本发明涉及用于超声诊断的含气微粒的特殊造影剂及其制造方法，该微粒的外壳由聚氰基丙烯酸酯或α-，β-或γ-羟基羧酸的聚酯构成。 经外周注射含微细气囊的溶液，已知可以获得心脏的回声造影（Roelandt J，Ultrasound Med.Biol.8∶471-492，1982）。这种气囊在生理可容性的溶液中得到，例如通过振摇，另外的搅拌或加入二氧化碳。然而其数量及大小不能标准化，不易重现。一般也不稳定，以致寿命很短。其平均直径大都超过红血球大小，以致不能经过肺毛细管和以合的器官造影术如左心室，肝、肾和脾造影。除此之外，还不适于定量化，因为由它产生的超声回声是由多种相互间不能区分的过程所构成，例如水泡形成，融合和崩解。因而用这种超声造影剂不可能对心肌作瞬间的造影测定。对此需要的造影剂是其播散体具有优良的稳定性。
EP 0 131 540叙述了加入糖使气泡稳定化，因而改善了造影效果的再现性和均匀性，然而这种气泡仍不能穿过肺通道。
在EP 0 122624和0 123 235中叙述了加入表面活性物质改善了糖、糖醇和盐的气泡稳定作用。这种超声造影剂可进入肺毛细血管和对股动脉及各种器官如肝和脾进行造影。但造影效果只限于血管内腔，因为气泡不被组织细胞吸收。
所述的超声造影剂在体内不会长时间不变，静脉注射后通过选择性地提高信号强度有足够的器官图象或定量化，用这种造影剂是不可能的。
在EP0 224 934中叙述了将气体如空气封闭成囊作为超声造影剂，所用的包膜物质是由蛋白质构成，尤其是人血清蛋白，皆知具有过敏原性质，经变性作用会产生细胞毒作用。
在EP0 327 490专利说明书中叙述了用于超声诊断的含气微粒，它是基于生物降解性合成材料制成的。这种造影剂显示有足够的体内寿命，静脉注射后便富集在细胞内地内质网系统，从而也富集在肝或脾脏中。在这一点上，虽然也需要用聚氰基丙烯酸酯或α-，β-或γ-羟基羧酸作为适宜的囊壳材料，但本发明的微粒与EP0 327 490公布的造影剂不同，即微粒的相对密度小于0.7g/cm3。
本发明的微粒较小的密度是由于在同样的粒度微囊中含有较多的气体。由于气囊的扩散和反射所产生的超声回声强度与气体核直径的六次方成比例，本发明的微粒作为超声造影剂明显地比EP 0 327 490公布的造影剂更有效。
本发明微粒气体体积的增大是通过减低壁的厚度实现的。令人意外的是，本发明微粒虽然降低了壁厚度，在经过肺通道时，仍然经久地有足够的稳定性。
应用本发明的方法制造了这种新的“薄壁”微粒。
鉴于毛细管通过性的要求，粒度应小于10μm，优选的微粒平均直径为0.2-2μm。这个要求可用本发明使用的方法加以满足。
按照本发明方法制造的微粒比密度为0.05-0.7g/cm3，由此计算出微粒的平均厚度为10-50nm。
本发明实施例9制造的作为举例选出的聚氰基丙烯酸酯微粒与EP 0 327 490的实施例2制造的微粒进行比较，表1中列出了数据。
按照本发明实施例9制造的微粒相对密度为0.15g/cm3，计算出平均壁厚几乎小了大约10倍，气体体积大约增加了60%。这些数据与由窄光栅电子显微镜图的结果有良好的一致性（参见图1和2）
图1按本发明实施例9制造的微粒的窄光栅电子显微镜图。
在图中部附近破碎的微粒可估计壁的厚度，与计算值有良好的一致性。
图2按EP0 327 490实施例2制造的微粒的窄光栅电子显微镜图。
处于右下方两条线的长度相当于1μm，在图的上半部可见到破碎微料的空穴的存在，可以估计壁的厚度，相当于表1中所列的计算值。
令人意外的是本发明的微粒进行超声研究时超出了散射条件下的信号增强作用，观测到由于微粒的作用进一步提高了造影效果，由于适宜的声压和适宜的频率的超声辐射作用，增高了特定的信号。
由于这种出乎意料的观察到的现象，本发明造影剂首次在肝和脾区域的胂瘤诊断中找到了新的用途。这样，静脉注射本发明微粒后用染色的多普勒技术，健康组织被着色，而肿瘤部位较少或不被染色。
此外，由于上述优良的微粒性质-较大的气体体积加上特定的超声信号-用明显少量的微粒就可得到良好的造影。由于这种有效性的提高，只用较少量（μg范围）的聚合物可得到良好的超声造影，因而提高了药理学的安全范围。
