具有可耐低温丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽与将其编码的 DNA和含有该DNA的重组载体以及转型植物 技术领域
本发明涉及作为赋予植物以耐低温性的手段的、具有新型可耐低温丙酮酸磷酸双激酶(以下简称“PPDK”)活性的多肽，将其编码的无性系化DNA，和含有该DNA的重组载休。此外，还涉及用上述本发明DNA转型的植物。
背景技术
C4植物在强光、高温、低CO2的条件下有高的光合作用能力，但除一部分能适应低温条件外，一般在低温时光合成量大大降低。PPDK(EC 2.7.9.1，能催化从ATP、丙酮酸和正磷酸生成AMP、磷酸烯醇丙酮酸和焦磷酸的反应)是C4途径的重要酶之一，但其活性与叶组织的光合作用速度相比是不够的，因而成为C4光合作用中制约二氧化碳固定速度的酶之一。此外，在人们发现PPDK的同时，就已指出它是低温敏感酶。在玉米PPDK的情况下，酶活性的内弯点是11.7℃，这个温度与玉米的生长极限温度是一致的。从这些事实，可以认为PPDK是C4植物低温光合成速度低的原因之一，通过改善PPDK地低温敏感性，说不定能降低玉米这种C4植物的生长极限温度。菊科植物棕黄花菊(Flaveria brownii)属于C3/C4中间型类别，已知它的PPDK即使在0℃的低温处理时也几乎不会失活(Burnell JN：A comparative study of the cold-sensitivityof pyruvate，Pi dikinase in Flaveria species.Plant CellPhysiol，31，295-297(1990))。
如果使将上述棕黄花菊的耐低温PPDK编码的基因无性系化，再用它使植物转型，则可望能赋予植物以耐低温性。
发明公开
因此，本发明的目的是提供作为赋予植物以耐低温性的手段的、具有新型可耐低温PPDK活性的多肽，将其编码的无性系化DNA以及含有该DNA的重组载体。此外，本发明的目的还提供用上述本发明的DNA转型的植物。
本申请的发明者等人进行深入研究的结果，成功地使棕黄花菊的全PPDK基因无性系化并确定了其碱基序列和将其编码的氨基酸序列，此外，还成功地在该PPDK基因中识别出赋予耐低温性的区域，从而完成了本发明。
即，本发明提供在下列(1)、(2)任意一种中，具有在从氨基酸序列的C端算起占全长1/6的范围内至少一个以上的氨基酸残基置换成其它氨基酸残基的氨基酸序列，且具有可耐低温丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽：
(1)具有序列表序列号1至4任意一种中所示氨基酸序列的丙酮酸磷酸双激酶；
(2)具有与(1)中所示氨基酸序列50％以上相同的氨基酸序列、且具有丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽。
此外，本发明还提供将具有本发明可耐低温PPDK活性的多肽编码的无性系化DNA。而且，本发明还提供含有本发明DNA、可在宿主中表达具有可耐低温PPDK的多肽的重组载体。进而，本发明还提供用本发明DNA转型的植物。
本发明使具有耐低温性的PPDK基因无性系化，并确定了其碱基序列。而且，也确定了该基因中赋予耐低温性的区域。因此，通过用本发明的基因使具有低温敏感性PPDK的植物转型，可使低温敏感性的PPDK变成耐低温性。此外，通过使上述赋予耐低温性的区域组合到低温敏感性PPDK的相同部分，也可以使低温敏感性PPDK变成耐低温性。通过这样做，使得即使在原来不能栽培该植物的塞冷地区也有可能栽培该植物。因此，本发明可望对农业做出巨大贡献。
附图简单说明
图1是一幅模式图，说明含有本发明PPDK基因之一例的表达载体的构建方法。
图2是说明用大肠菌表达的棕黄花菊、双齿黄花菊(Flaveriabidentis)和玉米的PPDK在0℃保存时酶活性随时间变化的图。
图3是一幅模式图，说明玉米PPDK和棕黄花菊PPDK的嵌合体基因的构建方法。
实施本发明的最佳形态
按照本发明，使具有耐低温性的棕黄花菊PPDK基因无性系化，并确定了其碱基序列及将其编码的推算氨基酸序列。该碱基序列和氨基酸序列用序列表的序列号5表示。这个序列如以下实施例中详细叙述的那样，是从棕黄花菊的绿叶提取全RNA，按常法制作cDNA库，以双齿黄花菊(Flaveria bidentis)(序列号1)和玉米的PPDK基因碱基序列(序列号2)的高同系性区域作为探子进行噬菌斑杂化，选择阳性无性系进行无性系化，再用双脱氧法确定碱基序列而确定的。这个序列具有与同属棕黄花菊PPDK基因一样高的同系性，也具有比玉米PPDK还要高的同系性，而且还与从棕黄花菊绿叶直接精制的PPDK的N末端序列、C末端序列和内部序列完全一致，因而，显然是棕黄花菊的PPDK基因。而且，双齿黄花菊的PPDK基因序列也是以玉米cDNA作为探子进行噬菌斑杂化、选择阳性无性系进行无性系化再用双脱氧法确定的。
