以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物及其合成方法和用途.pdf

本发明公开了两个新的以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物及其合成方法和用途。所述的钌、铑金属配合物是将二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱溶解于极性溶剂中，进行配位反应获得；具体可通过溶液法或溶剂热法合成。申请人通过考察它们对NCI-H460、HepG-2、DLD-1、MGC80-3等人类肿瘤细胞株的增殖抑制活性和人正常肝细胞HL-7702的毒性，结果表明它们具有显著的体外抗肿瘤活性，其中铑金属配合物的活性与顺铂相当，且其对正常细胞的细胞毒性较低，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。上述配合物的结构式分别如下述式(I)、式(II)所示。

1.  以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物，它们的结构式分别如下述式(I)、式(II)所示：


2.  权利要求1所述的以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物的合成方法，包括以下步骤：
1)按化学计量比称取二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱配体，溶于极性溶剂中，得到混合溶液；
2)所得混合溶液于20℃至极性溶剂的沸点之间反应；
3)所得反应液过滤，沉淀物经洗涤、干燥，即得到相应的钌金属配合物或铑金属配合物。

3.  根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述的极性溶剂为选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、氯仿和二氯甲烷中的一种或它们中任意两种以上的组合。

4.  权利要求1所述的以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物的合成方法，其特征在于：按化学计量比称取二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱配体，加入极性溶剂溶解，所得混合溶液置于容器中，经液氮冷冻后抽至真空，熔封，然后于60～150℃条件下反应，即得到相应的钌金属配合物或铑金属配合物。

5.  根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于：所述的极性溶剂为选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、氯仿和二氯甲烷中的一种或它们中任意两种以上的组合。

6.  权利要求1所述的以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.  以权利要求1所述的以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物为有效成分制备的抗肿瘤药物。

以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物及其合成方法和用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物及其合成方法和用途。
背景技术
观音莲明碱(Lysicamine)属异喹啉类生物碱，在防己科金线吊乌龟、番荔枝科及睡莲科植物莲荷叶中都有提取出观音莲明碱成分。现代药理研究证明，观音莲明碱具有抗菌消炎及抗肿瘤的作用。从目前对观音莲明碱的研究情况看，主要包括两个方面：一方面为从不同科属(如北马兜铃根、酸枣仁、金线吊乌龟茎叶和凹叶厚朴等)的植物中对其进行定量提取和成分分析；另一方面，则是对其药理活性特别是抗肿瘤活性的研究，研究者已对观音莲明碱的药理作用进行了广泛的研究并取得较大进展，实验证明观音莲明碱具有显著的抗肿瘤、抗病毒、抑菌活性、抗真菌和抗细菌繁殖作用，近来的研究则更加针对于它的抗癌作用和抗HIV作用，已发现观音莲明碱对人类肝癌细胞HepG-2和肺癌细胞NCI-H460的生长具有显著的抑制作用，可以诱发癌细胞的凋亡，并对其作用机制进行了较为系统的探讨。
基于药用活性配体的无机药物研究在近年来随着生物无机化学的蓬勃发展而成为热点研究领域。为了有根本性的创新与突破，基于天然活性成分的金属基药物成为研究的主要热点之一。Ru、Rh与Pt同属Ⅷ族，化学性质相似，因此对钌、铑配合物的抗肿瘤性质研究也较活跃。有低毒性的钌配合物有可能是因为配合物进入体内后，被充当前体药物，然后通过水解或者由Ru(III)向Ru(II)的还原而被激活，也称“还原活化(activation byreduction)”。同时，又因为钌跟铁相似，因此可以模拟铁和很多生物大分子结合，特别是与血浆中的血清蛋白和转铁蛋白结合，通过“转铁蛋白传输(transferrin targeteddelivery)”起作用。实验研究表明，许多铑的配合物对Ehrilch腹水癌、B16黑肿瘤、MCa乳腺癌、口腔癌肿、Lewis肺癌和P388小鼠细胞白血病都有活性。目前，基于观音莲明碱为配体合成的Ru/Rh金属配合物的方法及药理活性研究尚属空白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物，以及它们的合成方法和用途。
观音莲明碱(Lysicamine)的分子式为C₁₈H₁₃NO₃，分子量为291.31g/mol，其化学结构式如下式所示(以下所述的LY为观音莲明碱配体简称)：

