用作治疗剂的吡啶基二膦酸酯 本发明涉及用作治疗剂，特别是用于骨病的特殊吡啶基二膦酸四酯。
二膦酸酯是用于治疗各种起源的病理性骨损伤的治疗剂，例如由于恶性肿瘤的溶骨病、佩吉特病(Paget’s disease)和骨质疏松症。它们是生理性无机焦磷酸酯的类似物。二膦酸酯的基本P-C-P结构使其可通过改变碳原子侧链或通过加到磷酸酯上而形成许多不同化合物。
一般而言，二膦酸酯可抑制破骨细胞，该细胞负责骨的吸收。已知的结合在骨质上的二膦酸酯可进入再吸收的破骨细胞并降低破骨细胞的活性。它们可于体外及体内抑制骨吸收。从胃肠道有限的吸收、于骨组织中迅速消失以及尿中恒定的排泄都是已知二膦酸酯的特性。
本发明基于提供具有高口服生物利用度和对骨的低亲合力的二膦酸酯衍生物。这为了避免副作用而不削减抗吸收活性。
美国专利4447256、德国专利2831578(Suzuki等)、日本专利55089210、日本专利55098105、日本专利55043054、日本专利55043055(Nissan Chemicalindustries)公开了制备某些吡啶基氨基亚甲基二膦酸四烷基酯的方法。根据这些专利，该化合物可用作除草剂。
欧洲专利337706(Isomura等)中公开了环基和杂环基取代的氨基亚甲基二膦酸四酯的制备，其中的环取代基为部分或全部饱和。四酯未经检测。
美国专利4973576(Sakamoto等)公开了某些异噁唑基取代地氨基亚甲基二膦酸四烷基酯，但是它们基本上是在关节炎中试验的。其口服生物利用度低。
欧洲专利282309公开了吡咯氨基亚甲基二膦酸及低级烷基酯。四酯未经检测。
欧洲专利325482公开了环烷基氨基亚甲基二膦酸及酯。四酯未经检测。
本发明涉及具有新药理和药代动力学特征的吡啶基二膦酸酯。这些新吡啶基二膦酸酯在体外不能抑制骨吸收，但是它们可抑制体内骨吸收。
吡啶基二膦酸酯不与骨质结合，它们似乎需要新陈代谢活化。
因此本发明涉及用作治疗活性药物的吡啶基氨基亚甲基二膦酸四烷基酯，其选择性在吡啶环上取代，具体为通式I的亚甲基二膦酸衍生物
通式中R1至R4各自为直链或支链饱和C1-C5烷基，X和Y各自独立地为氢、直链或支链饱和C1-C5烷基、卤素、羟基、C1-C5烷氧基、苄氧基、酰氧基、硝基、三氟甲基或NR5R6，其中R5和R6相同或不同，可为氢、C1-C5烷基或酰基。
亚甲基二膦酸酯骨架中的基团X和Y以及氨基可在吡啶环的2至6位任一上取代。基团X和Y优选为氢或羟基，后者优选为一或两个羟基。吡啶基优选为2-吡啶基。
卤素为氟、氯、溴或碘。
C1-C5烷基为直链或支链，例如甲基，乙基，正、异丙基，正、异和叔丁基或者戊基，优选甲基或乙基。定义X和Y烷氧基中的烷基具有如上含义，优选甲基或乙基。
定义X和Y酰氧基中的酰基，或者定义R5和R6的酰基优选为低级烷基羰基，其中烷基含有1至5个碳原子并且具有如上含义，优选甲基和乙基。基团R1至R4优选都相同，乙基更好。
本发明优选的化合物如下：
[(2-吡啶基氨基)亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(3-羟基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(6-甲氧基-3-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[(4-吡啶基氨基)亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(5-氯-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(5-甲氧基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(6-氨基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(3-硝基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(3，5-二氯-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(6-羟基-3-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(5-羟基