序列号与所示氨基酸序列是新型的，与同属双齿黄花菊的PPDK氨基酸序列相比，有40个氨基酸残基不同。而且，与玉米的PPDK氨基酸序列相比，也有大约180个氨基酸残基不同。序列号5所示的棕黄花菊PPDK氨基酸序列，尤其与同属双齿黄花菊PPDK氨基酸序列相比，尽管有如此高的同系性，但双齿黄花菊的PPDK是低温敏感的，而棕黄花菊的PPDK则是耐低温的，这表明氨基酸序列的微小差异引起了性状上的重要差异。本发明提供将这种序列号5所示氨基酸序列编码的无性系化PPDK基因。如上所述，这种氨基酸序列是新型的，而且有具有耐低温性这样的显著效果。本发明的基因不限于有序列号5所示碱基序列的基因，只要是能将这种氨基酸序列编码，也可以有任何碱基序列。
本申请的诸发明者也曾试图识别序列号5所示棕黄花菊PPDK基因中与赋予耐低温性有关的区域。即，如以下实施例中详述的那样，用限制性内切酶把棕黄花菊的PPDK基因切成大小均等的三部分，把分割的区域与玉米PPDK基因的对应区域交换而形成嵌合体PPDK基因，确定该嵌合体基因编码的PPDK是否有耐低温性。结果确认在棕黄花菊的最后1/3区域中存在着赋予耐低温性的领域。此外，这个最后1/3区域又用限制性内切酶进一步切割成两等分，用同样方法确认其任意一部分中是否存在赋予耐低温性的区域。其结果确认了在序列号5所示棕黄花菊PPDK基因的XhoI部位下游，即在序列号5所示氨基酸序列中从第832号精氨酸至第955号缬氨酸的氨基酸序列(以下称这个序列为“赋予耐低温性序列”)中，存在着赋予耐低温性的功能。
即，判明了PPDK与耐低温性有关的区域存在于从C末端起占全长1/6的范围内。另一方面，在序列表序列号1中列出了双齿黄花菊PPDK编码基因的碱基序列及推断的氨基酸序列，而在序列号2中列出了玉米PPDK编码基因的碱基序列及推断的氨基酸序列(Journalof Biochemistry 263，11080-11083(1988))。序列号3中列出了细菌类共生拟杆菌(Bacteroides symbiosus)的PPDK编码基因的碱基序列及推断氨基酸序列(Biochemistry 29，10757-10765(1990))。序列号4中列出了细菌类组织溶解内变形虫(Entamoebahistolytiea)的PPDK编码基因的碱基序列及推断氨基酸序列(Molecular and Biochemical Parasitology 62，153-156(1993))。如上所述，赋予PPDK以耐低温性的区域由于已由本发明判明是在从C末端算起占全长的1/6范围内，因而通过使序列号1至4所示这些氨基酸序列从C末端算起占全长1/6范围内的至少1个以上氨基酸残基置换成其它氨基酸残基，有可能得到耐低温性PPDK。此外，这里的所谓“耐低温性”系指酶在0℃的温度下放置20分钟时其活性是放置前的60％以上。
如上所述，序列号5所示氨基酸序列中从第832号精氨酸至第955号缬氨酸的区域决定了耐低温性，因而把序列号1至4中所述低温敏感性PPDK的对应部分置换成序列号5所示氨基酸序列中从第832号精氨酸至第955号缬氨酸的氨基酸序列，可以使其低温敏感性PPDK变成耐低温性。这个发现非常重要，因为利用这个结果可以赋予所希望的PPDK以耐低温性。此外，作为赋予PPDK以耐低温性的方法，如以下实施例所述，不限于通过使棕黄花菊PPDK中的赋予耐低温性序列与低温敏感性PPDK的对应部分交换来制作嵌合体基因的方法，也可以使其植物本身的低温敏感性PPDK的对应部分发生部位特异性变异(site-directed mutagenesis)，从而改变成与棕黄花菊PPDK的赋予低温性序列相同的序列。因此，包含上述赋予低温性序列、具有PPDK活性的多肽编码无性系化DNA均属于本发明的范围。具体地说，序列号1所示氨基酸序列的第869号置换成脯氨酸的PPDK，以及第885号和第952号分别置换成亮氨酸和缬氨酸的PPDK，都有耐低温性。
赋予耐低温性的PPDK不限于序列表1至4中所示的那些，只要是有其各自同系性50％以上者即可。较好的是与棕黄花菊PPDK碱基序列的同系性可以在48.5％以上，更好的是可以在90％以上。
