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1、10申请公布号CN104086629A43申请公布日20141008CN104086629A21申请号201410259477122申请日20140611C07K7/08200601C07K16/12200601C12N5/20200601G01N33/577200601G01N33/569200601A61K39/40200601A61K39/10200601A61P31/04200601C12R1/9120060171申请人南方医科大学地址510515广东省广州市白云区沙太南路1023号72发明人王文敬廖卿宇李婷婷黎诚耀74专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人郑莹54。
2、发明名称布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位及其单克隆抗体和应用57摘要本发明公开了布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位及其抗体和应用，表位的序列为EYLYTDLGKRNLVDVD。本发明还公开了识别上述表位的单克隆抗体，及上述表位与单克隆抗体的应用，都有助于布鲁氏菌病的诊断。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表9页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表9页附图3页10申请公布号CN104086629ACN104086629A1/1页21布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位，其序列为EYLYTDLGKRNLVDVDSEQIDNO24。2权利要求1所述。
3、布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位在制备布鲁氏菌病诊断试剂或治疗药物中的应用。3抗布鲁氏菌OMP31蛋白的单克隆抗体，其制备方法为1）将权利要求1所述的布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位免疫动物；2）取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗布鲁氏菌OMP31蛋白的杂交瘤细胞；3）收集、纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗布鲁氏菌OMP31蛋白的单克隆抗体。4根据权利要求3所述的抗布鲁氏菌OMP31蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体的重链为IGG2A、轻链为链，该单克隆抗体能与权利要求1所述的布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位特异性结合。5根据权利要求3所述的抗布鲁氏菌OMP31蛋。
4、白的单克隆抗体，其特征在于产生免疫反应的动物的血清间接ELISA效价不低于151200。6权利要求35任一项所述的单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病试剂或药物中的应用。7稳定分泌权利要求35任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。8分泌权利要求35任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株OMP315B3。权利要求书CN104086629A1/6页3布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位及其单克隆抗体和应用技术领域0001本发明涉及一种布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位，以及使用该表位刺激得到的抗布鲁氏菌OMP31蛋白单克隆抗体。本发明还涉及该细胞表位抗体及该细胞表位的应用。背景技术0002布鲁氏菌病（B。