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(3-氯-5-三氟甲基-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(2-氯-3-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(6-氯-3-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(3-苄氧基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(5-硝基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
[[(5-苄氧基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]二膦酸四乙酯
N-取代的(氨基亚烷基)二膦酸四酯可用已知方式制备，例如通过氨基取代的化合物与原甲酸烷基酯反应，然后将所得中间体亚氨醚衍生物与亚磷酸二烷基酯(如此或纯化形式)反应。
另一方法是首先将适当氨基吡啶与甲酸/乙酸酐混合物反应。然后将所得甲酰胺与三卤化磷和亚磷酸三烷基酯反应。
氨基亚烷基二膦酸四酯也可通过将氨基吡啶衍生物与膦酸卤代甲基酯反应，然后将所得化合物溴化后与亚磷酸三烷基酯反应(Schrader等，Synthesis(1986)，372)。
该化合物可用于治疗哺乳动物的骨病，例如由于恶性肿瘤的溶骨病、佩吉特病和原发性及继发性骨质疏松症。
该化合物的活性可通过动物及体外研究确证，以下为方法和结果。在正常发育的大鼠中，一种代表性化合物-[(2-吡啶基氨基)亚甲基]二膦酸四乙酯可降低自发性骨吸收，其可通过长期预标记大鼠的尿四环素排泄量评价。所述化合物也可有效抑制由切断大鼠坐骨神经骨诱导的实验性骨质疏松症中骨的丢失。对体外培养的小鼠颅盖的吸收没有影响，其通过钙释放分析。这可以说明该化合物在发挥药理作用前被代谢掉。母体化合物对体外羟磷灰石晶体未显示出任何结合作用。
在大鼠中研究化合物[(2-吡啶基氨基)亚甲基]二膦酸四乙酯的药代动力学。静脉内药量中少量在24小时中进入尿以母体化合物形式排泄，维持彻底的新陈代谢。所述化合物口服剂量中约有半量可在大鼠中吸收。
下述实施例阐明本发明，但不以任何方式限定本发明。
实施例1
[(2-吡啶基氨基)亚甲基]二膦酸四乙酯的合成
将2-氨基吡啶(0.2摩尔)与原甲酸三乙酯(0.8摩尔)和三氟化硼醚合物混合，将该混合物于150℃加热4小时，然后蒸馏掉反应中形成的乙醇。真空中蒸馏掉原甲酸三乙酯。将亚磷酸二乙酯(0.4摩尔)加到反应混合物中，于150℃加热该混合物同时蒸馏掉所形成的乙醇。冷却混合物，色谱纯化粗产物(洗脱液为二氯甲烷-甲醇1∶1)。产率29克(37％)。
该产物的理化性质如下：31P-NMR(CDCl3)15.52ppm1H-NMR(CDCl3) ppm 质子 多重态 分配 1.27 12H m CH3 4.21 8H m CH2 4.78 1H d NH 5.57 1H dt CH 6.52 1H d CH(芳香) 6.67 1H m CH(芳香) 7.44 1H m CH(芳香) 8.11 1H d CH(芳香)
质谱(EIMass)
380M
334M-乙醇
243M-P(O)(OC2H5)2
实施例2
[[(5-氯-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯的合成
将5-氯-2-吡啶(0.2摩尔)与原甲酸三乙酯(0.8摩尔)和三氟化硼醚合物混合，将该混合物于150℃加热4小时。反应过程中蒸馏掉所形成的乙醇。真空中蒸馏掉原甲酸三乙酯。将亚磷酸二乙酯(0.4摩尔)加到反应混合物中，于150℃加热该混合物同时蒸馏掉所形成的乙醇。冷却混合物，色谱纯化粗产物(洗脱液为二氯甲烷-甲醇1∶1)。产率26.5克(32％)。(31-P-NMR 15.20 ppm；CDCl3)
按照相同的方式可制备下列化合物：
[[(3，5-二氯-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯(31-P-NMR14.59 ppm；CDCl3)