一般来说，即使在有生理活性的肽的氨基酸序列发生微小改变的情况下，即，即使在该氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被置换或缺失或者增加了1个或多个氨基酸的情况下，该肽的生理活性仍可保持的情况是众所周知的事实。因此，有序列号5所示氨基酸序列的多肽中进行这样的改性后仍具有耐低温性PPDK活性的多肽也属于本发明的范围。即，在序列号5所示氨基酸序列中，加成、缺失或置换了1个或多个氨基酸后仍具有耐低温性PPDK活性的多肽也属于本发明的范围。同样，在序列号5所示碱基序列中，加成、缺失或置换了1个或多个核苷酸后仍具有耐低温性PPDK活性的多肽编码DNA也属于本发明的范围。
引起氨基酸加成、缺失或置换的DNA可诸如借助于诱发部位特异性变异这种众所周知的技术(例如，Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p 6487-6500，1982)实施，本说明书中所谓“1个或多个氨基酸”系指可借助于部位特异性变异诱发法加成、缺失或置换的氨基酸数目。
部位特异性变异的诱发，可诸如利用除所希望变异的特定不一致外与应受到变异的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引子按如下进行。即，用上述合成寡核苷酸作为引子在噬菌体中合成互补链，再用所得到的双链DNA使可载带噬菌体的宿主细菌转型。把转型细菌的培养物涂在琼脂上，从含有噬菌体的单细胞形成噬菌斑。如果这样进行，在理论上，50％的新菌落含有作为单链、有变异的噬菌体，其余50％则含有原来的序列。然后，使所得到的噬菌斑在一个能和与具有上述所希望变异的DNA完全一致的DNA杂化但不和与原有链不一致的DNA杂化的温度，与激酶处理的合成探子发生杂化。然后收集、培养与该探子杂化的噬菌斑，回收DNA。
此外，作为在酶的氨基酸序列中置换、缺失或插入1个或多个氨基酸又不使之丧失酶活性的方法，除上述部位特异性变异诱发法外，还有用变异原处理基因的方法，以及使基因发生选择性断裂、然后脱除、加成或置换所选择的核苷酸再将其连接起来的方法。
通过用棕黄花菊的PPDK基因或含有其赋予耐低温性序列并具有PPDK活性的DNA使植物转型，可以获得耐低温性的植物。此时，作为转型植物的较好实例，可以列举玉米、甘蔗、稷(粟)、稗子和高梁等，但不限于这些。
植物的转型方法是已经成熟的，较好采用基于肿胀土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的方法。利用肿胀土壤杆菌的植物转型方法在本领域中是众所周知的，用这种方法，无论双子叶植物(例如特开平4-330234号公报)还是单子叶植物(W0 94/00977)都能转型。或者，还可以用常用方法如electroporation法等导入植物的原生质中，以及使DNA附着在钨粒子等上、打入植物的胚中等办法，也可以进行转型。这些转型的具体方法在以下实施例中叙述。
实施例
以下参照实施更具体地说明本发明。当然，本发明不限于下述实施例。
1.棕黄花菊PPDK基因的无性系化和碱基序列的确定
(1)cDNA库的制作和全长cDNA的无性系化
(i)cDNA库的制作
从棕黄花菊(F.brownii)的绿叶(60g)，用盐酸胍/苯酚法分离全RNA。用这种方法可以在锂沉淀后得到26.5mg RNA。然后用填充了oligo dT Cellulose Type 7(Pharmacia公司)的柱子，按常用方法从13.2mg RNA得到118.9μg poly A(+)RNA。在cDNA库的制备中，使用了TimeSaver cDNA Synthesis kit(Pharmacia公司)、Lambda ZAPII载体(Stratagene公司)和cDNA无性系化系统λgt10(Amersham公司)附带的填料试剂。用EcoRI/NotI衔接物把DNA片段插入Lambda ZAPII载体的EcoRI部位，从而制作了cDNA库。所制作的cDNA库的尺寸是41.5万pfu。还使用了XL1-Blue作为宿主细胞。
(ii)探子的制备
利用相当于加工部位附近的引子5′：GACGGCTAAAAAGAGGGT(根据双齿黄花菊PPDK的cDNA和玉米PPDK的cDNA同系性高的部分设计的)和引子R：TATCGAGAAACCTTCTATAC(双齿黄花菊PPDK序列的一部分，互补链)进行逆转录PCR使棕黄花菊RNA扩大，用具有扩大片段的pCRII载体(可购自Invitrogen公司)作为模板，用同样的引子进行PGR使该片段扩大、电泳后，用SUPREC-01(宝酒造)从凝胶中回收DNA。用这种工艺，可以得到成熟蛋白质N末端下游24bp开始的428bp(bp＝碱基对)的DNA片段。用Multiprime DNA标记系统(Amersham公司)对这个片段进行32P标记来制备探子。
