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1、10申请公布号CN104087552A43申请公布日20141008CN104087552A21申请号201410199316822申请日2009120408305881820081204EP200980153619320091204C12N5/078201001C12M1/00200601A61K35/14200601A61P7/0420060171申请人国家医疗保健研究所地址法国巴黎申请人雷卡尔巴黎大学巴黎公共救济院凡尔赛大学72发明人D巴吕什E克拉梅尔博尔德C迪努瓦拉德74专利代理机构北京市金杜律师事务所11256代理人陈文平徐志明54发明名称用于制备血小板的方法57摘要本发明涉及用于由。
2、成熟巨核细胞制备血小板的方法。更具体地，本发明涉及用于由成熟巨核细胞制备血小板的体外方法，所述方法包括使成熟巨核细胞悬浮液在涂覆有血管性血友病因子的固相上经历最小剪切率为600S1的流动。30优先权数据62分案原申请数据51INTCL权利要求书1页说明书16页附图9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书16页附图9页10申请公布号CN104087552ACN104087552A1/1页21用于制备血小板的体外方法，包括使成熟巨核细胞的悬浮液在涂覆有血管性血友病因子VWF或其结合GPIB的片段或变体或类似物的固相上经历剪切率至少为600S1的流动。2根据权利要求1。
3、的方法，其中所述VWF的片段或变体或类似物选自下组VWF的52/48KDA胰蛋白酶片段；金黄色葡萄球菌V8蛋白酶消化的VWF；用于治疗用途的VWF浓缩物和引起2N型血管性血友病的VWF突变体。3通过权利要求1或2定义的方法可获得的血小板。4根据权利要求3的血小板，其用于治疗。5根据权利要求3或4的血小板，用于治疗血小板计数减少障碍。6根据权利要求5的血小板，其中所述血小板计数减少障碍选自下组自身免疫性血小板减少症、与生成减少有关的血小板减少症和与血小板破坏的增加有关的血小板减少症。7根据权利要求3的血小板用于诊断目的的用途。8用于制备血小板的装置，包括流体室，所述流体室包括涂覆有VWF或其结合。
4、GPIB的片段或变体或类似物的固相。权利要求书CN104087552A1/16页3用于制备血小板的方法0001本申请是申请日为2009年12月04日和发明名称为“用于制备血小板的方法”的2009801536193号发明专利申请的分案申请。技术领域0002本发明涉及用于由成熟巨核细胞制备血小板的方法。背景技术0003巨核细胞MK分化是以顺序的步骤为特征的连续过程。MK倍性通过核内有丝分裂增加，同时细胞大小平行增大。储存细胞器和质膜的合成增加，导致分隔膜的形成。胞质成熟与MK大小的显著增加相关。最后，成熟MK经历微管参与的完全细胞骨架重组，来诱导相当于前血小板PROPLATELET的伪足伸长PAT。
5、EL等人，2005A；RICHARDSON等人，2005。血小板从这些包含所有血小板细胞器的前血小板的尖端释放。0004循环血小板通过粘附于血管壁和通过将第一层粘附血小板聚集到内皮下基质参与血栓形成RUGGERI，2003。血管性血友病因子VONWILLEBRANDFACTORVWF是内衬于脉管系统中的内皮细胞的主要组分。VWF是能够在高剪切率1000S1条件中抑留循环血小板的唯一蛋白。系留的血小板通过GPIB又名CD42B与VWFA1结构域的结合转位到固定基质VWF上HUIZINGA等人，2002。在血小板的瞬时系留过程中进行性发生的IIB3整联蛋白又名CD41A/CD61的活化包括GPIB。
6、介导的信号传导并使得IIB3结合VWF的RGD序列。巨血小板综合症BSS是以严重的血小板减少和巨血小板为特征的出血性障碍NURDEN，2005。这是由于GPIBIXV复合物，特别是包含VWF结合位点的GPIB亚基，的数量上或性质上的异常。在BSS病人的骨髓中发现正常数目的MK，提示在该情况中观察到的巨血小板减少症与MK的缺陷血小板形成有关。0005由于不是经常在骨髓隙中观察到MK破碎成血小板，MK需要迁移入骨髓毛细管中TAVASSOLI和AOKI，1981。血小板与前血小板脱离已在缺少流动条件的情况下描述。有趣的是，从在促血小板生成素TPO存在的情况下培养的MK脱落的血小板产量远低于在最佳成熟。
