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表达CASAR的真菌抗性植物
申请人要求2012年11月13日提交的EP 12192316.3的优先权，该专 利在此完整引入作为参考。
技术领域
本发明涉及提高植物、植物部分和/或植物细胞对真菌病原体的抗性， 尤其是对柄锈菌目(Pucciniales)的病原体，例如大豆锈菌的抗性的方法。这 通过与野生型植物、野生型植物部分和/或野生型植物细胞相比提高植物、 植物部分和/或植物细胞中CASAR蛋白的表达和/或活性来达到。
此外，本发明涉及对真菌病原体具有提高的抗性，尤其是对柄锈菌目 的病原体，例如大豆锈菌具有提高的抗性的转基因植物、植物部分和/或植 物细胞；涉及包含与编码CASAR蛋白的序列相同或同源的序列的重组表 达载体。
背景技术
农作物植物的栽培主要服务于人类和动物粮食的生产。单作(现在的规 则)对流行病样传播的疾病高度敏感。结果是产率显著降低。到目前为止， 病原生物主要通过使用农药来控制。现在，直接修饰植物或病原体的遗传 素质的可能性也对人类开放。
抗性通常描述植物阻止或至少减少有害病原体的侵袭和建群的能力。 可以在植物抵御植物病原生物建群的天然存在的抗性中分辨出不同的机 制。病原体和宿主之间的这些特异性相互作用决定感染的过程(Schopfer 和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie,Springer Verlag, Berlin-Heidelberg,德国)。
对于小种特异性抗性(race specific resistance，也称为宿主抗性)，在相 容和不相容相互作用之间进行区分。在相容相互作用中，相互作用存在于 致病病原体和敏感植物之间。病原体存活，且可以建立生殖结构，而宿主 大部分相继死亡。另一方面，在病原体感染植物但其生长在微弱发展症状 之前或之后受抑制(大部分通过核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列 (NBS-LRR)家族的R基因的存在，见下文)时，存在不相容相互作用。在 后一种情况下，植物对该病原体具有抗性(Schopfer和Brennicke,见上文)。 但是，这种类型的抗性对某种菌株或病原体特异。
在相容和不相容相互作用二者中，存在宿主对病原体的防御性和特异 性反应。但是，在自然界中，这种抗性通常由于病原体的新的致病小种的 快速进化发展而被克服(Neu等(2003)American Cytopathol.Society, MPMI 16No.7:626-633)。
大多数病原体具有植物物种特异性。这意指病原体可以在某些植物物 种中但不在其他植物物种中诱发疾病(Heath(2002)Can.J.Plant Pathol. 24:259-264)。某些植物物种中对病原体的抗性称为非宿主抗性。非宿主抗 性提供对植物病原体的强烈、广泛和持久的防护。提供非宿主抗性的基因 提供了在非宿主植物中强烈、广泛和持久地防护某些疾病的机会。尤其是， 这种抗性对病原体的不同菌株有效。
真菌分布于全世界。迄今已知约100 000种不同的真菌物种。其中的 锈菌非常重要。它们可以具有至多五个不同孢子阶段(性孢子、春孢子、夏 孢子、冬孢子和担孢子)的复杂发育周期。
在病原真菌感染植物期间，通常观察到不同的阶段。植物病原真菌和 它们的潜在宿主植物之间相互作用的第一阶段对真菌对植物的建群具有决 定性。在感染的第一阶段，孢子附着于植物表面，萌发，真菌侵入植物。 真菌可以通过已存在的孔口如气孔、皮孔、hydatode和创伤侵入植物，或 者可以由于机械力及借助于细胞壁消化酶而直接侵入植物表皮。发展特异 性感染结构用于侵入植物。
植物在识别潜在病原体后立即开始引出防御反应。大多数情况下，通 过所谓的PAMP受体(一类识别保守的病原体相关分子(例如鞭毛蛋白或壳 多糖)的跨膜受体样激酶)感应病原体的存在。受体样激酶(RLK)是以通过跨 膜结构域与胞质激酶连接的胞外结构域为特征的信号发放蛋白。此结构表 明RLK接收外部信号，将它们转导入细胞。在植物中，RLK首先涉及发 育调节、病原体反应和识别事件。(Santiago A Morillo和Frans E Tax(2006) Functional analysis of receptor-like kinases in monocots and dicots. Current Opinion in Plant Biology 9:460–469)。
PAMP受体下游的植物激素唾液酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)在不 同防御反应的调节中发挥重要作用。取决于不同植物激素的比例，宿主细 胞引出不同的防御反应。通常，SA依赖性防御与对活体营养型(biotrophic) 病原体的抗性关联，而JA/ET依赖性防御反应对死体营养性 (necrotrophic)病原体(和昆虫)具有活性。
除局部防御反应外，受病原体局部攻击的植物诱导“全植物”持久系 统性防御反应，称为系统性获得性抗性(SAR)。SAR与大范围基因(所谓的 PR或“致病相关”基因)诱导、活性氧类别(ROS)爆发、乙烯产生和唾液 酸(SA)累积相关。
Lee和Hwang(Planta 2005,221卷:790–800)显示，称为SAR8.2(“辣 椒(Capsicum annuum)SAR”也称为CASAR)的基因由于细菌和真菌病原 体感染、非生物引发因素及通过诸如干旱、盐和低温的环境胁迫而系统性 累积在辣椒叶中。CASAR在拟南芥中的异位表达导致包括AtPR-1、 AtPR-4和AtPR-5的PR基因的组成型表达。此外，CASAR在拟南芥中 的过表达增强对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. Tomato)、Fusarium oxysporum f.sp.matthiolae或灰葡萄孢霉(Botrytis  cinerea)感染的抗性(Lee和Hwang,Plant Molecular Biology(2006) 61:95–109)。此外，Lee和Hwang(Plant Molecular Biology(2006) 61:95–109)等显示，纯化的重组CASAR蛋白和转基因植物的粗蛋白提取 物对一些植物病原真菌显示抗真菌活性。
Lee和Hwang(Plant Molecular Biology(2006)61:95–109)未证明对半 死体营养型(heminecrotrophic)真菌，尤其是对柄锈菌目的真菌病原体(锈 菌)的增强的抗性或抗真菌活性。这组具体的真菌病原体表征为独特的生活 周期。
例如，大豆锈菌豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)直接侵入植物表 皮。跨过表皮细胞后，真菌到达叶肉的细胞间隙，真菌在其中开始散布至 整个叶片。为了获得营养物，真菌侵入叶肉细胞，并在叶肉细胞内侧发展 吸器。在侵入过程中，所侵入的叶肉细胞的质膜保持完整。因此，大豆锈 病真菌与大豆建立活体营养型相互作用。
活体营养型植物病原真菌(如大豆锈菌和所有其他锈菌)使其营养依赖 于植物活细胞的代谢。与其他锈菌、白粉病真菌或卵菌病原体(如疫霉属 (Phytophthora)或霜霉属(Peronospora))一样，这类真菌属于活体营养型真 菌。死体营养型植物病原真菌使其营养依赖于植物的死细胞，例如来自镰 孢属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizoctonia)或球腔菌属(Mycospaerella)的物种。 大豆锈菌占据中间位置，因为它直接侵入表皮，随后所侵入的细胞坏死。 侵入后，真菌变换为强制性活体营养型生活周期。基本遵循这种感染策略 的活体营养型真菌病原体亚组为半死体营养型。与半死体营养型病原体不 同，半活体营养型(hemibiotrophic)病原体以活体营养方式短时期生活， 随后开始杀死宿主细胞和/或宿主生物，即在其生活周期的剩余时间变为死 体营养型生活周期。
大豆锈病最近变得日益重要。该疾病可以由活体营养型锈菌豆薯层锈 菌和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)引起。它们隶属于担子菌门 (Basidiomycota)柄锈菌目(锈菌)，之前还称为锈菌目(Uredinales)层锈菌科 (Phakopsoraceae)。两种锈菌都感染广谱的豆科宿主植物。豆薯层锈菌(也 称为亚洲锈菌)是对大豆(Glycine max)更具攻击性的病原体，因至至少目前 对农业具有重要意义。豆薯层锈菌可见于全世界几乎所有的热带和亚热带 大豆种植区。豆薯层锈菌可以在自然条件下感染来自豆科(Leguminosae) 的17个科的31个种，且能够在受控条件下在其他60个种上生长(Sinclair 等(编辑),Proceedings of the rust workshop(1995),National  SoyaResearch Laboratory,Publication No.1(1996)；Rytter J.L.等,Plant  Dis.87,818(1984))。已在加勒比海盆地和波多黎各发现了山马蝗层锈菌， 其尚未引起实质性损伤。
目前仅可以利用杀真菌剂在大田中控制豆薯层锈菌。对全谱分离菌具 有抗性的大豆植物还不可得。在搜寻抗性大豆资源时，通过筛查数千种大 豆变种发现了NBS-LRR家族的6个显性R基因，称为Rpp1-5and  Rpp？(Hyuuga)，其介导大豆对豆薯层锈菌的抗性。由于R基因源自宿主(大 豆)，抗性快速丧失，因为豆薯层锈菌发展出新的毒性小种。
近年来，真菌疾病(例如大豆锈病)作为农业生产中的虫害引起重视。 因此，现有技术中存在发展控制真菌及提供真菌抗性植物的方法的需求。
已在感染植物表皮层的白粉病和霉霜病领域进行了许多研究。但是， 对付感染叶肉的大豆锈病的问题仍未得到解决。
本发明的目的尤其是提供提高对真菌病原体，优选锈菌病原体(即柄锈 菌目的真菌病原体)，优选对层锈菌科的真菌病原体，更优选对层锈菌属 (Phakopsora)的真菌病原体，最优选对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为 大豆锈菌)的抗性的方法。
令人惊奇地，我们发现，可以通过提高CASAR基因的表达来控制真 菌病原体，尤其是柄锈菌目的真菌病原体，尤其是层锈菌科的真菌病原体， 例如大豆锈菌。
因此，本发明提供通过过表达一种或多种CASAR核酸来提高转基因 植物、转基因植物部分或转基因植物细胞对真菌病原体，优选对锈菌病原 体(即柄锈菌目的真菌病原体)，优选层锈菌科的真菌病原体，更优选对层 锈菌属的真菌病原体，最优选对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈 菌)的抗性的方法。
另一个目的是提供对真菌病原体，优选对锈菌病原体(即柄锈菌目的真 菌病原体)，优选对层锈菌科的真菌病原体，更优选对层锈菌属的真菌病原 体，最优选对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈菌)具有抗性的转 基因植物，用于产生这类植物的方法，及用于以上方法的载体构建体。
因此，本发明还涉及包含外源CASAR核酸的重组载体构建体和转基 因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。此外，本文要求保护用本发 明的核酸产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法。此 外，本文要求保护本发明的核酸或重组载体在转化植物、植物部分或植物 细胞中的用途。
通过主体权利要求书的主题来达到本发明的上述目的。通过从属权利 要求书的主题来定义本发明的优选实施方案。
发明概述
本发明的目的尤其是提供提高对真菌病原体，优选锈菌病原体(即柄锈 菌目的真菌病原体)，优选对层锈菌科的真菌病原体，更优选对层锈菌属的 真菌病原体，最优选对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈菌)的抗 性的方法。
令人惊奇地，我们发现，可以通过提高CASAR基因的表达来增强对 真菌病原体，尤其是层锈菌科的真菌病原体，例如大豆锈菌的抗性。
因此，本发明提供通过过表达一种或多种CASAR核酸来提高转基因 植物、转基因植物部分或转基因植物细胞对真菌病原体，优选对锈菌病原 体(即柄锈菌目的真菌病原体)，优选对层锈菌科的真菌病原体，更优选对 层锈菌属的真菌病原体，最优选对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆 锈菌)的抗性的方法。
另一个目的是提供对真菌病原体，优选对锈菌病原体(即柄锈菌目的真 菌病原体)，优选对层锈菌科的真菌病原体，更优选对层锈菌属的真菌病原 体，最优选对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈菌)具有抗性的转 基因植物，用于产生这类植物的方法，及用于以上方法的载体构建体。
因此，本发明还涉及包含外源CASAR核酸的重组载体构建体和转基 因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。此外，本文要求保护用本发 明的核酸产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法。此 外，本文要求保护本发明的核酸或重组载体在转化植物、植物部分或植物 细胞中的用途。
通过主体权利要求书的主题来达到本发明的上述目的。通过从属权利 要求书的主题来定义本发明的优选实施方案。
附图简述
图1显示用来确定野生型和转基因大豆受锈病真菌豆薯层锈菌染病的 叶面积水平的评分系统(如GODOY,C.V.,KOGA,L.J.&CANTERI,M.G. Diagrammatic scale for assessment of soybean rust severity.Fitopatologia  Brasileira 31:063-068.2006中所述)。
图2显示包含欧芹泛素启动子控制下的CASAR cDNA的植物转化载 体的示意图。
图3显示包含病原体诱导的“锈菌诱导叶肉特异性启动子820”控制 下的CASAR cDNA的植物转化载体的示意图。
图4显示具有SEQ ID NO:1的来自辣椒的CASAR基因全长cDNA 序列。
图5显示具有SEQ ID NO:2的具有用于大豆中的最优表达的密码子 优化的CASAR基因全长cDNA序列。
图6显示CASAR蛋白质序列(SEQ ID NO:3)。
图7显示具有SEQ ID NO:4的锈菌诱导叶肉特异性启动子820的序 列。
图8显示43种表达CASAR过表达载体构建体的转基因植物(源自5 个独立事件)的评分结果。用豆薯层锈菌的孢子接种表达CASAR蛋白的 T1大豆植物。接种后14天进行所有叶片上的染病叶面积的评价。将所有 叶片上显示真菌菌落或强烈黄化/褐化的叶面积百分比的平均值视为染病 叶面积。将全部43种表达CASAR(通过RT-PCR来检验表达)的大豆T1 植物与非转基因对照植物平行评价。图7中显示染病叶面积的平均值。与 非转基因对照植物相比，CASAR的过表达使染病叶面积显著(***: p<0.001)减少44.5％。
图9包含序列表的序列简述。
发明详述
可以通过参考以下本发明的优选实施方案及本文所包括的实例的详细 描述来更容易地理解本发明。
定义
除非另有说明，本文所用的术语将按照相关领域普通技术人员的常规 用法理解。除本文提供的术语定义外，分子生物学中常用术语的定义也可 见于Rieger等,1991Glossary of genetics:classical and molecular,第5版, Berlin:Springer-Verlag；及Current Protocols in Molecular Biology,F.M. Ausubel等,编辑,Current Protocols,a joint venture between Greene  Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1998Supplement) 中。
应理解，取决于使用的背景，说明书和权利要求书中所用的“一”或 “一个”可以意指一个或多个。因此，例如，提到“一个细胞”可以意指 可以利用至少一个细胞。应理解，本文所用的术语仅是为了描述具体实施 方案的目的，并非旨在限制。
在本申请通篇中，引用了多种出版物。所有这些出版物及在那些出版 物内完整引入的那些参考文献的公开内容在此引入本申请作为参考，以更 充分地描述本发明所属领域的现有技术。用于克隆、DNA分离、扩增和纯 化，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶促反应的 标准技术及多种分离技术是本领域技术人员已知和常用的技术。许多标准 技术描述于Sambrook等,1989Molecular Cloning,第2版,Cold Spring  Harbor Laboratory,Plainview,N.Y.；Maniatis等,1982Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,N.Y.；Wu(编辑)1993Meth. Enzymol.218,Part I；Wu(编辑)1979Meth Enzymol.68；Wu等,(编辑) 1983Meth.Enzymol.100and 101；Grossman和Moldave(编辑)1980Meth. Enzymol.65；Miller(编辑)1972Experiments in Molecular Genetics,Cold  Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；Old和Primrose, 1981Principles of Gene Manipulation,University of California Press, Berkeley；Schleif和Wensink,1982Practical Methods in Molecular Biology； Glover(编辑)1985DNA Cloning卷I和II,IRL Press,Oxford,UK；Hames 和Higgins(编辑)1985Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK； 及Setlow和Hollaender 1979Genetic Engineering:Principles and Methods, 卷1-4,Plenum Press,New York中。所利用的缩写和命名认为是本领域中 的标准，且常用于诸如本文所引用的那些专业期刊中。
蛋白质的“同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取 代、缺失和/或插入且具有与它们所衍生自的未修饰蛋白质相似的功能活性 的肽、寡肽、多肽、蛋白质和/或酶。
核酸的“同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰核酸具有核酸取代、缺 失和/或插入的核苷酸和/或多核苷酸，其中由这类核酸编码的蛋白质具有 与由它们所衍生自的未修饰核酸编码的未修饰蛋白质相似的功能活性。尤 其是，核酸的同源物可以涵盖以简并氨基酸密码为基础的取代。
术语“同一性”、“同源性”和“相似性”在本文中可互换使用。两个 核酸序列或氨基酸序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”在每种 情况下指各CASAR核酸序列或CASAR氨基酸序列的全长内。
优选地，通过以下来计算“序列同一性百分比”：在具体区域内比较两 个最佳比对的序列，确定在两个序列中都存在相同的碱基或氨基酸的位置 的数目来产生匹配位置数，将这类位置的数目除以所比较的区域中的总位 置数，并将结果乘以100。
