髓样细胞分化蛋白MyD88在制备药物制剂中的用途 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，涉及一种髓样细胞分化蛋白在制备药物制剂中的用途，具体涉及髓样细胞分化蛋白MyD88蛋白在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒是一种对人体产生严重危害的病原体，它能引起慢性活动性肝炎，而且增加肝细胞癌变的机率[Kao，J.H.et al.Lancet Infect.Dis.2002，2：395-403]。虽然目前重组HBV疫苗已经被广泛使用，HBV感染仍然是对全球各国的一大挑战。目前，能抑制HBV复制的药物只有干扰素-α(Interferonalpha，IFN-α)和一些核苷类似物如拉米夫定等。然而干扰素治疗的痊愈率有限，停用后通常会出现复发现象。拉米夫定是HBV逆转录酶的强抑制剂，它能有效的阻断病毒的复制，然而有相当一部分病人在停药后复发，用药时间过长又会出现病毒变异[Carreno，V.et al.J.Hepatol.1992，15，102-106；Verhelst，D.et al.2000，24，342(8)：592]。深入了解乙型肝炎病毒与宿主细胞间的相互作用，寻找新的能抑制乙型肝炎病毒复制的制剂已成为各国科学家研究的热点。
迄今为止，对HBV持续性感染的分子机理尚未完全阐明，其主要原因是HBV持续性感染是病毒和机体宿主细胞之间一种复杂的相互作用，以往的研究方法和手段大多局限于单个蛋白质和基因等研究对象，故获得的信息较为有限，不能反映病毒和宿主细胞之间相互作用地整个过程。微点阵(Microarray)芯片技术是近年发展起来的一种利用核酸杂交原理检测未知核酸序列的新技术，可平行研究大量基因信息，为在基因组水平上全面的分析病毒与感染细胞基因表达谱的改变提供了可能。
MyD88蛋白首先在鼠髓样细胞中发现，随后证实该蛋白的编码基因在多种组织，尤其是在肝、脾和胸腺中广泛表达[Lord，K.A.et al.Oncogene，1990，5：387-396；Hardiman，G.et al.Oncogene.1996，13(11)：2467-2475]。近年来研究证实，MyD88是Toll样受体(Toll-like Receptors，TLRs)介导的先天免疫反应中的一个重要蛋白，而Toll样受体参与识别病原相关分子，如Toll样受体4(TLR4)参与识别细菌的脂多糖(LPS)，Toll样受体9(TLR9)参与识别细菌CpG DNA[Arbour，N.C.et al.Nat.Genet.2000，25：187-191；Bauer，S.et al.Curr.Top.Microbiol.Immunol.2002，270：145-154；Hemmi，H.etal.J.Immunol.2003，170：3059-3064]。另外，MyD88蛋白也参与IL-1受体和IL-18受体介导的信号通路[Adachi，O.et al.Immunity.1998，9，143-150]。上述膜受体激活后，引起该受体胞内的Toll样受体-IL-1受体结构域(TIRdomain)与MyD88蛋白上相同结构域发生同源结合，从而导致IL-1受体相关激酶(IRAK)的活化，最终使得核转录因子(NF-kB)游离并进入细胞核内，调控相应靶基因的转录，引起一系列的细胞生物学效应[Akira，S et al.Nat.Immunol.2001，2：675-680]。而有关MyD88抗病毒的作用则未见报道。