(iii)全长棕黄花菊cDNA的无性系化
以上述DNA片段作为探子，用噬菌斑杂化法筛选cDNA库。用Hybond N+(Amersham公司)作为杂化过滤器，杂化条件是在6×SSC、5×Denhalt′s溶液、0.1％SDS、100μg/ml变性鲑鱼精巢DNA中于65℃过夜。洗涤条件是用2×SSC、0.1％SDS在室温进行5分钟，用2×SSC、0.1％SDS在室温进行90分钟，进一步用1×SSC、0.1％SDS在68℃进行90分钟。其结果，得到了28个独立的阳性噬菌斑。从其中选择信号强的11个噬菌斑进行第二次筛选。第二次筛选除第二次洗涤时间为60分钟外按照与上述第一次筛选同样的方法进行。其结果，从6个无性系得到了由单一噬菌体产生的独立阳性噬菌斑。为了核对所插入DNA片段部分的尺寸，以上述R引子和M13PrimerM4(GTTTTCCCAGTCACGAC，宝酒造)以及M13PrimerRV(CAGGAAACAGCTATGAC，宝酒造)作为引子，用噬菌体作为模板进行PCR。结果，有2个无性系是全长的。然后，进行活体切割，在质粒载体pBruescript II SK(-)(Stratagene公司)中使插入DNA片段部分亚无性系化。亚无性系化的重组质粒命名为p 411和p 631。
通过上述PCR发现，如上所述制作的库是含有足够长插入物、适合于cDNA筛选的库。因此，为了分离棕黄花菊的mRNA，有利的是采用如上所述的方法，而且一旦进行如上所述的大量RNA处理，就能得到大量mRNA。
此外，由于上述cDNA库大量含有如上所述的足够长插入物，因而通过使用如上所述标的蛋白质加工部位附近的引子来制备探子，可以容易地进行全长cDNA的筛选。
(2)cDNA全碱基序列的确定和预想氨基酸序列的比较
为了确定p631的插入cDNA片段的全碱基序列，制作了缺失突变体(Deletion mutants)。缺失突变体的制作是用Kilo-Sequence专用Deletion Kit(宝酒造公司)进行的。然而，核酸外切酶III的反应是通过转移到事先保温在65℃的绿豆核酸酶缓冲剂中而使之停止的。碱基序列的确定是采用以Qiagen Plasmid Mini Kit(Diagen公司)精制的质粒、用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(ABI公司)和Applied Biosystems 373A DNA Sequencer(ABI公司)进行的。两条链除一部分外都确定了其碱基序列。根据所确定的碱基序列，也确定了氨基酸序列。所确定的碱基序列和氨基酸序列表示在序列表序列号5中。
应当注意，在制备用于确定所分离cDNA的碱基序列的缺失无性系时，重要的是要把绿豆核酸酶缓冲液事先加热到65℃，因为只是把反应液转移到绿豆核酸缓冲液中是不能使核酸外切酶III引起的缺失反应停止的。此外，由于无法通过只从上游侧缺失所插入的基因来确定从与载体的联结点算起可多达约600～900bp部分的碱基序列，因而有必要从两个方向缺失。
另一方面，从棕黄花菊直接精制了PPDK，并确定了其N末端区域、C末端区域和内部区域的氨基酸序列。PPDK的精制进行如下。用3倍量的萃取缓冲剂研磨棕黄花菊的绿叶→离心后上清液中添加硫酸铵使之达到30％饱和并除去沉淀的蛋白质→进一步添加硫酸铵使之达到70％饱和、回收蛋白、用Sephadex G25(Pharmacia公司制)脱盐→通过DEASE-Sepharose柱(Pharmacia公司制)→用50-400mM的KCl浓度梯度淋洗柱中吸附的蛋白质→合并有活性的级分、用70％饱和硫酸铵浓缩、用Sephadex G25脱盐→注入羟磷灰石柱中→用磷酸浓度梯度为10mM～40mM的磷酸缓冲剂淋洗柱上吸附的蛋白质→合并有活性的级分、用70％饱和硫酸铵浓缩、用Sephadex G25脱盐。此后进行SDS-PAGE电泳、切取PPDK带，用电溶出法回收凝胶中的蛋白质。用这种工艺精制，得到PPDK样品约5～10nmol。这样得到的精制PPDK在SDS-PAGE上显示单一条带。