该分子结构中，杂环N原子与羰基O原子具有较强的配位能力，可在配位反应中形成如下配位方式：N、O双齿螯合方式；以观音莲明碱的喹啉N和羰基O两个原子与Ru(Ⅱ)、Rh(III)进行配位螯合，得到钌金属配合物和铑金属配合物，它们的化学结构式分别如下述式(I)、式(II)所示：

上述配合物的合成方法为：按化学计量比称取二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱配体，溶解于极性溶剂中，然后混合进行配位反应(加热或回流)，即得到相应的钌金属配合物或铑金属配合物。合成路线如下：

本发明所述的合成方法中，所述作为原料的观音莲明碱配体可按现有技 术进行合成或从相应的药用植物中提取，具体可参考现有文献(Bioorganic&Medicinal Chemistry，2004,12(2),439-446.)进行制备；所述的二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)可按现有技术进行合成，具体可参考现有文献.(Dalton Trans.,2009,262–272)进行制备；所述观音莲明碱配体和二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)的物质的量之比通常为1～3：1，观音莲明碱配体和三氯化铑的物质的量之比通常为1～3：1。
具体在合成时，可采用溶液法或溶剂热法进行合成。
当采用溶液法合成时，包括以下步骤：
1)按化学计量比称取二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱配体，溶于极性溶剂中，得到混合溶液；
2)所得混合溶液于20℃至极性溶剂的沸点之间反应；
3)所得反应液过滤，沉淀物经洗涤、干燥，即得到相应的钌金属配合物或铑金属配合物。
该方法的步骤1)中，极性溶剂可以是现有技术中常规的选择，优选是采用选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、氯仿和二氯甲烷中的一种或它们中任意两种以上的组合。当极性溶剂的选择为它们中两种以上的混合物时，它们之间的配比可为任意配比。所述极性溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，以1mmol的二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑计算，全部原料所用极性溶剂的总用量一般为10～100mL。在具体的溶解步骤中，可将二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱配体分别用极性溶剂溶解，再混合在一起反应；也可将二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱配体混合后再加极性溶剂。
该方法的步骤2)中，反应是否完全通过薄层层析跟踪检测，优选是将混合溶液在60℃至极性溶剂的沸点之间进行回流反应，当反应的时间控制在6～24h时，产率即可达50％以上；也可根据需要将反应时间控制在24h以上。在进行反应时，可以根据反应物的性质，选择适当的反应环境，如对于光敏性物质和易氧化物质，需要分别采取避光和惰性气氛条件等。
该方法的步骤3)中，通常采用水、甲醇、乙醇、氯仿或二氯甲烷等极性溶剂洗涤沉淀物。干燥条件可以是在30～80℃条件下的真空干燥或常压干燥。本方法中，产物一般以沉淀的形式生成，如果前序步骤1)中极性溶剂的加入量较大(如接近配比的上限)或选用的极性溶剂对产物的溶解性较好(如二甲基亚砜、丙酮、氯仿或二氯甲烷或它们中任意两种以上的组合等)，则反应后溶液可能呈澄清状态，此时可将反应后溶液减压蒸馏以除去部分溶剂，使产物以晶体形式析出，分离出晶体后再进行下一步操作。
当采用溶剂热法合成时，所述的合成方法为：按化学计量比称取二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱配体，加入极性溶剂溶解，所得混合溶液置于容器中，经液氮冷冻后抽至真空，熔封，然后于60～150℃条件下反应，即得到相应的钌金属配合物或铑金属配合物。
上述溶剂热法中，极性溶剂可以是现有技术中常规的选择，优选是采用选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、氯仿和二氯甲烷中的一种或它们中任意两种以上的组合。当极性溶剂的选择为它们中两种以上的混合物时，它们之间的配比可为任意配比。所述极性溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，以1mmol的二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑计算，全部原料所用极性溶剂的总用量一般为0.5～30mL。在具体的溶解步骤中，可将二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱分别用极性溶剂溶解，再混合在一起反应；也可将二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)或三氯化铑和观音莲明碱混合后再加极性溶剂。该方法中，所述的容器通常为厚壁玻璃管，混合溶液在60～150℃条件下反应的时间通常为12～72h，产率即可在60％以上；也可根据需要将反应时间延长至72h以上。反应完成后取出厚壁玻璃管，冷却、静置，即有产物生成。分离出产物，经洗涤、干燥后即得到相应的配合物。
