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1、10申请公布号CN104152408A43申请公布日20141119CN104152408A21申请号201410400235X22申请日20140814C12N5/077520100171申请人黄福来地址351152福建省莆田市秀屿区月塘乡月埔村月埔200号72发明人王军霞黄福来74专利代理机构北京商专永信知识产权代理事务所普通合伙11400代理人高之波邬玥54发明名称亚全能干细胞的制备方法57摘要本发明公开了亚全能干细胞的制备方法，包括如下步骤组织的获得，消毒处理，组织的分离、洗涤和剪碎，胶原酶消化，亚全能干细胞的获得。本发明公开了一种从脐带、胎盘羊膜、绒毛膜或基蜕膜组织中分离亚全能干细胞。
2、的方法，获得的亚全能干细胞均一、稳定、生长周期短。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页10申请公布号CN104152408ACN104152408A1/1页21亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1分离、洗涤和剪碎脐带组织；步骤2胶原酶消化配制012的胶原酶，加入经步骤2的脐带组织，在37、150RPM震荡消化1060MIN，得细胞悬液；步骤3亚全能干细胞的获得向步骤2离心管内的细胞悬液补加等量生理盐水稀释，经150目筛网过滤，收集细胞初悬液，将细胞初悬液进行梯度离心，细胞初悬液梯度离心分。
3、为三个梯度，分别是2000RPM、10MIN，1500RPM、10MIN，1200RPM、10MIN，取梯度离心得到的细胞沉淀加入培养基重悬，得到细胞悬液即为亚全能干细胞悬液。2根据权利要求1所述的亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，所述组织的分离、洗涤和剪碎的步骤中，组织最优剪碎时间为1015MIN，剪碎大小为23MM3。3根据权利要求1所述的亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，所述胶原酶消化的步骤中，胶原酶的浓度为05，所述胶原酶为胶原酶P，37,消化时间为1525MIN。4根据权利要求1所述的亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1分离、洗涤和剪碎脐带组织操作前进行消毒处理。5根据。
4、权利要求4所述的亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，所述消毒处理方法为脐带两端结扎后，放入75的酒精中浸泡12MIN，用09生理盐水清洗23次；胎盘羊膜面、绒毛膜和基蜕膜面用75的酒精棉顺时针擦拭，重复一遍。6根据权利要求1所述的亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，所述分离、洗涤和剪碎脐带组织方法为脐带剔除一根脐静脉和两根脐动脉，获得华通氏胶，将羊膜从胎盘上剥离，取下羊膜后剥离绒毛主干和游离绒毛膜末端的基蜕膜，将不同的组织放入无菌皿内，再使用09生理盐水洗涤，去除残余的红细胞，将处理好的组织放入离心管内，用钝头无菌剪剪成055MM3小块，剪碎时间为1040MIN。权利要求书CN10415240。
5、8A1/4页3亚全能干细胞的制备方法技术领域0001本发明涉及干细胞工程技术领域，具体涉及一种亚全能干细胞的制备方法。背景技术0002干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞、新生儿干细胞和成体干细胞，按照干细胞分化潜能的不同，可以分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。目前，已有利用干细胞治疗心肌梗塞、红斑狼疮、类风湿性关节炎、神经损伤和肌肉萎缩等。0003亚全能干细胞是指具有三胚层分化潜能的一类干细胞亚群，在特定环境下，理论上可以诱导分化为人体任何一种组织细胞，主要来源于人体中广泛存在。