[[(3-氯-5-三氟甲基吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯(31-P-NMR 14.15ppm；CDCl3)
[[(5-羟基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯(质谱(EI Mass)：396M，350M-乙醇，259M-P(O)(OC2H5)2)
[[(5-硝基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯(31-P-NMR13.97 ppm；CDCl3)
[[(5-苄氧基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[(5-甲氧基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[(3，5-二甲氧基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
实施例3
[[(3-羟基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯的制备
将2-氨基-3-羟基吡啶与苄基氯在两相体系和相转移催化剂中进行o-苄化作用(Bristol等，Synthesis 1981，971)。将2-氨基-3-苄氧基吡啶(0.1摩尔)溶于二氯甲烷，将该溶液冷却至0℃，将50毫升甲酸/乙酸酐(5∶3)加到该溶液中，室温下搅拌该混合物过夜。浓缩反应混合物，残余物用二异丙醚洗涤而得11.4克6-甲氧基-3-甲酰胺。将10毫升三氯化磷和1.5毫升亚磷酸三乙酯于60-70℃加热1小时。将3-苄氧基吡啶基-2-甲酰胺(0.01摩尔)加到该溶液中，室温下搅拌混合物5小时。浓缩反应混合物，色谱纯化(洗脱液为二氯甲烷-甲醇，2∶1)得0.8克[[(3-苄氧基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯。将苄基氢化而得0.4克[[(3-羟基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯(质谱(EI Mass)：396M，350M-乙醇，259M-P(O)(OC2H5)2)。
按照相同方式制备下列化合物：
[[(6-苄氧基-3-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[(6-羟基-3-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
实施例4
[[(6-氯-3-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯的制备
按照Cade，J.Chem.Soc.1959；2266制备碘代甲基膦酸二乙酯。
用已知方法将6-氯-3-氨基吡啶与碘代甲基膦酸二乙酯烷基化，氨基钠作为碱。用200瓦灯照射所得6-氯-3-吡啶基氨基-甲基膦酸二乙酯(0.5摩尔)和N-溴琥珀酰亚胺(0.5摩尔)的无水四氯化碳溶液。滤除固体，用四氯化碳洗涤，真空浓缩溶液。将所得6-氯-3-吡啶基氨基(溴甲基)-膦酸二乙酯(0.1摩尔)在四氢呋喃中与亚磷酸三乙酯(0.1摩尔)50℃下保温4小时。真空浓缩反应混合物。色谱纯化产物(洗脱液为二氯甲烷∶甲醇，9∶1)。产率5.1克。
按照相同方式制备下列化合物：
[[(2-氯-3-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[(6-甲氧基-3-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[4-吡啶基氨基)亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[(6-氨基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[(3-硝基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[(2-氯-3-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯
[[(5-酰氧基-2-吡啶基)氨基]亚甲基]-二膦酸四乙酯 通过预标记大鼠的尿四环素排泄量评定对自发性骨吸收的作用