有代表性动物试验是用比格狗每公斤体重用25μg微粒，可得到优化的均匀的左心室造影（图3右）。而EP 0 327 490的微粒剂量为2mg/kg可得到差不多相同的造影（图3左）。
图3比格狗左心室的声图描记图。
左：按EP 0 327 490制造的微粒（按实施例2，剂量为2mg/kg体重）。
右：按本发明的制造的微粒（按实施例9，剂量为25mg/kg体重）。
图4和5是膀胱灌注本发明微粒（实施例9）和EP0 327 490所述的微粒（实施例2）的造影效果。EP0 327 490微粒用的剂量大约为3mg/ml，本发明微粒的剂量为0.04mg/ml。可以看出，尽管用明显小的浓度，仍能得到显著的良好造影效果。
图4
用本发明微粒灌注的狗膀胱的声图描记图（按实施例9制造，剂量为0.04mg/ml）。
图5
用EP 0 327 490微粒灌注的狗膀胱的声图描记图（按实施例9制造，剂量为3mg/ml）。
本发明的另一内容是关于制造该微粒的方法。
为了制造氰基丙烯酸酯的微粒，将氰基丙烯酸酯单体于用气体饱和的酸性溶液中，并必要时含有至少一种表面活性物质，于转子一定子混合器中分散，分散5分钟到3小时后，分出得到的微粒，必要时用水洗涤，然后分散在药用悬浮剂中，冷冻干燥，在冻结时使悬浮液强烈运动是有利的。优选的聚氰基丙烯酸酯是丁酯，气体为空气，氮气，氧气，惰性气体或二氧化碳。也可用类似的器械（例如溶解-搅拌器）代替转子-定子混合器，并使其强烈地分散。作为表面活性物质优选的有多乙氧基醚，辛基-或壬基酚，Macrogol-甘油酯或鲸蜡macrogole或PoloxamereR或是它们的混合物。气体饱和的水溶液的pH为1.8-4.5，为调整pH值用磷酸及其盐特别适宜。微粒的分离用离心法或浮选法。适宜的悬浮介质有注射用水，必要时添加食盐和（或）葡萄糖和（或）甘露醇和（或）乳糖，必要时还可加入表面活性物质，例如多乙氧基醚，辛基-或壬基酚，Macrogol-甘油酯或鲸蜡macrogole或PoloxamereR或它们的混合物和（或）多元醇。
为了制造以聚酯为基础的微粒，其方法是将α-，β-或γ-羟基羧酸的聚酯，必要时与水分散性乳化剂一起溶解在对健康无碍的溶剂中，并用溶解-搅拌器或超声棒使其分散下加入含气的液体中，只要未和聚酯一起已经加入乳化剂，该液体中应含有水分散性乳化剂，经过30分钟到2小时的分散，得到的微粒加以分离，必要时用水洗涤，最后用药用悬浮介质处理，冷冻干燥。本发明优选采用的聚合物是乳酸或羟基乙酸的聚合物以及它们的混合聚合物。作为对健康无阻碍的溶剂优选的是被加热的乙醇。作为含气的液体优选用水或87%甘油，气体优选用空气，氮气，氧气，惰性气体或二氧化碳。作为水分散性乳化剂有磷脂酰胆碱或蔗糖-棕榈酸-硬脂酸酯15以及它们的混合物。作为适宜的药用悬浮介质与制聚氰基丙烯酸酯为基础的微粒所用的相同。
本发明的微粒冷冻干燥时，优选加入能保护微粒不会在冷冻干燥时破坏或凝结的物质（所谓低温保护剂）。作为低温保护剂最好向悬浮液加入生物聚合物（如白蛋白，热压处理和明胶，氧化聚明胶，明胶-聚丁二酸酯，交联多肽），合成的大分子物质（例如Povidone，聚乙烯醇），糖（例如蔗糖，乳糖，海藻糖，棉子糖，糖醇（例如，甘露醇，山梨醇）或这些药用辅料的混合物。加入的浓度为1%-15%。本发明加入的低温保护剂或者加入到制备介质中，于冷冻保护溶液中用浮选分离得到的微粒加以处理，或者在冷冻干燥前直接加到悬浮液。
意外地还发现，在加入的低温保护剂中，加入深度为0.1-3%的冷冻干燥优选的物质多元醇（如甘油，丙二醇）或二甲基亚砜（DMSO）是有利的。
冷冻干燥最好是这样进行，在冷冻时阻碍了本发明微粒的浮选。因此，将本发明微粒的悬浮预冷是有利的，冻结和冷冻干燥速率每分钟2开氏温度或更多。
本发明的制造方法比EP 0 327 490公布的方法的另一个重要优点是，该充气的微粒在制造的步骤中不使用对健康和生态有危险性的有机溶剂或辅料。