然后，确定了所得到的精制PPDK的N末端序列、C末端序列和内部序列。即，N末端的氨基酸序列是通过把蛋白质转录在PVDF膜上、用气相氨基酸定序器确定的。C末端序列是用羧肽酶Y消化精制的PPDK、再根据游离出来的氨基酸组成与消化时间的关系推断。内部的氨基酸序列是通过从用蛋白酶消化蛋白质时产生的肽的N末端判明氨基酸序列来确定的。详细方法如下。首先，按照确定N末端氨基酸序列时的方法把从棕黄花菊的绿叶得到的PPDK精制到一定程度，进行通常的SDS-PAGE电泳之后，凝胶用Coomassie Brilliant BlueR250染色，切取PPDK条带。所切取的凝胶在平衡化缓冲剂(Tris-HCl pH 6.8 125mM、EDTA 1mM、0.1％SDS)中平衡化并插入井中，进行第二次SDS-PAGE电泳。此时，将平衡化的凝胶与重层液(Tris-HCl pH 6.8 125mM、EDTA 1mM、0.1％SDS、0.01％BPB、20％甘油)和酶溶液(Tris-HCl pH 6.8 125mM、EDTA 1mM、0.1％SDS、0.01％BPB、10％甘油、赖氨酰端肽酶1～5μg或V8蛋白酶0.01～0.1μg)一起添加稍候电泳后，在浓缩凝胶中进行蛋白质消化(切断电源、放置45分钟)。此后再开电泳，按照确定N末端氨基酸序列时的方法转录到PVDF膜上，用气相氨基酸定序器确定消化片段从N末端起的氨基酸序列。
如上所述确定的N末端序列、C末端序列和内部序列如下所示。N末端序列：Asn Pro Val Ser Pro Pro Val(72～78)C末端序列：Leu-Ala Ala*-Val Val(948～955)内部序列(1)：Lys Leu Tyr Gly Glu Phe Leu Val Asn Ala Gln Gly-Asp ValVal Ala(349～365)内部序列(2)：Gln Leu Leu Ala Pro Pro Ala Met Ser Asn Ala Leu-Thr
(592～605)内部序列(3)：Leu Thr Ala Asp Thr Gly Met Ser Lys Asp Glu Ile Tyr Ser ArgIle Glu(721～738)内部序列(4)：Ala - - - Ser Phe Gly Thr Asn Asp Leu Cys Gln Met ValPhe Gly-Ser(844～862)此外，在上述氨基酸序列中，“*”系指谷氨酰胺但不能用所用分析仪器分析，而“-”系指分析结果不清楚。括号内的号码系指序列号5所示氨基酸序列对应部分的氨基酸号码。内部序列(2)和(4)中有一部分与序列号5对应部分的序列不同，但这可以认为是由于氨基酸定序器的误差所致。众所周知，氨基酸定序器的误差以相当高的频率发生，而DNA定序器的误差则几乎不发生。
序列号5所示氨基酸序列与从上述精制PPDK直接确定的部分氨基酸序列有很好的一致性，因而可以确认序列号所示氨基酸序列就是PPDK的氨基酸序列。此外，序列号5所示氨基酸序列与众所周知的双齿黄花菊PPDK和玉米PPDK的氨基酸序列比较时，发现成熟蛋白质部分不同的氨基酸分别为40个(双齿黄花菊)和大约180个(玉米)。从上述结果还可以了解到，在序列号5所示氨基酸序列中第1号至第71号的氨基酸序列在成熟蛋白质中不存在，而是一种通过膜时必要的转送肽，是在通过膜后加工而成的。棕黄花菊和双齿黄花菊的成熟蛋白质中氨基酸残基的差异如以下表1所示。
表1 棕黄花菊 黄齿黄花菊 不同的氨基酸号 和氨基酸 5 Phe 10 Pro 15 Asn 28 Thr 40 Pro 41 Ala 48 Arg 49 Arg 50 Lys 52 Ser 57 Ile 61 Thr 62 Gly 66 Leu 81 Thr 92 Asn 97 Lys 114 Ala 140 Lys 150 Leu 154 Gln 6 Ser 11 Leu 16 Arg 29 Asn 41 Ser 42 Ser 47 Leu 48 Thr 49 Pro 50 Ala 55 Pro 59 Ser 60 Ser 64 Pro 79 Ala 90 Arg 95 Arg 112 Ser 138 Ser 148 Ser 152 Asp 170 Ala 201 Asp 205 Ala 263 Ala 265 Gln 323 Cys 356 Val 374 Val 382 Glu 385 Arg 392 Val 396 Arg 465 Asn 490 Val 564 Val 583 Ser 605 Thr 672 Ala 723 Thr 724 Ala 730 Lys 736 Arg 739 Lys 777 Asn 803 Gly 818 Leu 