5、RUCELLOSIS）是目前世界上流行最广的人畜共患传染病之一，据世界卫生组织统计表明，全世界每年出现50万例人布鲁氏菌病，每年造成的经济损失达30亿美元。我国布病的流行以羊种布氏杆菌为主的混合感染，羊种占流行株的80。0003布鲁氏菌病临床症状复杂，引起的发热、流产等病理损害易与某些常见疾病混淆；医生很难单凭有无病畜接触史来诊断布氏菌感染，给诊断带来了一定的困难，容易导致误诊，造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治疗手段，抗生素的大量长期使用仍很难见效，且容易引起耐药性问题。因此，布鲁氏菌的疫苗预防和早期快速诊断对布菌的防控具有重大的现实意义；其中疫苗的免疫效果和布菌诊断的准确性就显得尤为重要。。
6、目前，布鲁氏菌病的免疫制剂种类主要包括弱毒活疫苗死疫苗亚单位疫苗抗独特性疫苗和DNA疫苗等。0004由于热灭活菌缺乏活性抗原刺激，不能在体内诱发可检测的IL12，并且抑制IL12的产生，免疫效果不佳，而且死菌诱发的多是无保护力的体液免疫应答。而亚单位疫苗虽然可起到短期的保护作用，但并不能诱发有效的长期免疫，只有活菌才能诱发细胞免疫。0005我国主要是以布鲁氏菌弱毒菌苗株M590来免疫羊。它对成年羊有很好的免疫保护效果，但会导致妊娠羊流产。OMP31蛋白为膜孔蛋白，与弱毒菌苗株毒力相关，并含有保护性抗原表位，其基因序列在不同的种属之间的同源性高达98以上，在牛种菌中缺失，在羊种和猪种之间存在大约。
7、9个核苷酸的差异，并存在氨基酸序列的改变，故OMP31蛋白的单克隆抗体可能能够鉴别诊断不同生物型的布鲁氏菌感染。若将M590疫苗株携带的OMP31基因全部敲除，则影响弱毒菌苗株的免疫效果。另外，由于M590免疫的动物和野毒菌株自然感染的动物现有诊断方法不能鉴别，严重影响了布鲁氏菌病的检验和疫苗免疫预防。因此，针对OMP31蛋白的抗原表位进行修饰或改造标记疫苗，可建立该表位多肽ELISA诊断方法及其诊断试剂，进而解决布鲁氏菌病鉴别诊断和基因工程标记弱毒菌苗株的技术难题。发明内容0006本发明的一个目的在于提供一种布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位。0007本发明的另一个目的在于提供上述OMP31蛋。
8、白B细胞表位在制备布鲁氏菌病诊断试剂中的应用。0008本发明的又一个目的在于提供由上述表位刺激产生的单克隆抗体。0009本发明的再一个目的在于提供上述单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病试剂或药物中的应用。说明书CN104086629A2/6页40010本发明所采取的技术方案是布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位，其序列为EYLYTDLGKRNLVDVDSEQIDNO24。0011一种抗布鲁氏菌OMP31蛋白单克隆抗体，其制备方法为1）将上述的布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位免疫动物；2）取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗布鲁氏菌OMP31蛋白的杂交瘤细胞；3）收集、纯化杂交。
9、瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗布鲁氏菌OMP31蛋白的单克隆抗体。0012作为优选的，所述单克隆抗体的重链为IGG2A、轻链为链，该单克隆抗体能与上述的布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位特异性结合。0013作为优选的，产生免疫反应的动物的血清间接ELISA效价不低于151200。0014本发明的有益效果是本发明的布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位，偶联之后可用于检测羊血清中的布鲁氏菌病，建立PEPTIDEELISA检测方法，为新型分子标记疫苗的研制提供依据。本发明的单克隆抗体，对OMP31蛋白具有很好的特异性识别能力，可以精确地识别布鲁氏菌的表位。本发明的单克隆抗体及OMP31蛋白B细胞表位可用于。
10、制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病的试剂或药物。附图说明0015图1是PCR扩增目的序列的电泳图；图2是OMP31重组蛋白表达电泳鉴定图；图3是OMP31重组蛋白纯化电泳鉴定及WESTERNBLOT血清鉴定图；图4是WESTERNBLOT试验检测单克隆抗体OMP315B3与布鲁氏菌疫苗株M590中提取的天然膜蛋白的反应性结果图；图5是多肽ELISA测定单克隆抗体株OMP315B3抗原表位结果图；图6是间接免疫荧光试验检测单克隆抗体OMP315B3与感染带有OMP31基因的慢病毒的293FT细胞反应性结果图；图7是酶免疫染色试验检测单克隆抗体OMP315B3与羊种布鲁氏菌菌涂片反应性结果图。具体实施。