7、条件中可能预期的产量NOROL等人，1998。血小板脱落的许多步骤仍然是难以捉摸的。特别是从来没有证明剪切力对血小板形成的作用。VWF受体GPIB和IIB3都是在成熟过程中在MK表面上表达DEBILI等人，1990。少数成熟MK已经在血液循环中被识别PEDERSEN，1978；TAVASSOLI和AOKI，1981，其中它们暴露于在内皮细胞的内腔侧上的VWF。0006而且，有趣的是，在最佳的MK培养条件下，脱落的血小板的体外产量远低于可以由体内大的血小板日产生量预期的产量。因此，非常需要制备血小板的良好体系。发明内容0007本发明涉及用于由成熟巨核细胞制备血小板的体外方法，所述方法包括使成熟巨。
8、核细胞的悬浮液在涂覆有血管性血友病因子的固相上经历剪切率至少为600S1的流动。说明书CN104087552A2/16页40008发明详述0009定义0010如本发明所使用的，术语“血小板”表示参与导致形成血凝块的初级止血PRIMARYHEMOSTASIS的细胞机制的由细胞衍生的无核胞质体。0011如本发明所使用的，术语“前血小板”表示可导致血小板形成的巨核细胞或其片段的任何结构形式，例如胞质连接的血小板样颗粒。所述结构形式包括但不限于具有长的胞质延伸、突出或伪足的细胞，所述延伸、突出或伪足包含包括在各形成阶段的血小板体的膨大，例如，节结、水泡等。0012如本发明所使用的，术语“巨核细胞”表示。
9、负责产生正常止血所需的血小板的骨髓细胞。巨核细胞源自骨髓中的造血干细胞前体细胞。巨核细胞生成的原始信号是促血小板生成素或TPO。TPO对于诱导骨髓中的祖细胞向最终巨核细胞表型的分化是必需的。用于巨核细胞分化的其他分子信号包括GMCSF、IL3、IL6、IL11和促红细胞生成素。0013如本发明所使用的，术语“成熟巨核细胞”表示以稳定方式表达GPIB和IIB3表面标志物的巨核细胞的群体。如本发明所使用的，表面标志物的“稳定方式表达”表示在细胞群体中，至少70的细胞表达这些表面标志物。0014如本发明所使用的，术语“剪切率”表示用于表征层流的参数。在管中，层流具有抛物线流速特征，相邻流动层的渐增的。
10、流速在腔轴处达到最大值。在相邻层中径向速率增加率定义为剪切率。在平行板腔中，剪切率由公式给出，并对应于流动物料中的速度梯度。用于剪切率的SI计量单位是S1，表示为“倒易秒”或“倒数秒”。剪切率的公式是0015FK6Q/AB20016其中是剪切率以S1计，Q是流速ML/S，A狭缝宽度CM，B狭缝高度CM和FK是该系统的物理参数的函数。例如，使用来自马斯特里赫特仪表MAASTRICHTINSTRUMENTATION的流体室描述在LEGENDRE等人，2006中，对于剪切率100S1，FK等于103。因此，可以通过控制流速和腔室的狭缝高度来调节剪切率。0017在人体血液循环中，剪切率在最大静脉中的3。
11、040S1到微血管循环中的5000S1之间变化。0018如本发明所使用的，术语“血管性血友病因子”或“VWF”表示由参与止血的几种单体组成的多聚体蛋白。人血管性血友病因子的示例性氨基酸序列可以在GENPEPT数据库中以登录号AAB59458找到。优选本发明的血管性血友病因子是哺乳动物血管性血友病因子，更优选鼠科动物因子或灵长动物因子，更优选人血管性血友病因子。术语“VWF”包括任何哺乳动物来源的VWF，例如灵长动物VWF，优选人VWF。也可以是重组VWF。本领域技术人员可根据本领域的标准技术容易地制备重组VWF。0019根据本发明，VWF因子可以是重组VWF或天然VWF。在以其天然形式存在时，。
12、其可被纯化或可被包含在含有其他组分的组合物中例如在细胞外基质中。0020还包括VWF的片段、VWF的变体和VWF的类似物，其中所述片段、变体和类似物具有结合GPIB的能力。VWF的片段、变体和类似物可以包括，但不限于VWF的52/48KDA胰蛋白酶片段FUJIMURA等人，1986；金黄色葡萄球菌V8蛋白酶消化的VWFGIRMA等人，1986A；GIRMA等人，1986B；用于治疗用途的VWF浓缩物FEDERICI，2005；GOUDEMAND等人，说明书CN104087552A3/16页52005；HOUDIJK等人，1986如HAEMATEP/HUMATEP来自BEHRING、WILFAC。
13、TIN来自LFB；参见GOUDEMAND等人，2005和IMMUNATEBAXTER，VIENNA，AUSTRIA；以及引起2N型血管性血友病的VWF突变体其在因子VIII结合方面存在缺陷。0021如本发明所使用的，术语“血小板计数减少障碍”表示血小板生成的问题或导致血小板的低浓度的血小板降解增加或因处于正常范围的血小板的异常功能导致的问题。如本发明所使用的，“血小板的低浓度”表示浓度低于150000个血小板/MM3。根据本发明，血小板计数减少障碍包括但不限于自身免疫性血小板减少症、与生成减少有关的血小板减少症中心起源和与任何原因的破坏增加有关的血小板减少症外周起源。0022如本发明所使用的，。
