在生物样品中检测钙蛋白酶3活性的方法和 实施该方法所用的肽 本发明涉及在包含细胞、细胞系或组织的生物样品中检测钙蛋白酶3活性的方法。还涉及该方法中所用的肽。本发明还涉及应用所述的肽在体外诊断2A型肢带型肌营养不良症(LGMD 2A)。而且，还涉及分析在体外向动物或人细胞、及在体内向动物中转运钙蛋白酶3基因的效率的方法。此外，还涉及筛选钙蛋白酶3-抑制物或钙蛋白酶3-激活物的方法。最后，检测钙蛋白酶3活性的方法包括研究钙蛋白酶3功能的手段。
钙蛋白酶是一个钙激活的、非溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族(Sorimachi，1997)。这个家族目前包含11个成员，其中包括两个遍在蛋白。钙蛋白酶的生理功能大部分仍是未知的。作为调节型的蛋白酶，它们很可能调节重要的细胞功能。具体说来，遍在钙蛋白酶与编程性细胞死亡(Squier，1994)，生肌分化(Kwak，1993)，和细胞分裂及融合相关(Yamaguchi，1994)；(Schollmeyer，1986)；(Balcerzak，1995)。
钙蛋白酶3，也称作p94，是一种钙依赖的半胱氨酸酶，属于钙蛋白酶家族，并在骨骼肌中特异表达(Sorimachi，1989)。它与一种被称为2A型肢带型肌营养不良症的常染色体隐性遗传疾病相关(Richard，1995)。这种肌病以萎缩和骨盆的和肩带的肌肉渐进性衰弱为特征，肌肉活组织检查表象为坏死-再生(Fardeau，1996)。该基因定位于人的第15号染色体，编码3.5kb的转录物，该转录物本身编码94kDa的蛋白。已表明钙蛋白酶3可与肌联蛋白，即一种肌节弹性蛋白通过IS2区域相结合，当其在Cos7细胞中表达时，翻译后立即自溶降解(Sorimachi，1993)(Sorimachi，1995)。这一区域中包含核定位信号，这意味着钙蛋白酶可定位于细胞质或细胞核中。另外还已表明钙蛋白酶3在过表达IL-6的转基因小鼠中低表达，这些小鼠表现出肌肉萎缩。钙蛋白酶3还在多种包含肌肉萎缩成分(恶病质，等)的条件下表现为低表达。
依照当前地知识水平，由此认为LGMD 2A是由钙蛋白酶3基因的突变导致的，突变导致骨骼肌中存在的钙蛋白3的蛋白水解活性受到抑制。由于患者的临床症状与至少约10种其他的病理状况相类似，因此LGMD 2A的临床诊断非常困难。在分子诊断方面可依照多种方法进行。
第一种可能是对钙蛋白酶基因进行突变研究。但是，由于该基因相对较大，所以存在许多不同的突变，且并不存在优先的突变，因此这种技术是相当繁复的。
另一种技术包括利用特异的抗体检测该蛋白的存在。但即使样中存在钙蛋白酶3也不能说明该个体没有患病，这是因为钙蛋白酶基因的突变可能意味着虽然该蛋白存在但自溶现象并不存在。另一方面，如果钙蛋白酶不存在或减少，也可能涉及由于钙蛋白酶之外的基因突变造成的继发钙蛋白酶病。
换言之，本发明所要解决的问题并非仅仅是检测生物样品中钙蛋白酶3的存在，更重要的是检测其活性。
Guttmann等在“Methods in molecular biology”vol 144，ch 18中描述了检测遍在钙蛋白酶活性的方法，该方法包括使纯化的钙蛋白酶与非特异的荧光肽(Succ-LLVY-AMC)相接触，然后检测该分子被裂解后荧光的变化。在另一种方法中，将钙蛋白酶与完整的TAU蛋白接触，然后进行蛋白印迹。这篇文章没有以任何方式特异地涉及钙蛋白酶3。另外，所述的底物或是非特异的(m-钙蛋白酶和μ-钙蛋白酶的底物)或是完整蛋白。
本发明所要解决的问题是开发一种新的特异于钙蛋白酶3的底物，其可用于检测生物样品中钙蛋白酶3的活性。
因此，本发明首先涉及至少与一种荧光或生色的报道分子相偶联的肽，所述肽的特征在于它包含至少一种能被钙蛋白酶3或钙蛋白酶3的同工型裂解的氨基酸序列。
所述的“钙蛋白酶3的同工型”代表任何由钙蛋白酶3基因由于可变启动子的可变事件或可变剪接所产生的蛋白。
在第一个实施方案中，鉴于钙蛋白酶3的自溶特性，本发明的肽优选地包含至少一个钙蛋白酶3或钙蛋白酶3的同工型的自溶位点，其氨基酸的数量小于10。
在说明书的其他部分和权利要求中，“自溶位点”表示在钙蛋白酶3或其同工型之一中所包含的氨基酸序列和任何由此衍生的序列，其可被钙蛋白酶3或其同工型之一裂解成至少两个肽。
实践中，钙蛋白酶3自溶位点的氨基酸序列选自下述称作NMTYGTS(SEQ ID 1)，NMDNSLL(SEQ ID 2)和PVQYETR(SEQ ID 3)的序列，在说明书的其他部分分别称作位点1，位点2和位点3。这些位点在目前所有钙蛋白酶3序列已知的物种(人，小鼠，大鼠)中都是同一的。
