本发明涉及以球形炭作为有效成分的促红细胞生成素，特别是由重组体·促红细胞生成素（recombinant human E PO：以下有时称之为rHuEPO）引起的抗贫血作用的增强剂。或者，涉及上述抗贫血作用增强剂的制造工艺中球形炭的使用。 随着遗传工程学的发展，在贫血治疗中已开始使用rHuEPO制剂。促红细胞生成素是存在于生物体内的造血促进因子之一，贫血的一个因素是缺乏促红细胞生成素。可以确认rHuEPO，在化学、免疫学及生物学上和人的促红细胞生成素是相同的。
rHuEPO是由165个氨基酸残基构成的分子量约3万的糖蛋白质，在两个地方（7-161及29-33）上有二硫化物键，3根N-葡糖苷型糖链和1根O-葡糖苷型糖链，分别在第24、第38及第83的天门冬酰胺和第126的丝氨酸上键合。根据糖链结构不同，存在各种不同的rHuEPO。作为rHuEPO的例子，可举出现在已商品化的エポジン（商品名）和エスポ-（商品名）等（参看岩川精吾，医学のあゅ2，Vol，155，No.10，631-633，1990）。
通常，一旦贫血厉害，血中的促红细胞生成素浓度就会变高。但是，对于肾贫血患者的情况来说，如果与肾机能正常的贫血患者相比，不仅是血中促红细胞生成素浓度低的情况居多，而且由于存在造血抑制因子，因此，如期待的那样，要使红细胞比容上升，就需要大量的rHuEPO。
然而，rHuEPO，作为副作用，会引起血压上升，头痛、高血压性脑病，因血栓形成导致的脑梗塞和心肌梗塞、网膜静脉闭塞，支脉闭塞，或透析效率低下等。此外，作为rHuEPO导致地变应性疾病或类过敏性病症，还可见到血压低下、关节痛、搔痒、浮肿、红眼睛、胸部压迫感、出血斑等症状。有时还可见到轻度发热、出疹或肝不适等。因副作用引起的高血压，也被认为是由于未稍血管的收缩和血液粘度的上升而导致未稍血管阻力增大所致。
本发明者们对抑制因投与rHuEPO而引起的副作用的方法进行了努力地研究，结果发现，通过合并使用球形炭，可以既维持rHuEPO的抗贫血作用，同时又大幅度减少rHuEPO的投与量，从而避免或减轻上述的副作用。也就是说，发现了球形炭增强rHuEPO的抗贫血作用。本发明就是基于上述发现而完成的。
因此，本发明涉及以球形炭作为有效成分的、促红细胞生成素抗贫血作用的增强剂。也就是说，本发明涉及在具有抗贫血作用的促红细胞生成素中并用球形炭，从而增强促红细胞生成素抗贫血作用的医药制剂。也就是说，本发明涉及上述抗贫血作用增强剂制造工艺中球形炭的使用。并且，涉及促红细胞生成素抗贫血作用的增强方法，该方法是与促红细胞生成素的贫血治疗有效量的份量配合起来，给患者投与有效量的球形炭。
以下详述本发明。
作为本发明增强剂有效成分使用的球形炭，只要是可用于医疗方面的球形的活性炭即可，对此并没有特别的限制。以前，作为解毒剂而使用于医疗的粉末状活性炭，其副作用是容易引起便秘，而且，病态时的便秘特别危险，因而这一点是最大的缺点。
本发明中所用的球形炭，其粒径范围是直径为0.05-2mm。不足0.05mm时，不能充分地去除便秘等副作用，而超过2mm时，不仅服用困难，而且不能迅速地发挥期待的药理效果。球形炭的形状是为获得本发明效果的重要因素之一，也就是必需使其基本上为球状。
球形炭制造时，作为原料，可使用任意的活性炭原料，例如锯末、煤、椰子壳、石油系或煤炭系的各种沥青类，或有机合成高分子，最好是石油系烃。作为球形炭，最好是用球形活性炭和/或球形吸附炭。