用于比对序列进行比较的方法为本领域公知，这类方法包括GAP、 BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP用Needleman和Wunsch ((1970)J Mol Biol 48:443-453)的算法来找到两个序列的最大化匹配数并 最小化缺口数的全局(即跨越全序列)比对。BLAST算法(Altschul等(1990) J Mol Biol 215:403-10)计算两个序列间的百分比序列同一性或相似性或同 源性，并进行两个序列间同一性或相似性或同源性的统计学分析。用于进 行BLAST分析的软件可通过National Centre for Biotechnology  Information(NCBI)公开获得。例如，可以使用默认配对比对参数及以百 分比表示的评分方法，用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)容易地鉴定 同源物。还可以用可在MatGAT软件包(Campanella等,BMC  Bioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT:an application that  generates similarity/homology/identity matrices using protein or DNA  sequences.)中获得的方法之一确定全局相似性/同源性/同一性百分比。如对 本领域技术人员而言显而易见，可以进行小的手动编辑来优化保守基序之 间的比对。此外，还可以用具体结构域来鉴定同源物，而不是用全长序列 来鉴定同源物。以默认参数使用上文提到的程序，可以在整个核酸或氨基 酸序列内或在选定的结构域或保守基序内测定序列同一性值。对于全局比 对，Smith-Waterman算法尤其有用(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol. Biol 147(1)；195-7)。
还可以借助Informax(USA)公司的利用Clustal Method(Higgins DG, Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignments on a  microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2):151-1)的Vector NTI  Suite 7.1程序用以下设置来计算序列同一性：
多重比对参数：

配对比对参数：

备选地，可以按照Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi, Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.(2003) Nucleic Acids Res 31(13):3497-500、网页 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#和以下设置确定同一性

可以通过本领域已知的序列比较和比对算法(见Gribskov和Devereux, Sequence Analysis Primer,Stockton Press,1991及其中引用的参考文献)来 优化用于本发明的核酸或蛋白质和CASAR核酸或CASAR蛋白之间的序 列同一性，并通过例如用默认参数在BESTFIT软件程序中执行的 Smith-Waterman算法来计算核苷酸或蛋白质序列之间的百分比差异(例如 University of Wisconsin Genetic Computing Group)。
“缺失”指从蛋白质去除一个或多个氨基酸或从DNA、ssRNA和/或 dsRNA去除一个或多个核酸。
“插入”指在蛋白质或核酸中的预定位点引入一个或多个氨基酸残基 或核酸残基。
“取代”指用其他具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、 形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的氨基酸替换蛋白质的氨基 酸。
在核酸水平，取代指在核酸内用其他核苷酸替换一个或多个核苷酸， 其中由修饰核酸编码的蛋白质具有相似的功能。尤其是，核酸的同源物涵 盖以简并氨基酸密码为基础的取代。
氨基酸取代通常是单个残基的取代，但可以取决于施加在蛋白质上的 功能限制而簇聚，且可以在1至10个氨基酸的范围内；插入或缺失通常将 是约1至10个氨基酸残基的插入或缺失。氨基酸取代优选保守氨基酸取代。 保守取代表为本领域公知(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H. Freeman and Company(编辑)和以下表1或Taylor W.R.(1986)The  classification of amino acid conservation J Theor Biol.,119:205-18)。
表1：保守氨基酸取代的实例

残基 保守取代 残基 保守取代 Ala Ser Leu Ile；Val Arg Lys Lys Arg；Gln Asn Gln；His Met Leu；Ile Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr Gln Asn Ser Thr；Gly Cys Ser Thr Ser；Val Glu Asp Trp Tyr Gly Pro Tyr Trp；Phe His Asn；Gln Val Ile；Leu Ile Leu,Val    
氨基酸取代、缺失和/或插入可以用本领域公知的肽合成技术，如固相 肽合成等，或通过重组DNA操作容易地进行。
用于操作DNA序列来产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法为 本领域公知。例如，用于在DNA中的预定位点产生取代突变的技术为本 领域技术人员公知，且包括M13诱变、T7基因体外诱变(USB,Cleveland, OH)、QuickChange位点定向诱变(Stratagene,San Diego,CA)、PCR介导 位点定向诱变或其他位点定向诱变流程。
直向同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念。 旁系同源物是同一物种内通过祖先基因的复制起源的基因；旁系同源物是 来自不同生物的通过物种形成起源且也源自共同祖先基因的基因。
术语“编码”用于核酸通过遗传密码包含蛋白质氨基酸序列信息的能 力，即一连串密码子各为三个核苷酸的序列，其指定蛋白质合成期间随后 将加入哪种氨基酸。因此，术语“编码”包括核酸的所有可能的阅读框。 因此，术语“编码”还适用于编码序列被在翻译之前去除的非编码核酸序 列中断的核酸，例如包含内含子的核酸序列。
术语“结构域”指沿着进化上相关的蛋白质的序列比对在特定位置保 守的一组氨基酸。虽然其他位置上的氨基酸在同源物之间可以变化，但在 特定位置高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能中可能必 需的氨基酸。
存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids  Res 30,242-244)、InterPro(Mulder等,(2003)Nucl.Acids.Res.31, 315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax  for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence  interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference  on Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.,Brutlag D.,Karp  P.,Lathrop R.,Searls D.,编辑,53-61页,AAAI Press,Menlo Park；Hulo等, Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等,Nucleic  Acids Research 30(1):276-280(2002))。可在ExPASy蛋白质组学服务器 (Swiss Institute of Bioinformatics(Gasteiger等,ExPASy:the proteomics  server for in-depth protein knowledge and analysis,Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003))上获得用于计算机模拟分析蛋白质序列的一组工具。 结构域或基序也可以用常规技术，例如通过序列比对来鉴定。
本文所用的术语“真菌抗性”、“对真菌具有抗性”和/或“抗真菌”意 指减少、阻止或延迟真菌感染。术语“抗性”指真菌抗性。抗性并非意味 着植物必然对感染具有100％抗性。在优选实施方案中，增强或提高的真 菌抗性意指与野生型植物中的抗性相比，抗性植物中的抗性高10％、高 20％、高30％、高40％、高50％、高60％、高70％、高80％、高90％ 或高95％。
本文所用的术语“大豆锈菌抗性”、“对大豆锈菌具有抗性”、“抗大豆 锈菌”、“锈菌抗性”、“对锈菌具有抗性”或“抗锈菌”意指与野生型植物、 野生型植物部分或野生型植物细胞相比减少或阻止或延迟了层锈菌科，尤 其是豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈菌或亚洲大豆锈菌(ASR)) 对植物、植物部分或植物细胞的感染。抗性并非意味着植物必然对感染具 有100％抗性。在优选实施方案中，增强或提高的锈菌抗性意指与不抗大 豆锈菌的野生型植物相比，抗性植物中的锈菌抗性高10％、高20％、高 30％、高40％、高50％、高60％、高70％、高80％、高90％或高95％。 优选地，野生型植物是这样的植物，其具有与对大豆锈菌具有提高的抗性 的植物相似、更优选具有相同的基因型，但不包含外源CASAR核酸、该 外源CASAR核酸功能片段和/或能够与CASAR核酸杂交的外源核酸。
植物的真菌抗性水平可以以多种方式测定，例如通过评分/测量与总叶 面积相关的染病叶面积。测定抗性水平的另一种可能性是计数植物上大豆 锈菌菌落的数目或测量由这些菌落产生的孢子的量。解析真菌侵染程度的 另一种方式是通过定量(q)PCR特异性测量锈菌DNA的量。用于大多数真 菌病原体的特异性探针和引物可在文献(Frederick RD,Snyder CL, Peterson GL等2002Polymerase chain reaction assays for the detection  and discrimination of the rust pathogens Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae,Phytopathology 92(2)217-227)中获得。
本文所用的术语“杂交”包括“核酸分子的一条链借助其来通过碱基 配对与互补链结合的任意方法”(J.Coombs(1994)Dictionary of  Biotechnology,Stockton Press,New York)。杂交和杂交强度(即核酸分子间 结合的强度)受诸如核酸分子间的互补程度、所涉及的条件的严格性、所形 成的杂交核酸的Tm和核酸分子内的G:C比的因素影响。
本文所用的术语“Tm”参考“解链温度”使用。解链温度是双链核酸 分子群体的一半解离为单链的温度。计算核酸分子Tm的方程为本领域公 知。如标准参考文献所指出，在核酸分子处于1M NaCl水溶液中时，Tm 值的简单估计值可以通过方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)来计算(见例如 Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic Acid  Hybridization(1985))。其他参考文献包括更精细的计算，其考虑结构以及 序列特征来计算Tm。严格条件为本领域技术人员已知，且可见于Current  Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6 中。
具体而言，术语“严格条件”指这样的条件，其中作为互补核酸分子 (DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)的片段或与互补核酸分子相同的100个相 邻核苷酸或更多、150个相邻核苷酸或更多、200个相邻核苷酸或更多或 250个相邻核苷酸或更多在等同于50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5 M NaPO4、1mM EDTA中杂交并在50℃或65℃、优选在65℃下在2X  SSC、0.1％SDS中洗涤的条件下与具体核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或 ss RNA)杂交。优选地，杂交条件等同于50℃下在7％十二烷基硫酸钠 (SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交并在50℃或65℃、优选65℃ 下在1X SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选地，杂交条件等同于50℃下在 7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交并在50℃ 或65℃、优选65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤。优选地，互补核 苷酸与CASAR核酸的片段或整个CASAR核酸杂交。备选地，优选的杂 交条件涵盖在65℃下在1x SSC中或在42℃下在1x SSC和50％甲酰胺中 杂交，然后在65℃下在0.3x SSC中洗涤，或者在50℃下在4x SSC中或在 40℃下在6x SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在50℃下在2x SSC中洗涤。 其他优选的杂交条件是0.1％SDS、0.1SSD和65℃。
除非文中清楚地另有说明，术语“植物”旨在涵盖处于成熟或发育的 任意阶段的植物，及取自或源自任意这种植物的任意组织或器官(植物部 分)。植物部分包括但不限于植物细胞、茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、 叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、 小孢子、原生质体、发根培养物等。本发明还包括由本发明的植物产生的 种子。优选地，该种子包含外源CASAR核酸。在一个实施方案中，该种 子可以发育为与该植物种子的野生型变种相比具有提高的对真菌感染的抗 性的植物。本文所用的“植物细胞”包括但不限于原生质体、产配子细胞 和再生为整株植物的细胞。植物多种组织的组织培养物及从其再生植物为 本领域公知，并广泛公开。
本文提到“内源”核酸和/或蛋白质指所讨论的核酸和/或蛋白质以其 天然形式见于植物中(即不存在任何人为干预)。
术语“外源”核酸指借助基因技术引入植物的核酸。“外源”核酸可以 以其天然形式存在于植物中，不同于以其天然形式见于植物中的所讨论的 核酸，或者可以与以其天然形式见于植物中的核酸相同，但不整合在其天 然遗传环境内。“外源的”的相应含义适用于蛋白质表达的背景。例如，与 内源基因的表达相比，包含转基因(即外源核酸)的转基因植物可以遇到各 基因或蛋白质的总表达的实质性增加。本发明的转基因植物包含整合在任 意基因座上的外源CASAR核酸，可选地，该植物还可以包含天然遗传背 景内的内源基因。
为了本发明的目的，“重组体”意指例如包含任意一个或多个CASAR 核酸的核酸序列、核酸分子、表达盒或载体构建体，所有那些构建都由人 通过基因技术方法产生，其中：
(a)该一个或多个CASAR核酸或其部分的序列，或
(b)与本发明的CASAR核酸序列有效连接的一个或多个遗传控制序 列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不定位在其天然遗传环境中或已由人通过基因技术方法修饰。修饰可 以采取例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。 天然遗传环境理解为意指最初的植物中的天然基因组或染色体基因座，或 存在于基因组文库中，或与天然启动子组合。
例如，在由人通过非天然、合成(“人工”)方法(例如诱变处理)修饰此 表达盒时，天然存在的表达盒——例如核酸序列的天然启动子与上文定义 的编码用于本发明的方法的蛋白质的相应核酸序列的天然存在的组合—— 成为重组表达盒。适宜的方法描述于例如US 5,565,350、WO 00/15815或 US200405323中。此外，在此表达盒不整合在天然遗传环境中而是整合在 不同遗传环境中时，天然存在的表达盒——例如核酸序列的天然启动子与 上文定义的编码用于本发明的方法的蛋白质的相应核酸序列的天然存在的 组合——成为重组表达盒。
术语“分离的核酸”或“分离的蛋白质”指不定位在其天然环境中、 尤其是其天然细胞环境中的核酸或蛋白质。因此，分离的核酸或分离的蛋 白质基本上与其天然环境的其他成分分开。但是，本领域技术人员意识到， 取决于所使用的分离方法，分离的核酸或分离的蛋白质的制备物可以展示 某种程度的杂质。用于纯化核酸和蛋白质的方法为本领域公知。分离的基 因可以分离自生物，或可以是人造的，例如通过化学合成。在这方面，重 组核酸也可以处于分离的形式。
本文所用的术语“转基因的”指外源包含本文所述的核酸、重组构建 体、载体或表达盒或其部分的生物，例如植物、植物细胞、愈伤组织、植 物组织或植物部分，该核酸、重组构建体、载体或表达盒或其部分优选通 过非基本生物方法、优选通过农杆菌转化引入。重组构建体或其部分稳定 整合入染色体，使得它通过克隆繁殖、营养繁殖或有性繁殖传递至连续世 代。基本生物方法可以是植物的杂交和/或天然重组。
因此，用于本发明目的的转基因植物、植物细胞或组织理解为意指借 助基因技术将包含一个或多个CASAR核酸的外源CASAR核酸、重组构 建体、载体或表达盒整合入基因组。
“野生型”植物、“野生型”植物部分或“野生型”植物细胞意指该植 物、植物部分或植物细胞不表达外源CASAR核酸或外源CASAR蛋白。
天然基因座意指具体染色体上的位置，优选某些基因之间的位置，更 优选与转化的最初植物中相同的序列背景。
优选地，转基因植物、植物细胞或其组织表达本文所述的CASAR核 酸、CASAR构建体或CASAR表达盒。
术语“表达”或“基因表达”意指一个或多个特定基因或特定遗传载 体构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指一个或多个基因 或遗传载体构建体转录为结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，随后将后 者翻译为或不翻译为蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得到的RNA产 物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括mRNA的翻译和用它 合成所编码的蛋白质，即蛋白质表达。
本文所用的术语“增加的表达”或“增强的表达”或“过表达”或“含 量的增加”意指除了最初的野生型表达水平的任意形式的表达。为了本发 明的目的，最初的野生型表达水平也可以是零(缺乏表达)。
用于增加基因或基因产物的表达的方法在本领域中由大量文件记载， 且包括例如由适当启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。 可以在非异源形式的多核苷酸的适当位置(通常在上游)引入作为启动子或 增强子元件的分离的核酸，以上调编码目的蛋白质的核酸的表达。例如， 可以通过突变、缺失和/或取代来在体内改变内源启动子(见Kmiec,US  5,565,350；Zarling等,WO9322443)，或者可以按适当的取向和与本发明的 基因的距离将分离的启动子引入植物细胞，以控制基因的表达。
术语“功能片段”指任意核酸或蛋白质，其仅分别包含全长核酸或全 长蛋白质的部分，但分别在植物中表达或抑制时仍提供相同的功能，例如 真菌抗性。优选地，该片段包含最初的序列的至少50％、至少60％、至少 70％、至少80％、至少90％at least 95％、至少98％、至少99％。优选 地，该功能片段分别包含最初的核酸或最初的蛋白质中的相邻核酸或氨基 酸。在一个实施方案中，任意CASAR核酸的片段在各CASAR核酸的至 少20％、至少30％、至少50％、至少75％、至少90％核苷酸的长度内具 有上文定义的同一性。