钙蛋白酶3自溶位点的氨基酸序列也可以选自下述人序列VAPRTAAEPRSP(SEQ ID 4)，QSKATE AGGGNP(SEQ ID 5)，和下述的鼠序列VAPRTG AEPRSP(SEQ ID 6)，QGKTTE AGGGHP(SEQ ID 7)。
在所述的实施方案中，本发明的肽包含至少一个钙蛋白酶3同工型的自溶位点，所述自溶位点的氨基酸序列来源于存在于啮齿动物，大鼠和小鼠中的称作Lp82的钙蛋白酶3同工型，并选自下述的氨基酸序列：NPYLLPGFFC(SEQ ID 8)和TISVDRPVP(SEQ ID 9)。
在第二个实施方案中，可被钙蛋白酶3或其同工型裂解的氨基酸序列来自底物蛋白，如钙蛋白酶抑制蛋白，细丝蛋白，踝蛋白，遍在钙蛋白酶，晶体蛋白(crystalline)，热激蛋白等。
优选地，所述底物蛋白具有下述序列：
REVTIPPKYRELL(SEQ ID 10)(人钙蛋白酶抑制蛋白)
KEGTIPPEYRKLL(SEQ ID 11)(小鼠和大鼠钙蛋白酶抑制蛋白)
PVSREEKPTSAPSS(SEQ ID 12)(人α-A-晶体蛋白)
PVSREEKPSSAPSS(SEQ ID 13)(小鼠和大鼠α-A-晶体蛋白)
KSTVLQQQYNR(SEQ ID 14)(人踝蛋白)
以登记号为XP045856公开的序列(人细丝蛋白2)
以登记号为P10809公开的序列(人热激蛋白60)
以登记号为NP004355公开的序列(人c/EBPβ)
以登记号为P17655公开的序列(人m-钙蛋白酶)。
在第三个实施方案中，所述的包含可被钙蛋白酶3或其同工型裂解的肽是用钙蛋白酶3或其同工型筛选肽文库所获得的。
为使得接下来能通过显色法或荧光测定法检测钙蛋白酶的活性，上述的本发明的肽与生色的或荧光报道分子相偶联。
当所述的报道分子是生色分子时，钙蛋白酶3对所述氨基酸序列的裂解在分光光度计上通过有色化合物的出现来检测。实践中所应用的有色化合物是对硝基苯胺。也可以是硫酯。
当所述的肽与荧光化合物偶联时，通过荧光发射的改变检测所述的裂解。在此种情况下，实践中所用的荧光化合物是4-甲基-7-香豆酰胺(MCA)或萘胺。萘酰胺和4-甲基-7-香豆基酰胺可用作生色的或荧光底物。
在另一实施方案中，所述的可被钙蛋白酶3裂解的肽的两端与两种荧光化合物相偶联，通过，由于裂解后继发的间隔而引起的第一化合物(供体分子)、及当两分子相接近时定位于所述肽另一端并可吸收第一化合物荧光的第二化合物(受体分子)的荧光发射改变检测所述的裂解。已知这一技术被称为FRET(荧光共振能量转移)(Frster，1948)。更具体地说，FRET是一种两荧光分子在一定条件下出现的物理现象：两分子必须足够地接近(小于100)，其中一个分子(供体分子)的发射光谱需覆盖第二分子(受体分子)的激发光谱。因此当供体分子在其激发波长下被激发时，其达到一高能量级。在几微微秒内，部分能量以不同的形式(热等)在介质中分散。若供体分子处于最佳的方向并接近受体分子，在没有光子参与、无需两分子发生碰撞的情况下，其能量可转移到受体分子。使受体分子受到激发并在自己的发射波长下发光。当肽被裂解后，所述的能量不再被吸收，供体分子发射荧光。因此荧光的增加相应于可测定的肽裂解活性。所述的荧光报道分子可以是通过化学合成获得的合成分子，或是可使荧光信号发射的蛋白。
在第一个实施方案中，所述的肽的两端都具有合成的荧光报道分子，分别是MCA(供体分子)和Dnp(受体分子)。
在第二个实施方案中，所述的供体是5-[(2’-氨基-乙基)氨基]萘磺酸(EDANS)，受体分子是4-[[4’二甲胺基]苯基]偶氮苯甲酸(DABCYL)。
在上述所有的情况下，与生色或荧光分子偶联的本发明的肽是通过化学合成的。
如已提及的，所述的报道分子也可以是可发射荧光信号的蛋白。在此种情况下，优选的实施方案中，所述肽的每一端都具有突变的GFP。
GFP(绿色荧光蛋白)是27kD的蛋白，它是由一种太平洋水母(Aequora Victoria)合成的，当此种动物应激时发射绿色荧光(Prasher，1992)。目前已可以纯化这种蛋白并鉴定其基因。编码GFP的序列可同相地与非常不同蛋白的编码序列一起克隆。与其他蛋白连接时GFP保持了其荧光特性，这样由于与GFP相连的蛋白可使对许多现象的研究易于进行，例如，对细胞迁移，蛋白在不同细胞区室内的迁移的研究。GFP在形成荧光团或与该荧光团相互作用的氨基酸序列中的某种突变使得鉴定具有特异荧光特性的突变体成为可能(Ellenberg，1999；Pollock，1999)。具体说来，已分离了CFP，即蓝绿荧光蛋白(激发440nm；发射480nm)，YFP，即黄色荧光蛋白(激发514nm；发射530nm)。理论上这两种蛋白可通过FRET现象连接起来。实际上，CFP(供体分子)的发射光谱和YFP(受体分子)的激发光谱之间存在重叠。