可在本发明中使用的球形活形炭，是一种直径为0.05-2mm的活性炭。制造活性碳的基本方法是将原料碳化之后再活化而制得。作为活化的方法，可采用水蒸汽活化，药品活化、空气活化或二氧化碳气活化等各种公知的方法。
球形活性炭，例如可用以下三种方法制备。第一种方法是首先用沥青等粘合剂将粉末原料造粒成小粒球形，然后在惰性气氛中加热至600-1000℃煅烧以使其碳化，继而在水蒸汽气氛中于850-1000℃活化。第二种方法，如特公昭51-76号公报中所记载的那样，先将沥青类于熔融状态制成小粒球形状，然后用氧使之不融化后，在与上述第一种方法相同条件下进行碳化活化。第三种方法，如特公昭59-10930号公报中所记载的那样，先将沥青类于熔融状态制成绳状沥青，将它破碎后投入热水中使之球状化，然后用氧使它不融化后，在与上述第一种方法相同条件下进行碳化活化。
可用于本发明的球形吸附炭，其直径为0.05-2mm，小孔半径为80埃以下的空隙量为0.2-1.0ml/g。总酸性基（A）为0.30-1.20meq/g，总碱性基（B）为0.20-0.70meq/g，而总酸性基（A）/总碱性基（B）为0.40-2.5的活性炭为最好。作为这样的球形活性炭之一例，可列举美国专利第4681764号说明书中记载的球形碳素质吸附剂。
球形吸附炭可用以下方法制备，将直径为0.05-2mm、和小孔率半径为80埃以下的空隙量为0.2-1.0ml/g的球形活性炭，进一步经高温氧化处理和还原处理而制得。最好是通过高温下的氧化和还原处理，将制得的球形吸附炭的酸性基和碱性基调整在总酸性基（A）为0.30-1.20meq/g、总碱性基（B）为0.20-0.70meq/g，以及总酸性基（A）/总碱性基（B）为0.40-2.5的范围内。
此处，所说的总酸性基（A）和总碱性基（B），是按常规方法定量的物性。
（甲）总酸性基（A）
在0.05N的NaOH溶液50ml中，添加粉碎至200目以下的球形吸附炭1g，振荡48小时，滤出球形吸附炭，通过中和滴定求得的NaOH消耗量。
（乙）总碱性基（B）
在0.05N的HCl溶液50ml中，添加粉碎至200目以下的球形吸附炭1g，振荡24小时后，滤去球形吸附炭，然后通过中和滴定求得的HCl消耗量。
所说在高温下的氧化处理，是指在氧化气氛中进行的高温热处理。作为氧源，可以使用纯氧、氧化氮或空气等。另外，所说在高温下的还原处理是指在一种对碳为惰性的气氛中进行的高温热处理。作为对于碳是惰性的气氛，可以采用氮、氩或氦气等。，或是它们的混合气体。氧化热处理最好是在氧含量为0.5-25体积%，优选为氧含量为3-10体积%的气氛中，以及最好是在300-700℃，优选在400-600℃的温度下进行。原处理最好是在700-1100℃，优选800-1000℃的温度下氮气氛中进行。
本发明的增强剂是和具有抗贫血作用的任一种促红细胞生成素，特别是与rHuRPO并用。作为rHuEPO，例如可以用遗传工程学的方法，通过含有编码遗传因子的媒介物使人的促红细胞生成素至少是其活性部位转化的各种哺乳动物细胞宿主所产生的各种rHuEPO。
本发明者对贫血大白鼠试验了仅给予有效量的rHuEPO皮下注射，与此相对照，对球形吸附炭的口服和rHuEPO的皮下注射的并用效果进行了调研，结果惊奇地发现，与球形炭并用时，即使仅用rHuEPO投与量的一半，其效果也和仅仅皮下注射正常有效量的rHuEPO时的效果相同。也就是说，球形炭增强了rHuEPO的抗贫血作用，从而揭晓了将球形炭作为rHuEPO抗贫血作用的增强剂是十分有用的。将本发明的增强剂投与正常大白鼠时，没有引起任何异常现象。