本文所用的术语“剪接变体”涵盖其中已切除、替换、移动或加入选 定的内含子和/或外显子，或其中已缩短或延长内含子的核酸序列变体。因 此，剪接变体可以去除或加入一个或多个或甚至全部内含子。根据此定义， 将cDNA视为分别含有内含子的基因组序列的剪接变体，反之亦然。这类 剪接变体可以见于自然界中，或者可以是人造的。用于预测和分离这类剪 接变体的方法为本领域公知(见例如Foissac和Schiex(2005)BMC  Bioinformatics 6:25)。
在希望过表达核酸的情况下，术语“相似的功能活性”或“相似的功 能”意指在植物中表达时，任意同源物和/或片段都提供真菌抗性。优选地， 相似的功能活性意指与通过外源表达SEQ ID NO:1或2定义的CASAR 核苷酸序列或SEQ ID NO:3定义的CASAR蛋白质序列提供的功能活性 相比，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少 95％、至少98％、至少99％或100％或更高的真菌抗性。
本文所用的术语“提高的活性”或“增强的活性”意指具有提高的活 性且与仅表达各内源CASAR核酸的野生型植物相比提供提高的真菌抗性 的任意蛋白质。只要涉及过表达，为了本发明的目的，最初的野生型表达 水平也可以是零(缺乏表达)。
关于载体构建体和/或重组核酸分子，术语“有效连接”旨在意指待表 达的核酸以允许表达该核酸(例如在将载体引入宿主植物细胞时在宿主植 物细胞中)的方式与包括启动子、终止子、增强子和/或其他表达控制元件(例 如多腺苷酸化信号)的调节序列连接。这类调节序列描述于例如Goeddel, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic  Press,San Diego,CA(1990)及Gruber和Crosby,in:Methods in Plant  Molecular Biology and Biotechnology,Glick和Thompson编辑,第7章, 89-108,CRC Press:Boca Raton,Florida(包括其中的参考文献)中。调节序 列包括指导核酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些，及仅在 某些宿主细胞中或仅在某些条件下指导核苷酸序列表达的那些。本领域技 术人员将理解，载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所 希望的核酸表达水平等的因素。
本文提到的术语“引入”或“转化”涵盖外源多核苷酸转移入宿主细 胞，不考虑用来进行转移的方法。可以用本发明的载体构建体转化随后能 够进行克隆繁殖(通过器官发生或胚胎发生)的植物组织，并从其再生整株 植物。所选择的具体组织将取决于可用于和最适于所转化的具体物种的克 隆繁殖系统而不同。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、 雌配子、愈伤组织、现有分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织) 和诱导分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬 时或稳定引入宿主细胞，且可以例如作为质粒非整合维持。备选地，它可 以整合入宿主基因组。宿主基因组包括包含在细胞核中的核酸以及包含在 质体(例如叶绿体和/或线粒体)中的核酸。然后可以以本领域技术人员已知 的方式用所得到的转化植物细胞来再生转化植物。
术语“终止子”涵盖这样的控制序列，其是转录单位末端的DNA序 列，其发出初级转录物的3’加工和多腺苷酸化的信号，并终止转录。终止 子可以源自天然基因、源自多种其他植物基因或源自T-DNA。待加入的终 止子可以源自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或备选地源自另一植物 基因，或较不优选地源自任意其他真核基因。
发明详述
CASAR核酸
为达到提高对真菌病原体，例如层锈菌科的真菌病原体，例如大豆锈 菌的抗性而过表达的CASAR核酸优选是编码CASAR蛋白的核酸，且优 选如SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、或其 片段、同源物、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体所定义。 优选地，编码本发明的CASAR蛋白的核酸与SEQ ID NO:2、1、5-12、 13、15、17、19、21、23、25或27具有至少60％同一性、优选至少70％ 序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％ 序列同一性、或甚至100％序列同一性，或是其功能片段或其剪接变体。 最优选与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27 具有至少90％同一性、至少95％同一性、更优选至少98％同一性或至少 99％同一性。
优选地，为达到提高对真菌病原体，例如层锈菌科的真菌病原体，例 如大豆锈菌的抗性而过表达的CASAR核酸优选是编码CASAR蛋白的核 酸，且优选如SEQ ID NO:1、或其片段、同源物、衍生物、直向同源物或 旁系同源物、或其剪接变体所定义。优选地，编码本发明的CASAR蛋白 的核酸与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、 至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、 或甚至100％序列同一性，或是其功能片段或其剪接变体。最优选与SEQ  ID NO:1具有至少90％同一性、至少95％同一性、更优选至少98％同一 性或至少99％同一性。
更优选地，为达到提高对真菌病原体，例如层锈菌科的真菌病原体， 例如大豆锈菌的抗性而过表达的CASAR核酸优选是编码CASAR蛋白的 核酸，且优选如SEQ ID NO:2、或其片段、同源物、衍生物、直向同源物 或旁系同源物、或其剪接变体所定义。优选地，编码本发明的CASAR蛋 白的核酸与SEQ ID NO:2具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一 性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一 性、或甚至100％序列同一性，或是其功能片段或其剪接变体。最优选与 SEQ ID NO:2具有至少95％同一性、更优选至少98％或至少99％同一性。
优选地，该CASAR核酸是由选自以下的核酸组成或包含选自以下的 核酸的分离的核酸分子：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27 所示的核酸序列、或其功能片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或 其剪接变体按递增的优选顺序具有至少60％、至少61％、至少62％、至 少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少 69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、 至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至 少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少 88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、 至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同 一性的核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28所示的 氨基酸序列或其功能片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物按递增的优 选顺序具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至 少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少 71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、 至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至 少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、 至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的CASAR蛋白的核 酸；优选地，该CASAR蛋白具有与由SEQ ID NO:2或1编码的CASAR 蛋白基本相同的生物活性；优选地，该CASAR蛋白赋予相对于对照植物 增强的真菌抗性；
(iii)在高严格性杂交条件下与(i)或(ii)的任意核酸分子的互补序列杂交 的核酸分子；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有 与SEQ ID NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码 的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和
(iv)编码与以上(i)至(iii)的CASAR核酸相同的CASAR蛋白，但由于 遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的CASAR核酸的核酸。
优选地，编码本发明的CASAR蛋白的核酸与SEQ ID NO:3、14、16、 18、20、22、24、26或28具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一 性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一 性、或甚至100％序列同一性。最优选与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、 22、24、26或28具有至少95％同一性，更优选至少98％或至少99％同一 性。
优选地，编码本发明的CASAR蛋白的核酸与SEQ ID NO:3具有至 少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少 95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性。最优 选与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性，更优选至少98％或至少99％同 一性。
优选地，该CASAR核酸是由选自以下的核酸组成或包含选自以下的 核酸的分离的核酸分子：
(i)与SEQ ID NO:2所示的核酸序列、或其功能片段、衍生物、直向 同源物或旁系同源物、或其剪接变体按递增的优选顺序具有至少60％、至 少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少 67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、 至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至 少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少 86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、 至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至 少99％或100％序列同一性的核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其功能片段、衍生物、 直向同源物或旁系同源物按递增的优选顺序具有至少60％、至少61％、至 少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少 68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、 至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至 少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少 87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、 至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或 100％序列同一性的CASAR蛋白的核酸；优选地，该CASAR蛋白具有与 由SEQ ID NO:2编码的CASAR蛋白基本相同的生物活性；优选地，该 CASAR蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)在高严格性杂交条件下与(i)或(ii)的任意核酸分子的互补序列杂交 的核酸分子；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有 与SEQ ID NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码 的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和
(iv)编码与以上(i)至(iii)的CASAR核酸相同的CASAR蛋白，但由于 遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的CASAR核酸的核酸。
核酸的百分比同一性参考本文明确公开的序列中给出的整个核苷酸区 域显示。
优选地，CASAR核酸的部分的长度为SEQ ID NO:2、1、5-12、13、 15、17、19、21、23、25或27中给出的核酸序列的优选从核酸的5’或3’ 端计数的约150-160、约160-170、约170-180、约180-190、约190-200、 约200-210、约210-220、约220-230、约230-240、约240-250或约250-261 个核苷酸，优选连续核苷酸。
优选地，CASAR核酸包含SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、 21、23、25或27中所示的核酸序列的优选从核酸的5’或3’端计数的至少 约50、至少约75、至少约100、至少约125、至少约150、至少约160、至 少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、 至少约230、至少约240或至少约250个核苷酸，优选连续核苷酸，或至 多全长。
优选地，CASAR核酸的部分的长度为SEQ ID NO:2中给出的核酸 序列的优选从核酸的5’或3’端计数的约150-160、约160-170、约170-180、 约180-190、约190-200、约200-210、约210-220、约220-230、约230-240、 约240-250或约250-261个核苷酸，优选连续核苷酸。
优选地，CASAR核酸包含SEQ ID NO:2或1中所示的核酸序列的优 选从核酸的5’或3’端计数的至少约50、至少约75、至少约100、至少约 125、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至 少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240或至少约250 个核苷酸，优选连续核苷酸，或至多全长。
本文提到的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA 和mRNA)可以以已知的方式，通过从核苷酸构件化学合成来产生，例如 通过双螺旋的单个重叠、互补的核酸构件的片段缩合。寡核苷酸的化学合 成可以例如通过亚磷酰胺法以已知的方式进行(Voet,Voet,第2版,Wiley  Press,New York,896-897页)。合成寡核苷酸的累积及借助DNA聚合酶的 Klenow片段和连接反应填充缺口以及一般克隆技术描述于Sambrook等 (1989)中，见下文。
本文所述的CASAR核酸用于本发明的构建体、方法、植物、可收获 部分和产品。
CASAR蛋白
CASAR蛋白优选通过SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26 或28或其片段、同源物、衍生物、直向同源物或旁系同源物来定义。优选 地，本发明的CASAR蛋白由核酸编码，其与SEQ ID NO:3、14、16、18、 20、22、24、26或28或其功能片段具有至少60％同一性、优选至少70％ 序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序 列同一性或甚至100％序列同一性。更优选地，本发明的CASAR蛋白与 SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28具有至少60％同一性、 优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、 至少99％序列同一性或甚至100％序列同一性，或是其功能片段、其直向 同源物或旁系同源物。最优选与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、 26或28具有至少90％同一性、至少95％同一性、更优选至少98％或至少 99％同一性。
CASAR蛋白优选通过SEQ ID NO:3或其片段、同源物、衍生物、直 向同源物或旁系同源物来定义。优选地，本发明的CASAR蛋白由核酸编 码，其与SEQ ID NO:3或其功能片段具有至少60％同一性、优选至少70％ 序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序 列同一性或甚至100％序列同一性。更优选地，本发明的CASAR蛋白与 SEQ ID NO:3具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少 80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性或甚至100％ 序列同一性，或是其功能片段、其直向同源物或旁系同源物。最优选与SEQ  ID NO:3具有至少90％同一性、至少95％同一性、更优选至少98％或至 少99％同一性。
优选地，CASAR蛋白是由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以 下的氨基酸序列的蛋白质：
(i)与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28所示的氨基 酸序列或其功能片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物按递增的优选顺 序具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、 至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至 少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少 78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、 至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至 少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；优选地， 该CASAR蛋白具有与由SEQ ID NO:2或1编码的CASAR蛋白基本相 同的生物活性；优选地，该CASAR蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌 抗性；或