当这两个蛋白彼此足够接近时，当CFP在其激发波长下激发后，CFP可将其激活的能量转移到YFP，其由此可在535nm波长下发光。因此可将上述相应于钙蛋白酶3自溶位点的序列克隆到CFP和YFP序列之间。在活细胞中产生嵌合蛋白，并将这一系统应用于检测钙蛋白酶3，在所述的嵌合蛋白中CFP通过可被钙蛋白酶3裂解的肽与YEP相连。
本发明的主题还涉及编码与至少一种荧光蛋白相偶联的肽的DNA序列，所述的肽包含至少一种能被钙蛋白酶3或钙蛋白酶3的同工型裂解的氨基酸序列。在优选的实施方案中，所述的DNA序列编码下述的肽：
CFP-位点1-YEP
CFP-位点2-YEP
CFP-位点3-YEP。
本发明还涉及包含上述DNA序列和诱导该DNA序列在宿主细胞中表达的启动子的载体。这种载体是，例如由本申请人开发的质粒pTOM，其直接由在(Vanderklish 2000)中描述的质粒衍生而来。本发明还涉及经所述载体转化的宿主细胞。
本发明还涉及在体外检测生物样品中钙蛋白酶3或钙蛋白酶3的同工型活性的方法，依照该方法：第一步，将生物样品与上述的肽相接触，第二步，通过测定显色或荧光反应强度检测是否存在由钙蛋白酶3或钙蛋白酶3同工型对所述肽进行的裂解。
在第一步骤中可依所述的检测是在由活细胞或细胞抽提物、还是组织组成的生物样品上进行而假定多种形式，所述的细胞来源于人或动物。
当所述样品由活细胞组成，其与所述肽的接触可通过两种途径进行。在第一实施方案中，使所述的肽直接与细胞相接触，以此种方式所述的肽必须具有足够的穿透性以穿透细胞。所述肽的穿透性可作为报道分子的固有功能来确定。在第二个实施方案中，所述的生物样品相当于经编码相应于本发明的肽的DNA序列转染的宿主细胞，所述的报道分子然后相当于可以发射荧光信号的蛋白。
当所述的样品是细胞抽提物形式时，可简单地将所述的肽与细胞抽提物相接触。
如上所述，也可以直接在组织切片上进行活性的检测。实践中，取出所述的生物样品(器官，部分器官，例如肌肉活组织检查)，然后迅速地冷冻在异戊烷中，并用液氮冷却。将其贮存在-80℃下备用。用低温恒温器制备5到15μm的切片并置于玻片上。所述的玻片若不立即使用也置于-80℃细胞保存。可将所述的肽直接置于所述玻片上检测钙蛋白酶的活性。
在优选的实施方案中，所述肽的两端分别具有荧光供体分子和荧光受体分子，通过FRET测定荧光反应的强度。因此当FRET现象出现时，钙蛋白酶在细胞中没有活性。另一方面，如果钙蛋白酶有活性，其对所述的肽进行裂解，则FRET现象减弱。
检测钙蛋白酶3或钙蛋白酶3同工型活性的方法开发了有用的体外诊断LGMD 2A的方法。因此，本发明还涉及应用上述的检测方法在体外诊断LGMD 2A。
本发明还涉及筛选抑制或激活钙蛋白酶3或钙蛋白酶3同工型活性的物质的方法。所述的方法可确定两种不同的实施方案。
依照第一实施方案，该方法包括：
-制备用所述物质处理的生物样品，
-然后将经上述处理的生物样品与本发明的肽相接触，
-检测显色或荧光反应存在与否，分别表明可激活或抑制钙蛋白酶3或钙蛋白酶3同工型的物质的存在与否。
所述的生物样品可以是细胞、细胞抽提物或其他组织的形式。然后使经处理的样品(细胞，细胞抽提物或组织抽提物)与所述的肽相混合制备含有所述肽的生物样品。实践中，所述肽的两端分别具有荧光供体分子和荧光受体分子，通过FRET测定荧光反应的强度。
依照第二实施方案，所述的方法包括：
-制备包含本发明的肽的生物样品，
-将所述样品与待鉴定的物质相接触，
-检测显色或荧光反应存在与否，分别表明可激活或抑制钙蛋白酶3或钙蛋白酶3同工型的物质的存在与否。
在这种情况下，所述的生物样品由用包含编码本发明的肽的DNA序列的载体转染的细胞或细胞系组成，所述的报道分子是蛋白。
在优选的实施方案中，所述肽的两端分别具有荧光供体分子和荧光受体分子，该方法包括：
a/制备含有所述肽的生物样品，
b/测定不存在能激活或抑制钙蛋白酶3或钙蛋白酶3同工型的物质时FRET的量，
c/使含有所述肽的生物样品与能激活或抑制钙蛋白酶3或钙蛋白酶3同工型的物质相接触，
d/测定在存在能激活或抑制钙蛋白酶3或钙蛋白酶3同工型的物质时FRET的量，
e/作出存在下述物质的结论：
如果在b/步骤中测定的FRET的量高于在d/步骤中测定的FRET的量则存在激活物质；
如果在b/步骤中测定的FRET的量等于在d/步骤中测定的FRET的量则存在抑制物质。
本发明的主题还涉及分析钙蛋白酶3的转移效率的方法，其包括：
-首先用编码钙蛋白酶3的质粒转染动物或人细胞，
-然后使经转染的细胞与本发明的肽在体内或体外相接触，
-再测定显色或荧光反应的强度。
在优选的实施方案中，所述肽的两端分别具有荧光供体分子和荧光受体分子，通过FRET测定荧光反应的强度。