14、术语“受试者”表示哺乳动物，例如啮齿类动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选本发明的受试者是人。0023用于制备血小板的方法和装置0024本发明涉及用于制备血小板的体外方法，所述方法包括使成熟巨核细胞的悬浮液在涂覆有血管性血友病因子的固相上经历剪切率至少为600S1的流动。0025在优选的实施方式中，该流动的剪切率至少为800S1、优选至少为1000S1、优选至少为1200S1、优选至少为1400S1、更优选至少为1600S1、至少为1800S1或者至少为2000S1。0026典型地，该流动的剪切率不超过血小板在体内可能经受的生理剪切率。典型地，所述剪切率不超过6000S1、优选不超过40。
15、00S1、更优选不超过3000S1。0027在一个实施方式中，成熟巨核细胞的悬浮液呈现05106到4106/ML，优选至少1106/ML，优选至少2106细胞/ML，更优选至少4106/ML的细胞浓度。0028典型地，成熟巨核细胞的悬浮液包含悬浮在适当的细胞培养基中的巨核细胞群体。在一个实施方式中，所述细胞培养基是ISCOVESMODIEDDULBECCOS培养基IMDM。0029成熟巨核细胞的悬浮液可以在从血液样品或者骨髓样品分离后获得。或者，可在适当条件下使用稳定的巨核细胞细胞系例如DAMIGREENBERG等人，1988，MEG01ISAKARI等人，2009，UT7/TPOBARROG。
16、A等人，2008的悬浮液。根据本发明，成熟巨核细胞悬浮液经历600S1的剪切率，持续足以产生血小板的处理时间。典型地，所述处理时间可以为10分钟到2小时，典型地为15分钟到1小时，更优选地为15分钟到30分钟。在优选的实施方式中，所述处理时间为约20分钟。0030在具体的实施方式中，固相通过与血管性血友病因子或者其片段或变体或类似物的溶液一起孵育而涂覆。0031用于涂覆固相的VWF的浓度通常为5到100G/ML。在优选的实施方式中，VWF的浓度是20G/ML。0032在一个实施方式中，该固相涂覆有选自下组的片段或者变体或者类似物VWF的52/48KDA胰蛋白酶片段、金黄色葡萄球菌V8蛋白酶消化。
17、的VWF、用于治疗用途的VWF浓缩物和重组野生型VWF或引起2N型血管性血友病的VWF突变体。0033用于由成熟巨核细胞制备血小板的方法可以在流体室中进行，其中所述流体室包括涂覆有VWF或者其片段或变体或类似物的底壁，其中所述其片段、变体或类似物结合GPIB。0034本发明也涉及用于由成熟巨核细胞制备血小板的装置，所述装置包括流体室，所说明书CN104087552A4/16页6述流体室包括涂覆有VWF或者其片段或变体或类似物的底壁，其中所述其片段、变体或类似物结合GPIB。0035在优选的实施方式中，所述流体室由矩形腔构成。0036在进一步的实施方式中，所述流体室的底部是涂覆有本发明的因子的盖。
18、玻片。0037在进一步的实施方式中，用于制备血小板的流体室是在MEKRACHE等人，2002和LEGENDRE等人，2006中描述的腔室。0038在另一个实施方式中，所述流体室是微流体流动系统例如玻璃微毛细管KAUSKOT等人，2007，或微流体生物芯片和流量传感器ROBINSON等人，2008；WILLIAMS等人，2002，或任何其他类型的微流体流动系统例如参见CONANT等人，2009。0039有利地，适合于本发明的一些流体室允许在无菌条件下工作例如参见WILLIAMS等人，2002和CONANT等人，2009。在优选的实施方式中，所述流体室是无菌的。0040在进一步的实施方式中，剪切率。
19、由于流体室中的电泵而获得。0041血小板和药物组合物0042作为另一目的，本发明涉及由上述方法可获得的血小板。0043作为本发明的进一步的目的，由上述方法可获得的血小板可用于制备药物组合物。0044因此，本发明也提供含有本发明的血小板的药物组合物。通常所述药物组合物可包含一种或多种药学可接受的和/或被认可的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。这种辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。适合的载体通常是大的、缓慢代谢的分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚二醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。该药物组合物可以含有额外的添加剂，例如甘露醇、右旋。