(ii)由与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27 所示的核酸序列、或其功能片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或 其剪接变体按递增的优选顺序具有至少60％、至少61％、至少62％、至 少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少 69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、 至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至 少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少 88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、 至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同 一性的核酸编码的氨基酸序列；优选地，该CASAR蛋白赋予相对于对照 植物增强的真菌抗性。
优选地，CASAR蛋白是包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质：
(i)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其功能片段、衍生物、直向 同源物或旁系同源物按递增的优选顺序具有至少80％、至少81％、至少 82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、 至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至 少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一 性的氨基酸序列；优选地，该CASAR蛋白具有与由SEQ ID NO:2或1 编码的CASAR蛋白基本相同的生物活性；优选地，该CASAR蛋白赋予 相对于对照植物增强的真菌抗性；或
(ii)由与SEQ ID NO:2或1所示的核酸序列、或其功能片段、衍生物、 直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体按递增的优选顺序具有至少 80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、 至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至 少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％或100％序列同一性的核酸编码的氨基酸序列；优选地，该CASAR 蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性。
优选的CASAR蛋白衍生物是由选自以下的氨基酸序列组成或包含选 自以下的氨基酸序列的CASAR蛋白：
与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28所示的氨基酸 序列按递增的优选顺序具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、 至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至 少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少 76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、 至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至 少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的氨基酸 序列；
其中不相同的氨基酸残基是SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、 26或28的相应氨基酸残基的优选如表1中所示的保守氨基酸取代；优选 地，该CASAR蛋白具有与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26 或28或由SEQ ID NO:2或1编码的CASAR蛋白基本相同的生物活性； 优选地，该CASAR蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性。
优选地，该CASAR蛋白由含有SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、 24、26或28的相应氨基酸残基的优选如表1中所示的保守氨基酸取代的 SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28所示氨基酸序列组成， 或包含含有SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28的相应氨 基酸残基的优选如表1中所示的保守氨基酸取代的SEQ ID NO:3、14、16、 18、20、22、24、26或28所示氨基酸序列。优选地，SEQ ID NO:3的1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、1-10、10-20、20-30、40-50、 50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120或120-130个氨 基酸残基是SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28的相应氨 基酸残基的优选如表1中所示的保守氨基酸取代。
更优选地，该CASAR蛋白由与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、 24、26或28所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至 少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列组成，或包含与 SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28所示的氨基酸序列具 有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序 列同一性的氨基酸序列，其中至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、 至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、 至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少 21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、 至少29或至少30个不相同的氨基酸残基，或其中1-10、10-20、20-30、 40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100个或甚至所有不相同的氨基 酸残基是SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28的相应氨基 酸残基的优选如表1中所示的保守氨基酸取代。
多肽或蛋白质的百分比同一性参考本文明确公开的整个氨基酸序列显 示。
优选地，该CASAR蛋白包含SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、 24、26或28中所示的氨基酸序列的优选从氨基酸序列的N端或C端计数 的至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、 至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80或 至少约85个优选连续的氨基酸残基，或至多全长。
优选地，该CASAR多肽包含由SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、 24、26或28中所示的核酸序列编码的任意氨基酸序列的优选从氨基酸序 列的N端或C端计数的约25-30、约30-35、约35-40、约40-45、约45-50、 约50-55、约55-60、约60-65、约65-70、约70-75、约75-80或约80-86 个氨基酸，优选连续的氨基酸，或至多全长。
优选地，该CASAR蛋白包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的 优选从氨基酸序列的N端或C端计数的至少约25、至少约30、至少约35、 至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至 少约70、至少约75、至少约80或至少约85个优选连续的氨基酸残基，或 至多全长。
优选地，该CASAR多肽包含由SEQ ID NO:3中所示的核酸序列编 码的任意氨基酸序列的优选从氨基酸序列的N端或C端计数的约25-30、 约30-35、约35-40、约40-45、约45-50、约50-55、约55-60、约60-65、 约65-70、约70-75、约75-80或约80-86个氨基酸，优选连续的氨基酸， 或至多全长。
本文所述的CASAR蛋白用于本发明的构建体、方法、植物、可收获 部分和产品。
用于提高真菌抗性的方法；用于调节基因表达的方法
本发明的一个实施方案是通过与野生型植物、野生型植物部分或野生 型植物细胞相比提高CASAR蛋白或其功能片段、直向同源物、旁系同源 物或同源物的表达来提高植物、植物部分或植物细胞的真菌抗性，优选对 层锈菌科，例如大豆锈菌的抗性的方法。
本发明还提供用于提高植物或植物细胞对真菌病原体，优选对半死体 营养型病原体，尤其是对锈菌病原体(例如柄锈菌目的真菌病原体)，优选 层锈菌科的真菌病原体，优选对层锈菌属的真菌病原体，最优选对豆薯层 锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈菌)的抗性的方法，其中与野生型植物、 野生型植物部分或野生型植物细胞相比CASAR蛋白过表达。
本发明还提供用于通过过表达CASAR蛋白来提高植物或植物细胞对 层锈菌属的真菌病原体，最优选对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆 锈菌)的抗性的方法。
在优选实施方案中，与未用CASAR核酸转化的野生型植物相比，该 植物中CASAR蛋白的蛋白量和/或功能提高了至少10％、至少20％、至 少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少 90％或至少95％或更多。
在本发明的一个实施方案中，该CASAR蛋白由以下编码：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 其功能片段、或其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少60％、 优选至少70％、例如至少75％、更优选至少80％、例如至少85％、甚至 更优选至少90％、例如至少95％或至少96％或至少97％或至少98％、最 优选99％同一性的外源核酸；或
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、其功 能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性、优选至少70％、 例如至少75％、更优选至少80％、例如至少85％、甚至更优选至少90％、 例如至少95％或至少96％或至少97％或至少98％、最优选99％同源性的 蛋白质的外源核酸，优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的 真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
用于通过提高CASAR蛋白、或其功能片段、直向同源物、旁系同源 物或同源物、或其剪接变体的表达来提高植物、植物部分或植物细胞的真 菌抗性、优选对层锈菌科，例如大豆锈菌的抗性的方法是本发明的另一实 施方案，其中该CASAR蛋白由以下编码：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 其功能片段、或其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少60％ 同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、 至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、其功 能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％、优选至少70％序列同 一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一 性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的外源核酸；优选地，所编码的蛋 白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
用于通过提高CASAR蛋白、或其功能片段、直向同源物、旁系同源 物或同源物、或其剪接变体的表达来提高植物、植物部分或植物细胞的真 菌抗性、优选对层锈菌科，例如大豆锈菌的抗性的方法是本发明的另一实 施方案，其中该CASAR蛋白由以下编码：
(i)与SEQ ID NO:2、或其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或 其剪接变体具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、 至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％ 序列同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、其功能片段、其直向同源物或旁系同源物 具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少 95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白 质的外源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌 抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
在本发明的另一方法中，该方法包括以下步骤：
(a)用包含与启动子功能性连接的以下核酸的重组表达盒稳定转化植 物细胞：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 或其功能片段、或其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少 60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、 至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、其功 能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性、优选至少70％ 序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序 列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的核酸；优选地，所编码的 蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的核酸； 优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID NO: 3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋予相 对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸相同的CASAR多肽，但由于遗传 密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的核酸。
(b)从该植物细胞再生植物；和
(c)表达该核酸，可选地，编码CASAR蛋白的核酸以足以产生或提高 该植物的大豆锈菌抗性的量和时期表达。
优选地，该方法包括以下步骤：
(a)用包含与启动子功能性连接的以下核酸的重组表达盒稳定转化植 物细胞：
(i)与SEQ ID NO:2、或其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或 其剪接变体具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、 至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％ 序列同一性的核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、其功能片段、其直向同源物或旁系同源物 具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少 95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白 质的核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的核酸； 优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID NO: 3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋予相 对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸相同的CASAR多肽，但由于遗传 密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的核酸。
(b)从该植物细胞再生植物；和
(c)表达该核酸，可选地，编码CASAR蛋白的核酸以足以产生或提高 该植物的大豆锈菌抗性的量和时期表达。
优选地，该启动子是锈菌诱导和/或叶肉特异性启动子，优选锈菌诱导 叶肉特异性启动子820，优选如SEQ ID NO:4中所示。
优选地，用于提高植物、植物部分或植物细胞的真菌抗性，优选对层 锈菌科，例如大豆锈菌的抗性的方法包括选择表达以下的转基因植物的步 骤：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 或其功能片段、或其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少 60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、 至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、其功 能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性、优选至少70％ 序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序 列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的外源核酸；优选地，所编 码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸相同的CASAR多肽，但由于遗传 密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外源核酸。