6、的间充质组织，特别是骨髓、脂肪、脐带和胎盘等间充质组织，由于脐带和胎盘来源的亚全能干细胞具有更为原始和更为强大的增值能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。0004作为要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有如下特点组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制；分离过程简单，无外源污染引入；外来添加物少，过程可控性强，重复性好；可获得足够细胞，细胞活力好；培养周期短，成本低。目前亚全能干细胞的制备过程中，获得的亚全能干细胞不稳定，且需要多次传代才可获得足够的干细胞，因此生长周期长。0005现有技术人脐带间充质干细胞及其制备方法CN102127522使用到了。
7、含抗生素HANKSBALANCEDSALTSOLUTION和DPBS溶液，成本高而且是科研研究用的，引入不要的风险。其还使用II型胶原酶、IV型胶原酶、II型胶原酶和胰酶混合液、或II型胶原酶和透明质酸酶混合液中的一种。消化时间长达6小时且效果一般。0006现有技术一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法申请号2013101705749。方法复杂且用到牛血清等试剂。发明内容0007本发明的目的提供亚全能干细胞的制备方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。0008根据本发明的一个方面，亚全能干细胞的制备方法，包括如下步骤0009亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤0010步骤1。
8、分离、洗涤和剪碎脐带组织，预处理提高制备效果。0011步骤2胶原酶消化配制012的胶原酶，加入经步骤2的脐带组织，在37、150RPM震荡消化1060MIN，得细胞悬液；0012步骤3亚全能干细胞的获得向步骤2离心管内补加等量生理盐水，经150目筛网过滤，收集细胞初悬液，将细胞初悬液进行梯度离心，细胞初悬液梯度离心分为三个梯说明书CN104152408A2/4页4度，分别是2000RPM、10MIN，1500RPM、10MIN，1200RPM、10MIN，取梯度离心得到的细胞沉淀加入培养基重悬，得到细胞悬液即为亚全能干细胞。使用此特点参数分离效果好对细胞伤害小。获得的亚全能干细胞均一、稳定、生。
9、长周期短。0013在一些实施方式中，组织的分离、洗涤和剪碎的步骤中，组织最优剪碎时间为1015MIN，最优剪碎大小为23MM3。0014在一些实施方式中，胶原酶消化的步骤中，胶原酶的最优浓度为05，37，最优消化时间为1525MIN。由此消化时间缩短，消化效果仍可保证，且对细胞伤害小见表一和图17。0015在一些实施方式中，分离、洗涤和剪碎脐带组织操作前进行消毒处理。由此即使脐带组织采集环境条件不同，环境可能无法达到完全无菌的条件仍然可以保证亚全能干细胞提取安全。0016在一些实施方式中，消毒处理方法为脐带两端结扎后，放入75的酒精中浸泡12MIN，用09生理盐水清洗23次；胎盘羊膜面、绒毛膜。
10、和基蜕膜面用75的酒精棉顺时针擦拭，重复一遍。不使用抗生素并根据组织特性消毒。0017在一些实施方式中，分离、洗涤和剪碎脐带组织方法为脐带剔除一根脐静脉和两根脐动脉，获得华通氏胶，将羊膜从胎盘上剥离，取下羊膜后剥离绒毛主干和游离绒毛膜末端的基蜕膜，将不同的组织放入无菌皿内，再使用09生理盐水洗涤，去除残余的红细胞，将处理好的组织放入离心管内，用钝头无菌剪剪成055MM3小块，剪碎时间为1040MIN。0018胶原酶P，其作用是消化细胞间的胶原组织，加速细胞解离出来，不对细胞产生破坏。选用这种特定酶经过大量实践筛选。0019华通氏胶为构成脐带的凝胶状物质，主要成份是黏多糖MUCOPOLYSACC。
11、HARIDES，也含有成纤维细胞和巨噬细胞，是一种黏膜组织。当婴儿分娩后，温度的改变使华通氏胶内部的结构发生蹋陷，从而钳住脐带内的血管，此过程一般持续约五分钟。华通氏胶内的部份细胞具有干细胞的特质。0020本发明提供的亚全能干细胞的制备方法，还有以下优点0021本发明可从一种从脐带、胎盘羊膜、绒毛膜或基蜕膜组织中分离亚全能干细胞。0022本发明组织样本经过组织表面消毒和组织样本的反复洗涤处理，避免采集环节出现的污染。0023本发明样本组织洗涤液为医用09的生理盐水，而非科研研究用的杜氏磷酸缓冲液DPBS等，易于后续使用。0024本发明的干细胞分离技术结合专门的培养基，使细胞经过一次传代就可以获。
