严重地威胁到生命的真菌感染的发生率正以惊人的速率增加。1980到1990年期间在非教学医院中白色假丝酵母血流感染的病例数增加370%。同时，这一时期在教学医院中白色假丝酵母血流感染的发生率增加487%。除凝固酶阳性的葡萄球菌外，根据统计结果，在血流感染有关的医院中白色假丝酵母代表了相关的最快的生长领域（Banerjee等，1991，American Journal of Medicine 91（3B）：86S-89S）。 由于变化的医疗操作，包括关节置换和切开心脏外科手术的侵入性外科手术过程，增加使用的癌症化疗以及爱滋病的流行刺激了医院真菌感染发生率的上升。所有这些过程危及到免疫系统并提供了真菌感染的环境。
大约90%的医院真菌感染是以假丝酵母属为代表的。其余的真菌感染大部分是由曲霉属、隐球酵母属、以及卡氏肺囊虫为代表的。不幸的是，诊断真菌感染是困难和耗时地。不能等待诊断检测的结果，必须经常用如化合物两性霉素B（有高度毒性不利条件）或一种吡咯类化合物（真菌属快速地对该化合物产生抗性）开始经验医学的抗真菌治疗。于是，具有广谱活性并具有低毒性的抗真菌药是非常需要的。
对特异性真菌属的抗真菌化合物的发现及开发已获得了某种程度的成功。由于假丝酵母属代表了大部分真菌感染，设计筛选新抗真菌化合物的方案以发现抗假丝酵母的化合物。在产品开发期间，以抗白色假丝酵母属的活性为基础，抗真菌活性通常是最佳的。结果，这些抗假丝酵母属化合物通常不具有临床意义上的抗其他真菌属的活性。然而，有趣的是任意到其中某些化合物在较高浓度时能杀死其他真菌属，这提示在这些真菌中也存在着抗真菌药的靶标。回想一下，这些结果表明这些真菌具有天然的抗性机理，从而使它们在某些抗真菌化合物的临床使用浓度时能存活。这种真菌对抗真菌化合物的抗性的基本机理几十年来一直未曾描述。
在制定癌症化疗方式的过程中开始认识到由mdr（对多种药物具有抗性）基因介导的对多种药物的抗性问题。一种对多种药物具有抗性的癌细胞系显示出对高剂量的各种各样的细胞毒性化合物具有抗性。通常这些细胞毒性化合物没有共同的结构特征，也不与细胞内的共同靶标相互作用。对这些细胞毒性药物的抗性是由明显受控制的ATP依赖性泵介导的。由于该机理，特定化合物不可能在细胞中积累达到毒性剂量。
除了向胞外流出外，还有证据证明在细胞中内流也降低了，这表示对多种药物具有抗性（mdr）（Gottesman and Pastan，1993，Annual Review of Biochemistry 62∶385-427）。已对相当大的mdr基因族（包括大量的完全歧异的有机体）进行了定性。至今为止具有类似于mdr功能的生物体包括许多细菌，果蝇（黑猩猩果蝇）、恶性疟原虫、智人、酵母（低发酵度酿酒酵母）、新杆状线虫（Caenorhabditis eleqans）、杜氏利什曼原虫、海蟹卵块，以及植物拟南芥菜。
为了描述人癌细胞对多种药物具有抗性表观型，已进行了几十年的研究。大量的研究结果表明有几个类别的化合物能逆转对多种药物具有抗性的癌细胞系的mdr表现型，结果使得它们对细胞毒性化合物（例如钙离子通道抑制剂、抗心律失常药、抗高血压药、抗菌素、抗组织胺药、免疫抑制剂、甾类激素、变化的甾类、亲脂阳离子、二萜类、去污剂、抗抑郁药、抗精神病药，以及许多其他疏水的两性化合物及其类似物）的作用敏感（Gottesman and Pastan，1993，Annual Review of Biochemistry 62∶385-427）。将这些化合物称为mdr抑制剂。将人mdr抑制剂临床上用于癌症化疗已成为研究的集中焦点。
近来，已经发现，既在非致病的也在关键的致病真菌中存在对多种药物抗性（mdr）相关的基因。由于这些基因编码的蛋白质和人mdr-1基因产物之间存在同源性，因此将这些基因称作为“mdr-类似物”。
由于在各种各样真菌（包括主要的致病真菌如黄曲霉、烟曲霉和新型隐球酵母）中发现了mdr类似基因，因此使用包括一种具有被证实的对某些真菌有效的抗真菌药和真菌的mdr抑制剂进行结合治疗的期望成为现实。
使用结合治疗方法可以将以前证实仅有相应有限临床抗真菌活性的某些抗真菌化合物的抗真菌活性谱扩大。同样，由一种真菌mdr抑制剂也能加强具有被证实的抗真菌活性的化合物，这样这些化合物的抗真菌活性扩大到以前所述的具有抗性的真菌属。
本发明的一个方面是提供提高真菌细胞对抗真菌剂敏感性的方法，该方法包括给所述细胞施用有效剂量的各种（ⅰ）抗真菌剂和（ⅱ）加强剂。