838 Asp 841 Ala 168 Pro 199 Ala 203 Gly 261 Val 263 Lys 321 Ser 354 Ile 372 Gly 380 Asp 383 Lys 390 Glu 394 Gly 463 Asp 488 Cys 562 Ile 581 Thr 603 Ile 670 Val 721 Ala 722 Val 728 Ala 734 Lys 737 Asn 775 Thr 801 Ser 816 Val 836 Glu 839 Gly 845 Glu 871 Pro 875 Ser 887 Leu 954 Val 843 Asp 869 Gln 873 Ala 885 Ile 952 Ile
2.棕黄花菊PPDK在大肠菌中的生产及其耐低温性的测定
为了确认从如上所述分离的棕黄花菊PPDK cDNA确实产生了耐低温性酶，在大肠菌中的表达进行如下。
为了除去转送肽并使表达载体与解读密码结合在一起，限制性内切酶部位的导入进行如下。以p631用SacI切断再环化得到的p631Sac(缺失了SacI下游区域的p631质粒)作为模板，用以加工部位附近的序列为基础、含EcoRV的引子4：GATATCAATCCGGTGTCTCCTCC与载体序列的互补引子M13RV(宝酒造)的组合进行PCR，并使扩大的片段在pCRII中进行亚无性系化。用限制性内切酶EcoRV和SacI，把含N末端部分的片段从pCRII上切下来，再与p631的SacI-HindIII(含有PPDK CDNA的残余部分)，和用NcoI切断、用Klenow酶使末端平滑化后用HindIII切断的pKK233-2一起进行三个片段的连接反应(图1)。用这种质粒使E.coli MV1184转型并用于表达实验。1ml前培养液用9ml新LB培养基(含50mg/l氨苄青霉素)稀释，在37℃振荡培养3小时后添加IPTG使之达到5mM，进一步培养3小时后用离心法回收菌体。将菌体悬浮在0.5ml萃取缓冲剂(50mMHepes-KOH pH 7.5，10mM MgSO4，1mM EDTA，5mM DTT)中，添加溶菌酶使之达到约0.5mg/ml，在冰上处理5分钟后，用超声波破碎装置(COSMOBIO UCD-130T型)边用冰冷却边按30秒钟间隔处理5分钟，提取酶。用微量离心机离心10分钟，上清液通过用柱缓冲剂(50mM Hepes-KOH pH 7.0，10mM MgCl2，2mM EDTA，10mMDTT)平衡化的Sephadex G25柱除去低分子物质后，在25℃放置30分钟，进行4聚体缔合，用于活性测定。
在大肠菌内从棕黄花菊、双齿黄花菊和玉米(Harvest Queen)的PPDK cDNA生产的PPDK在SDS-PAGE上显示出与源于植物的酶几乎相同的淌度。从各种cDNA预期的成熟酶的分子量都大致相同，但在SDS-PAGE上的表观分子量则有颇大差异。这显然是由于各多肽中所含的氨基酸组成不同，而不是由于蛋白质的缺失加工或糖链加成等的翻译后修饰。用大肠菌生产的各种PPDK的耐低温性与对应的植物酶是一致的。即，棕黄花菊PPDK的耐低温性无需用该植物特有的辅助因子或翻译后的加工就能得到，如果把这种cDNA导入玉米中予以表达，就可望产生耐低温性PPDK。图2显示酶在0℃的温度放置后所经历的时间与PPDK的相对活性之间的关系。
此外，在上述工艺中，为了用大肠菌生产有活性的PPDK，制作脱除了转送肽编码区的cDNA并将其插入表达载体中，但此时重要的是准确地使要切取的位置匹配于与源于植物的酶的N末端位置对应的部位。 (棕黄花菊) 在大肠菌中的产量 (所使用的引子)
MITAKKRVFTF… - 2 MIPVSPPVTTTKKRVFTF… + 3 MINPVSPPVTTTKKRVFTF… ++ 4 NPVSPPVTTTKKRVFTF… (源于叶的酶)(双齿黄花菊)
MITAKKRVFTF… ++ MIPVSPPVTTAKKRVFTF… --
TAKKRVFTF… (源于叶的酶)(玉米)
MATKKRVFTF… ++
TTKKRVFTF… (源于叶的酶)
即，在进行棕黄花菊cDNA的表达实验时，既成功地表达了玉米和双齿黄花菊，也能参照玉米的切断部位进行表达。因此，即使在棕黄花菊cDNA中，也使用引子2在相同位置切断来制作表达载体并试图予以表达，但PPDK根本没有产生。然后，基于源于叶的酶的N末端序列，用引子3制作了在N末端多含7个残基的表达载体，在试图予以表达时确认产生了PPDK。但是，即使在这个阶段表达量也很少，还不能得到足以测定耐低温性的酶量。然后，进一步用引子4制作了在N末端侧延长1个残基的表达载体，在进行表达实验时能产生大量PPDK，因而能确认其耐低温性。引子2和引子3的碱基序列如下所示：