通过提高CASAR蛋白的表达来提高大豆植物、大豆植物部分或大豆 植物细胞对大豆锈菌的抗性的方法是优选实施方案，其中该CASAR蛋白 由以下编码：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27 具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性 或甚至100％序列同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28具有至 少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性或甚至 100％序列同一性的蛋白质的外源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对 于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
其中通过用包含(i)或(ii)或(iii)或(iv)项下所示的核酸的核酸转化大豆 植物、植物部分或植物细胞来达到提高CASAR蛋白的表达。
通过提高CASAR蛋白的表达来提高大豆植物、大豆植物部分或大豆 植物细胞对大豆锈菌的抗性的方法也是优选实施方案，其中该CASAR蛋 白由以下编码：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27 具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性 或甚至100％序列同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28具有至 少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性或甚至 100％序列同一性的蛋白质的外源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对 于对照植物增强的真菌抗性；或
(iii)编码与以上(i)至(ii)的任意核酸相同的CASAR蛋白，但由于遗传 密码的简并性而不同于以上(i)至(ii)的核酸的外源核酸；
其中通过用包含(i)或(ii)或(iii)项下所示的核酸的核酸转化大豆植物、 植物部分或植物细胞来达到提高CASAR蛋白的表达。
真菌病原体或真菌样病原体(例如假菌界(Chromista))可以隶属于根肿 菌门(Plasmodiophoramycota)、卵菌门(Oomycota)、子囊菌门 (Ascomycota)、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、担子 菌门(Basidiomycota)或半知菌纲(Deuteromycetes)(半知菌(Fungi  imperfecti))。可以作为实例而不是限制提到的病原体是表2和3中详述的 那些，及与它们相关的疾病。
表2：由活体营养型和/或半死体营养型植物病原真菌引起的疾病


表3：由死体营养型和/或半活体营养型真菌和卵菌引起的疾病




尤其优选以下：
-根肿菌门(Plasmodiophoromycota)，如芸苔根肿菌(Plasmodiophora  brassicae)(十字花科根肿病)、马铃薯粉痂菌(Spongospora subterranean)、 禾谷多粘菌(Polymyxa graminis)；
-卵菌门，如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)(莴苣霉霜病)、金鱼草(金鱼 草霜霉(P.antirrhini))、洋葱(洋葱霜霉(P.destructor))、菠菜(散展霜霉(P. effuse))、大豆(P.manchurica)、烟草(―青霉‖；烟草霜霉(P.tabacina))、苜 蓿和三叶草(P.trifolium)中的霜霉属(霜霉病)、葎草假霜霉 (Pseudoperonospora humuli)(啤酒花霜霉病)、单轴霉属(Plasmopara)(葡萄 藤中的霜霉病)(葡萄生单轴霉(P.viticola)和向日葵(霍尔斯单轴霉(P. halstedii))、指疫霉(谷物和草中的霜霉病)、腐霉属(Pythium)(例如由德巴 利腐霉(P.debaryanum)引起的甜菜的腐烂)、致病疫霉(Phytophthora  infestans)(例如马铃薯和西红柿等中的晚疫)、Albugo spec；
-子囊菌门，如白小羊蹄菌(Microdochium nivale)(黑麦和小麦的血腐 病)、镰孢属、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、大刀镰孢(主要为小 麦中的部分谷穗不育)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)(西红柿的镰刀菌萎蔫 病)、小麦禾白粉菌(Blumeria graminis)(大麦(f.sp.hordei)和小麦(f.sp. tritici)的白粉病)、豌豆禾白粉菌(Erysiphe pisi)(豌豆的白粉病)、仁果癌丛 赤壳菌(Nectria galligena)(果树的Nectria canker)、葡萄钩丝壳(Uncinula  necator)(葡萄藤白粉病)、维管束假盘菌(Pseudopeziza tracheiphila)(葡萄 藤叶斑病)、麦角菌(Claviceps purpurea)(例如黑麦和草上的麦角菌)、禾顶 囊壳(Gaeumannomyces graminis)(小麦、黑麦和其他草上的立枯病)、稻瘟 菌(Magnaporthe grisea)、麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)(大麦叶条 斑病)、圆核腔菌(Pyrenophora teres)(大麦网斑病)、偃麦草核腔菌 (Pyrenophora tritici-repentis)(小麦叶枯病)、苹果黑星菌(Venturia  inaequalis)(苹果黑星病)、核盘菌(Sclerotinia sclerotium)(茎裂、茎腐)、苜 蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)(苜蓿、白三叶草和红三叶草的叶斑)；
-担子菌纲，如肉孢核瑚菌(Typhula incarnate)(大麦、黑麦、小麦上的 血腐病)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(玉蜀黍上的泡状黑粉病)、裸黑粉菌 (Ustilago nuda)(大麦上的散黑粉病)、小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)(小麦、 斯佩尔特小麦上的散黑粉病)、燕麦散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麦上的散 黑粉病)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(马铃薯立枯丝核菌根腐病)、轴黑 粉菌属物种(Sphacelotheca spp.)(高粱丝黑穗病)、亚麻栅锈菌(Melampsora  lini)(亚麻锈病)、禾柄锈菌(Puccinia graminis)(小麦、大麦、黑麦、燕麦的 秆锈病)、隐匿柄锈菌(小麦上的叶锈病)、散生柄锈菌(Puccinia dispersa)(黑 麦上的褐锈病)、大麦柄锈菌(Puccinia hordei)(大麦上的叶锈病)、禾冠柄锈 菌(Puccinia coronate)(燕麦冠锈病)、条形柄锈菌(小麦、大麦、燕麦和许多 草上的黄锈病)、疣顶单胞锈菌(Uromyces appendiculatus)(豆褐锈病)、齐 整小核菌(许多植物的根腐和茎腐)；
-半知菌纲(半知菌)，如小麦(小麦壳针孢)的颖枯壳针孢(壳多 孢)(Septoria(Stagonospora)nodorum)(颖枯病)、铺毛拟小尾孢 (Pseudocercosporella herpotrichoides)(小麦、大麦、黑麦的眼斑病)、大麦 云纹病菌(Rynchosporium secalis)(黑麦和大麦上的叶斑)、Alternaria solani (马铃薯、西红柿的早疫)、菾菜茎点霉(Phoma betae)(甜菜上的黑腿病)、甜 菜生尾孢(Cercospora beticola)(甜菜叶斑)、芸苔链格孢(Alternaria  brassicae)(油菜、卷心菜和其他十字花科植物上的黑斑)、大丽花轮枝孢 (Verticillium dahlia)(轮枝菌萎蔫病)、毛盘孢属(Colletotrichum)、豆刺 盘孢(Colletotrichum lindemuthianum)(菜豆炭疽病)、黑胫茎点霉(Phoma  lingam)(卷心菜和油菜的黑腿病)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(葡萄藤、草 莓、西红柿、啤酒花等的灰霉病)。
特别优选的是活体营养型病原体，例如豆薯层锈菌和/或具有与本文所 述的豆薯层锈菌基本相似的感染机制的那些病原体。尤其优选的是来自柄 锈菌纲(Pucciniomycetes)，优选来自柄锈菌目(锈菌)(也称为锈菌目)的病原 体，其中尤其有Melompsoraceae。优选的是层锈菌科，更优选层锈菌属。 特别优选的是豆薯层锈菌和/或山马蝗层锈菌。
还优选选自以下的锈病真菌：柄锈菌属、胶锈菌属 (Gymnosporangium)、桧属(Juniperus)、柱锈菌属(Cronartium)、驼孢锈 菌属(Hemileia)和单孢锈菌属(Uromyces)；优选高粱柄锈菌(Puccinia  sorghi)、Gymnosporangium juniperi-virginianae、Juniperus virginiana、 茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola)、咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)、 禾柄锈菌(Puccinia graminis)、禾冠柄锈菌(Puccinia coronate)、菜豆单胞 锈菌(Uromyces phaseoli)、萱草柄锈菌(Puccinia hemerocallidis)、Puccinia  persistens subsp.Triticina、条形柄锈菌、Puccinia graminis causes和/或 Uromyces appendeculatus。
CASAR表达构建体和载体构建体
重组核酸、表达盒或载体构建体优选包含天然基因和天然启动子、天 然基因和非天然启动子、非天然基因和天然启动子或非天然基因和非天然 启动子。
如果希望表达蛋白质，则通常希望在多核苷酸编码区的3’端包含转录 终止序列，例如多腺苷酸化区。多腺苷酸化区可以源自天然基因、源自多 种其他植物基因、或源自T-DNA。待加入的3’端序列可以源自例如胭脂碱 合酶或章鱼碱合酶基因，或备选地源自另一植物基因，或较不优选地源自 任意其他真核基因。
重组载体构建体，其包含：
(a)(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或 27、或其功能片段、或其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至 少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少 95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、其功 能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性、优选至少70％ 序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序 列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的核酸；优选地，所编码的 蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的核酸； 优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID NO: 3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋予相 对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的核 酸；
该核酸与以下有效连接
(b)启动子；和
(c)转录终止序列。
此外，提供包含以下的重组载体构建体：
(a)(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27 具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、 或甚至100％序列同一性的核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28具有至 少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚 至100％序列同一性的蛋白质的核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对 于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的核酸； 优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID NO: 3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋予相 对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的核 酸；
该核酸与以下有效连接
(b)启动子；和
(c)转录终止序列。
此外，提供包含以下的重组载体构建体：
(a)(i)与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少90％、至少95％、至少 98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少90％、至少95％、至 少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的核酸； 优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的核酸； 优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID NO: 3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋予相 对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的核 酸；
该核酸与以下有效连接
(b)启动子；和
(c)转录终止序列。
在基因组文库的情况下，优选至少部分保持核酸序列的天然遗传环境。 该环境优选至少在一侧位于该核酸序列的侧翼，且具有至少50bp、优选 至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp的长度。
本发明的启动子可以是组成型、诱导型，尤其是病原体诱导型、发育 阶段优选型、细胞类型优选型、组织优选型或器官优选型。优选地，该启 动子是非天然启动子。组成型启动子在大多数条件下具有活性。组成型启 动子的非限制性实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等,1985,Nature 313:810-812)、sX CaMV 35S启动子(Kay等,1987,Science 236:1299-1302)、 Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等,1990,Plant Cell 2:163-171)、 拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等,1989,Plant Molec. Biol.18:675-689)、pEmu(Last等,1991,Theor.Appl.Genet.81:581-588)、 玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等,1984,EMBO J. 3:2723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号 5,683,439)、来自农杆菌T-DNA的启动子如甘露碱合酶、胭脂碱合酶和章 鱼碱合酶、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子等。
优选地，本发明的表达载体包含组成型启动子、叶肉特异性启动子、 表皮特异性启动子、根特异性启动子、病原体诱导型启动子或真菌诱导型 启动子。
如果在启动子控制下产生的RNA的量上测量的其在诱导状态下的活 性比其未诱导状态高至少30％、至少40％、至少50％、优选至少60％、 至少70％、至少80％、至少90％、更优选至少100％、至少200％、至少 300％，则该启动子是诱导型启动子。如果在启动子控制下产生的RNA的 量上测量的启动子在特定细胞类型、组织或器官中的活性比在相同植物的 其他细胞类型或组织中高至少30％、至少40％、至少50％、优选至少60％、 至少70％、至少80％、至少90％、更优选至少100％、至少200％、至少 300％，则该启动子是细胞、组织或器官特异性启动子，优选地，该其他细 胞类型或组织是相同植物器官(例如根)的细胞类型或组织。在器官特异性 启动子的情况下，必须将启动子活性与其他植物器官，例如叶、茎、花或 种子中的启动子活性相比较。优选地，该启动子是组成型启动子、叶肉特 异性启动子或表皮特异性启动子。
在优选实施方案中，CASAR蛋白的蛋白量和/或活性的提高以组成型 或组织特异性的方式发生。在特别优选的实施方案中，蛋白量和/或蛋白活 性的基本上为病原体诱导的提高例如通过在真菌诱导型启动子的控制下重 组表达CASAR核酸而发生。具体而言，CASAR核酸的表达发生在真菌 感染部位，但是，其中优选CASAR核酸的表达在未受真菌感染的组织中 保持基本不变。
发育阶段优选型启动子优先在发育的某些阶段表达。组织和器官优选 型启动子包括优先在某些组织或器官，如叶、根、种子或木质部中表达的 那些。组织优选型和器官优选型启动子的实例包括但不限于果实优选型、 胚珠优选型、雄性组织优选型、种子优选型、珠被优选型、块根优选型、 柄优选型、果皮优选型、叶优选型、柱头优选型、花粉优选型、花药优选 型、花瓣优选型、萼片优选型、花梗优选型、长角果优选型、茎优选型、 根优选型启动子等。种子优选型启动子优先在种子发育和/或萌发期间表 达。例如，种子优选型启动子可以是胚优选型、胚乳优选型和种皮优选型。 见Thompson等,1989,BioEssays 10:108。种子优选型启动子的实例包括但 不限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD 玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。