已完全鉴定出了钙蛋白酶3基因，并且在EP717110中已精确地描述了转染技术，因此此处不再给出具体的细节描述。
本发明及由此带来的有益之处将通过由下述附图支持的实施例更加清楚地表现出来。
图1：钙蛋白酶3的部分序列；箭头标示出自溶位点的位置；用于所述肽的序列用下划线标出，其在目前所有钙蛋白酶3序列已知的所有物种(人，小鼠，猴，大鼠，牛)中都是同一的。
图2：通过重组钙蛋白酶1(左栏)和钙蛋白酶2(右栏)测定相应于钙蛋白酶3自溶位点1，2和3的肽随时间的裂解活性(分别为曲线A，B和C)。
图3通过经或未经编码钙蛋白酶3的质粒转染的C2C12细胞抽提物测定相应于钙蛋白酶3自溶位点的肽随时间的裂解活性。
图4通过正常(+/+)或钙蛋白酶3缺陷(-/-)的小鼠成肌细胞的抽提物测定相应于钙蛋白酶3自溶位点的肽随时间的裂解活性。
图5通过正常(+/+)或钙蛋白酶3缺陷(-/-)的小鼠肌管细胞的抽提物测定相应于钙蛋白酶3自溶位点3的肽随时间的裂解活性全程。
图6通过正常(+/+)或钙蛋白酶3缺陷(-/-)的小鼠成肌细胞的抽提物测定6小时内相应于钙蛋白酶3自溶位点的肽的裂解活性。
图7通过正常(+/+)或钙蛋白酶3缺陷(-/-)的小鼠四头肌的抽提物测定6小时内相应于钙蛋白酶3自溶位点的肽的裂解活性。
图8：质粒pTOM的部分序列。用斜体表示的氨基酸是ECFP序列的部分。用粗体表示的氨基酸序列是ECFP的一部分。在载体pTOM中EYFP的终止密码子已被去除。用斜体和粗体表示的碱基分别表示EYFP和ECFP序列相。用下划线标示出的序列相应于取出用于构建载体pTOMp的片段。蛋白序列A和B分别相应于在定位于Ec1136II和SmaI酶切位点之间的双链片段被取出之前、之后载体pTOM从EYFP编码序列的ATG所翻译出的序列。在序列A中，编码EYFP和ECFP的序列不在相位中。它们在序列B的相中。
图9：A用pTOMp转化后的传代培养集落进行PCR所得产物在琼脂糖凝胶上的迁移。该PCRs是用寡核苷酸midEYFP.a和midECFP.m进行的。B：这些PCR产物经EcoRI消化后的迁移；孔1：1kb序列梯；孔2：pTOM；孔3：用EcoRI消化后的pTOM；孔4-9：凝胶A中的PCR产物经EcoRI消化后的迁移；它们的大小总是800bp。
图10：载体pTOM的克隆位点(10a)和编码钙蛋白酶3自溶位点的寡核苷酸序列(10b，10c，10d)。每一对互补的寡核苷酸由一种名称中以“.a”结尾的寡核苷酸和一种名称中以“.m”结尾的寡核苷酸组成。
图11：用pTOMp和编码自溶位点2的插入物转化后的传代培养集落中进行PCR所得产物在琼脂糖凝胶上的迁移；该PCR是用寡核苷酸SGp94S2.a和midECFP.m进行的。
图12：质粒pTOM的限制性酶切图谱。
图13：质粒pTOMs1，pTOMs2和TOMs3的限制性酶切图谱。
I/用蛋白抽提物测定钙蛋白酶3的活性：
相应于钙蛋白酶3自溶位点(图1)的合成肽的裂解使应用涉及FRET的技术检测其活性成为可能。
A/材料和方法
1/荧光计：SpectraMax Gemini XS Microplate荧光计(分子设备)。
2/荧光肽的序列：
Mca-NMTYGTS-Dnp(位点1)
Mca-NMDNSLL-Dnp(位点2)
Mca-PVQYETR-Dnp(位点3)
3/所用的可商购酶和抑制剂的索引：
钙蛋白酶1：人红细胞(Calbiochem)
钙蛋白酶2：大鼠，重组体，大肠杆菌(Calbiochem)Caspase3：人，重组体，大肠杆菌(Ca1biochem)4/反应条件：
终体积200μl；钙(CaCl2)终浓度10mM；荧光肽终浓度1.9μM。5/荧光检测：
反应在37℃下进行1小时(这种情况下每50秒测定一次荧光)或6小时(每2分钟测定一次)。在每次测定之间摇动培养基。用于检测肽荧光的波长为：
-Mca的激发波长为325nm。
-Dnp的发射波长为392nm。
6/调制缓冲液
首先设定反应条件，具体说来是反应缓冲液的组分。实际上已证明荧光检测非常灵敏。第一步实验包含多种不同的缓冲液组分和浓度。试验了多种NaCl浓度。表明具有低浓度的用于重悬所述肽的DMSO非常重要。还表明在反应介质中存在CHAPS和BSA可进行最佳的荧光检测。为确定激活钙蛋白酶3，反应于37℃下，存在10mM钙的条件下进行。实际上，在存在约纳摩尔浓度的钙时钙蛋白酶3具有活性。
缓冲液的组分：
可商购的钙蛋白酶的重悬缓冲液：100mM NaCl，5mM EDTA，50mMTris HCl，5mM β-巯基乙醇，40％甘油，pH7.8。在环境温度下贮存。荧光肽的重悬缓冲液：所述的肽以1mg/ml重悬于100％的DMSO中。于4℃下在黑暗中贮存。