20、糖酐、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或者其他的添加剂，例如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或适于体内施用的重组蛋白例如人血清白蛋白。0045如本文中所使用的，术语“药学可接受的”意指当适当地施用于哺乳动物特别是人时，不会产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学可接受的载体或赋形剂意指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂辅料。0046而且，本发明血小板和本发明药物组合物可用于治疗血小板计数减少症障碍，特别是血小板减少症和血小板病。例如，由本发明方法可获得的血小板可以以有效量输入患有血小板生成障碍的受试者中。0047在优选的实施方式中，血小板计数减少障碍可选。
21、自自身免疫性血小板减少症、与生成减少有关的血小板减少症中心起源或与任何原因的破坏增加有关的血小板减少症外周起源。0048本发明的相关方面涉及用于治疗患有血小板计数减少症障碍的受试者的方法，所述方法包括将有效量的本发明血小板或其群体或其药物组合物给药于受试者的步骤。0049在本发明的情况中，如本文所使用的术语“治疗”或“疗法”意指目的在于延迟或防止病理发作、在于逆转、缓解、抑制、延缓或停止病理症状的发展、加重或恶化、在于导致病理症状的改善和/或在于治愈病状的方法。0050如本文所使用的，术语“有效量”意指足以实现预定目的的本发明血小板或其群体或其药物组合物的任何量。说明书CN104087552A。
22、5/16页70051有效剂量和给药方案可以基于受试者的病理性质通过良好的医疗实践容易地确定，并取决于许多因素，包括但不限于病理症状的程度和所关注的组织或器官的损伤或退化程度，以及受试者的特征例如，年龄、体重、性别、总体健康等。0052为了治疗，本发明的血小板和药物组合物可以通过静脉内给药而全身性施用。给药剂量和次数可以由本领域技术人员以已知方式优化。0053而且，本发明的血小板可用于诊断目的。它们可作为用于血小板功能标准化的正常对照。0054血小板功能测试要求来自正常个体和感染个体的天然功能性状态下的新鲜血液血小板。血管性血友病是出血性疾病的最常见的单一原因。另外，高达50的皮肤粘膜出血性疾病。
23、由血小板功能障碍所引起。血小板功能测试的标准化要求实验室应该对所进行的每批血小板功能测试进行正常对照。然而，通过静脉穿刺的连续常规血液采样引起几种健康担忧和伦理问题。血小板功能的实验室评估包括透光率集合度测定LIGHTTRANSMITTANCEAGGREGATION和ATP释放试验、糖蛋白试验、电子显微术、促凝血功能测试、遗传测试PAI和HAYWARD，2009。0055因此本发明涉及用于诊断血小板障碍的方法，包括使用本发明的血小板以标准化血小板功能的步骤。0056通常，本发明的血小板可以由上述的巨核细胞细胞系获得。然后它们用于在体外诊断测试中标准化血小板功能。换言之，它们在测定血小板功能的体。
24、外诊断试验中用作阳性对照。0057通过以下实施例、附图和表格进一步说明本发明。附图说明0058图1在高剪切率、抑制剂的作用和粘性表面下前血小板形成的定量。将悬浮在IMDM中的细胞以1800S1在VWF上灌流10MIN，然后将单独IMDM灌流10MIN。粘附导致大的细胞形状变化并导致前血小板形成。图A显示与未变形的MK相比阶段1，在前血小板和血小板释放之前的剪切条件下MK变形的两个阶段；早期变形以细胞质延伸为特征阶段2；阶段3包括MK的后期变形，具有细胞极或两端的细胞骨架重组，连续的“成串珠”的长细丝，然后细胞破裂成细薄的区域。进一步暴露于剪切，所产生的血小板仍然与长细胞质血小板串或血小板双联体。