引子-2：CGGTGTCTCCTCCGGATATCACGGCTAAAAAGAG
引子-3：TTGATATCCCGGTTGTCTCCTCCGGTA
3.棕黄花菊PPDK基因中赋予耐低温性区域的确定
(1)棕黄花菊和双齿黄花菊的嵌合体
按常法用限制性内切酶重组。使pKK-brownii的EcoRI-HindIII片段与pKK-bidentis(采用与pKK-brownii的构建方法相同的方法使双齿黄花菊的cDNA插入pKK-223-2中而得到的质粒)的对应片段交换来制作pKK-011，反之，使pKK-bidentis的EcoRI-HindIII片段与pKK-brownii的对应片段交换来制作pKK-100。同样，使NdeI-HindIII片段相互交换制作了pKK-001和pKK-110。此外，使pKK-110的Xho-HindIII片段与pKK-bidentis的对应片段交换制作了pKK-1101，而使pKK-bidentis的XhoI-HindIII片段与pKK-brownii的对应片段交换制作了pKK-1110。为了使XhoI-HindIII片段进一步精细地相互重组，用PCR法(linking PCR法)进行这些片段的联接。在bidentis(双齿黄花菊)和brownii(棕黄花菊)的XhoI-HindIII片段中碱基序列相同的情况下，制作了互补的引子link-F：GCAGAGATGATGTTGGCAAG和link-R：CTTGCCAACATCATCTCTGC。以用pBluescript SK(-)亚无性系化的brownii或bidentis的XhoI-HindIII片段作为模板，用link-F/RV、M4/link-R的组合进行第一次PCR。所得到的片段(共4种)用凝胶切出法精制，用brownii前半部和bidentis后半部或bidentis前半部和brownii后半部的片段混合物作为模板，用引子M4/RV进行第二次PCR。扩大的结合片段用XhoI和HindIII切断，与pKK-bidentis的对应部分交换，制作了pKK-link01和pKK-link10。利用linking PCR的重组部位与HindIII之间的PstI部位，制作了另一组嵌合体基因。把pKK-link10的XhoI-PstI片段和pKK-bidentis的PstI-HindIII片段插入pKK-bidentis的XhoI-HindIII部位(3片段连接反应)，制作了pKK-link101。pKK-bidentis的XhoI-PstI片段和pKK-brownii的PstI-HindIII片段也按同样方法插入pKK-bidentis的XhoI-HindIII部位，制作了pKK-link110。
棕黄花菊和双齿黄花菊的PPDK在成熟蛋白质部分出现的40个部位的氨基酸置换较多地靠近酶的N末端和C末端区域，而在中部活性中心附近较少。因此，首先利用两种基因中共同存在的限制性内切酶EcoRI和NdeI部位把cDNA分成前、中、后三个部分，使这些片段相互交换来制作嵌合体基因，考察了到底哪一部分与耐低温性有关。其结果是，在含有棕黄花菊cDNA后1/3的情况下获得了耐低温性，反之，在含有双齿黄花菊cDNA后1/3的情况下具有低温敏感性。然后，用限制性内切酶XhoI把后1/3区域分成两个部分，分别导入pKK-bidentis的对应部分中，测定耐低温性。其结果是，获得耐低温性的必要且充分条件是含有XhoI部位的下游区域(距C最末端1/6的区域)。然后，用linking PCR法制作含有后1/6区域(XhoI-HindIII片段，含有7个氨基酸置换)的嵌合体基因，导入pKK-bidentis中，测定其耐低温性。其结果是，具有含4个置换的最后区域的嵌合体酶pKK-link10有耐低温性，而具有含3个置换的前半区域的嵌合体酶pKK-link01则在低温失活。因此，用限制性内切酶PstI使这个后半区域重组，制作了各有2个氨基酸置换的嵌合体基因，测定耐低温性，但其中任何一个嵌合体酶都显示耐低温性，因而推测存在2个以上与耐低温性有关的区域。
(2)玉米和棕黄花菊的嵌合体