为了研究IFN抗病毒的机制、HBV持续存在对IFN诱导基因表达的影响及寻找新的抗病毒的细胞蛋白，有报道用含有14112个靶基因的人cDNA基因芯片检测了HepG2细胞和来源于HepG2细胞并整合有HBV基因组的HepG2.2.15细胞经IFN-α处理6h前后基因表达谱的差异。结果发现6小时已分别有34、83种细胞基因发生3倍以上的变化，24小时则达到48和103种。上述发生变化的已知细胞基因中，以干扰素相关基因最多，其次为细胞信号传导、激酶、磷酸化及配体受体结合相关基因。此外，还有部分细胞基因为新发现的EST或功能不明的未知基因。芯片结果还发现，与HepG2细胞相比，MyD88蛋白的基因表达在HBV复制的HepG2.2.15细胞中受抑制，而且IFN-α处理也不能使HepG2.2.15细胞中MyD88基因的表达恢复到HepG2细胞中同样的水平。
【发明内容】
本发明的目的是提供髓样细胞分化蛋白MyD88蛋白的新用途，具体涉及MyD88蛋白在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的应用。
本发明在有乙型肝炎病毒感染的细胞内导入MyD88蛋白或使细胞内源性MyD88蛋白表达增加，能使HBV表面抗原、e抗原及病毒复制中间体的合成均明显降低，同时细胞中总的和胞浆中所含的HBV RNA也出现显著的降低。通过核因子kappa B(NF-kB)激活报导系统发现MyD88蛋白与HBV能协同活化NF-kB信号系统。证实了MyD88蛋白具有抗乙型肝炎病毒新功能，可用于乙型肝炎病毒持续性感染等的治疗。
本发明的目的通过下述技术方案实现，
在乙型肝炎病毒感染的细胞内导入MyD88蛋白或使细胞内源性MyD88蛋白的表达增加。本发明将MyD88蛋白表达质粒与HBV复制型质粒共转染HepG2细胞或建立MyD88蛋白稳定表达细胞后将HBV复制型质粒转染该细胞，检测细胞中HBV表面抗原和e抗原的合成、病毒核心颗粒中HBV复制中间体的合成以及HBV RNA转录体的合成情况。
本发明技术方案包括下述方法和步骤，
1、构建质粒
按常规方法，用RT-PCR从IFN-α处理的HepG2细胞(购于中国医学科学院细胞库)中扩增获得MyD88基因(Genebank NM_002468)，然后克隆入原核表达载体pET23a(Novagen公司)，再转入以巨细胞病毒(CMV)为启动子的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(Invitrogen公司)，获得MyD88基因的真核表达质粒，命名为pcDNA-MyD88。
HBV复制型质粒pHBV3.8(中国科学院上海生物化学研究所)，含1.2拷贝HBV DNA(adr亚型)并有完整转录单元，其能在转染细胞内完成病毒的复制，细胞培养上清中可检测到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，细胞内可检测到病毒复制中间体。
分别将编码HBVx蛋白(HBx)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His构建HBx的真核表达质粒pcDNA-HBx及转染效率内参质粒pcDNA-CAT。
pCI-neo/HBs质粒为HBsAg基因经EcoRI酶插入含CMV启动子的真核表达载体pCI-neo(Promega公司)。
NF-kB依赖性荧光素酶报导质粒pNF-kB-Luc购自Stratagene公司。
2、细胞培养和建立MyD88稳定表达细胞株
人肝癌HepG2细胞培养于含10％胎牛血清、105u/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM培养基(Gibco公司)。将MyD88基因的真核表达质粒pcDNA-MyD88和其空载体pcDNA3.1/myc-His分别转染HepG2细胞，然后通过G418筛选培养，从pcDNA-MyD88转染的细胞中挑选MyD88稳定表达的细胞株，从pcDNA3.1/myc-His转染的细胞中挑选新酶素抗性对照细胞株(Neo)。
3、细胞转染及HBV表面抗原和e抗原检测