25、以及圆形血小板有关。定量化显示于图B中A，MK形状改变分为四类1转位的MK；2早期变形的MK，丧失球形；3晚期变形的MK和前血小板的延长；4前血小板破碎和血小板形成。图BF相对于10个区域中计数的细胞总数，各类的细胞分布，随灌流时间变化。在不存在抑制剂的情况下，在VWF上灌流的脐血MK图B或骨髓MK图C的分布的改变。在GPIBVWF相互作用抑制剂，糖萼素GLYCOCALICIN的封闭抗体图D或抗VWFMOAB图E，的存在下脐血MK在VWF上的灌流显示对MK与VWF接触以及后续步骤的重大抑制，从而破坏前血小板的形成。阻断IIB3和VWF的相互作用的阿昔单抗阻止前血小板和血小板形成图F。代表15个。
26、实验，比例尺代表10M。0059图2在剪切或静态条件下粘附于VWF涂覆的盖玻片的脐血MK的光学显微外观。从流动体室中取出盖玻片并用PBS冲洗，然后在冰冷的甲醇中固定，随后进行罗曼诺夫斯基ROMANOVSKY染色。在暴露于高剪切率下20MIN后，许多MK显示长和薄的前血小板延说明书CN104087552A6/16页8伸，其方向与流动方向平行。单一的单极的、长的前血小板从在其末端具有出芽BUDDING的细胞核心并沿着轴延伸左图。作为高剪切率作用的对照，将MK沉积在VWF上并在静态条件下孵育20MIN，除去非粘附细胞并用IMDM冲洗盖玻片。细胞显示球形形状，无任何前血小板延伸右图。放大倍率500。0。
27、060图3微管在剪切诱导的前血小板形成中的作用。图A用抗微管蛋白抗体标记间接免疫荧光显示前血小板和血小板形成。将在涂覆有VWF的表面上暴露于1800S1的剪切率的MK固定，并用鬼笔环肽左图和抗微管蛋白抗体右图染色。用共焦显微镜分析图像。没有看到肌动蛋白和微管蛋白之间的共定位。图B血小板脱落的MK延伸长和薄的前血小板，其具有血小板大小的膨胀末端。整个前血小板轴以及其尖端对微管蛋白进行标记。两个脱离的细胞片段显示特征性的微管蛋白标记其勾勒出哑铃形的前血小板及其中心窄化，而血小板大小的片段显示圆形的标记模式。图C微管抑制剂对前血小板的作用。前血小板延伸的逆转通过微管蛋白的解体表征。0061图4暴露于。
28、导致血小板形成的高剪切率的MK超微结构。流出的细胞悬浮液直接从灌流室出口收获在固定剂中，并如方法部分中描述的进行处理以用于电子显微镜检查。使成熟MK伸长，从而延伸包围平行的纵向微管插入物的长的细胞质丝状伪足。这些前血小板显示包含胞质细胞器的规则膨大。大的球形细胞质碎片，也许是脱离的前血小板PP位于附近图A。含有致密染色质的核叶NUCLEARLOBEN延长并位于细胞的一极。在流出物中收集通常不存在于MK培养基中的具有椭圆形的裸核和含有致密染色质的紧密核叶图B。填充有胞质细胞器的前血小板PP表现为大的细胞质碎片，无核，大致上是球形、哑铃形或伸长有细长的末端图C和D。观察到几个分离的血小板大小的片段。
29、P图E。比例尺代表2M。0062图5VWF和高剪切率对前血小板形成的特异性。图A在静态条件上图和在高剪切率下图下形成前血小板的MK在VWF涂覆的盖玻片上的相衬图像。在静态条件中前血小板在14H后形成并在16H后最大，但在流动下仅需要10MIN。图B甚至在没有活化的情况下HUVEC单层支持MK粘附上图，而HUVEC活化后观察到前血小板形成下图。图C在剪切条件下在非VWF上的MK变形和前血小板的形成最少，如纤维蛋白原、纤维连接蛋白和胶原蛋白所示的。0063图6暴露于高剪切率的MK获得的血小板可被凝血酶激活。在静态条件下在纤维蛋白原粘附试验中分析暴露于高剪切率的MK流通FLOWTHROUGH中的细胞。
30、流出物，然后用共焦显微术分析，用鬼笔环肽ALEXA546为细胞染色以可视化肌动蛋白以及用ALEXA488为细胞染色以可视化IIB3。由剪切暴露产生的MK源的血小板上图在不存在凝血酶左图的情况下或存在凝血酶右图的情况下粘附到纤维蛋白原上。非激活细胞显示弥漫性肌动蛋白染色和IIB3膜定位。在凝血酶活化后，肌动蛋白丝组织为应力纤维。它们显示与在未暴露于剪切的独立试验中制备的洗涤血小板相似的细胞骨架组织下图。比例尺代表10M。0064图7由凝血酶激活的释放的血小板表达P选择蛋白。由如图6的图例中所描述的由凝血酶激活或不激活细胞流出物并用流式细胞仪试验进行分析。用抗CD62PFITCFL1，P选择蛋白和。
31、抗CD41PEFL2，IIB标记样品。洗涤的血小板的FSCSSC特征的设置用于分析流通细胞左上图MK暴露于剪切；左下图洗涤的血小说明书CN104087552A7/16页9板。R1、R2和R3区域中的CD62P和CD41A双阳性细胞的柱状图由不存在凝血酶开放柱或存在凝血酶填充柱的情况下的点图获得。仅凝血酶激活的样品含有CD62P阳性细胞，而所有样品对CD41A都是阳性的右上图。流通中的激活血小板R1的柱状图，在存在凝血酶的情况下，用非免疫IGG细线，灰色背景、抗CD62P或抗CD41A粗线标记后右下图。0065图8MK源的血小板在凝血酶活化后的超微结构改变。通过凝血酶激活或不激活细胞流出物，并通。