本发明还包括上述以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还包括上述以观音莲明碱为配体的钌、铑金属配合物为有效成分制备的抗肿瘤药物。
本发明以观音莲明碱为配体，与金属钌和铑配位反应合成了具有抗肿瘤活性的观音莲明碱钌、铑金属配合物，通过考察它们对NCI-H460、HepG-2、DLD-1、MGC80-3等人类肿瘤细胞株的增殖抑制活性和人正常肝细胞HL-7702的毒性，结果表明它们具有显著的体外抗肿瘤活性，其中铑金属配合物的活性与顺铂相当，且其对正常细胞的毒性较低，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的Ru^Ⅱ－LY配合物的红外谱图；
图2为本发明实施例1制得的Ru^Ⅱ－LY配合物电喷雾质谱谱图；
图3为本发明实施例1制得的Ru^Ⅱ－LY配合物单晶X射线衍射图；
图4为本发明实施例2制得的Rh^Ⅲ－LY配合物的红外谱图；
图5为本发明实施例2制得的Rh^Ⅲ－LY配合物电喷雾质谱图；
图6为本发明实施例2制得的Rh^Ⅲ－LY配合物单晶X射线衍射图；
图7为本发明实施例2制得的Rh^Ⅲ－LY核磁共振氢谱谱图；
图8为本发明实施例2制得的Rh^Ⅲ－LY核磁共振碳谱谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
以下实施例中用到的二氯·四(二甲基亚砜)合钌(II)(RuCl₂(DMSO)₄)采用以下方法进行制备：
取0.5g RuCl₃.3H₂O和3mL DMSO置于容器中，升温至190℃回流反应10min，得到深红色溶液；降至常温，向此溶液中加入25mL丙酮，混合均匀后，在-4℃条件下放置24h，析出黄色晶体，即为RuCl₂(DMSO)₄。
实施例1：以溶液法合成Ru^Ⅱ－LY配合物
取1mmol RuCl₂(DMSO)₄溶解于10ml的氯仿中，1mmol的LY溶解于15mL的甲醇中，在65℃两种溶液混合反应12h，反应后得到墨绿色溶液；该溶液蒸除部分溶剂，以使产物达到过饱和而析出，分离出深绿色固体，洗涤、干燥，得到深绿色固体产物(产率93％)。
对所得深绿色固体进行红外光谱、元素分析、电喷雾质谱、单晶衍射分析，具体波谱特性如下：
(1)红外光谱，其谱图如图1所示，IR(KBr):(Ar-H)3008(m),(C＝O)1601(m),(C＝C)1563/1481/1468(s),(C-O)14121269(vs),(C-N)1026(s)cm^-1。
(2)元素分析，Anal.Calc.(for C₂₂H₃₁Cl₂NO₈RuS₂)C％:42.88；H％:3.755；N％:2.29；S％:9.692％Found.C％:42.65；H％:4.070；N％:2.26；S％:10.33.
(3)电喷雾质谱，其谱图如图2所示，ESI-MS m/z:745.05[Ru(LY)Cl₂(DMSO)₂].2H₂O。
(4)单晶X射线衍射分析，其结构图如图3所示。
因此可确定该产物为配合物[C₂₂H₃₁Cl₂NO₈RuS₂]。
实施例2：以溶液法合成Rh^Ⅲ－LY配合物：
取0.1mmol RhCl₃·3H₂O溶解于10ml的水中，1mmol的LY溶解于15mL的乙醇中，在80℃下回流反应12h后停止反应，降至室温，静置过夜；过滤，滤液于室温下缓慢挥发，两周后有深红色方条型晶体析出，分离出晶体，洗涤、干燥，得到深红色方条型晶体(产率93％)。
对所得深红色进行红外光谱、元素分析、电喷雾质谱、单晶衍射分析，具体波谱特性如下：
(1)红外光谱，其谱图如图4所示，
IR(KBr)::(Ar-H)3066(m),(C＝O)1602(m),(C＝C)1557/1496/1429(s),(C-O)127812143(vs),(C-N)1077(s)cm^-1
(2)元素分析，Anal.Calc.(for C₁₈H₁₅Cl₃NO₅Rh)C％:40.68/40.58；H％:2.724；N％:2.81；Found.C％:41.86；H％:2.735；N％:2.72.
(3)电喷雾质谱，其谱图如图5所示，ESI-MS m/z:516.81[Rh(LY)Cl₃CH₃OH]。
(4)单晶X射线衍射谱，其谱图如图6所示。
