP等进行PCR扩增反应；00933对PCR扩增产物进行纯化；00944对纯化的PCR产物进行BIGDYE反应；00955对BIYDYE反应产物纯化；00966对BIYDYE反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。说明书CN104293813A111/3页1200010002序列表CN104293813A122/3页130003序列表CN104293813A133/3页14序列表CN104293813A141/3页15图1图2说明书附图CN104293813A152/3页16图3图4图5说明书附图CN104293813A163/3页17图6说明书附图CN104293813A17。