32、过电子显微镜进行研究。不存在凝血酶的情况下，血小板大小的碎片显示平滑表面并含有若干分散于整个细胞质的颗粒A以及离散的SCCS潴泡图A。存在凝血酶的情况下，血小板大小的碎片显示激活的血小板特征性的形态变化，即球形形状、表面伪足P、SCCS扩大潴泡内的致密材料、细胞质中没有粒形成以及微纤丝的中心束，暗示激活的血小板图B。比例尺代表2M。实施例0066材料和方法0067蛋白质0068VWF由LABORATOIREFRANCAISDUFRACTIONNEMENTETDESBIOTECHNOLOGIESLILLE，法国赠送。纤维蛋白原来自HYPHENBIOMEDNEUVILLESUROISE，法国。人V。
33、WF和纤维蛋白原经纯化，且分别耗竭杂质纤维连接蛋白及纤维蛋白原和VWFLEGENDRE等人，2006。马腱胶原蛋白来自NYCOMEDMUNICH，GERMANY，且人纤维连接蛋白来自VWRFONTENAYSOUSBOIS，法国。野生型和突变的V1316M2B型重组VWFRVWF如另外AJZENBERG等人，2000所描述的获得。0069抗体0070单克隆抗体MOAB713，其在瑞斯托菌素的存在下阻断VWF与GPIB的结合，由JPGIRMA博士INSERMUNIT770，LE法国惠赠AJZENBERG等人，2000。多克隆抗糖萼素抗体，包含VWF结合位点的GPIB胞外域，由MCBERNDT博士M。
34、ONASHUNIVERSITY，MELBOUME，AUSTRALIA惠赠CRAMER等人，1991。藻红蛋白PE偶联的抗CD62PP选择蛋白、异硫氰酸荧光素FITC偶联的抗CD41AIIB、抗CD42BGPIB和非免疫抗体来自BECKMANCOULTERVILLEPINTE，法国。抗和微管蛋白MOAB来自AMERSHAMORSAY，法国。抗3整联蛋白P37MOAB由GONZALEZRODRIGUEZ博士CSIC，MADRID，SPAIN赠送CALVETE等人，1991。抗IIB3FABC7E3阿昔单抗来自LILLYSURESNES，法国。0071人巨核细胞0072用于该研究的人MK由从脐带血或。
35、骨髓分离的前体细胞培养。人骨髓样品在臀部手术期间收获和脐带血样品在经我们的学院伦理委员会ASSISTANCEPUBLIQUEDESDEPARIS同意后并按照赫尔辛基宣言DECLARATIONOFHELSINKI声明获得。人脐带血和骨髓CD34细胞通过免疫磁性技术STEMCELLTECHNOLOGIES，GRENOBLE，法国如先前所述FICHELSON等人，1999进行分离。细胞在补充有15BIT9500血清替代物STEMCELLTECHNOLOGIES和20NMOL/LTPO肽激动剂AF13948GENOSYSSIGMA，SAINTQUENTINFALLAVIER，法国的ISCOVESMOD。
36、IEDDULBECCOS培养基IMDM说明书CN104087552A8/16页10GIBCOINVITROGEN，CERGYPONTOISE，法国中生长。在培养的第一天一次性加入10NG/ML干细胞因子SCFAMGEN，NEUILLYSURSEINE，法国。在TPO存在下培养10到16天的MK完全成熟，并且准备用于血小板生物发生PATEL等人，2005A。通过流式细胞计显示细胞表达GPIB和IIB36070阳性细胞。对于剪切实验，在第10天和第16天之间使用细胞。0073人血小板0074从在之前的两周时间内没有摄取任何药物的健康个体中获得血液。将血液吸入PH58的15V/V的酸性柠檬酸葡萄糖A。
37、CIDCITRATEDEXTROSEACD中。在三磷酸腺苷双磷酸酶1U/MLSIGMA和ACD1ML用于40ML存在下从分离的富含血小板的血浆PRP制备经洗涤的血小板AJZENBERG等人，2000。简言之，在洗涤后，血小板再悬浮在含有015牛血清蛋白BSA的PH75的HEPES缓冲液10MMOL/LHEPESN2羟乙基哌嗪N乙磺酸、136MMOL/LNACL、27MMOL/LKCL和2MMOL/LMGCL2中。用电子颗粒计数器MODELZ1，COULTERELECTRONICS，MARGENCY，法国计数血小板，且浓度调节到15108血小板/MI。0075小鼠巨核细胞和血小板0076使用71。