制备本发明的微粒即可使用的、可注射的制剂是将冻干物重新悬浮到药用悬浮介质中，例如注射用水，一种或多种无机溶液如生理电解质溶液，和缓冲溶液如Tyrode，单糖或二糖的水溶液如葡萄糖或乳糖，糖醇如甘露醇，必要时还可加入表面活性剂，例如选自多乙氧基醚，辛基-或壬基酚，Macrogol甘油酯或鲸蜡macrogole，或选自poloxamere的物质或它们的混合物和（或）生理上可容受的多元醇如甘油，不过，为了注射的目的优选的适宜的是水。上述任选的溶解物质的总浓度为0-15%（重量%）。
制备即可使用的可注射的制剂的另一种方法是，在本发明制备微粒时不用后来的冷冻干燥。为了提高使用的可靠性，可在注射前直接对悬浮液进行过滤。优选的方法是在注射器和针头之间装一过滤器，其作用是，在使用不当时可阻挡住最后出现的凝聚物，而未凝聚的颗粒仍可通过，适宜的滤材原则是市售的膜滤材，在选择滤器时，还意外地发现，由聚丙烯-微纤维制成的特异复合膜可以得到最好的结果。尤其上具有绝对保持率为10-20μm的过滤器显示有优点。这样的过滤器也是很小的;例如5-10μm大小，在静脉注射使用时仍能够阻挡住不希望有的微粒聚集。
即用造影剂的浓度范围是0.01-20mg/ml，优选用2-6mg/ml，注射的剂量取决于使用的方法，例如于双色-声图描记血管造影时，每公斤体重用1-500μg微粒，优选为10-100μg/kg，肝和脾造影时，用50-1000μg/kg，优选为200-600μg//kg。
下面的实施例对本发明加以说明。
实施例1
将0.4ml氰基丙烯酸丁酯及转子-定子混合器在含有1%Poloxamer407的pH2.0的盐酸60ml中分散5分钟。粒度平均为2μm的微粒离心分出后，用含有1%Poloxamer和5%葡萄糖的水溶液处理，密度测定得相对密度为0.2g/cm3。
实施例2
按实施例1方法操作，盐酸的pH为2.5，用辛基酚-9（Octoxynol-9）代替Poloxamer407。微粒平均粒度约为0.9μm，相对密度为0.2g/cm3。微粒用含有1%多乙氧基醚20的5%甘露醇溶液300ml处理。
实施例3
按实施例1方法操作，盐酸的pH为3.0，用鲸蜡macrogol1200代替Poloxamer407。微粒平均粒度约为1.5μm，相对密度为0.3g/cm3。用300ml的含有0.1%鲸蜡macrogol1200和5%Povidone的5%甘露醇溶液处理。
实施例4
按实施例1方法操作，用5%多乙氧基醚40代替Poloxamer407。微粒平均粒度约为1.0μm，相对密度为0.4g/cm3。用含有1%的Macrogol甘油羟基硬脂酸酯的5%甘露溶液300ml处理。
实施例5
按实施例1方法操作，用5%Macrogol甘油羟基硬脂酸酯代替Poloxamer407。微粒平均粒度约为0.9μm，相对密度为0.3g/cm3。用300ml含有1%macrogol甘油羟基硬脂酸酯和10%丙二醇的5%甘露醇处理。
实施例6
按实施例1方法操作，氰基丙烯酸丁酯用氰基丙烯酸乙酯代替。微粒平均粒度约为1.5μm，相对密度为0.2g/cm3。用300ml含有1%poloxamer407和5%葡萄糖的水溶液处理。
实施例7
按实施例1方法操作，氰基丙烯酸丁酯用氰基丙烯酸乙酯代替。微粒平均粒度约为1.3μm，相对密度为0.2g/cm3。用300ml含有1%poloxamer407，5%甘露醇和1%丙二醇的水溶液处理。
实施例8
3ml氰基丙烯酸丁酯在300ml的含有1%poloxamer407的pH值2.0的盐酸中用溶解-混合器分散120分钟。微粒平均粒度约为2μm，相对密度为0.1g/cm3。经浮选法分离得到。用5升含有1%poloxamer407和10%丙二醇的5%甘露醇溶液处理。
实施例9
按实施例8的方法操作。用辛基酚-9（octoxynol-9）代替poloxamer407，pH值2.5。微粒平均粒度约为0.8μm，相对密度为0.15g/cm3。用5L含有0.1%鲸蜡macrogol1200的0.9%食盐溶液处理。
实施例10
