五种尿激酶变体基因及在大肠杆菌中的表达 本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽药物技术领域。
尿激酶(UK)是一种重要的纤溶酶原激活剂，在人体内主要由肾脏细胞分泌。其前体尿激酶原经纤溶酶等激活后即成为双链高分子尿激酶，活化的尿激酶可激活纤溶酶原，产生纤溶酶，纤溶酶即可大量水解纤维蛋白。这一系列反应在机体纤溶系统中起着十分重要的作用，可维持体内正常的血凝—纤溶平衡，保证机体血液流通和组织器官的正常生理机能。但在病理条件下，机体纤溶系统不足以消除血栓，必需通过静脉灌注或局部注射溶栓药物—纤溶酶原激活剂，才能有效溶解血栓中的纤维蛋白，清除血栓。在临床上，尿激酶已被广泛用于治疗急性心肌梗塞，脑血栓，心肌缺血性坏死，糖尿病并发的静脉血栓等多种血管栓塞性疾病。
由于尿激酶对纤维蛋白没有选择性，因此在治疗血栓疾病时，也可非特异性地激活血循环中的纤溶酶原，产生大量游离的纤溶酶，导致血循环中的纤溶酶原和纤维蛋白原等含量降低，引起出血等副作用。为此，欧美各国都在努力研制新型纤溶酶原激活剂，以解决溶栓疗法的出血副作用。对于尿激酶而言，他们的工作大都集中在尿激酶活性结构域和其它血浆蛋白的亲纤维蛋白结构域之间的杂合体研究上，真正对尿激酶本身所进行的改造为数很少，鲜见有目的改造的成功之例。
在国内，南京大学从1987年开始就开展了国家″863″任务—尿激酶原的蛋白质工程的研究。通过计算机辅助的分子设计，我们模建了尿激酶的三维结构，发现尿激酶分子中149-158片段中所包含的正电荷氨基酸残基对kringle结构域和纤维蛋白的结合有潜在地抑制作用；竞争结合试验也表明，人工合成或分离纯化的该片段对t-PA与纤维蛋白的结合确实有强烈的抑制作用，部分替换该片段中的正电荷氨基酸残基，竞争效应明显降低。因此，我们认为该片段中的正电荷氨基酸残基的存在是导致尿激酶对纤维蛋白没有亲和性的结构基础之一，去除这些正电荷氨基酸残基或将之改为负电荷氨基酸残基，应可使尿激酶获得对纤维蛋白的亲和性。
本发明的目的在于根据蛋白质工程所提供的理论依据和化学试验结果，利用寡核苷酸介导的定点突变方法，改造尿激酶基因，获得五种尿激酶变体基因，即：将尿激酶基因中第151位赖氨酸(Lys)密码子AAG改为谷氨酸(Glu)密码子GAG所构建的尿激酶变体基因(Lys151→Glu)UK；将尿激酶基因中第151位Lys密码子AAG改为Glu密码子GAG和第154位精氨酸(Arg)密码子AGG改为甘氨酸(Gly)密码子(GGG)所构建的尿激酶变体基因(Lys151→Glu，Arg154→Gly)UK；将尿激酶基因中第151位Lys密码子AAG和第154位Arg密码子AGG均改为Glu密码子GAG所构建的尿激酶变体基因(Lys151→Glu，Arg154→Glu)UK；将尿激酶基因中第154位Arg密码子AGG改为Gly密码子GGG所构建的尿激酶变体基因(Arg154→Gly)UK；将尿激酶基因中第154位Arg密码子AGG改为Glu密码子GAG所构建的尿激酶变体基因(Arg154→Glu)UK，并实现在大肠杆菌中的高效表达，经分离纯化，创造五种溶栓效果好，对血栓中纤维蛋白有较高选择性的尿激酶变体蛋白，以解决临床治疗急性心肌梗塞，脑血栓，心肌缺血性坏死，糖尿病并发的静脉血栓等多种血管栓塞性疾病时的出血副作用，提高用药安全性。
本发明的技术内容包括：
通过定点突变，构建五种对纤维蛋白有较高选择性的尿激酶变体基因，即：将尿激酶中第151位Lys和第154位Arg这两个正电荷氨基酸残基分别或同时改为不带电荷的Gly或带负电荷的Glu，以减低尿激酶中149-158片段中的正电荷对尿激酶与纤维蛋白结合时的竞争性抑制作用。本发明按照上述设计思想，采用随机合成法，合成了一对互补的突变引物，使原来Lys和Arg密码子分别突变为Glu和Glu/Gly密码子。两引物经退火，磷酸化，得到编码尿激酶变体第150-163之间14个氨基酸的DNA片段，其长度为41/45碱基。同时，天然尿激酶基因用BalI和EcoRI双酶切，去除150-163氨基酸的编码片段，与上述退火引物相连，得到的变体基因经序列分析，分别筛选出五种不同的尿激酶变体基因，再利用BspHI和NcoI互为同尾酶的特点，用BspHI和HindIII双酶切取变体基因，插入表达载体pKK233-2的NcoI和HindIII切点之间，转化大肠杆菌JA221，经筛选得到阳性克隆，经37℃培养和0.1mM IPTG诱导，使五种尿激酶变体蛋白表达，经SDS-PAGE检测，表明五种尿激酶变体蛋白的表达量均占菌体总蛋白的10％以上，分子量为43kD，与理论计算值相符。