38、0周大的野生型C57BL/6J小鼠。动物饲养和处置遵循制度规定。巨核细胞扩增并从冲洗骨髓中分离。简言之，免疫磁性纯化的LIN细胞在存在TPO肽的情况下在适当的巨核细胞分化培养基中生长。培养6天后，将成熟巨核细胞引入小型化流体室CONANT等人，2009中并在固定的小鼠重组VWFMARX等人，2008上以高剪切率灌流。0077灌流研究0078使用由MAASTRICHTINSTRUMENTATION获得的先前公开的流体室进行灌流研究LEGENDRE等人，2006。流体室由雕刻在有机玻璃PLEXIGLAS块中的005MM高、29MM长和5MM宽的矩形空腔组成。该室的底部内衬有盖玻片，该盖玻片在4下用。
39、在TRIS缓冲盐水TBS，25MMOL/LTRISHCL，PH74，150MMOL/LNACL中稀释的VWF20G/ML涂覆过夜。在一些实验中，测试另一种纯化的蛋白纤维连接蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白或2B型RVWF。将在IMDM悬浮液2ML中的浓度为081106细胞/ML的MK吸入5ML气密的玻璃微量注射器EXMINE，ITOCORPORATION，FUJI，日本中，所述微量注射器通过延伸装置EXTENSIONSETSTERITEX，CODAN，LENSAHN，德国与室连接。通过电动泵施加225L/MIN的流速，从而产生1800S1的剪切率。细胞灌流10MIN，然后在相同剪切率下IMDM灌流1。
40、0MIN。所有的实验在利用MINITB加热系统MINITBABFLLUNDLABORTECHNIK，TIEFENBACH，德国维持的37下进行。在一些实验中，细胞或盖玻片在灌流前用抗体预孵育10MIN。在灌流结束时，用冰冷的甲醇固定盖玻片5MIN，用蒸馏水洗涤，干燥并染色。在室的出口处收集流出物用于进一步的研究，包括凝血酶活化。0079视频显微镜系统0080灌流室置于倒置显微镜AXIOVERT135，ZEISS，德国的夹片台上。用CCD照相机SONY，TOKYO，日本显现细胞，使用20HOFFMAN调制对比度物镜。用连接到视频定时器VIDEOTIMERVTG，TOKYO，日本上的数字图像记录仪。
41、REPLAYSOFTWARE，MICROVISIONINSTRUMENTS，EVRY，法国进行连续记录。用HISTOLAB或VIDEOMET量化软件MICROVISIONINSTRUMENTS分析图像帧。说明书CN104087552A109/16页110081细胞活化研究和流式细胞分析。0082收集流出细胞悬浮液，并在05MMOL/L的EDTA存在下以1800RPM离心12MIN，沉淀再悬浮在IMDM中。等分试样在不存在或存在凝血酶05U/ML的情况下在37下孵育10MIN。悬浮液100L中的细胞在室温下与FITC抗CD62P和PE抗CD41A各5L或非免疫偶联的对照抗体一起孵育20MIN，然。
42、后加入300ULPBS。然后用FACSORR流式细胞计BECTONDICKINSON，LEPONTDECLAIX，法国分析细胞；用血小板区域上的设置获得10000个结果，所述设置通过其在由未刺激的洗涤血小板在独立实验中确定的直角散射RIGHTANGLESCATTERSSC和前向角散射FSC图上的特征曲线确认。0083共焦免疫荧光0084将未激活的和凝血酶激活的细胞的等分试样150L加入在静态条件下孵育30MIN的纤维蛋白原涂覆的玻璃LABTEK室载玻片上NUNC，ROCHESTER，NY。除去非粘附细胞，并用PBS洗涤载玻片三次，然后用在PBS中的2仲甲醛CARLOERBA，VALDEREUI。
43、L，法国固定30分钟，并在4储存。对于免疫荧光染色，用01TRITONX100的PBS溶液渗透细胞5MIN，然后用抗3P37MOAB10G/ML的PBS溶液孵育30MIN，洗涤并用20G/ML的与ALEXAFLUOR488MOLECULARPROBES，EUGENE，OR偶联的二级抗体一起孵育。阴性对照使用来自小鼠腹水的相同蛋白浓度的纯化IGG。对于肌动蛋白标记，渗透的细胞在室温下用含有3BSA的50L的30NMOL/LALEXAFLUOR546鬼笔环肽MOLECULARPROBES的PBS溶液孵育30MIN。然后洗涤盖玻片两次并封固在含有TOTO3和VECTASHIELDVECTORLABO。