11、方式0016下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。0017本发明使用的布鲁氏菌M590疫苗株购自兰州兽医研究所，为本行业所公知的疫苗株。0018一、OMP31重组蛋白表达载体的构建以新疆石河子大学陈创夫教授提供的布菌基因组为模板扩增目的基因序列，利用GENBANK中提供的羊布鲁氏菌OMP31基因序列，GENBANKACCESSIONNOGI|333601402，用生物学软件OLIGO7设计引物扩增截短N端19个氨基酸信号肽的OMP31基因，选用PET30A载体，分别在5端和3端引入NDEI及XHOI酶切位点，斜体加粗为酶切位点。说明书CN104086629A3/6页50019上。
12、游引物F5GGAATTCCATATGGCCGACGTGGTTG3（SEQIDNO28）下游引物R5CCGCTCGAGGAACTTGTAGTTCAGAC3（SEQIDNO29）PCR扩增目的基因25L体系包括DNTP15L，10PCRBUFFER25L，P1、P2各05L，模版DNA1L，FASTSTAR酶05L，H2O185L。PCR反应条件为95预变性2MIN，9545S，5030S，7270S，扩增30个循环后,72延伸10MIN。PCR结果在1琼脂糖凝胶上电泳检测（见图1，由图1可知目的基因片段680BP），并用胶回收试剂盒回收。将PCR产物与克隆载体PMD19T连接并按照PMD19T载。
13、体说明书进行，感受态的制备、转化与阳性克隆的鉴定均按分子克隆第三版操作。挑取PMD19T/OMP31阳性克隆交由英潍捷基（上海）贸易有限公司。测序成功后，用NDEI/XHOI双酶切PMD19T/OMP31，回收小片段即为目的基因片断。与经过相应核酸内切酶双酶切的PET30A质粒连接，连接产物转入大肠杆菌DH5，阳性克隆提取质粒经PCR扩增及NDEI/XHOI双酶切鉴定后，交由英潍捷基（上海）贸易有限公司。测序正确，成功构建表达载体PET30AOMP31。0020布鲁氏菌重组膜蛋白OMP31的制备将构建的重组质粒PET30AOMP31（新疆石河子大学陈创夫教授惠赠）转化感受态BL21。将重组菌摇。
14、至对数生长期后，以终浓度1MMIPTG加入诱导目的蛋白表达。诱导后超声破碎，经鉴定目的蛋白主要处于沉淀中。将包涵体以2M尿素浓度的包涵体洗涤液（1PBS，2M脲，05TRITONX100，1MMOL/LEDTA，PH80）洗涤后，目的蛋白纯度达85以上。将洗涤后的沉淀用6M盐酸胍1PBS，6M盐酸胍，PH80溶解后进行梯度透析复性，复性后将蛋白浓缩并测定蛋白浓度并用WESTERNBLOT分析其免疫原性（见附图2、3，图2，M蛋白分子质量标准；102MMIPTG诱导破菌后沉淀；206MMIPTG诱导破菌后沉淀；310MMIPTG诱导破菌后沉淀；4重组子未诱导全菌对照；502MMIPTG诱导破菌后。
15、上清；606MMIPTG诱导破菌后上清；710MMIPTG诱导破菌后上清；图3，图A，MMARKER；1蛋白复性与浓缩后上清；2洗涤后未溶解包涵体；图B，1一抗为免疫羊阳性血清；2一抗为阴性血清）。0021当然，也可以使用其他方法制备得到的布鲁氏菌重组膜蛋白OMP31，或直接购买纯化的布鲁氏菌重组膜蛋白OMP31。0022制备重组膜蛋白OMP31的单克隆抗体1小鼠免疫1选择6周龄的纯系雌性BALB/C小鼠，用纯化的重组OMP31蛋白作为免疫抗原免疫小鼠，将OMP31蛋白与等体积的弗氏完全佐剂（CFA）乳化后，背部或腹腔皮下多点注射；2初次免疫后2周将纯化的OMP31与等体积的弗氏不完全佐剂（I。
16、FA）乳化后，背部或腹腔皮下多点注射；32周后，小鼠尾部取血，离心获得血清将血清倍比稀释采用间接ELISA方法测效价，效价需不低于151200；4融合前三天，腹腔注射OMP31蛋白；三次免疫抗原的量分别为100G/鼠、50G/鼠、50G/鼠。00232细胞融合断颈处死上述免疫好的BALB/C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按51在50PEG4000融合剂下融合，融合后以HAT选择培养基铺板置于375CO2培养。说明书CN104086629A4/6页600243阳性克隆筛选及克隆利用纯化的重组OMP31蛋白以间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，将阳性孔扩大培养后，用有限稀释。