(5)核磁共振氢谱，其谱图如图7所示，¹H NMR(500MHz,DMSO):δ10.02(d,J＝8.7Hz,1H),9.24(d,J＝5.3Hz,1H),8.54(d,J＝7.3Hz,1H),8.22(d,J＝5.4Hz,1H),7.91(s,1H),7.59(s,1H),7.37(s,1H),4.01(s,3H).
(6)核磁共振碳谱，其谱图如图8所示，¹³C NMR(125MHz,DMSO):δ 181.52,173.11,159.32,143.94,138.45,136.69,136.65,134.38,127.14,126.18,125.43,124.81,124.70,123.94,107.74,105.41,56.52,49.08.
因此可确定该产物为配合物[C₁₈H₁₅Cl₃NO₅Rh]。
实施例3：溶剂热法合成Ru^Ⅱ－LY金属配合物
在一端开口的厚壁玻璃管中，加入0.1mmol中间产物RuCl₂(DMSO)₄和0.1mmol的LY，再加入2mL丙酮与1mL二氯甲烷的混合溶剂，在抽真空的条件下，将另一开口端熔封，然后在80℃条件下反应48h，反应后除去溶剂，取出深绿色固体以乙醇洗，以去除未反应物及杂质，40℃真空干燥4h，得到深绿色固体，此产物经红外光谱、元素分析测试，质谱，X-射线单晶衍射确定为配合物[C₂₂H₃₁Cl₂NO₈RuS₂]。
实施例4：以溶液法合成Rh^Ⅲ－LY配合物
在一端开口的厚壁玻璃管中，加入0.1mmol RhCl₃·3H₂O与0.1mmol LY，再加入3mL二甲基亚砜，在抽真空的条件下，将另一开口端熔封，然后在70℃条件下反应72h，反应后除去溶剂，取出深红色固体以乙醇洗，以去除未反应物及杂质，40℃真空干燥4h，得到深红色晶体，此产物经红外光谱、元素分析测试，质谱，X-射线单晶衍射确定为[C₁₈H₁₅Cl₃NO₅Rh]。
为了充分说明本发明所述的观音莲明碱钌、铑金属配合物在制药中的用途，申请人对其进行了抗肿瘤活性实验。
一、配合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：
1、细胞株与细胞培养
本实验选用人肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞HepG-2、人结肠癌DLD-1、人胃癌细胞MGC80-3等4种人类肿瘤细胞株和人正常肝细胞HL-7702。
所有细胞株均培养在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO₂孵箱中培养。
2、待测化合物的配制
所用的配合物的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配制成20μmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的终浓度≤1％，测试该浓度下配合物对各种肿瘤细胞生长的抑制程度。
3、细胞生长抑制实验(MTT法)
(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成个数浓度为5000/mL的细胞悬液，以每孔190μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
(2)5％CO₂，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；
(3)5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；
(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h；
(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。
(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用下述公式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算配合物1对上述几种肿瘤细胞株的IC₅₀值。其结果如以下表1所示。

表1：配体LY、Ru/Rh配合物对不同肿瘤细胞株的IC₅₀值(μM)

从IC₅₀的结果来看，配合物对四种人肿瘤细胞株均表现出一定的增殖抑制活性，配合物Rh^Ⅲ-LY对癌细胞珠具有抗癌广谱性，活性几乎与顺铂相当，但对人正常肝细胞HL-7702细胞毒性小，其IC₅₀值大于50μM，这是一个有积极意义的结果，表明配合物Rh^Ⅲ-LY在表现一定的广谱抗肿瘤活性的同时，还具有较低的毒性，即配合物Rh^Ⅲ-LY具有一定的细胞毒性选择性。相对于铑配合物的活性，钌配合物的活性相对较差一些。
综上所述，本发明所述的铑配合物，总体表现出了明显的体外抗肿瘤活性和毒性选择性，且有助于克服肿瘤细胞耐药性，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。