将HBV的复制型质粒pHBV3.8瞬时转染Neo、MyD88-6和MyD88-8细胞。在质粒转染后的1天、2天、3天分别收集培养细胞的上清，并用ELISA的方法检测其中的HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表达水平。CAT ELISA试剂盒(Roche公司)检测转染细胞内CAT活性，以平衡转染效率。实验重复三次，每次设复孔。
4、转染细胞胞浆内HBV病毒核心颗粒DNA抽提及Southern blot检测
将HBV的复制型质粒pHBV3.8瞬时转染Neo、MyD88-6和MyD88-8细胞，在转染2天后，用Southern blot检测转染细胞胞浆内HBV核心颗粒中病毒复制中间体DNA的含量。按林旭等(Lin et al.J.Virol.2001，75，11827-11833)的方法提取转染细胞胞浆内HBV病毒核心颗粒DNA。
5、Northern blot检测转染细胞总的和胞浆中HBV RNA含量
将pHBV3.8瞬时转染上述三株细胞，在转染2天后，用Northern blot检测转染细胞总的和胞浆中HBV RNA的水平。
6、NF-kB活性分析
将NF-kB依赖性荧光色素酶报导质粒pNF-kB-Luc和pHBV3.8共转染Neo、MyD88-6和MyD88-8细胞株，通过检测荧光色素酶活性判断分析NF-kB的活性。
本发明证实了在有乙型肝炎病毒感染的细胞内导入MyD88蛋白或使细胞内源性MyD88蛋白表达增加能使HBV表面抗原、e抗原及病毒复制中间体的合成均明显降低，同时细胞中总的和胞浆中所含的HBV RNA也出现显著的降低。通过核因子kappa B(NF-kB)激活报导系统发现MyD88蛋白与HBV能协同活化NF-kB信号系统。MyD88蛋白具有抗乙型肝炎病毒复制的新功能，可用于乙型肝炎病毒持续性感染等的治疗。
【附图说明】
图1是MyD88蛋白稳定表达的细胞株
其中，(A)Neo、MyD88-6、MyD88-8细胞株中MyD88蛋白表达水平。
(B)Neo、MyD88-6和MyD88-8细胞株的细胞生长曲线。
图2是MyD88蛋白抑制HBV蛋白的合成
其中，(A)细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平，
(B)细胞裂解物中HBsAg和HBeAg的表达水平。
图3是MyD88蛋白抑制HBV DNA的复制
其中，箭头所示为松驰环型(RC)、双链线型(DS)、单链线型(SS)HBVDNA。
图4是MyD88蛋白抑制细胞总的和胞浆中HBV RNA的转录
其中，(A)细胞总的HBV RNA的转录水平，
(B)胞浆中HBV RNA的转录水平。
图5是MyD88蛋白和HBV协同激活核因子NF-kB信号通路
其中，(A)MyD88稳定表达细胞株，
(B)HepG2细胞。
【具体实施方式】
实施例1建立MyD88稳定表达细胞株
人肝癌HepG2细胞培养于含10％胎牛血清、105u/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM培养基(Gibco公司)。用磷酸钙沉淀法将空载体pcDNA3.1/myc-His或pcDNA-MyD88(各8μg)转染HepG2细胞(1×106个)，36h后，将细胞以1∶4的比例接种到含200μg/ml G418(Gibco公司)的选择性培养基中。经G418筛选3周后，将新酶素抗性的单细胞克隆挑选出，其中经空载体pcDNA3.1/myc-His转染的细胞挑选出一株新酶素抗性对照细胞株(Neo)，经pcDNA-MyD88转染的细胞挑选出两株MyD88稳定表达的细胞株即MyD88-6和MyD88-8。用MyD88的单克隆抗体经Western blot检测上述两株MyD88稳定表达细胞株及经IFN-α处理或未处理的Neo细胞株中MyD88蛋白的表达水平，结果证实，在两株MyD88稳定表达细胞株中MyD88蛋白的表达均高于经IFN-α诱导之后Neo细胞株中MyD88蛋白的表达水平(图1A)。绘制上述三株细胞的生长曲线，证实MyD88蛋白在MyD88-6和MyD88-8两株细胞中高表达对细胞的生长没有显著的影响(图1B)。