将工程菌大量培养并表达尿激酶变体蛋白表达后，离心收集菌体，超声破菌，离心收集包涵体，经体外变复性，上CM-纤维素柱层析和抗体亲和柱层析，收集洗脱蜂，测定纤维蛋白平板溶解活性，将活性部分合并，并用SDS-PAGE检测，最后经固相化纤溶酶活化，获得高比活的尿激酶变体基因。
本发明的优点是创造了五种溶栓效果好，对纤维蛋白有较高选择性，出血副作用小的新型溶栓药物，其关键是分别或同时改变尿激酶中第151和154两个氨基酸的电荷性质，使尿激酶获得了较好的对纤维蛋白的选择性，可用作治疗急性心肌梗塞，脑血栓，心肌缺血性坏死，糖尿病并发的静脉血栓等多种血管栓塞性疾病。
下面是本发明的实施例：
1.五种对纤维蛋白有较高选择性的尿激酶变体基因的构建。
合成一对互补的突变引物，其序列分别如下：5′-C CAA AAG ACT CTG AGG CCC CGC TTT AAG ATT ATT GGG GGA G--3′
G GA5′-AA TTC TCC CCC AAT AAT CTT AAA GCG GGG CCT CAG AGT CTT TTG G-3′
TC C经磷酸化，退火，得到编码尿激酶第150-163位之间14个氨基酸的DNA片段。将克隆在pUC9中的尿激酶基因用BalI和EcoRI双酶切，去除150-163位之间氨基酸的编码片段，与上述退火片段相连，转化E.coli，经杂交筛选(用第一个引物为探针)，选出所有的阳性克隆，再制备DNA，用与尿激酶第175-180位之间氨基酸密码子互补的引物进行双链DNA序列分析，选出五种尿激酶变体基因，以第151和154两个氨基酸均突变为Glu的尿激酶变体基因(Lys151→Glu，Arg154→Glu)UK为例，进行表达。
2.利用BspHI和NcoI互为同尾酶的特点，用BspHI和HindIII双酶切取变体基因，插入表达载体pKK233-2的NcoI和HindIII切点之间，转化大肠杆菌JA221，经筛选得到阳性克隆，挑取阳性克隆接种至2mlLB/Amp(100μg/ml)培养液中，37℃振荡培养8小时，按2％比例接种至40ml LB/Amp(50μg/ml)培养液中，37℃振荡培养8小时，再按20％比例接种至200ml LB/Amp(50μg/ml)培养液中，37℃振荡培养1小时，加入预热的IPTG至终浓度0.1mM，37℃振荡培养1.5小时。
3.将培养液离心，收集菌体，悬浮于pH7.5 100mM含0.5M Nacl的PBS溶液中，超声破菌10分钟(超声15秒，间歇15秒)，3000rpm离心20分钟，收集沉淀，用含5M尿素的pH7.5 100mM Tris-Cl溶液悬浮，4℃放置30分钟，3000rpm离心20分钟，收集沉淀，用含8M尿素和50mM 2-巯基乙醇的pH7.5 100mM Tris-Cl溶液于4C溶解16小时，15000rpm离心20分钟，弃去沉淀，上清对含8M尿素，pH7.5 100mM Tris-Cl溶液透析2小时，再滴入含2M尿素，5mMEDTA，0.005％Tween，1.25mMGSH，0.25mMGSSG，pH11.0的0.05M Tris-Cl溶液中，于4℃复性24小时。复性液对0.01MPBS透析16小时后，将溶液pH调至4.0，上CM-纤维素柱层析，用pH5.0，含0.5M NaCl的PBS溶液洗脱，洗脱液经透析后上抗体亲和柱层析，用含0.5M NaCl的PBS洗去杂蛋白，再用含3.5M MgCl2的PBS洗脱，收集洗脱蜂，测定纤维蛋白平板溶解活性，将活性部分合并，用SDS-PAGE检测，经考马斯亮蓝染色，样品为一条带，测定样品蛋白浓度，以1mM样品比1g干胶的比例将样品与纤溶酶-sepharose CL混合，37℃缓慢搅拌1小时，5000rpm离心20分钟，取上清，冻干浓缩，即得比活为110000IU/mg的尿激酶变体蛋白纯品。