反应缓冲液：100mM NaCl，50mM HEPES，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油，0.1％CHAPS，100ng/μl BSA，pH＝7.4，过滤，于环境温度下贮存。
7/真核细胞培养：
所用的细胞系：C2C12：鼠成肌细胞；
所用的培养基：
DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco BRL)
MEM：非必需氨基酸溶液(Gibco BRL)
FSC：胎牛血清(Gibco BRL)
用于C2C12的培养基：DMEM+10％FCS
钙蛋白酶的激活：向培养基中添加终浓度6mM的CaCl2和终浓度为0.5μM的离子霉素(Calbiochem)。
8/将表达载体转染到真核细胞中的方案：
材料：
依照QIAGEN EndoFree方法(ref.12362)制备多种质粒DNA。
所用的质粒：pECFP-N1(Clontech)；pBYFP-C1(Clontech)。
方法：
第一天：
将所需的细胞胰蛋白酶化，在孔中接种细胞使其在接下来几天中达到铺满50-80％。
第二天：
将无胎牛血清的94μl培养基置于第一无菌的聚苯乙烯管(T1)中。
向每个T1管中加入6μl FUGENE 6缓冲液。
在环境温度下温育5min。
将1-2μg EndoFree质粒添加到第二无菌聚苯乙烯管(T2)中，加在管底。
在温育5min结束时，所述的FUGENE 6(T1)缓冲液+培养基滴加到含有载体的T2管中。
在不搅拌的情况下，于环境温度下温育30min。
更换孔中的培养基。
30min后，将转染混合物滴加到每一孔中，将滴加的混合物散布到整个孔表面。
使细胞在37℃/7％CO2中生长。
注示：
对于每次转染，均留有一个未与FUGENE 6接触的孔(细胞对照)，以及一个其中的细胞仅与FUGENE 6接触的孔(FUGENE 6毒性对照)。
9/细胞裂解方案：
原理：裂解经转染的或未转染的动物细胞以制备蛋白抽提物研究其性质。
方法：
去除孔中的培养基，用PBS(硫酸盐缓冲的Dulbecco溶液(无钙，镁或碳酸氢钠)-Gibco BRL)。
收集细胞，于4℃下500g离心10min。
去上清，向细胞中加入裂解缓冲液(50mM HEPES，1mMDTT，0.1mMEDTA，0.1％CHAPS，pH＝7.4)，以每孔700μl裂解缓冲液的比例。
使缓冲液在4℃下作用5min。
10000g/10min/4℃下离心。
收集上清液于-20℃下贮存。
10/组织裂解方案：
原理：将肌肉磨碎以制备蛋白抽提物，并研究其性质。
材料：正常小鼠和钙蛋白酶3缺陷小鼠的四头肌。
方法：
在液氮中将肌肉磨碎。
按每微克磨碎组织19μl裂解缓冲液的比例将磨碎的物质重悬于裂解缓冲液中(参见上述细胞裂解方案中的组分)。
使缓冲液在冰上作用10分钟。
于4℃下10000g离心10min。
收集上清液于-20℃下贮存。
B/“自溶位点”特异性试验
由钙蛋白酶3裂解肽
在证明钙蛋白酶3是否能裂解相应于其自溶位点的肽之前，第一个试验包括证明这些肽(位点1，位点2，位点3)不能被其它蛋白酶，特别是遍在钙蛋白酶(参见图2)所裂解。由于对照，即“无酶肽”曲线和“肽+酶”曲线可以相叠加，可见钙蛋白酶1和2对每个自溶位点均无裂解活性。另一蛋白酶，caspase 3也给出了类似的结果。
已知由于肌联蛋白的存在，钙蛋白酶3在肌肉细胞中具有更高的稳定性。为证明钙蛋白酶3能够裂解其自身的自溶位点，用编码钙蛋白酶3的质粒转染C2C12细胞使钙蛋白酶3在其中过表达。与用编码钙蛋白酶3的质粒进行转染的同时用pECFP进行对照转染。对C2C12细胞的转染效率低于10％。抽提蛋白并试验其对自溶位点的活性(图3) 。
代表经转染和未经转染的C2C12细胞抽提物对位点1和2的活性的曲线表明荧光略有提高，这可能意味着钙蛋白酶3可以裂解这些位点。钙蛋白酶3是一种在肌肉中表达的蛋白，因此从未转染的细胞抽提物所观察到的基础活性是正常的。但没有检测到经转染的和未转染的细胞对位点1和2有任何差异。另一方面，对于位点3，在经转染的细胞中的裂解活性更高。差异是微小的，这与经转染细胞的低百分比相关。
然后用该系统对缺失或不缺失钙蛋白酶3的细胞的抽提物进行试验。为此使用了缺失钙蛋白酶3基因的小鼠，生肌细胞培养物来源于此(Richard，2000)。钙蛋白酶3缺失的肌细胞(-/-细胞)培养物的抽提物与正常肌细胞(+/+细胞)培养物的抽提物相比较。首先对未分化的细胞(成肌细胞)进行该试验(图4)。通过这些试验可以表明，对位点1可检测到低裂解活性。但-/-和+/+细胞之间的差异非常小。对位点2未能检测到裂解活性。对位点3检测到了裂解活性，但在-/-和+/+细胞之间没有观察到活性的差异。