按实施例8的方法操作。用鲸蜡macrogol1200代替poloxamer407。微粒平均粒度为1.8μm，相对密度0.4g/cm3，用5L含有0.2%鲸蜡macrogol1200的5%葡萄糖溶液处理。
实施例11
按实施例8的方法操作。用5%多乙氧基醚60代替poloxamer407。微粒平均粒度为1.0μm，相对密度0.4g/cm3，用5L含有1%poloxamer407和10%丙二醇的5%甘露醇溶液处理。
实施例12
实施例8、9、10或11制备的微粒不是用5L含有0.1%鲸蜡macrogol1200和5%povidon的5%甘露醇溶液整个处理，而是于一份为15ml强烈振摇下冷冻和冷冻干燥，在应用该冻干剂之前用注射用水重新分散，必要时加以过滤。
实施例12a
实施例8、9、10或11制备的微粒不是用5L含有0.1%鲸蜡macrogol1200的10%乳糖溶液整个处理，而是每份15ml在强烈振摇下冷冻和冷冻干燥，在使用该冻干剂之前用注射用水重新分散，必要时加以过滤。
实施例13
1.0g氢化大豆磷脂用溶解-混合器在200ml甘油中分散。将2.0g溶解在10ml沸腾乙醇中的聚L-丙交酯（平均分子量1100）于60分钟后滴加到上述分散液中。再分散60分钟，生成的微粒于1000转/分离心，沉降物用50ml水处理，再离心（1000转/分）。沉降物用5%甘露醇水溶液处理。以10ml一份进行冷冻干燥。冻干物在使用前用注射用水重新分散。
实施例14
1.0g蔗糖-棕榈酸酯-硬脂酸酯（HLB15）于溶解-混合器中用200ml甘油分散。将1.0g聚L-丙交酯（平均分子量1100）于10ml的沸腾乙醇的溶液于30分钟内滴加到上述分散液中，再分散60分钟。得到的微粒平均粒度为2μm，于1000转/分离心30分钟，沉降物用50ml处理，再离心（1000转/分），沉降物用50ml甘露醇溶液处理。将此分散液分成每10ml份进行冷冻干燥。冻干物在使用前用注射水重新悬浮。
实施例15
体重12.5kg经吸入麻醉的狗，于外周静脉注射按实施例8制备的微粒（250μg/ml），剂量为25μg/kg体重，注射速度为2ml/分钟。心脏的左半部的超声研究，显示出B-图有强力持久的增强信号。
实施例16
用实施例1-7或9-14制备的微粒重复实施例15的操作，心脏的左半部也显示有强力持久的信号的增强。
实施例17
体重11kg吸入麻醉的狗经外用静脉注射按实施例8制备的微粒（250μg/ml），剂量为300μg/ml体重，注射速度为0.1ml/秒。10分钟后肝脏用颜色双造影显示出颜色编码均匀地长时间的增高。
实施例18
用实施例1-7或9-14制备的微粒按实施例17重复操作，肝脏造影呈均匀的颜色编码。
实施例19
实施例8制备的微粒与狗血清1+1混合，37℃温育。4小时后以前混浊的悬浮液完全澄明，用气相色层证明得到几乎100%理论上预计的丁醇量。
实施例20
用溶解-混合器将3ml氰基丙烯酸丁酯于含有1%壬基酚的pH2.5的盐酸溶液300ml中分散90分钟。经浮选法得到微粒平均粒度1.4μm。用100ml水处理，与50%白蛋白混合。然后以5ml一份轻缓地摇动下冻结和冷冻干燥。
实施例21
在溶解-混合器中将3ml氰基丙烯酸丁酯于含有1%辛基酚的pH2.5的盐酸溶液300ml中分散90分钟。经浮选法得到微粒平均粒度1.4μm。微粒用100ml热压处理的明胶溶液并用HCl/NaOH调节pH5.0处理，然后以每5ml一份轻缓摇动并冷冻干燥。
实施例22
在溶解-混合器中将3ml氰基丙烯酸丁酯于含有1%辛基酚和5%povidone的pH2.5的盐酸溶液300ml中分散90分钟。经浮选法得到微粒平均粒度1.4μm。用5%povidone溶液处理，5ml一份，在0℃下保持1小时，然后冻结并冷冻干燥。
实施例23
在溶解-混合器中将3ml氰基丙烯酸丁酯于含有1%辛基酚的pH2.5的盐酸溶液300ml中分散90分钟。经浮选法得到微粒平均粒度1.4μm的微粒用300ml水处理，与0.1%甘油和10%乳糖混合，冻结后冷冻干燥。