本发明的抗贫血作用增强剂，通过口服投与，其投与量根据施药对象（动物或人）、年龄，个人情况，病况等而异。例如，施药对象是人时的口服量，通常是每1天投与的球形炭为0.2-20g，也可以是一次或分成2-4次服用。也可以根据症状，适当增或减投与量。球形炭制剂可以是颗粒、片剂、糖衣片、胶囊、密封袋装剂（スティフク剂），分包包装体或悬浊剂等任意投与形态施药。以胶囊形式服用时，可以用通常的明胶胶囊，或根据需要可用肠溶性的胶囊。作为颗粒、片剂或糖衣片使用时，必需是一到体内即可解体成微小的颗粒体。
促红细胞生成素的投与是按通常的方法，一般是作为注射剂，注射到静脉，皮下或腹腔内等处。通常仅投与单一形式的rHuEPO时，作为投与方法的一例，如下所述。
也就是说，对于成人，是一次3000单位，每周3次，尽可能缓慢地静脉注射。然而，为了确认贫血的改善效果，作为维持量，对于成人是一次1500单位，每周2次或3次，或者是一次3000单位每周投与2次。作为贫血改善的目标值，红细胞比容是30%左右。防止红细胞比容在1周内不能上升1%以上的副作用是很重量的。
并用本发明增强剂时促红细胞生成素（rHuEPO）的投与量，是仅用rHuEPO作为抗贫血剂时的上述投与量的5-90%，优选30-90%。
本发明的球形炭增强剂的施用时期和促红细胞生成素抗贫血剂的施用时期，可自由选择进行组合。例如，既可以前后施用，也可以同时施用。还可以仅仅是部分时期同步施用，还可以将这种施药方案适当组合，反复进行。
以下通过实施例具体说明本发明，但这些实施例并不是用于限定本发明范围。
制造例1：球形吸附炭的制备
将一种在偏光显微镜下的各向异性领域呈均匀性的沥青（氢原子/碳原子比＝0.55，流动点＝220℃）300g和萘100g放在安装有搅拌机的高压釜中，于180℃溶解混合，添加聚乙烯醇的0.5%水溶液1200g，然后于140℃经30分钟剧烈搅拌后，搅拌下冷却至室温，获得球形粒子。滤除大部分水后，将所得球形粒子放入萃取器，通入己烷，萃取除去萘，通风干燥。然后用流化床，流入加热空气以25℃/小时升温至300℃，进而在300°时保持2小时不溶化。然后，在水蒸汽中升温至900℃，于900℃保持2小时进行碳化活化，得到多孔质的球形活性炭。所得球形活性炭的直径为0.05-1.0mm，小孔半径为80以下的空隙量为0.755ml/（按照采用自动吸附量测定装置的甲醇吸附法测出）。
将如此制得的碳质球状体，用流化床，于温度为600℃，氧浓度为3%的气氛中处理3小时后，于氮气氛中升温至950℃，于950℃保持30分钟，获得球形吸附炭（以下称为试料1）。这种球形吸附炭的直径为0.05-1mm，小孔半径为80以下的空隙量为0.751mg/g（按照采用自动吸附量测定装置的甲醇吸附法测出），总酸性基（A）为0.542meq/g，总碱性基（B）为0.525meq/g，而总酸性基（A）/总碱性基（B）为1.03。
在大白鼠（Cpb：WU：ウィスタ-ランダム）口服急性毒性试验中，即使是按照毒性试验法控制线（药审118号）的最大投药量（雌雄大白鼠5000mg/kg）也没观察到异常现象。
实施例1：对贫血大白鼠的抗贫血增强作用
作为抗贫血作用增强剂的有效成分-吸附炭，使用按上述制造例1方法制得的试料。