为证明+/+抽提物和-/-抽提物之间活性的更大差异，对分化成肌管的肌细胞抽提物进行了同样的试验(图5)。特定地，理论上钙蛋白酶3在肌管细胞中比在成肌细胞中的表达量高。
这一实验可表明-/-细胞抽提物比+/+细胞抽提物对位点3的裂解活性更高，这是令人惊讶的，因为钙蛋白酶3缺失是+/+细胞和-/-细胞间的唯一差异。因此，在钙蛋白酶3缺失细胞中的活性降低就更有可能。
为试图证明+/+和-/-细胞抽提物之间活性的更大差异，将同样的反应进行了6小时而非1小时(图6)。
+/+细胞抽提物和-/-细胞抽提物中对位点1和2的裂解活性更高。当将反应进行6小时后也证明了对位点3活性的提高。在-/-细胞抽提物中的活性高于在+/+细胞抽提物中的活性。这些试验可表明，当所述试验进行6小时时，对位点3裂解活性的差异可使+/+和-/-细胞类型得以区分。
还对来自缺失或不缺失钙蛋白酶3的小鼠肌肉溶胞产物进行了上述活性试验。对四头肌溶胞产物也进行了上述试验(图7)。
+/+组织抽提物比-/-组织抽提物对位点1和2的裂解活性更强。-/-组织抽提物比+/+组织抽提物对位点3的裂解活性更强。这些试验表明用组织抽提物与用细胞抽提物试验所得的结果相类似。具体说来，确定了不存在钙蛋白酶3的抽提物对位点3有更强的活性。这一活性很可能是由于另一种蛋白酶的作用，其活性在该蛋白酶3不存在时被激活。
II细胞中钙蛋白酶3的活性试验
A/材料和方法
将寡核苷酸克隆到表达载体pTOM中
原理
将两个互补的寡核苷酸放在一起以便形成相应于钙蛋白酶3自溶位点的双链序列。通过下述方式筛选寡核苷酸，即，其配对在每一末端形成限制性位点。将这些片段克隆到已预先用限制性酶消化的表达载体pTOM中。
材料：
寡核苷酸：位点1，位点2，位点3
限制性内切酶：BamH1，BspE1，SmaI(BioLabs)；Ec1136II(Fermentas)
所用的细菌菌株：SCS110：dam-StrR细菌(Stratagene)；XL1-Blue(Stratagene)。
质粒载体：pTOM(Généthon)(图12)
方法：
两互补寡核苷酸间的杂交
使在SYBR Green PCR缓冲液(Applied Biosystems)中终浓度为20ng/μl的两种单链互补寡核苷酸彼此接触。杂交在ABI Prism 7700设备(Applied Biosystems)中依照下述条件进行：95℃/1min→90℃/30sec→85℃/30sec→80℃/30sec→75℃/30sec→70℃/30sec→65℃/30sec→60℃/30sec→55℃/30sec。用SequenceDetector 1.6.3软件随时间追踪配对的发展。
载体pTOM的消化：
将载体pTOM用两种酶BamH1和BspE1分别在37℃下消化2小时。
将寡核苷酸连接到pTOM中：
在连接混合物中，插入物和载体的量的比率是3(摩尔比)。连接反应在T4 DNA连接酶(BioLabs)存在下于16℃下反应过夜。
制备电感受态细菌的方案：
接种310μl细菌的15ml LB+选择试剂在20％甘油中贮存于-80℃。在37℃下振荡培养8小时(约300rpm)。200ml LB+可能的选择试剂接种2ml预培养物。使所述细菌生长到OD(600nm)＝0.5。
所有所用的材料都必须预冷到4℃。
将培养物在冰上放置15min，然后以25ml每管的比例分配(8管)。
4℃下4000rpm离心20min。
弃上清，轻轻地将所余的颗粒状物取出到200ml冰水中(25ml每管-8管)，按上述条件离心。
弃上清，轻轻地将所余的颗粒状物取出到100ml冰水中(两两合并试管、4管)，按上述条件离心。
小心地弃上清，将每一颗粒状物取出到5ml 10％的甘油(经高压灭菌并贮存于-20℃)中，将4体积合并成一管；按上述条件离心。
弃上清，轻轻地将颗粒状物取出到400μl 10％的甘油中。
40μl小份分配到eppendorf管中，于-80℃下冷冻。
感受态细菌的对照：依照下述方案用对照质粒转化所述细菌。转化的载体的滴度应高于每微克108菌落。
转化方案：
将1μl连接的DNA(≈0.1ng)添加到40μl电感受态细菌，使其在冰上接触4min。
将混合物置于电穿孔槽(Bviorad基因脉冲发射器杯；0.2cm)中。
电穿孔条件：2500V，200ohm，25μF。
立即添加1ml SOC，在37℃下放置30min到1小时使所述基因表达以抵抗抗生素。
20μl和200μl锢于LB+终浓度为10μg/ml的卡那霉素平板中。使所述细菌在37℃下生长过夜。
对菌落的分析：