另一方面，本发明提供了含有有效剂量的各种（ⅰ）抗真菌剂和（ⅱ）加强剂以及药物学上可接受的赋形剂的药物制剂。
再一个方面，本发明提供了测定在抗真菌剂与真菌细胞接触时一种化合物的抗真菌效果加强作用的试验方法，该方法包括：
a）在所述真菌细胞对其有抗性的一种抗真菌化合物（ⅰ）存在下，以及推测有加强抗真菌特性的一种化合物（ⅱ）存在下培养所述真菌细胞；以及
b）检测所述化合物对抗真菌剂的抗真菌效果的加强作用。
在本文中术语“试验对象”是指一种其中具有活存的真菌细胞系的生物体，器官，器官系统或一种生物体的细胞系。照此，可对试验对象进行体内或体外治疗。令人满意的试验对象是一种哺乳动物，包括正接受体内治疗的病人。
在本文中术语“抗真菌剂”或“抗真菌化合物”是指对真菌细胞具有抑制真菌细胞生长作用或对真菌细胞具有细胞毒性的化合物或组合物。
在本文中术语“加强剂”，“加强性”，“加强”或“被加强”等等是指一个化合物，一类化合物或组合物，它们具有增强抗真菌剂或抗真菌化合物的抗真菌细胞活性的特性。
术语“增强的活性”和“增强活性”是指一种抗真菌剂或抗真菌化合物在低于无加强剂时的浓度下所显示的抑制细胞作用或细胞毒性作用的能力，或者是指在无所述加强剂时对所述抗真菌剂或抗真菌化合物具有抗性的真菌细胞显示的细胞抑制作用或细胞毒性作用的能力。
术语“抗性的”或“抗性”是指一种生物体在对有关生物体具有细胞毒性的药物存在时的生长能力。
术语“抗真菌活性”或“抗真菌作用”是指一种抗真菌剂或抗真菌化合物对真菌细胞的细胞抑制作用或细胞毒性作用。
在本文中术语“给药”等等是指体外或体内适当地给予细胞一定剂量的抗真菌剂或抗真菌化合物或其组合物，以便产生治疗或预防效果。“给药”可以是仅将这些成分与细胞系接触，或者就哺乳动物试验对象而言，给药可用常规剂型进行。常规剂型包括口腔或舌下给药剂型如粉剂，珠状样品，片剂，胶囊剂，糖浆剂，静脉溶液注射剂或胶体混合物，应用的经皮或其他外用制剂有例如溶液，奶液剂，霜剂，凝胶剂或其他软膏剂，和/或速效或长效的植入制剂。
抗真菌剂和加强剂可以（a）同时给药（或者有选择地将两者用常用载体配制在一起），或（b）在常规的治疗安排期间内在不同的时间给药。对于后一种情况，服用二种化合物在时间上要充分地接近以使加强剂增强抗真菌药对真菌细胞的抗真菌活性。另外，也可以使一种或多种抗真菌剂以及一种或多种加强剂共存于一个制剂中。
加强剂的服用剂量要能使真菌细胞对服用的抗真菌剂敏感从而有效地降低所需的抗真菌药的剂量。在本发明方法中使用的抗真菌化合物的剂量依据需控制的特定真菌生物体，服用药物的具体情况，所选定的抗真菌剂，以及所使用的具体加强剂而定。
根据已知的制备药用组合物的方法，可以配制单剂的抗真菌剂和加强剂或配制其组合物，因此，将1个或多个抗真菌剂和1个或多个加强剂单独地进行配制，或与药学上可接受的载体赋形剂一起混合配制成组合物。合适的载体赋形剂及其含有其他人蛋白质（例如人血清白蛋白）的药剂描述于例如，Remington's Pharmaceutical Sciences16版，1980，Mack Publishing Co.，由Oslo等编辑。为了制备适用于宿主有效服用的组合物，这些组合物可以单独地含有有效剂量的抗真菌剂和加强剂，或者与合适量的载体赋形剂一起制成组合物。这样的组合物可以通过口腔，局部，非经肠道，或鼻腔或眼睛的途径给药，或借助其他确保抗真菌剂或加强剂能以有效形式输送到感染部位的途径给药。
下面的实施是为了帮助进一步理解本发明。所用的特定材料，品种和条件是为了进一步阐述本发明而不是为了限制其合理的范围。
实施例1
将临床分离的烟曲霉的10AF菌株（Eli Lilly and Company）用于进行抗真菌剂敏感性/加强作用试验。用长期贮存的孢子接种土豆葡萄糖琼脂（Difco Laboratories，Detroit，MI）而制备烟曲霉10AF菌株的孢子。将这些平板在35℃培养24小时，然后再在室温下培养1-2天直到有迹象形成孢子。用0.05%吐温80溶液侵没平板，缓慢地刮擦平板表面以悬浮孢子达到收集孢子目的。通过离心收集孢子，并再悬于含有50g/L乳糖，100ml/L甘油和850ml水的冷贮存的保存培养基中。按这种方式制备的孢子悬液贮存于-70℃时可贮存几个月保持存活。
将约1×106/ml的烟曲霉10AF菌株的孢子悬浮于高压蒸汽灭菌的Trypticase黄豆琼脂（冷至约50℃）中，将15ml悬浮液置于各个佩特里平皿上。使这些佩特里平皿的琼脂表面在防生物危害罩中干燥。