作为rHuEPO，使用エポエチンァルフ（遗传因子组变换）〔麒麟麦酒（株）的エスポ-（商品名）〕。所谓エポエチンァルフ，是根据来源于人肝细胞的促红细胞生成素基因组DNA而发现的，由中国田鼠卵巢细胞中产生的165个氨基酸残基（C809H1301N229O240S5j分子量：18，235.96）构成的糖蛋白质（分子量：约30，000）。
使用ウィスタ-雄大白鼠（体重260g左右），用肾动脉分支部分结扎法，使其患肾性贫血症。手术后的第9天，测定红细胞比容，进行选择，使各组间没有任何偏差，将选择出来的大白鼠分成6组：对照组（C组），球形吸附炭投与组（A组），rHuEPO单独投与组（E组），rHuEPO半量投与组（E1/2组）、球形吸附炭和rHuEPO半量的并用投与组（A E1/2组），以及球形吸附炭和rHuEPO1/3量的并用投与组（AE1/3组）。
试验期间定为3周。让各组大白鼠自由地摄取饲料。对各组投与的药物，具体按以下方法实施。
C组：将生理食盐水按每次0.4ml/kg（大白鼠体重）的用量每周2次的比例进行皮下注射。
A组：大白鼠饲料中混合5%的球形吸附炭，让其自由地摄取。
E组：将rHuEPO的生理食盐水溶液（60单位/kg（大白鼠体重）〕按每周2次的比例进行皮下注射。
E1/2组：将rHuEPO的生理食盐水溶液（30单位/kg（大白鼠体重）〕按每周2次的比例进行皮下注射。
AE1/2组：在大白鼠饲料中混合5%球形吸附炭，让其自由摄取的同时，将rHuEPO的生理食盐水溶液〔30单位/kg（大白鼠体重）〕按每周2次的比例进行皮下注射。
AE1/3组：在大白鼠饲料中混合5%球形吸附炭，让其自由摄取的同时，将rHuEPO的生理食盐水溶液（20单位/kg（大白鼠体重）]按每周2次的比例进行皮下注射。
三周的试验期结束后，从颈静脉采血样，测定红细胞比容。将结果示于表1。
值：每组5只的平均值±标准偏差
（AE1/3组是3只的平均±标准偏差）
明显差异鉴定：在t-test中的P值（N·S表示没有明显差异）
C组中，与试验开始时相比较，红细胞比容降低，相对于观察贫血状况，A组中红细胞比容降低受到一定程度的抑制。E组的红细胞比容比试验开始时升高，贫血受到抑制。但是E1/2组中红细胞比容与试验开始时相比较，降低很少。然而，按照本发明的AE1/2组中，与试验开始时相比较，其红细胞比容增加，其红细胞比容值比E1/2组的高许多。抑制贫血的程度与E组相同。E组和AE1/2组之间没有明显差异。E组和AE1/3组之间没有明显差异。也就是说，由于与球形吸附炭并用，即使rHuEPO是半量投与，和1/3量投与，也显示出与单独投rHuEPO时的效果相同。此外，由摄取量计算的抗贫血作用增加剂（球形吸附炭）的投与量是约18.8g/kg（大白鼠体重）/周。
制剂制备例1：胶囊剂的制备
将上述制造例1制得的球形吸附炭200mg封入明胶胶囊，制得胶囊剂。
制剂制备例2：密封袋装剂的制备
将上述制造例1制得的球形吸附炭2g填充到层压膜（其构成＝玻璃纸/聚乙烯/铝箔/聚乙烯/聚偏氯乙烯;厚度＝74±8μm）制的密封袋中后，将薄片热压密封制成密封袋装剂。
在使用rHuEPO抗贫血剂时，通过并用由球形炭构成的本发明增强剂，可显著增强rHuEPO的抗贫血作用，从而能使rHuEPO的投与量大大减少。因此，由于rHuEPO引起的副作用也会明显减少。
以上是按具体实施方案说明本发明，而本技术领域的人都知道的一些改良也都将包括在本发明范围内。