实施例2MyD88对HBV蛋白合成的影响
将HepG2细胞、MyD88稳定表达细胞株及Neo细胞株接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，培养过夜后，用磷酸钙沉淀法将pHBV3.8(3μg)和pcDNA-CAT(0.5μg)瞬时转染上述细胞。16h后，换入新鲜的培养基，在IFN处理组细胞的培养基中加1000IU/ml重组人IFN-α(R & D公司)。继续培养1天、2天、3天后，分别收集细胞培养上清，培养三天后将细胞裂解，用HBV表面抗原和E抗原ELISA试剂盒(上海科华生物)检测细胞培养上清和细胞裂解物中HBsAg和HBeAg的水平，用CAT ELISA试剂盒(Roche公司)检测转染细胞内CAT活性，以平衡转染效率。实验重复三次，每次设复孔。
结果证实，与pHBV3.8转染的Neo细胞株相比，pHBV3.8转染后的MyD88-6细胞培养上清中分泌的HBsAg和HBeAg均降低了60％，而在MyD88-8细胞中HBsAg和HBeAg分别下降了35％和30％(图2A)。另外，pHBV3.8转染的Neo细胞经IFN-α处理后，其培养上清中HBsAg和HBeAg的含量分别下降了20％和15％(图2A)。进一步，将pHBV3.8转染3天后的细胞裂解，用同样的方法检测了细胞裂解物中HBsAg和HBeAg的含量。结果发现，与pHBV3.8转染的Neo细胞相比，HBsAg在MyD88-6、MyD88-8及IFN处理的Neo细胞内分别下降了55％、30％和15％，而HBeAg在上述细胞内分别下降了40％、15％、10％(图2B)。以上结果证明，MyD88蛋白降低了HBV表面抗原和e抗原的合成。
实施例3 MyD88蛋白对HBV复制的影响
将HepG2细胞、MyD88稳定表达细胞株及Neo细胞按1×106个细胞/皿，接种于60mm平皿，磷酸钙沉淀法将pHBV3.8(10μg)和pcDNA-CAT(1.5μg)瞬时转染上述细胞，IFN处理组细胞在转染16h后，加入1000IU/ml重组人IFN-α。转染48h后细胞用PBS洗1次，每皿细胞加入650μl新鲜配制的细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl pH7.9，1mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，1％NP40，8％蔗糖)，37℃静置10min，反复吹打分散细胞裂解物，4℃，12000r/min离心2min。取50μl上清用CAT ELISA检测细胞中CAT活性，以平衡转染效率，其余上清，按林旭等(Lin et al.J.Virol.2001，75，11827-11833)的方法提取转染细胞胞浆内HBV病毒核心颗粒DNA。根据转染效率，调整HBV DNA的上样量，经1％琼脂糖凝胶电泳后，将HBV DNA转移至阳离子尼龙膜(Roche公司)，再经120℃干烤30min固定。尼龙膜在42℃与含5×SSC、5×Denhardt溶液、1％SDS、50％甲酰胺、0.1mg/ml鲑鱼精DNA的杂交液预杂交6h后，与随机引物法标记的含[α-32P]dCTP的全长HBV探针在相同的杂交液中42℃杂交16h。然后分别用2×SSC+2g/L SDS、0.1×SSC+1g/L SDS、0.1×SSC在68℃洗膜30min，室温晾干，置-70℃放射自显影。放射自显影的斑点用凝胶成像系统扫描(KODAK 1D影像分析系统)并计算出目的条带的相对灰度值。实验重复三次。
结果显示，与pHBV3.8转染的Neo细胞相比，在MyD88-6和MyD88-8细胞中HBV复制中间体DNA的合成显著降低达80％，而在IFN-α处理的Neo细胞中HBV复制中间体下降30％。由此可见，除了降低HBV蛋白合成之外，MyD88蛋白能显著抑制HBV复制中间体DNA合成。
实施例4 MyD88蛋白对HBV RNA转录的影响