其他适宜的组织优选型或器官优选型启动子包括但不限于来自油菜的 油菜籽蛋白基因启动子(美国专利号5,608,152)、来自蚕豆(Vicia faba)的 USP启动子(Baeumlein等,1991,Mol Gen Genet.225(3):459-67)、来自拟南 芥的油质蛋白启动子(PCT申请号WO 98/45461)、来自菜豆(Phaseolus  vulgaris)的菜豆蛋白启动子(美国专利号5,504,200)、来自芸苔属(Brassica) 的Bce4启动子(PCT申请号WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4； Baeumlein等,1992,Plant Journal,2(2):233-9)，以及在如玉米、大麦、小 麦、黑麦、稻等的单子叶植物中赋予种子特异性表达的启动子。应指出的 适宜启动子是来自大麦的lpt2或lpt1基因启动子(PCT申请号WO  95/15389和PCT申请号WO 95/23230)或描述于PCT申请号WO 99/16890 中的那些(来自大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇 溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高 粱kasirin基因和/或黑麦醇溶蛋白基因的启动子)
用于本发明的启动子包括但不限于主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、 组蛋白启动子、Ap3启动子、β-伴大豆球蛋白启动子、油菜籽蛋白启动子、 大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白 启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、waxy、 shrunken 1、shrunken 2、bronze启动子、Zm13启动子(美国专利号 5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和 5,545,546)、SGB6启动子(美国专利号5,470,359)，以及合成启动子或其他 天然启动子。
表皮特异性启动子可以选自以下：
WIR5(＝GstA1)；检索号X56012；Dudler&Schweizer,
GLP4,检索号AJ310534；Wei Y.,Zhang Z.,Andersen C.H., Schmelzer E.,Gregersen P.L.,Collinge D.B.,Smedegaard-Petersen V.和 Thordal-Christensen H.,Plant Molecular Biology 36,101(1998),
GLP2a,检索号AJ237942,Schweizer P.,Christoffel A.和Dudler R., Plant J.20,541(1999)；
Prx7,检索号AJ003141,Kristensen B.K.,H.,Rasmussen  S.K.和Nielsen K.A.,Molecular Plant Pathology,2(6),311(2001)；
GerA,检索号AF250933；Wu S.,Druka A.,Horvath H.,Kleinhofs A., Kannangara G.和von Wettstein D.,Plant Phys Biochem 38,685(2000)；
OsROC1,检索号AP004656
RTBV,检索号AAV62708,AAV62707；A.,Henrich C.,Bieri S., He X.,Chen G.,Burkhardt P.K.,Wünn J.,Lucca P.,Hohn T.,Potrykus I.和 Fütterer J.,PMB 40,249(1999)；
来自马铃薯的几丁质酶ChtC2启动子(Ancillo等,Planta.217(4),566, (2003))；
AtProT3启动子(Grallath等,Plant Physiology.137(1),117(2005))；
来自拟南芥的SHN启动子(涉及角质和蜡产生的AP2/EREBP转录因 子)(Aarón等,Plant Cell.16(9),2463(2004))；和/或
来自小麦的GSTA1(Dudler等,WP2005306368及Altpeter等,Plant  Molecular Biology.57(2),271(2005))。
叶肉特异性启动子可以选自以下：
PPCZm1(＝PEPC)；Kausch A.P.,Owen T.P.,Zachwieja S.J.,Flynn  A.R.和Sheen J.,Plant Mol.Biol.45,1(2001)；
OsrbcS,Kyozuka等,PlaNT Phys 102,991(1993)；Kyozuka J., McElroy D.,Hayakawa T.,Xie Y.,Wu R.和Shimamoto K.,Plant Phys.102, 991(1993)；
OsPPDK,检索号AC099041；
TaGF-2.8,检索号M63223；Schweizer P.,Christoffel A.和Dudler R., Plant J.20,541(1999)；
TaFBPase,检索号X53957；
TaWIS1,检索号AF467542；US 200220115849；
HvBIS1,检索号AF467539；US 200220115849；
ZmMIS1,检索号AF467514；US 200220115849；
HvPR1a,检索号X74939；Bryngelsson等,Mol.Plant Microbe  Interacti.7(2),267(1994)；
HvPR1b,检索号X74940；Bryngelsson等,Mol.Plant Microbe  Interact.7(2),267(1994)；
HvB1,3gluc；检索号AF479647；
HvPrx8,检索号AJ276227；Kristensen等,Molecular Plant Pathology, 2(6),311(2001)；和/或
HvPAL,检索号X97313；Wei Y.,Zhang Z.,Andersen C.H.,Schmelzer  E.,Gregersen P.L.,Collinge D.B.,Smedegaard-Petersen V.和 Thordal-Christensen H.Plant Molecular Biology 36,101(1998)
锈菌诱导叶肉特异性启动子820，如SEQ ID NO:4中所示。
组成型启动子可以选自以下：
来自欧芹的PcUbi启动子(WO 03/102198)
CaMV 35S启动子：花椰菜花叶病毒35S启动子(Benfey等1989 EMBO J.8(8):2195–2202),
STPT启动子：拟南芥(Arabidopsis thaliana)短磷酸丙糖易位蛋白启动 子(检索号NM_123979)
Act1启动子：稻(Oryza sativa)肌动蛋白1基因启动子(McElroy等 1990PLANT CELL 2(2)163-171a)；和/或
EF1A2启动子：Glycine max翻译延伸因子EF1α(US 20090133159)。
在优选实施方案中，CASAR蛋白的蛋白量或功能的提高以组成型或 组织特异性的方式发生。在特别优选的实施方案中，蛋白量或蛋白功能的 基本上为病原体诱导的提高例如通过在真菌诱导型启动子，优选锈菌诱导 型启动子的控制下外源表达CASAR核酸而发生。具体而言，CASAR核 酸的表达发生在真菌感染部位，但是，其中优选CASAR核酸序列的表达 在未受真菌感染的组织中保持基本不变。
优选地，CASAR核酸处于锈菌诱导叶肉特异性启动子的控制之下。 更优选地，该启动子是优选如SEQ ID NO:4中所示的锈菌诱导叶肉特异 性启动子820。优选地，锈菌诱导叶肉特异性启动子包含与SEQ ID NO:4 中所示的核酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、 至少98％或至少99％同一的核酸序列。
优选的终止子是来自马铃薯(Solanum tuberosum)的组织蛋白酶D抑 制剂基因终止子。
目的基因居间的优选的启动子-终止子组合是来自欧芹的启动子(优选 欧芹泛素启动子)与来自马铃薯的组织蛋白酶D抑制剂基因终止子组合。 另一优选的启动子-终止子组合是锈菌诱导叶肉特异性启动子820与来自 马铃薯的组织蛋白酶D抑制剂基因终止子组合。
还可以将内含子序列加至5’非翻译区(UTR)和/或部分编码序列的编码 序列来增加累积在胞质溶胶中的成熟信息的量。已显示在植物和动物表达 构建体中的转录单位中包含可剪接内含子使基因表达在mRNA和蛋白质 水平都提高至多1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8: 4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev 1:1183-1200)。在放置在转录单位的 5’附近时，基因表达的这种内含子增强通常最大。玉米内含子Adh1-S内 含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途为本领域已知。一般信息见：The  Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot,编辑,Springer,N.Y. (1994)。
一类载体构建体是“质粒”，质粒是指可以将附加的DNA区段连接入 其中的环状双链DNA。另一类载体是病毒载体，其中可以将附加的DNA 区段连接入病毒基因组。某些载体构建体能够在它们所引入的宿主植物细 胞中自主复制。其他载体构建体在引入宿主细胞时整合入宿主植物细胞的 基因组，从而随着宿主基因组复制。尤其是，该载体构建体能够指导与之 有效连接的基因的表达。但是，本发明旨在包括这类其他形式的表达载体 构建体，如病毒载体(例如马铃薯病毒X、烟草脆裂病毒和/或Gemini病毒)， 其执行等同的功能。
转基因生物；转基因植物、植物部分和植物细胞
优选实施方案是过表达外源CASAR蛋白的转基因植物、转基因植物 部分或转基因植物细胞。优选地，在植物、植物部分或植物细胞中过表达 的CASAR蛋白由以下编码：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 或其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少60％ 同一性的外源核酸；或
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、其功 能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性的蛋白质的外源 核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
最优选地，该外源核酸与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少90％、 至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性； 或者包含编码与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少90％、至少95％、 至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的外 源核酸。
优选实施方案是过表达外源CASAR蛋白的转基因植物、转基因植物 部分或转基因植物细胞。优选地，在植物、植物部分或植物细胞中过表达 的CASAR蛋白由以下编码：
(i)与SEQ ID NO:2、或其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或 其剪接变体具有至少60％同一性的外源核酸；或
(ii)编码与SEQ ID NO:3、其功能片段、其直向同源物或旁系同源物 具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予 相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
最优选地，该外源核酸与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少90％、 至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性； 或者包含编码与SEQ ID NO:3具有至少95％、至少98％、至少99％序 列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的外源核酸。
在优选实施方案中，与未用CASAR核酸转化的野生型植物相比，转 基因植物中CASAR蛋白的蛋白量增加至少10％、至少20％、至少30％、 至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至 少95％或更多。
更优选地，通过用本文所述的重组载体转化来获得本发明的转基因植 物、转基因植物部分或转基因植物细胞。
适合用于转化或转染包括植物细胞的宿主细胞的方法为植物生物技术 领域公知。可以用任意方法将重组表达载体转化入植物细胞来产生本发明 的转基因植物。用于转化双子叶植物的一般方法公开于例如美国专利号 4,940,838、5,464,763等中。用于转化具体双子叶植物(例如棉花)的方法在 美国专利号5,004,863、5,159,135和5,846,797中显示。可以使用美国专利 号4,992,375、5,416,011、5,569,834、5,824,877、6,384,301中及EP 0301749B1 中所示的大豆转化方法。转化方法可以包括直接和间接转化法。适宜的直 接转化法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪的生物射弹法(Fromm ME等,Bio/Technology. 8(9):833-9,1990；Gordon-Kamm等Plant Cell 2:603,1990)、电穿孔、在含 有DNA的溶液中孵育干胚及显微注射。在这些直接转化法的情况下，所 使用的质粒无需满足任何具体要求。可以使用简单质粒，如pUC系列的那 些、pBR322、M13mp系列、pACYC184等。如果要从转化细胞再生完整 植物，则附加的选择标记基因优选定位在质粒上。直接转化技术同等地适 合于双子叶和单子叶植物。
转化还可以通过借助农杆菌的细菌感染(例如EP 0116718)、借助病毒 载体的病毒感染(EP 0 067 553；US 4,407,956；WO 95/34668；WO 93/03161) 或借助花粉(EP 0270356；WO 85/01856；US 4,684,611)来进行。基于农杆菌 的转化技术(特别是用于双子叶植物)为本领域公知。农杆菌菌株(例如根瘤 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium  rhizogenes))包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，其在用农杆菌感染后 转移至植物。T-DNA(转移的DNA)整合入植物细胞的基因组。T-DNA可以 定位在Ri或Ti质粒上，或分开地包含在所谓的二元载体中。用于农杆菌 介导的转化的方法描述于例如Horsch RB等(1985)Science 225:1229中。 农杆菌介导的转化最适于双子叶植物，但也已适应于单子叶植物。农杆菌 转化植物描述于例如White FF,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung和R. Wu编辑,Academic Press,1993,15–38页；Jenes B等Techniques for  Gene Transfer,Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D. Kung和R.Wu编辑,Academic Press,1993,128-143页；Potrykus(1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225中。转化可以产生瞬 时或稳定的转化和表达。虽然可以将本发明的核苷酸序列插入这些广泛种 类内的任意植物和植物细胞，但它尤其用于作物植物细胞。
遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的所有方法来再生。适宜 的方法可以见于上文提到的S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或和 Willmitzer的出版物中。
转化后，可以针对与目的基因共转移的由植物可表达基因编码的一个 或多个标记的存在选择植物细胞或细胞群，然后将转化材料再生为整株植 物。为了选择转化植物，通常使转化中获得的植物材料经受选择性条件， 使得可以从未转化的植物区分转化植物。例如，可以种植以上述方式获得 的种子，并在最初的生长期后通过喷雾使其经受适宜的选择。另一种可能 性是用适宜的选择剂在琼脂平板上培养种子(如果适当，在灭菌后)，使得 只有转化种子可以生长为植物。备选地，针对选择标记(如上文所述的选择 标记)的存在筛选转化植物。也可以通过针对CASAR核酸的存在进行筛选 来直接选择转化植物。
DNA转移和再生后，还可以例如用Southern分析针对目的基因的存 在、拷贝数和/或基因组组织评价假定转化的植物。备选地或此外，可以用 Northern和/或Western分析监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术 都为本领域普通技术人员公知。
产生的转化植物可以通过多种手段繁殖，如通过克隆繁殖或经典育种 技术。例如，可以使第一代(或T1)转化植物自交，选择纯合的第二代(或 T2)转化体，然后可以通过经典育种技术进一步繁殖T2植物。产生的转化 生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合 体；克隆转化体(例如，所有细胞都转化为包含表达盒)；转化和未转化组 织的嫁接物(例如，在植物中，转化的砧木嫁接至未转化的接穗)。
优选地，构建体或载体或表达盒不存在于最初的植物的基因组中，或 不在其在最初的植物的基因组的天然基因座上存在于转基因植物的基因组 中。
优选地，本发明的转基因植物或通过本发明的方法获得的植物具有提 高的对真菌病原体，优选锈菌病原体(即柄锈菌目的真菌病原体)，优选对 层锈菌科的真菌病原体，更优选对层锈菌属的真菌病原体，最优选对豆薯 层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈菌)的抗性。优选地，对豆薯层锈菌 和/或山马蝗层锈菌的抗性得到提高。
优选地，该植物、植物部分或植物细胞是选自豆、大豆、豌豆、三叶 草、葛、紫花苜蓿、扁豆、羽扇豆、巢菜、花生、稻、小麦、大麦、拟南 芥、扁豆、香蕉、卡诺拉、棉花、马铃薯、玉米、甘蔗、苜蓿和甜菜的植 物或源自这样的植物。