17、法进行细胞克隆，经过三次克隆获得1株能稳定传代并分泌抗OMP31蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株OMP315B3。0025单克隆抗体的鉴定1单克隆抗体的亚类鉴定参照HYCULTBIOTECHNOL公司鼠源抗体分型试剂盒说明书对杂交瘤细胞OMP315B3进行鉴定，经鉴定OMP315B3重链为IGG2A，轻链为链。00262WESTERNBLOT鉴定按BIORAD膜蛋白提取试剂盒说明书提取布鲁氏菌M590疫苗株膜蛋白，提取后膜蛋白按11加入2SDS上样缓冲液，沸水浴中煮5MIN，12000RPM离心1MIN，取上清10L进行分离胶12，浓缩胶5的SDSPAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，P。
18、VDF膜以含5脱脂奶粉TBST封闭2H，随后以各株单抗的细胞上清13稀释孵育1H，TBST洗膜三次，每次10MIN；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IGGIGM作为二抗孵育1H，TBST洗膜后发光显影。试验中以HCVNS3的一株单抗作为阴性对照。试验结果显示OMP315B3与天然膜蛋白在约为31KDA处有一明显条带，而阴性对照HCVNS3的单抗不与膜蛋白反应（图4）。0027PEPTIDEELISA鉴定单克隆抗体OMP315B3抗原识别表位根据PET30AOMP31测序结果设计并合成了27条重叠肽，长度1116个氨基酸，每两条多肽之间重叠7个氨基酸（包括所有8个氨基酸残基的表位）表1。27条重叠多肽。
19、OMP31（P01P27）每条多肽终浓度5G/ML，每孔100L包被过夜；洗涤液PBST洗涤4次后，以PBS4BSA，每孔200L37封闭一小时；洗涤液洗涤4次后，以50L各单克隆抗体株细胞上清50L抗体稀释液（PBST1BSA）为一抗37孵育45MIN；洗涤液洗涤6次后，110000抗体稀释液稀释的HRP标记羊抗鼠IGGIGM为二抗，每孔100L，37孵育30MIN；洗涤液洗涤6次后，加入TMBH2O2，每孔100L避光显色10MIN，每孔50L2MH2SO4终止反应。测量450NM波长下每孔的光密度（OD）。以杂交瘤细胞SP2/0细胞上清作为抗体对照，以重组蛋白OMP31作为抗原对照。以待。
20、测孔OD450NM21倍阴性对照OD450NM判为阳性。经过测定，单抗OMP315B3和P24特异性反应（图5）。0028表1重叠7个氨基酸的合成多肽说明书CN104086629A5/6页7间接免疫荧光试验鉴定单克隆抗体OMP315B3与感染带有OMP31基因慢病毒的293FT细胞反应说明书CN104086629A6/6页8感染带有OMP31基因慢病毒的293FT细胞于96孔板中培养16小时后，弃原培养基，每孔100UL4预冷的100甲醇，于20固定20MIN。弃甲醇，每孔100ULIFBUFFER（001MPH74PBS1BSA25MMEDTA），室温孵育1H。弃IFBUFFER，以50LO。
21、MP315B3单克隆抗体株细胞上清50L抗体稀释液（PBST1BSA）为一抗4孵育过夜。PBS洗涤4遍后，11000抗体稀释液稀释的荧光素标记羊抗鼠IGGIGM每孔100UL，37孵育1H；PBS洗涤4遍后荧光显微镜下观察（图6）。0029酶免疫染色试验鉴定单克隆抗体OMP315B3与羊种布鲁氏菌菌涂片反应3过氧化氢处理菌涂片，001MPH74PBS洗涤后滴加50ULOMP315B3单克隆抗体株细胞上清，37孵育1H。PBS洗涤后滴加PBS110000稀释的HRP标记羊抗鼠IGGIGM50UL，37孵育45MIN。PBS洗涤后，滴加50ULDABH2O2，避光显色15MIN，纯水终止反应；中性。
22、树胶封片后油镜下观察。以菌体膨大，呈黄棕色至棕黑色判定为阳性结果；不显色或仅呈浅黄色判定为阴性。以大肠杆菌菌涂片作为抗原对照，HCVNS3单克隆抗体3E5作为抗体对照。经鉴定，OMP315B3能与羊种布鲁氏菌菌涂片反应（图7）。0030以上实验表明，本发明的单克隆抗体OMP315B3，对OMP31蛋白具有很好的特异性识别能力，可以精确地识别布鲁氏菌的表位。本发明的单克隆抗体及OMP31蛋白B细胞表位可用于制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病的试剂或药物。说明书CN104086629A1/9页9南方医科大学布鲁氏菌OMP31蛋白B细胞表位及其单克隆抗体和应用29PATENTINVERSION35112。