将所述菌落计数并在96-孔培养板中的100μl LB+终浓度为10μg/ml的卡那霉素中传代培养。为证明菌落中有质粒存在，用midEYFP.a和midECFP.m的配对或用下述的正向寡核苷酸之一与反向寡核苷酸midECFP.m形成的配对对这些克隆进行PCR：
SFp94S1.a CCGGAAGTGGCACGAACATG
用于位点1 每一寡核苷酸特异
SFp94S2.a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT 于一种克隆的双链
用于位点2 片段。它们集中于
SFp94S3.a CCGGAAGTGGCATTGTTCCC BspEI限制性位点。
用于位点3
将PCR产物上样于含0.8％琼脂糖+终浓度为0.5μg/ml溴化乙锭的凝胶上。为证明质粒中存在插入片段，用寡核苷酸midECFP.m对一定数量的阳性克隆PCR产物测序。
2-真核细胞培养：
所用的细胞系：C2C12：鼠成肌细胞；
所用的培养基：
DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco BRL)
MEM：非必需氨基酸溶液(Gibco BRL)
FSC：胎牛血清(Gibco BRL)
用于911系的培养基：DMEM+10％FCS+1％MEM
用于Cos 7和C2C12系的培养基：DMEM+10％FCS
钙蛋白酶的激活：向培养基中添加终浓度6mM的CaCl2和终浓度为0.5μM的离子霉素(Calbiochem)。
3-将表达载体转染到真核细胞中的方案：
材料：
依照QIAGEN EndoFree方法(ref.12362)制备多种质粒DNA。
所用的质粒：pECFP-N1(Clontech)；pEYFP-C1(Clontech)。
方法：
第一天：
将所需的细胞胰蛋白酶化，在孔中接种细胞使其在接下来几天中达到铺满50-80％。
第二天：
将无胎牛血清的94μl培养基置于第一无菌的聚苯乙烯管(T1)中。
向每个T1管中加入6μl FUGENE 6缓冲液。
在环境温度下温育5min。
将1-2μg EndoFree质粒添加到第二无菌聚苯乙烯管(T2)中，加在管底。
在温育5min结束时，所述的FUGENE 6(T1)缓冲液+培养基滴加到含有载体的T2管中。
在不搅拌的情况下，于环境温度下温育30min。
更换孔中的培养基。
30min后，将转染混合物滴加到每一孔中，将滴加的混合物散布到整个孔表面。
使细胞在37℃/7％CO2中生长。
注示：
对于每次转染，均留有一个未与FUGENE 6接触的孔(细胞对照)，以及一个其中的细胞仅与FUGENE 6接触的孔(FUGENE 6毒性对照)。
B/结果
为检测活细胞中钙蛋白酶3的蛋白水解活性，利用FRET现象研究三自溶位点的裂解。
为具有“FRET阳性”对照，即不能被钙蛋白酶裂解且可在其中出现FRET现象的编码ECFP-EYFP嵌合蛋白的质粒，载体pTOM首先通过下述方式进行修饰，即该载体中的两荧光蛋白，增强的-CFP(ECFP)和增强的-YEP(EYEP)是同相的。将编码钙蛋白酶3三自溶位点的DNA片段插入到这些序列之间。然后我们证明了所产生的嵌合蛋白的确能在体外被遍在蛋白酶裂解。最后，在细胞中通过荧光影象分析在细胞中研究所述的裂解。用三种不同的方法进行所述的分析，特别是FRET。
1-对照载体和带有编码所述裂解位点的DNA片段的载体的克隆：
编码同相的两荧光蛋白的载体的构建：
构建带有编码同相的ECFP和EYFP序列的载体(称作pTOMp)的策略包括：用两种在pTOM中有独特位点的限制性酶Ec1136II和SmaI消化质粒pTOM产生平末端(图8)。纯化线性载体并使载体自连。在转化和阳性菌落传代培养后，通过PCR反应确证所述质粒存在于这些菌落中(图9)。有约1/3经传代培养的菌落可得以扩增，即其中应当包含载体pTOMp。用EcoRI对这些PCR产物进行的消化，通过Ec1136II-SamI片段的排除消失的限制性位点，可以确证经传代培养的菌落确实含有质粒pTOMp而非起始的质粒。对PCR产物进行测序可以确证两序列彼此间的确是同相的。
2-在表达载体pTOM中编码可被钙蛋白酶3裂解的位点的寡核苷酸的克隆：
为促进两蛋白EYFP和ECFP之间的FRET现象，在裂解位点两端添加甘氨酸和丝氨酸以促进两蛋白聚在一起，甘氨酸可促进嵌合蛋白的灵活性，丝氨酸可提高其在含水介质中的溶解度(图10)。寡核苷酸的序列是当它们配对时在每一末端形成限制性位点BspE1和BamHI。
在寡核苷酸的序列中用粗体和下划线标示的碱基是不改变蛋白序列但不同于基因组序列的碱基。这些碱基是经修饰以限制同源引物形成双螺旋的，它们也可能妨碍双链寡核苷酸的形成。也可使这种碱基修饰适应在小鼠中密码使用频率。