将抗真菌化合物R106I溶于100%乙醇中，浓度为1或7mg/ml。抗真菌化合物R106I公开于美国专利No.5，057，493，该文献引入本文供参考。将20μl的1mg/mlR106I溶液置于抗菌敏感性检测园片（Difco Laboratories，Detroit，MI）上。在加入抗菌溶液后，将园片在防生物危害罩中空气干燥，干燥时，将园片置于含烟曲霉孢子的佩特里平皿表面。
将能加强R106I对烟曲霉抗真菌活性的待测试化合物（即估计的加强剂）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中。加到DMSO中化合物的量依据各个待测试化合物的溶解性而定。将含有待测试化合物的20μl悬液置于抗菌敏感性检测园盘（Difco Laboratories，Detroit，MI）中。将含有待测试化合物的园盘在防生物危害罩中空气干燥。然后将这些园盘置于离含抗真菌剂园盘约2cm处的含有烟曲霉孢子干燥的佩特里平皿表面。将含两种园盘的佩特里平皿置于35℃保温过液。第二天早晨检测佩特里平皿在园盘周围生长抑制圈。
表1提供了化合物（即推测的加强剂）目录，以及应用上述方法测试这些化合物加强R106I抗菌曲霉活性的能力时所获得的结果。在上面指出的R106I各浓度下，在含R106I园盘周围没有观察到明显的生长抑制圈。在表1中，结果“+”表示在检测平板上存在生长抑制圈，因此，在与抗菌园片邻近的园片中含有的化合物加强了抗真菌化合物R106I的抗真菌活性。结果“-”表示在检测平板上不存在生长抑制圈，因此，检测的化合物没有加强抗真菌化合物R106I的抗真菌活性。表1还对许多受试化合物加强R106I的抗真菌活性能力给予了简短的描述。
表1 检测的化合物 结果 说明戊脉安1300mg/园盘2＋Ca2通道抑制剂；人mdr抑制剂文杂灵420mg/园盘2360mg/园盘3－＋抗肿瘤药剂；人mdr抑制剂三氟甲哌丙嗪1440mg/园盘1＋抗精神病药；安定药；人mdr抑制药
1.从Sigma Chemical Company，St.Louis Mo得到
2.R106I浓度=20mg/园盘
3.R106I浓度=140mg/园盘
实施例2
基本上按照Queener等，1985 Microbiology 1985，American Society for Microbiolgy，pp 468-472，以及Skatrud等，1987，Current Genetics，12∶337-348描述的用于顶头孢的方法，用Novozyme234制备产黄青霉菌（Eli Lilly and Co.）的原生质体。在产黄青霉菌原生质体形成时和随后的细胞壁再生期间，使用蔗糖而不使用上面参考文献中所述的氯化钠作为渗透稳定剂。制备含有一层琼脂层的佩特里平皿，该琼脂层由无氨基酸和硫酸铵的酵母氮基质（1.7g/L）（Difco Laboratories，Detroit，MI）；硫酸铵（5g/L）；蔗糖（125g/L），三氟甲哌丙嗪（最终浓度250mM；Sigma Chemical Co.Catalog # T-8516）；以及氯化镉（最终浓度3mM/ml）组成。将大约3×107产黄青霉菌原生质体置于4ml软琼脂交叠层中的固化琼脂表面，其中软琼脂交叠层是由下列成分组成：无氨基酸和硫酸铵的酵母氮基质（1.7g/L）（Difco Laboratories，Detroit，MI）；硫酸铵（5g/L）；蔗糖（125g/L）；以及琼脂（4g/L）。将平皿在15℃培养过夜。
第二天早晨向平板的4ml软琼脂交叠层中加入潮霉素B（最终浓度250mg/ml，Boehringer Mannheim Catalog # 843 555），其中琼脂层是由无氨基酸和硫酸铵的酵母氮基质（1.7g/L）（Difco Laboratories，Detroit，MI）；硫酸铵（5g/L）；蔗糖（125g/L）以及琼脂（4g/L）组成。将平板置于28℃培养48小时。完成下一步测试，其中三氟甲哌丙嗪以及潮霉素B的浓度按表2所示变化。
该检测试验的结果列于表2中。这些结果表明三氟甲哌丙嗪的存在加强了潮霉素B对产黄青霉菌的毒性作用。在表2中，结果“+”表示产黄青霉菌细胞生长，因此，潮霉素B的毒性作用未受TFP的增强。“-”结果表明产黄青霉菌培养物没有生长，因此，潮霉素B的毒性作用由三氟甲哌丙嗪增强。
表2
产黄青霉菌的生长