23、PRT人工序列1METLYSSERVALILELEUALASERILEALAALAMET1510216PRT人工序列2LEUALASERILEALAALAMETPHEALATHRSERALAMETALAALAASP151015316PRT人工序列3序列表CN104086629A2/9页10THRSERALAMETALAALAASPVALVALVALSERGLUPROSERALAPRO151015416PRT人工序列4VALSERGLUPROSERALAPROTHRALAALAPROVALASPTHRPHESER151015516PRT人工序列5ALAPROVALASPTHRPHESERTRPT。
24、HRGLYGLYTYRILEGLYILEASN151015616PRT人工序列6GLYGLYTYRILEGLYILEASNALAGLYTYRALAGLYGLYLYSPHELYS1510157序列表CN104086629A103/9页1116PRT人工序列7TYRALAGLYGLYLYSPHELYSHISPROPHESERSERPHEASPLYSGLU151015816PRT人工序列8PHESERSERPHEASPLYSGLUASPASNGLUGLNVALSERGLYSERLEU151015916PRT人工序列9GLUGLNVALSERGLYSERLEUASPVALTHRALAGLYGLYPHE。
25、VALGLY1510151016PRT人工序列10序列表CN104086629A114/9页12THRALAGLYGLYPHEVALGLYGLYVALGLNALAGLYTYRASNTRPGLN1510151116PRT人工序列11GLNALAGLYTYRASNTRPGLNLEUASPASNGLYVALVALLEUGLYALA1510151216PRT人工序列12ASNGLYVALVALLEUGLYALAGLUTHRASPPHEGLNGLYSERSERVAL1510151316PRT人工序列13ASPPHEGLNGLYSERSERVALTHRGLYSERILESERALAGLYALASER151。
26、0151416序列表CN104086629A125/9页13PRT人工序列14SERILESERALAGLYALASERGLYLEUGLUGLYLYSALAGLUTHRLYS1510151516PRT人工序列15GLUGLYLYSALAGLUTHRLYSVALGLUTRPPHEGLYTHRVALARGALA1510151616PRT人工序列16TRPPHEGLYTHRVALARGALAARGLEUGLYTYRTHRALATHRGLUARG1510151716PRT人工序列17GLYTYRTHRALATHRGLUARGLEUMETVALTYRGLYTHRGLYGLYLEU序列表CN1040866。
27、29A136/9页141510151816PRT人工序列18VALTYRGLYTHRGLYGLYLEUALATYRGLYLYSVALLYSSERALAPHE1510151916PRT人工序列19GLYLYSVALLYSSERALAPHEASNLEUGLYASPASPALASERALALEU1510152016PRT人工序列20GLYASPASPALASERALALEUHISTHRTRPSERASPLYSTHRLYSALA1510152116PRT序列表CN104086629A147/9页15人工序列21TRPSERASPLYSTHRLYSALAGLYTRPTHRLEUGLYALAGLYALAG。
28、LU1510152216PRT人工序列22THRLEUGLYALAGLYALAGLUTYRALAILEASNASNASNTRPTHRLEU1510152316PRT人工序列23ILEASNASNASNTRPTHRLEULYSSERGLUTYRLEUTYRTHRASPLEU1510152416PRT人工序列24GLUTYRLEUTYRTHRASPLEUGLYLYSARGASNLEUVALASPVALASP151015序列表CN104086629A158/9页162516PRT人工序列25ARGASNLEUVALASPVALASPASNSERPHELEUGLUSERLYSVALASN1510152。
29、616PRT人工序列26PHELEUGLUSERLYSVALASNPHEHISTHRVALARGVALGLYLEUASN1510152710PRT人工序列27THRVALARGVALGLYLEUASNTYRLYSPHE15102826DNA人工序列序列表CN104086629A169/9页1728GGAATTCCATATGGCCGACGTGGTTG262926DNA人工序列29CCGCTCGAGGAACTTGTAGTTCAGAC26序列表CN104086629A171/3页18图1图2图3说明书附图CN104086629A182/3页19图4图5说明书附图CN104086629A193/3页20图6图7说明书附图CN104086629A20。