44、RATORIES，PETERBOROUGH，UK的封片溶液MOUNTINGSOLUTION中。用LEICATCSSP2AOBS共焦显微镜分析ALEXAFLUOR488/ALEXAFLUOR546染色。0085电子显微镜检查0086流出细胞悬浮液直接在灌流室的出口处收集在戊二醛固定液在01M、PH74的磷酸盐缓冲液中的最终浓度为15中，在通过各种基质后，然后如先前描述CRAMER等人，1997的进行处理以用于电子显微镜检查。一些样品首先如上由凝血酶激活并进一步处理用于电子显微镜检查。在JEOL1011电子显微镜JEOLLTD，TOKYO，日本上进行检测。0087统计学分析0088我们使用STUD。
45、ENTS不配对T检验进行统计分析；P值005被认为显著。误差棒代表平均值的标准误差SEM。0089结果0090MK与VWF的动力学相互作用0091脐血成熟MK以不同的切变率在涂覆有纯化VWF的表面上灌流。在1800S1下，MK形成与VWF的瞬时相互作用，从而减慢在VWF上滚动的MK的速度并逐渐导致深刻的形态变化，其最终导致血小板从MK脱落。血小板形成的不同阶段概述于图1A中。该过程从大致球形的MK开始，然后细胞外缘变形和伪足在粘附的MK上变得可见阶段2。然后在细胞体后面和/或前面发生沿着流动组织化的细胞质延伸阶段3。具有成串珠外观特征的中间膨大开始显现。延伸以21M/MIN的速度迅速发生，从而。
46、比在静态条件下报告的高25倍PATEL等人，2005B。有趣的是，破碎不仅发生在这些延伸的末端，还发生在膨大之间，特别在较薄的收缩段中，从而释放不同大小的碎片，且最经常是几个珠仍然连在一起，但是没有主细胞体图1A。最后，这些碎片进一步破碎成在稍后时间点期间清晰可见的更小说明书CN104087552A1110/16页12的颗粒，为血小板的大小图1A。前血小板破碎在高剪切率条件下在1520MIN内迅速发生。使用脐血源的MK或骨髓源的MK获得了相似的结果。相反，在不存在流动或在较低剪切率1000S1的情况下，在MK与VWF接触的20MIN时间内没有观察到前血小板和血小板释放。未成熟MK培养少于9天的。
47、剪切暴露不会发生转位和破碎。0092与MK受体相互作用的VWF在血小板形成中的特异性0093定义四个细胞种类以量化剪切暴露期间的形态变化1转位的MK；2早期变形MK，丧失球形；3晚期变形MK，具有前血小板延伸；和4前血小板破碎和血小板释放图1B，图A。延伸细胞和前血小板和血小板的比例逐渐增加，在20MIN时达到细胞的27649。这种增加反映转位的细胞从5MIN时的28265降低到20MIN的3616，以及早期变形MK的降低图1B，图B。当测定暴露于高剪切率的骨髓MK的分布时，获得类似于用脐血MK描述的结果图1B，图C。在存在针对糖萼素或VWF的GPIB结合域的抗体的情况下，MK转位和后续步骤包。
48、括前血小板形成和血小板释放完全停止图1B，图D和E，说明VWFGPIB相互作用的至关重要。在IIB3抑制剂阿昔单抗存在下，不具有前血小板的细胞未变形和早期变形的MK的比例随时间保持恒定，而前血小板延伸强烈减少，且血小板的形成几乎完全消除图1B，图F。这种前血小板形成的无效是由于与VWF表面的接触不良数据未示出。0094由MK暴露于高剪切率诱导的血小板形成的表征0095和在静态条件下在VWF上孵育细胞20MIN得到的对照其中MK的形态相对于与VWF接触前的细胞保持不变相比，施加于成熟MK的剪切力诱导特异性的形态变化图2。相反，MK灌流20MIN后涂覆有VWF的盖玻片的固定后染色显示，MK在其尖端。
49、延伸长的线状伪足，且沿轴形成珠状血小板样尖突起以及较大细胞质碎片图2。前血小板延伸需要对于和1微管蛋白染色的重叠微管的滑动PATEL等人，2005B。我们发现MK延伸在与肌动蛋白不同的区域中由抗微管蛋白抗体染色，证实这些延伸显示与由ITALIANO等人ITALIANO等人，2003；ITALIANO等人，1999；PATEL等人，2005A；PATEL等人，2005B的工作在前血小板形成MK中确认的类似的染色；微管蛋白标记跟随延伸的MK中的前血小板轴并在球形MK上、前血小板上和血小板上显示环形图案图3B。微管在剪切诱导的前血小板形成中的重要性由诺考达唑NOCODAZOLE微管装配抑制剂的预孵育证实，其完全阻止流动条件下的MK延伸和前血小板形成数据未显示。为证明诺考达唑不是作用于细胞悬浮液中的预形成的血小板，在延伸后加入微管抑制剂；实时可见的效应显示，当在该过程发生之后添加时，诺考达唑可以逆转剪切诱导的延伸。逆转的特异性由微管蛋白染色证实。有趣的是，加入诺考达唑25MIN后，在前血小板和血小板中观察到微管蛋白不再组织化，从而表明延伸过程不同于系留图3C。事实上，膜系留是在流动影响下从小的、局部化粘附接触延伸。