使用雄性Sprague-Dawley大鼠。从出生第一周起，将含有溶解在生理盐水中的10μCi/ml(7-3H(N)四环素)皮下注射给大鼠。每周注射两次，共6周。每只动物都接受总量为20μCi放射性标记的四环素。所有动物都给予动物生长的正常饮食和任意量的水。最后一次注射放射性标记的四环素一周后，将大鼠称重，喂以成年动物的饮食。第5天时，将大鼠随机分成小组，关在各自的代谢笼中。收集24小时的尿10天。自第二天起，将溶于生理盐水中的[(2-吡啶基氨基)亚甲基]二膦酸四乙酯(化合物I)在每日的不同剂量水平皮下注射6天。对照动物接受生理盐水。测量尿体积，通过液闪计数确定尿样中的放射性。以每日的治疗/对照比例计算数据以确定四环素排泄的最大抑制。
分泌到尿中未代谢的四环素反映了其在吸收过程中从骨中的消除，因此可连续监测骨吸收。如表1(化合物I)所示，剂量依赖性抑制放射性标记的四环素的排泄表明对骨吸收的抑制。
表1对大鼠自发性骨吸收的影响 四环素排泄的抑制 ％ n 平均(SE) I 1mg/kg 10mg/kg 100mg/kg 200mg/kg 5 5 5 5 12.2(6.4) 19.8(5.9) 50.0(6.1) 72.9(2.6)
对固定术诱发大鼠骨质疏松症的影响
将雄性体重为200±25g的Sprague-Dawley大鼠按体重随机分成小组，用Hypnorm/Mebunat和Temgesic麻醉。在右或左髋部沿背外侧切口，暴露坐骨神经，切下0.5cm段。缝合肌肉和皮肤，将动物释放回笼。对侧腿保持完整。从术前两天直至神经切除术后第20天每日在不同剂量水平皮下注射溶于生理盐水的化合物I。对照动物接受生理盐水。在神经切除术后21天处死在标准时间点用荧光染料双标记的动物，除去其股骨。将股骨插入甲基丙烯酸甲酯中，切段，染色。将股骨的metphyseal第二松质(secondary spogiosa)和骨干皮质骨进行组织形态学分析。在对照大鼠中，不能移动腿的股骨总骨区域减少。如表2所示，化合物I剂量依赖性增加了不能移动腿的股骨区域。没有显示出对皮质骨的矿质增加率(mineral apposition rate)的有害影响(没有数据)。
表2对固定术诱发大鼠骨质疏松症的影响 不能移动腿股骨的 总骨区％ 对照 n 平均(SE) 20 5.3(0.6) I 1mg/kg 37，5mg/kg 75mg/kg 200mg/kg 4 5 5 7 6.0(1.3) 17.3(2.0) 24.5(2.5) 35.5(1.7)
对体外骨的影响
处死新生鼠前4天通过皮下注射45Ca进行标记。从顶骨显微解剖下颅盖骨碎片，与消炎痛一起在培养基中预培养，洗涤，然后与化合物I或不含化合物I培养3天。通过甲状旁腺激素(PTH，10nM)刺激骨吸收，测定这种刺激性吸收的抑制作用。如表3所示，除了在非常高的非生理浓度外，没有显示出体外吸收的抑制。为测定化合物I与骨矿质的结合，于室温将14C-4水氯甲双磷酸二钠和羟基磷灰石晶体在生理pH值的巴比土酸缓冲液中在不含化合物I下培养以及与不同浓度的化合物I培养。培养2小时后，离心该混合物，从上清液中测量总特定结合放射性的百分数。直至500μM浓度都未发现化合物I与羟基磷灰石的结合(表3)。
表3对体外骨的影响对PTH刺激的吸收的抑制100(PTH-X)抑 制％(SE) 与骨矿质的结合 I 1μmol/l 5μmol/l 10μmol/l 100μmol/l 200μmol/l 500μmol/l 1000μmol/l 无抑制 N.D 无抑制 无抑制 N.D N.D 12.9(1.3) N.D 无结合 N.D 无结合 无结合 无结合 N.DN.D＝未测定药代动力学
从24小时排泄到尿中的化合物总量确定生物利用度或者从口服给药及静脉内给药后不同时间点的血清浓度数据确定生物利用度。用高压液相色谱法分析测试的尿样和血样的化合物I。24小时中低于10％的口服剂量和14％静脉内剂量以母体化合物排泄(表4，生物利用度58％)。通过血清浓度数据评价的化合物I生物利用度为44％。
表4 单一静脉内或口服剂量后I的尿排泄量，AUC0-＞∞，以及生物利用度 0-24小时排泄量 AUC0-＞∞ 剂量％ F％ h*μg/ml F％ p.o. 7.8 58 60.7 44 i.v 13.6 138.7剂量114m/kgF＝生物利用度AUC0-＞∞＝血液水平-时间曲线下面积