用于克隆的限制性位点是独特的位点。若克隆位点被甲基化可使BspE1酶失活。对准备接受双链寡核苷酸的载体pTOM的克隆可在编码Dam甲基化酶的基因突变的细菌中进行。在用BspE1和BamHI酶消化所述载体后，连接所述的寡核苷酸并进行电穿孔，将一些抗性菌落取样。用midECFP.m和特异于限制性位点的寡核苷酸进行PCR可证明所述质粒的存在(图11)。
对由PCR所获得的一些阳性克隆进行测序可证明pTOM中的插入物的存在，这些插入物确实与编码ECFP和EYFP的蛋白同相，且它们不含有任何突变。三个含有被克隆质粒的菌落是保守的。这三个质粒相应于三个插入的DNA片段：三个钙蛋白酶3裂解位点(质粒pTOMs1，pTOMs2和pTOMs3)(图13)。
序列表
<110>法国国家科学研究中心
<120>在生物样品中检测钙蛋白酶3活性的方法和实施该方法所用的肽
<130>G143-B-18244 PCT
<150>FR0108614
<151>2001-06-29
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>1
Asn Met Thr Tyr Gly Thr Ser
1 5
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>2
Asn Met Asp Asn Ser Leu Leu
1 5
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>3
Pro Val Gln Tyr Glu Thr Arg
1 5
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>4
Val Ala Pro Arg Thr Ala Ala Glu Pro Arg Ser Pro
1 5 10
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>5
Gln Ser Lys Ala Thr Glu Ala Gly Gly Gly Asn Pro
1 5 10
<210>6
<211>12
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>6
Val Ala Pro Arg Thr Gly Ala Glu Pro Arg Ser Pro
1 5 10
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>7
Gln Gly Lys Thr Thr Glu Ala Gly Gly Gly His Pro
1 5 10
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>8
Asn Pro Tyr Leu Leu Pro Gly Phe Phe Cys
1 5 10
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>9
Thr Ile Ser Val Asp Arg Pro Val Pro
1 5
<210>10
<211>13
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>10
Arg Glu Val Thr Ile Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Leu Leu
1 5 10
<210>11
<211>13
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>11
Lys Glu Gly Thr Ile Pro Pro Glu Tyr Arg Lys Leu Leu
1 5 10
<210>12
<211>14
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>12
Pro Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ser
1 5 10
<210>13
<211>14
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>13
Pro Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ser
1 5 10
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>设计的肽
<400>14
Lys Ser Thr Val Leu Gln Gln Gln Tyr Asn Arg
1 5 10