12、得足够的干细胞用于储存。细胞冻存代数越早，细胞的增殖，活力，分化能力就越好。附图说明0025图1为05胶原酶P浓度作用下获得的亚全能种子细胞活力图；0026图2为01胶原酶P浓度作用下获得的亚全能种子细胞活力图；0027图3为2胶原酶P浓度作用下获得的亚全能种子细胞活力图；0028图4为05胶原酶P浓度作用下获得的亚全能种子细胞24H换液后细胞长势图；说明书CN104152408A3/4页50029图5为01胶原酶P浓度作用下获得的亚全能种子细胞24H换液后细胞长势图；0030图6为2胶原酶P浓度作用下获得的亚全能种子细胞24H换液后细胞长势图；0031图7为本发明提取的亚全能干细胞表面标志物。
13、检测结果。具体实施方式0032下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下面对本发明作进一步详细说明。0033实施例10034组织的获得将新生儿的脐带，置于无菌条件下，在12H内分离，胎盘取自足月健康孕妇，孕妇HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体等检测项目均为阴性，胎盘自手术台取下后，浸在含有抗生素的09的生理盐水里，维持在4的环境下保存；0035消毒处理脐带两端结扎后，放入75的酒精中浸泡12MIN，用09生理盐水清洗23次，剔除组织表面残留的血液；胎盘羊膜面、绒毛膜和基蜕膜面用75的酒精棉顺时针擦拭，重复一遍；环境可能无法达到完全无菌的条件仍然。
14、可以保证亚全能干细胞提取安全，脐带与胎盘羊膜面、绒毛膜、基蜕膜面根据其特性所以消毒处理不同，脐带可以酒精浸泡，胎盘羊膜面、绒毛膜和基蜕膜面脆弱不可浸泡酒精。0036组织的分离、洗涤和剪碎脐带剔除一根脐静脉和两根脐动脉，获得华通氏胶，将羊膜从胎盘上剥离，取下羊膜后剥离绒毛主干和游离绒毛膜末端的基蜕膜，将不同的组织放入无菌皿内，再使用09生理盐水洗涤3次，去除残余的红细胞，将处理好的组织放入50ML的离心管内，10ML/管，用钝头无菌剪剪成13MM3小块，剪碎时间为1015MIN；0037胶原酶消化配制05的胶原酶，在离心管中加入05的胶原酶充分混匀，在37、150RPM震荡消化1525MIN。不。
15、同酶浓度作用下获得的亚全能种子细胞数和活力的比较见表一。0038表一不同酶浓度作用下获得的亚全能种子细胞数和活力的比较0039胶原酶P浓度05012消化时间25MIN1H10MIN组织量10ML10ML10ML原始种子数个451052310545105细胞活力909080细胞活力图图1图2图324H后细胞长势图4图5图60040可见本方法加速细胞解离出来，不对细胞产生破坏，使用此特点参数分离效果好对细胞伤害小。细胞活力好，细胞长势良好。说明书CN104152408A4/4页60041亚全能干细胞的获得向离心管内细胞悬液补加等量生理盐水稀释，经150目筛网过滤，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经20。
16、00RPM、10MIN，1500RPM、10MIN，1200RPM、10MIN三次梯度分离后，加入10ML培养基重悬，取离心得到的细胞沉淀加入无血清培养基重悬，得到细胞悬液即为亚全能干细胞。0042实施例2配制01的胶原酶,其他步骤同实施例1。0043实施例3配制2的胶原酶,其他步骤同实施例1。0044结果分析0045亚全能干细胞表面标志物0046将收集的干细胞进行培养23代，消化离心后，将细胞沉淀用DPBS洗涤2次，取约051X106，100UL细胞悬液放于流式上样管中，加入一抗15UL，4孵育30MIN后，加入400ULDPBS，1500RPM离心6MIN，弃去上清，加入10UL的二抗，4。
17、孵育30MIN后，加入400ULDPBS，1500RPM离心6MIN，弃去上清，加入500ULDPBS混匀，上机检测。检测阳性指标FLK1，CD73，CD90，CD105，阴性指标CD34，HLADR,阳性率95，阴性率2。说明我们分离得到的是脐带、胎盘亚全能干细胞而不是其他细胞，见表二及图7。0047表二人脐带亚全能干细胞表面标志物的检测结果00480049本发明组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制；分离过程简单，无外源污染引入，不用到牛血清等试剂；外来添加物少，过程可控性强，重复性好；可获得足够细胞，细胞活力好；周期短，成本低。0050以上所述仅是本发明的优选方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干相似的变形和改进，这些也应视为本发明的保护范围之内。说明书CN104152408A1/2页7图1图2图3图4图5图6说明书附图CN104152408A2/2页8图7说明书附图CN104152408A。