在本发明的一个实施方案中，该植物选自豆、大豆、三叶草、葛、紫 花苜蓿、扁豆、羽扇豆、巢菜和/或花生。优选地，该植物是豆科植物，包 括菜豆属(Phaseolus)的植物(包括菜豆、矮菜豆、蔓菜豆(Phaseolus  vulgaris)、利马豆(棉豆(Phaseolus lunatus L.))、宽叶菜豆(Phaseolus  acutifolius A.Gray)、红花菜豆(Phaseolus coccineus))；大豆属(Glycine)(包 括野大豆(Glycine soja)、大豆(Glycine max(L.)Merill))；豌豆(豌豆属 (Pisum))(包括硬荚豌豆(Pisum sativum L.convar.sativum)，也称为滑粒或 圆粒豌豆；皱粒豌豆(Pisum sativum L.convar.medullare Alef.emend.C.O. Lehm)；甜豌豆(Pisum sativum L.convar.axiphium Alef emend.C.O. Lehm)，也称为糖荚豌豆、食荚豌豆或嫩豌豆(Pisum granda sneida L. convar.sneidulo p.shneiderium))；花生(Arachis hypogaea)、三叶草 (Trifolium spec.)、苜蓿(苜蓿属(Medicago))、葛(Pueraria lobata)、常见紫 花苜蓿、苜蓿(M.sativa L.)、鹰嘴豆(鹰嘴豆属(Cicer))、扁豆(Lens)(Lens  culinaris Medik.)、羽扇豆(羽扇豆属(Lupinus))；巢菜(巢菜属(Vicia))、蚕 豆(field bean)、蚕豆(Vicia faba)、香豌豆(香豌豆属(Lathyrus))(包括草香 豌豆(Lathyrus sativus)、块茎香豌豆(Lathyrus tuberosus))；豇豆属 (Vigna)(包括蛾豆(Vigna aconitifolia(Jacq.)Maréchal)、赤豆(Vigna  angularis(Willd.)Ohwi&H.Ohashi)、黑绿豆(Vigna mungo(L.)Hepper)、 绿豆(Vigna radiata(L.)R.Wilczek)、班巴拉花生(Vigna subterrane(L.) Verdc.)、赤小豆(Vigna umbellata(Thunb.)Ohwi&H.Ohashi)、野豇豆 (Vigna vexillata(L.)A.Rich.)、豇豆(Vigna unguiculata(L.)Walp.)(三个亚 种长豇豆、豇豆、眉豆))；木豆(Cajanus cajan(L.)Millsp.)；硬皮豆属 (Macrotyloma)(包括geocarpa groundnut(Macrotyloma geocarpum (Harms)Maréchal&Baudet)、马蚕豆(Macrotyloma uniflorum(Lam.) Verdc.)；四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus(L.)DC.)、非洲豆薯 (Sphenostylis stenocarpa(Hochst.ex A.Rich.)Harms)、埃及黑豆、扁豆、 甜扁豆(Lablab purpureus(L.)Sweet)、豆薯(Pachyrhizus)、瓜耳豆 (Cyamopsis tetragonolobus(L.)Taub.)；和/或刀豆属(Canavalia)(包括矮刀 豆(Canavalia ensiformis(L.)DC.)、刀豆(Canavalia gladiata(Jacq.)DC.))。
还优选选自豆、大豆、豌豆、三叶草、葛、紫花苜蓿、扁豆、羽扇豆、 巢菜和花生的植物。最优选地，该植物、植物部分或植物细胞是大豆或源 自大豆。
优选地，本发明的转基因植物或通过本发明的方法获得的植物是大豆， 且具有提高的对柄锈菌目的真菌病原体(锈菌)，优选层锈菌科的真菌病原 体，更优选对层锈菌属的真菌病原体，最优选对豆薯层锈菌和山马蝗层锈 菌(也称为大豆锈菌)的抗性。优选地，对豆薯层锈菌和/或山马蝗层锈菌的 抗性得到提高。
用于产生转基因植物的方法
本发明的一个实施方案提供用于产生对真菌病原体，优选层锈菌科的 真菌病原体，例如大豆锈菌具有抗性的转基因植物、转基因植物部分或转 基因植物细胞的方法，其中用来产生转基因植物的重组核酸包含与 CASAR核酸(优选SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、 25或27)有效连接的在植物细胞中具有功能的启动子及终止子调节序列。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生具有提高的真菌抗性的转基 因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，其包括：
(a)将本发明的重组载体构建体引入植物、植物部分或植物细胞；和
(b)从该植物、植物部分或植物细胞产生转基因植物。
优选地，用于产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的 方法进一步包括以下步骤：
(c)表达优选由以下编码的CASAR蛋白：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少60％同 一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、或其 功能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性的蛋白质的外 源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
优选地，该引入和表达不包括基本生物过程。
更优选地，用于产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞 的方法进一步包括以下步骤：
(c)表达优选由以下编码的CASAR蛋白：
(i)与SEQ ID NO:2、其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或其 剪接变体具有至少60％同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、或其功能片段、其直向同源物或旁系同源 物具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
优选地，用于产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的 方法进一步包括选择表达以下的转基因植物的步骤：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 或其功能片段、或其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少 60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、 至少98％、至少99％序列同一性或甚至100％序列同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、其功 能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性、优选至少70％ 序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％ 序列同一性或甚至100％序列同一性的蛋白质的外源核酸；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸相同的CASAR多肽，但由于遗传 密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外源核酸。
优选地，用于产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的 方法还包括收获转基因植物的种子、种植种子和使种子生长为植物的步骤， 其中该栽培植物包含：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少60％同 一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、或其 功能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性的蛋白质的外 源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸；
优选地，重复收获转基因植物的种子、种植种子和使种子生长为植物 的步骤一次以上，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 30、35、40、45或50次，其中该栽培植物包含：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少60％同 一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、或其 功能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性的蛋白质的外 源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
可以通过上文所述的已知方法选择转基因植物(例如，通过筛查由与 CASAR基因共转移的植物可表达基因编码的一个或多个标记的存在，或 通过直接筛查CASAR核酸)。
此外，提供外源CASAR核酸或包含CASAR核酸的重组载体构建体 在转化植物、植物部分或植物细胞来提供真菌抗性植物、植物部分或植物 细胞中的用途。
可收获部分和产品
本发明的转基因植物的可收获部分是本发明的部分。优选地，可收获 部分包含CASAR核酸或CASAR蛋白。可收获部分可以是包含CASAR 核酸或CASAR蛋白的种子、根、叶和/或花或其部分。大豆植物的优选部 分是包含CASAR核酸或CASAR蛋白的大豆。
源自本发明的转基因植物、其部分或其可收获部分的产品是本发明的 部分。优选的产品是粉或油，优选大豆粉或大豆油。优选地，该大豆粉和/ 或油包含CASAR核酸或CASAR蛋白。
优选地，本发明的转基因植物的可收获部分或源自转基因植物的产品 包含由选自以下的核酸组成或含有选自以下的核酸的外源核酸：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27 所示的核酸序列、或其功能片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或 其剪接变体按递增的优选顺序具有至少70％、至少71％、至少72％、至 少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少 79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、 至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至 少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％序列同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28所示的 氨基酸序列或其功能片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物按递增的优 选顺序具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至 少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少 81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、 至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至 少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％ 序列同一性的CASAR蛋白的外源核酸；优选地，该CASAR蛋白具有与 由SEQ ID NO:2或1编码的CASAR蛋白基本相同的生物活性；优选地， 该CASAR蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌(优选锈菌)抗性；
(iii)在高严格性杂交条件下与(i)或(ii)的任意核酸分子的互补序列杂交 的外源核酸分子；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码 具有与SEQ ID NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所 编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌(优选锈菌)抗性；和
(iv)编码与以上(i)至(iii)的CASAR核酸相同的CASAR蛋白，但由于 遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的CASAR核酸的外源核酸；
或其中转基因植物的可收获部分或源自转基因植物的产品包含由(i)至 (iv)的CASAR核酸中的任一种编码的CASAR蛋白。
用于制备产品的方法
本发明的或可通过本发明的方法获得的植物、植物部分或植物细胞可 以用来制备可收获部分或产品。
在一个实施方案中，用于制备产品的方法包括：
a)培养本发明的或可通过本发明的方法获得的植物；和
b)从或通过本发明的植物和/或这些植物的部分(例如种子)生产该产 品。
在另一实施方案中，该方法包括以下步骤：
a)培养本发明的植物；
b)从该植物取下上文定义的可收获部分；和
c)从或通过本发明的可收获部分生产该产品。
优选地，通过该方法获得的产品包含由选自以下的核酸组成或含有选 自以下的核酸的外源核酸分子：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27 所示的核酸序列、或其功能片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或 其剪接变体按递增的优选顺序具有至少70％、至少71％、至少72％、至 少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少 79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、 至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至 少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％序列同一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28所示的 氨基酸序列或其功能片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物按递增的优 选顺序具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至 少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少 81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、 至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至 少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％ 序列同一性的CASAR蛋白的外源核酸；优选地，该CASAR蛋白具有与 由SEQ ID NO:2或1编码的CASAR蛋白基本相同的生物活性；优选地， 该CASAR蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌(优选锈菌)抗性；
(iii)在高严格性杂交条件下与(i)或(ii)的任意核酸分子的互补序列杂交 的外源核酸分子；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码 具有与SEQ ID NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所 编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌(优选锈菌)抗性；和
(iv)编码与以上(i)至(iii)的CASAR核酸相同的CASAR蛋白，但由于 遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的CASAR核酸的外源核酸；
或其中通过该方法获得的产品包含由(i)至(iv)的CASAR核酸中的任 一种编码的CASAR蛋白。
产品可以在培养植物的地点生产，可以从培养植物的地点取得植物和/ 或其部分来生产产品。通常，培养植物，从植物取得希望的可收获部分(如 果可行，则反复循环)，并从植物的可收获部分制备产品。每次进行本发明 的方法可以只进行培养植物的步骤一次，而允许多次重复产品生产的步骤， 例如通过反复取得本发明的植物的可收获部分，并根据需要进一步加工这 些部分来获得产品。还可能重复培养本发明的植物的步骤，并保存植物或 可收获部分，直至然后对积累的植物或植物部分进行一次产品生产。另外， 培养植物和生产产品的步骤可以在时间上重叠、甚至在很大程度上同时或 顺次进行。通常，在生产产品之前培养植物一段时间。
在一个实施方案中，通过本发明的该方法生产的产品是植物产品，例 如但不限于食品、饲料、食品添加剂、饲料添加剂、纤维、化妆品和/或药 品。食品视为用于营养和/或用于补充营养的组合物。动物饲料和动物饲料 添加剂尤其视为食品。
在另一实施方案中，用本发明的生产方法来制备农产品，例如但不限 于植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等。
植物产品可能在很大程度上由一种或多种农产品组成。
育种方法/植物改良方法/植物变种产生方法
可以用已知的植物育种方法使本发明的转基因植物与相似的转基因植 物或与缺乏本发明的核酸的转基因植物或与非转基因植物杂交来制备种 子。此外，本发明的转基因植物细胞或植物可以包含一种或多种外源核酸， 和/或与另一包含一种或多种外源核酸的转基因植物杂交，从而在植物和/ 或其后代中产生转基因的“堆叠”。然后种植种子来获得包含CASAR核酸 的杂交可育转基因植物。杂交可育转基因植物可具有通过母本或通过父本 遗传的具体表达盒。第二植物可以是近交植物。杂交可育转基因植物可以 是杂种。这些杂交可育转基因植物中任一种的种子也包含在本发明之内。 可以从可育转基因植物收获本发明的种子，并用来培养本发明的转化植物 的后代，包括含有外源核酸的杂种植物品系。
因此，本发明的一个实施方案是用于繁育真菌抗性植物的方法，其包 括以下步骤：
(a)使本文所述的转基因植物或可通过本文所述的方法获得的植物与 第二植物杂交；
(b)获得源自(a)中所述杂交步骤的一粒或多粒种子；
(c)种植该一粒或多粒种子并将该一粒或多粒种子培养为植物；和
(d)从该植物选择表达优选由以下编码的CASAR蛋白的植物：
(i)与SEQ ID NO:2、1、5-12、13、15、17、19、21、23、25或27、 其功能片段、其直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体具有至少60％同 一性的外源核酸；
(ii)编码与SEQ ID NO:3、14、16、18、20、22、24、26或28、或其 功能片段、其直向同源物或旁系同源物具有至少60％同一性的蛋白质的外 源核酸；优选地，所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；
(iii)能够在严格条件下与(i)或(ii)的任意核酸的互补序列杂交的外源核 酸；优选编码CASAR蛋白；优选地，其中该核酸分子编码具有与SEQ ID  NO:3中所述的多肽基本相同的特性的多肽；优选地，所编码的蛋白质赋 予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或
(iv)编码与以上(i)至(iii)的任意核酸编码的CASAR蛋白相同的 CASAR蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外 源核酸。
另一优选实施方案是用于植物改良的方法，其包括：
(a)通过本发明的任意方法获得转基因植物；
(b)将(a)的植物的至少一个植物细胞的遗传物质与在一个或多个基因 上不同于(a)的植物的植物细胞的至少一个细胞的遗传物质组合在一个植 物细胞内，或使(a)的转基因植物与第二植物杂交；
(c)从产生自(b)的植物细胞的至少一株植物或步骤(b)的杂交的植物获 得种子；
(d)种植该种子并将种子培养为植物；和
(e)从该植物选择表达编码CASAR蛋白的核酸的植物；并可选地
(f)从表达编码CASAR蛋白的核酸的植物产生繁殖材料。
可以通过上文所述的已知方法选择转基因植物(例如，通过筛查由与 CASAR基因共转移的植物可表达基因编码的一个或多个标记的存在，或 筛查CASAR核酸本身)。