将HepG2细胞、MyD88稳定表达细胞株及Neo细胞按1×106个细胞/皿，接种于60mm平皿，培养过夜后，用磷酸钙沉淀法转染pHBV3.8(10μg)和pcDNA-CAT(1.5μg)。转染48h后，用TRIzol抽提转染细胞总RNA，或将转染细胞用裂解缓冲液(0.14M NaCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl，pH8.6，0.5％NP-40，1mM DTT，1000U/ml RNase inhibitor)裂解，离心去除细胞核后再用TRIzol提取胞浆RNA。将细胞总RNA和胞浆RNA与DNase I 37℃孵育20min，取10μg细胞总RNA或胞浆RNA经1％琼脂糖凝胶电泳后，将样品转移至阳离子尼龙膜(Roche公司)，然后与随机引物法标记的含[α-32P]dCTP的全长HBV探针，按Southern blot同样的步骤进行预杂交、杂交、洗膜及放射自显影。煮沸法去除尼龙膜上的HBV探针后，将膜再与[α-32P]dCTP标记的β-actin探针按同样的方法杂交。放射自显影的斑点用凝胶成像系统扫描，并用β-actin的杂交信号及CAT ELISA检测的细胞转染效率为内对照，计算目的条带的相对密度值。实验重复三次。
结果显示，在MyD88-6和MyD88-8细胞中，细胞总的和胞浆中HBV RNA转录体的水平分别下降了70％和60％，而在IFN-α处理的Neo细胞中总的和胞浆中HBVRNA转录体的水平仅分别下降了25％和20％(图4A，4B)。结果表明，在MyD88稳定表达细胞中，由于MyD88蛋白抑制HBV RNA的转录引起HBV蛋白合成和DNA复制水平的下降。
实施例5 MyD88蛋白和HBV协同激活NF-kB
将HepG2细胞、MyD88稳定表达细胞株及Neo细胞分别接种于12孔板，每孔2×105个细胞，培养过夜后，用磷酸钙沉淀法将pNF-kB-Luc(0.3μg)单独或与pHBV3.8(1μg)共同瞬时转染上述细胞。将pNF-kB-Luc(0.3μg)、pHBV3.8(1.0μg)、pcDNA-MyD88(1.0μg)、pcDNA-HBx(1.0μg)和pCI-neo/HBs(1.0μg)等质粒单独或共同转染相同数量的HepG2细胞。另外，各孔加pcDNA-CAT(0.3μg)作为转染效率内参。转染18h后，干扰素处理组细胞换入含有1000IU/ml重组人IFN-α的新鲜的培养基，继续培养6h后，将细胞裂解用荧光素酶检测系统(Promega公司)分析裂解物中荧光素酶活性，用CAT ELISA检测转染细胞内CAT活性，以平衡转染效率。实验重复三次，每次均设复孔。
结果表明，与对照Neo细胞株相比，在MyD88稳定表达细胞株中NF-kB的激活增加2倍左右，将HBV转染Neo细胞其NF-kB的激活有1.5倍增加，将HBV转染MyD88稳定表达细胞株后NF-kB的活化显著增加达6-8倍(图5A)。另外，将pNF-kB-Luc、pHBV3.8和pcDNA-MyD88共同瞬时转染HepG2细胞得到了相似的结果，即在MyD88和HBV共同存在的情况下NF-kB的激活显著增加(图5B)。进一步将HBV x蛋白(HBx)的真核表达质粒pcDNA-HBx和表面抗原(HBs)的真核表达质粒pCI-neo/HBs分别与pcDNA-MyD88、pNF-kB-Luc共转染HepG2细胞，结果发现，与单独转染HBV相比，HBx蛋白能更显著活化NF-kB(上升4倍左右)，但是HBx与MyD88共同存在时，其活化NF-kB仅为5倍左右，未达到HBV与MyD88协同激活NF-kB的水平(图5B)，而HBs不能激活NF-kB(图5B)。另外，IFN-α处理6h后NF-kB活化有微弱的增加(图5A，5B)。以上结果提示，MyD88蛋白和HBV能协同激活NF-kB，而这一过程不依赖HBx蛋白；在MyD88稳定表达细胞株中HBV复制的抑制与NF-kB信号系统活化有关。