根据本发明，如果所引入的CASAR核酸掺入非染色体自主复制子或 整合入植物染色体，则它可以稳定保持在植物细胞中。无论是存在于染色 体外非复制或复制载体构建体中还是整合入染色体的载体构建体中，外源 CASAR核酸都优选保留在植物表达盒中。植物表达盒优选包含功能性连 接的能够在植物细胞中驱动基因表达的调节序列，使得每个序列可以执行 其功能，例如通过多聚腺苷酸化信号终止转录。优选的多聚腺苷酸化信号 是源自根瘤农杆菌t-DNA的那些，如Ti质粒pTiACH5(Gielen等,1984, EMBO J.3:835)的称为章鱼碱合酶的基因3或其功能等同物，但在植物中 具有功能活性的所有其他终止子也适宜。由于植物基因表达常不在转录水 平上受限制，植物表达盒优选包含其他功能性连接的提高多肽/RNA比的 序列，如翻译增强子，如含有来自烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列的过 度驱动序列(Gallie等,1987,Nucl.Acids Research 15:8693-8711)。植物表达 载体的实例包括以下中详述的那些：Becker,D.等,1992,New plant binary  vectors with selectable markers located proximal to the left border,Plant  Mol.Biol.20:1195-1197；Bevan,M.W.,1984,Binary Agrobacterium vectors  for plant transformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721；及Vectors for  Gene Transfer in Higher Plants；in:Transgenic Plants,第1卷, Engineering and Utilization,Kung和R.Wu编辑,Academic Press,1993,S. 15-38。
实施例
以下实施例并非旨在限制本发明的权利要求的范围，而是旨在示例某 些实施方案。本领域技术人员在所示例的方法中想到的任何变通形式旨在 落在本发明的范围之内。
实施例1：一般方法
寡核苷酸的化学合成可以例如用亚磷酰胺法以已知的方式实现(Voet, Voet,第2版,Wiley Press New York,896-897页)。为了本发明的目的而进 行的克隆步骤(例如限制切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段纯化、核酸转 移至硝酸纤维素膜和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、细菌 培养、噬菌体扩增和重组DNA的序列分析)按Sambrook等Cold Spring  Harbor Laboratory Press(1989),ISBN 0-87969-309-6所述进行。按Sanger 法(Sanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463(1977))用MWG-Licor激 光荧光DNA测序仪进行重组DNA分子的测序。
实施例2：过表达载体构建体的克隆
以BamHI限制位点位于起始ATG前面而PstI限制位点位于终止密码 子下游的方式合成CASAR cDNA(如SEQ ID NO:1中所示)。用限制酶 PstI(NEB Biolabs)消化所合成的cDNA，按厂家手册(NEB Biolabs)用绿豆 核酸酶切平PstI位点的黏端。用限制酶BamHI消化平端片段，连接入 HindIII消化的Gateway pENTRY-B载体(Invitrogen,Life Technologies, Carlsbad,California,USA)。按厂家手册(NEB Biolabs)用绿豆核酸酶切平 HindIII位点的黏端，用BamHI消化平端载体，然后连接。
为了获得二元植物转化载体，用含有欧芹泛素启动子的pENTRY-A载 体、上述含有CASAR基因的pENTRY-B载体和含有来自马铃薯的组织蛋 白酶D抑制剂基因终止子的pENTRY-C载体按厂家的流程进行三重LR 反应(Gateway system,Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,California, USA)。作为靶标，使用了由以下组成的二元pDEST载体：(1)用于细菌选 择的壮观霉素/链霉素抗性盒；(2)用于农杆菌中的复制的pVS1起点；(3) 用于大肠杆菌中的稳定维持的colE-1复制起点；(4)右边界和左边界之间的 处于pcUbi启动子控制下的AHAS选择(图2)。将重组反应产物转化入大 肠杆菌(DH5α)，小量制备，并通过特异性限制消化来筛查。测序来自每种 载体构建体的阳性克隆，并进行大豆转化。
以NcoI限制位点位于起始ATG前面而AscI限制位点位于终止密码 子下游的方式合成大豆表达优化的CASAR cDNA(如SEQ ID NO:2中所 示)。用限制酶NcoI和AscI(NEB Biolabs)消化所合成的cDNA，并以全长 片段正向定位在“锈菌诱导叶肉特异性启动子820”(叶肉特异性启动子， 豆薯层锈菌诱导表达，SEQ ID NO:4)和来自马铃薯的组织蛋白酶D抑制 剂基因终止子之间的方式(t-StCATHD-pA)连接入NcoI/AscI消化的 Gateway pENTRY-B载体(Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad, California,USA)。
为了获得二元植物转化载体，用pENTRY-A空载体、含启动子::cDNA:: 终止子的pENTRY-B载体和pENTRY-C空载体按厂家流程进行三重LR 反应(Gateway system,Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,California, USA)。作为靶标，使用了由以下组成的二元pDEST载体：(1)用于细菌选 择的壮观霉素/链霉素抗性盒；(2)用于农杆菌中的复制的pVS1起点；(3) 用于大肠杆菌中的稳定维持的colE-1复制起点；(4)右边界和左边界之间的 处于pcUbi启动子控制下的AHAS选择(图3)。将重组反应产物转化入大 肠杆菌(DH5α)，小量制备，并通过特异性限制消化来筛查。测序来自每 种载体构建体的阳性克隆，并进行大豆转化。
实施例3：大豆转化
将表达载体构建体(见实施例2)转化入大豆。
3.1大豆种子的灭菌和萌发
几乎任意大豆变种的任意种子都可以用于本发明的方法。多种大豆栽 培种(包括Jack、Williams 82、Jake、Stoddard和Resnik)适合用于大豆转 化。在具有通过在用盖子盖紧的干燥器中将3.5ml 12N HCl逐滴加入100 ml漂白剂(5.25％次氯酸钠)产生的氯气的小室中对大豆种子进行灭菌。在 小室中24至48小时后，取出种子，将约18至20粒种子种植在100mm 平皿中的含或不含5μM 6-苄基-氨基嘌呤(BAP)的固体GM培养基上。不 含BAP的幼苗更长，根发育，尤其是次生根和侧根形成。BAP通过形成 更短和更粗壮的幼苗来强化幼苗。
将25℃下光照(>100μEinstein/m²s)培养的七日龄幼苗用于三外植体类 型的外植体材料。此时，种皮裂开，具一小叶的上胚轴最少生长至子叶的 长度。上胚轴应为至少0.5cm，以避开子叶节组织(由于大豆栽培种和种子 批次的发育时间可以不同，萌发阶段的描述比具体的萌发时间更准确)。
对于整个幼苗的接种，见方法A(实施例3.3.1和3.3.2)，对于叶外植体 的接种，见方法B(实施例3.3.3)。
对于方法C(见实施例3.3.4)，从各幼苗取下下胚轴和两个子叶的一个 半或部分。然后将幼苗放置在繁殖培养基上2至4周。使幼苗产生几个分 支枝条来获得外植体。大多数外植体源自从顶芽长出的小植株。这些外植 体优选用作靶组织。
3.2-农杆菌培养物的生长和繁殖
通过将携带希望的二元载体(例如H.Klee.R.Horsch和S.Rogers 1987Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its further  Applications to Plant Biology；Annual Review of Plant Physiology第38卷: 467-486)的农杆菌(例如根瘤农杆菌或毛根农杆菌)划线在固体YEP生长培 养基(YEP培养基：10g酵母提取物、10g Bacto蛋白胨、5g NaCl，调节 pH至7.0，用H2O定容至终体积为1升，对于YEP琼脂平板，加入20g 琼脂，高压灭菌)上并在25℃孵育至出现菌落(约2天)来制备农杆菌培养物。 取决于Ti或Ri质粒、二元载体和细菌染色体上存在的选择标记基因，用 不同的选择化合物在YEP固体和液体培养基中选择根瘤农杆菌和毛根农 杆菌。多种农杆菌菌株可以用于转化方法。
约两天后，挑取单菌落(用无菌牙签)，接种50ml含抗生素的液体YEP， 175转/分钟(25℃)震荡，直至OD₆₀₀达到0.8-1.0之间(约2天)。配制用于 转化的工作甘油原液(15％)，将1ml农杆菌原液分装入1.5ml Eppendorf 管，然后保存在-80℃。
外植体接种前一天，用5μl至3ml工作农杆菌原液在500ml三角瓶 中接种200ml YEP。三角瓶在25℃过夜震荡，直至OD₆₀₀在0.8和1.0之 间。在制备大豆外植体之前，通过5,500xg、20℃离心10分钟沉淀农杆菌。 将沉淀重悬在液体CCM中至希望的密度(OD₆₀₀0.5-0.8)，使用前室温放置 至少30分钟。
3.3-外植体制备和共培养(接种)
3.3.1方法A：转化当日的外植体制备
幼苗此时具有至少0.5cm但通常在0.5和2cm之间的延长的上胚轴。 成功利用了长度至多4cm的延长的上胚轴。然后用以下制备外植体，i)有 或没有一些根，ii)有部分、一个或两个子叶，去除所有预先形成的叶，包 括顶端分生组织，用锋利的解剖刀在位于第一组叶的节损伤几个切口。
节上的此切口不仅诱导农杆菌感染，还散布腋分生组织细胞，并损伤 预先形成的枝条。创伤和制备后，将外植体放置在平皿中，随后与液体 CCM/农杆菌混合物共培养30分钟。然后从液体培养基取出外植体，种植 在具有固体共培养培养基的15x100mm平皿上的无菌滤纸上。这样放置创 伤靶组织，使得它们与培养基直接接触。
3.3.2改进的方法A：上胚轴外植体制备
用从4至8日龄幼苗制备的大豆上胚轴作为用于再生和转化的外植体。 在含或不含细胞分裂素的1/10MS盐或相似组成培养基中萌发大豆栽培种 L00106CN、93-41131和Jack的种子4至8天。通过从茎部分除去子叶节 和茎节制备上胚轴外植体。将上胚轴切为2至5段。特别优选的是附着于 包含腋分生组织的初级或高级节的区段。
用外植体进行农杆菌转染。在含有适当抗生素的LB培养基中过夜培 养包含含有目的基因(GOI)及AHAS、bar或dsdA选择标记基因的质粒的 农杆菌AGL1，收获，并重悬在含有乙酰丁香酮的接种培养基中。在农杆 菌悬液中浸泡新鲜制备的上胚轴区段30至60分钟，然后在无菌滤纸上吸 干外植体。然后在含L-半胱氨酸和TTD及其他化学药品(如用于增加 T-DNA传递的乙酰丁香酮)的共培养培养基上培养所接种的外植体2至4 天。然后将感染的上胚轴外植体放置在含有诸如灭草烟(imazapyr)(用于 AHAS基因)、草铵膦(glufosinate)(用于bar基因)或D-丝氨酸(用于dsdA 基因)的选择剂的枝条诱导培养基上。在含选择剂的延长培养基上传代再生 的枝条。
为了产生转基因植物，然后将区段培养在含有细胞分裂素(如BAP、 TDZ和/或激动素)的培养基上进行枝条诱导。4至8周后，将培养的组织 转移至含有低浓度细胞分裂素的培养基进行枝条延长。将延长的枝条转移 至含有植物生长素的培养基进行生根和植物发育。再生多个枝条。
恢复许多显示强cDNA表达的稳定转化部分。从上胚轴外植体再生大 豆植物。证明了有效的T-DNA传递和稳定的转化部分。
3.3.3方法B：叶外植体
为了制备叶外植体，从下胚轴取下子叶。将子叶彼此分开，并去除上 胚轴。通过在托叶基底处仔细切割来从上胚轴去除由叶片、叶柄和托叶组 成的初生叶，使得腋分生组织包括在外植体上。为了损伤外植体以及刺激 从头枝条形成，去除任何预先形成的枝条，并用锋利的解剖刀切割托叶之 间的区域3至5次。
外植体制备后立即将外植体完全浸入农杆菌悬液或将创伤的叶柄端浸 入农杆菌悬液。接种后，将外植体印在无菌滤纸上，以去除过量的农杆菌 培养物，创伤侧与覆盖固体CCM培养基的圆形7cm Whatman滤纸接触 (见上文)放置外植体。此滤纸防止根瘤农杆菌在大豆外植体上过度生长。 用Parafilm^TM"M"(American National Can,Chicago,Ill.,USA)缠绕五块 平板，25℃避光或光照孵育3至5天。
3.3.3方法C：繁殖的腋分生组织
为了制备繁殖的腋分生组织外植体，使用了3-4周龄小植株。可以从 第一至第四节制备腋分生组织外植体。从每株幼苗可以获得平均3至4个 外植体。通过在腋节下0.5至1.0cm节间上切开并从外植体去除叶柄和叶 片来从小植株制备外植体。用解剖刀切割腋分生组织所处的尖端来诱导从 头枝条生长，并使靶细胞接近农杆菌。因此，0.5cm外植体包括茎和芽。
一旦切下，立即将外植体放入农杆菌悬液20至30分钟。接种后，将 外植体印在无菌滤纸上，以去除过量的农杆菌培养物，然后，取决于农杆 菌菌株，几乎完全浸没在固体CCM中放置或放置在覆盖固体CCM的圆 形7cm滤纸上。此滤纸防止农杆菌在大豆外植体上过度生长。用 Parafilm^TM"M"(American National Can,Chicago,Ill.,USA)缠绕五块平 板，25℃避光孵育2至3天。
3.4-枝条诱导
25℃避光共培养3至5天后，在液体SIM培养基(对于SIM，见Olhoft 等,A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of  soy using primary-node explants from seedlings,In Vitro Cell.Dev. Biol.—Plant(2007)43:536–549)或Modwash培养基(1X B5主要盐、1X B5 次要盐、1X MSIII铁、3％蔗糖、1X B5维生素、30mM MES、350mg/L  Timentin^TM pH 5.6，WO 2005/121345)中漂洗外植体，以去除过量的农杆 菌，并在无菌滤纸上吸干(以防止特别是对叶片的损伤)，然后放置在固体 SIM培养基上。放置约5个外植体(方法A)或10至20个外植体(方法B和 C)，使得靶组织与培养基直接接触。前2周期间，可以用或不用选择培养 基培养外植体。优选地，将外植体转移至无选择的SIM上一周。
对于叶外植体(方法B)，外植体应这样放入培养基，使得它垂直于培 养基的表面，叶柄埋置入培养基，叶片在培养基外。
对于繁殖的腋分生组织(方法C)，将外植体这样放入培养基，使得它 平行于培养基的表面(向基式)，外植体部分埋置入培养基。
将具有Scotch 394通风带(3M,St.Paul,Minn.,USA)的缠绕平板放入 生长室两周，温度平均25℃，18小时光照/6小时黑暗周期，70-100μE/m²s。 外植体保留在有或无选择的SIM培养基上，直至在靶区域(例如上胚轴上 方第一节处的腋分生组织)发生从头枝条生长。此期间可以发生向新鲜培养 基的转移。约一周后将外植体从有或无选择的SIM转移至有选择的SIM。 此时，在多种SIM中的叶外植体的叶柄基底处(方法A)、幼苗外植体的初 级节处(方法B)和繁殖外植体的腋节处(方法C)存在显著的从头枝条发育。
优选地，在共培养至多2周后去除转化前形成的所有枝条，以从分生 组织刺激新的生长。这有助于减少初级转化体中的嵌合状态和增加转基因 分生细胞的扩增。在此期间，可以将外植体切为或不切为更小的块(即通过 切割上胚轴来从外植体脱附节)。
3.5-枝条延长
在SIM培养基(优选有选择)上2至4周后(或直至形成大量枝条)，将 外植体转移至刺激枝条原基的枝条延长的SEM培养基(枝条延长培养基， 见Olhoft等,A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation  method of soy using primary-node explants from seedlings,In Vitro Cell. Dev.Biol.Plant(2007)43:536–549)。此培养基可以包含或不包含选择化合 物。
每2至3周后，在仔细去除死组织后将外植体转移至新鲜SEM培养 基(优先包含选择)。外植体应保持在一起，不片段化为小块，并保持某种 程度的健康。持续转移外植体，直至外植体死亡或枝条延长。取下>3cm 的延长枝条，放入RM培养基约1周(方法A和B)，或取决于栽培种约2 至4周(方法C)，此时根开始形成。在具有根的外植体的情况下，将它们 直接转入土壤。将生根的枝条转移至土壤，在生长室中硬化2至3周，然 后转移至温室。用此方法获得的再生植物可育，每株植物产生平均500粒 种子。
与根瘤农杆菌共培养5天后，目的基因(GOI)的瞬时表达广泛分布在 幼苗腋分生组织外植体上，尤其是在外植体制备期间产生创伤的区域中(方 法A)。将外植体放入不含选择的枝条诱导培养基，以观察初级节如何响应 枝条诱导和再生。到目前为止，超过70％的外植体在此区域形成新枝条。 SIM上14天后GOI的表达稳定，表明T-DNA整合入大豆基因组。此外， 初步实验导致在SIM上3周后形成表达cDNA的枝条。
对于方法C，使用繁殖腋分生组织流程的大豆小植株的平均再生时间 为外植体接种后14周。因此，此方法具有非常快的产生可育、健康大豆植 物的再生时间。
实施例4：病原体测定
4.1植物的生长
将每个事件的10株T1植物种植在花盆中，并在光照室(16小时白昼 和8小时黑夜的节律，16和22℃的温度，75％的湿度)中培养3-4周，直 至前2个具三小叶的叶完全展开。
4.2接种
用豆薯层锈菌接种植物。
为了获得适当的孢子材料用于接种，在接种前2-3天采集已在15-20 天前用锈菌感染的大豆叶，并转移至琼脂平板(含1％琼脂的H2O)。将叶 片上部朝向琼脂放置，这允许真菌生长通过组织，并产生非常年轻的孢子。 对于接种溶液，从叶片上敲下孢子，并加至Tween-H2O溶液。借助Thoma 计数室在光学显微镜下进行孢子的计数。对于植物的接种，将孢子悬液加 入压缩空气驱动的喷雾瓶，并均一地施加在植物或叶片上，直至叶表面充 分湿润。对于肉眼测定，我们使用了1-5x10⁵孢子/ml的孢子密度。对于镜 检，使用了>5x 10⁵孢子/ml的密度。接种的植物在平均22℃和>90％空气 湿度的温室中放置24小时。在平均25℃和70％空气湿度的温室中进行随 后的培养。
实施例5：镜检筛查
为了评价病原体发展，感染后48小时用苯胺蓝染色所接种的植物叶。
苯胺蓝染色用于检测荧光物质。在宿主相互作用和非宿主相互作用中 的防御反应期间，诸如苯酚、胼胝质或木质素的物质累积或产生并局部在 乳突中的细胞壁处或在整个细胞中掺入(超敏反应，HR)。与苯胺蓝结合形 成复合物，其例如在胼胝质的情况下产生黄色荧光。将叶材料转移至包含 脱色溶液II(乙醇/乙酸6/1)的falcon管或平皿中，并在90℃水浴中孵育 10-15分钟。然后立即去除脱色溶液II，用水洗涤叶片两次。对于染色， 在染色溶液II(0.05％苯胺蓝＝甲基蓝，0.067M磷酸氢二钾)中孵育叶片 1.5-2小时，然后立即通过镜检分析。
通过镜检评价(计数)了不同的相互作用类型。使用了Olympus UV显 微镜BX61(入射光)和UV Longpath滤片(激发：375/15；分光器：405LP)。 苯胺蓝染色后，孢子在UV光下显蓝色。可以通过绿色/黄色染色在真菌附 着器下识别出乳突。超敏反应(HR)表征为全细胞荧光。
实施例6：评价大豆锈病易感性
通过估计叶背侧(远轴侧)的染病面积(夏孢子形成所覆盖的面积)来评 价大豆锈病的进展。此外，考虑叶片黄化(方案见图1)。
在表达CASAR蛋白的全部43株T1大豆植物(5个独立事件，每个事 件7-10株转基因植物；通过RT-PCR检验转基因的表达)上接种豆薯层锈 菌的孢子。接种后14天评价由豆薯层锈菌在所接种的大豆植物上引起的肉 眼可见的疾病症状。
将所有叶上显示真菌菌落或强烈黄化/褐化的叶面积百分比的平均值 视为染病叶面积。与相同变种的非转基因对照植物平行评价了表达 CASAR(通过RT-PCR检验表达)的全部43株大豆T1植物。用与转基因植 物平行培养的非转基因大豆植物作为对照。图7中显示外源表达CASAR 的植物的染病叶面积的平均值，与野生型植物相比。在所测试的全部5个 独立事件中，与非转基因对照植物相比，CASAR的过表达使染病叶面积 平均减少44.5％。此数据清楚地表明，CASAR表达载体构建体的植物内 表达导致转基因植物与非转基因对照相比更低的疾病评分。因此， CASAR(如SEQ ID NO:1中所示)在大豆中的表达显著(p<0.001)提高大豆 对大豆锈病的抗性。