用引子PPDK-F：CTCACTGTTCGAAGAGAAGC和含有NdeI部位的mNdeI：CATATGCTCTGTCCGGCATAATC(互补链上)，以玉米PPDK cDNA为模板进行PCR，所得到的片段在pCRII中进行亚无性系化。用SacI和NdeI把这个片段从pCRII上切下来，pKK-PPDK的ScaI-SmaI片段(载体片段)和棕黄花菊PPDK cDNA用HindIII切断，用Klenow酶使末端平滑化后用NdeI切断得到的片段，将其一起进行了3个片段连接反应(图3)，得到了pKK-mz/bro(Nde)。此外，用引子PPDK-F和含XhoI部位的mXhoI：CTCGAGGGATCTCAATCATTG(互补链上)以玉米PPDK cDNA为模板进行PCR，所得到的片段在pCRII中亚无性系化后用SacI和XhoI从pCRII上切下来，与pKK-mz/bro(Nde)的ScaI-XhoI片段(载体片段)结合，得到pKK-mz/bro(Xho)。
玉米PPDK和棕黄花菊PPDK C末端1/3区域(NdeI-HindIII片段)或1/6区域(XhoI-HindIII片段)的嵌合体酶均显示与棕黄花菊相同水平的强耐低温性。这样，便可以使氨基酸序列颇为不同的玉米PPDK具有耐低温性，因而可以认为，通过导入这个最后1/3区域或1/6区域就能使源于各种植物的PPDK具有耐低温性。由于由此制作的玉米/棕黄花菊嵌合体PPDK可以对玉米PPDK的转送肽以其原来形式加以利用，因而若其转送部分也源于棕黄花菊PPDK的转型体在耐低温性PPDK向叶绿体输送上有问题，则可考虑用导入这种嵌合体基因来取而代之的办法加以解决。
(3)点变异无性系
对于pKK-brownii的XhoI-HindIII片段，制作了棕黄花菊→双齿黄花菊型的氨基酸残基逐一置换。而对于pKK-bidentis的XhoI-HindIII片段，也制作了双齿黄花菊型→棕黄花菊型的氨基酸残基逐一置换。变异导入是通过使棕黄花菊和双齿黄花菊PPDK cDNA的XhoI-HindIII片段分别在pBluescript II SK(-)中亚无性系化，再用Megalabel Kit(宝酒造)和Mutan-K Kit(宝酒造)按照Kunkel法进行的。用于变异导入的引子序列如表2中所示。变异的碱基序列用DNA定序器确认后，把这些片段插入pKK-bidentis的XhoI-HindIII部位中。
表2 用于点变异无性系制作的引子 棕黄花菊型→双齿黄花菊型的变异导入 886DE 5′GCAATCTCTTCAGCAATC 839AG 5′GCTTCTTTTCCAATCTCATC 843ED 5′CGAAAAGAAATCGGCTTC 869PQ 5′GAAAGATAAATCTGCAAAAACTTG 873SA 5′GCCTTGAGCAAGATAAATC 885LI 5′TTCTGGTCAATAACCTCAATG 952VI 5′GCTTAAACAATGACTTGTGC 双齿黄花菊型→棕黄花菊型的变异导入 836ED 5′CCAATCTCATCAGCTATTAAAG 839GA 5′GCTTCTTTTGCAATCTCTTC 843DE 5′CGAAAAGAACTCAGCTTC 869QP 5′CAAGATAAATCGGCAAAAACTTG 873AS 5′GAATGCCTTGAGAAAGATAAATC 885IL 5′CTTTCTGGTCAAGAACCTCAAATG 952IV 5′GCTTAAACAACGACTTGTGC
使pKK-1110的XhoI-HindIII区域中不同的氨基酸逐一置换成双齿黄花菊型的酶全都显示耐低温性，因而可以认为存在着多个赋予耐低温性的变异(只改变一个残基无损于抗性)。然后，与此相反，使pKK-bidentis的XhoI-HindIII区域中不同的氨基酸逐一置换成棕黄花菊型，考察其是否变成耐低温性酶。即，在0℃处理20分钟后，测定酶活性。其结果是，896Gln→Pro变异获得耐低温性(上述低温处理后的活性是原来的60～70％)，而885Ile→Leu和952Ile→Val变异使得低温失活稍难以发生，如果综合考虑上述(1)嵌合体酶pKK-link110的结果，则可以推测这两种变异共存时仍能获得耐低温性。从以上结果可以断言869Pro、885Leu、925Val这三个残基与耐低温性有关。然而，在棕黄花菊与耐低温性有关的这些残基中，就869Pro和885Leu而言，玉米PPDK也具有棕黄花菊型。因此，仅仅这些残基是棕黄花菊型的不一定就能获得耐低温性，但可以认为在棕黄花菊或双齿黄花菊的氨基酸序列中它们最初就赋予了完全的抗性，因而，在使氨基酸序列差异颇大的其它物种PPDK耐低温性化的情况下不宜导入点变异，较好是像对玉米PPDK进行的那样，制作以区域单位导入的嵌合体基因。
4.用棕黄花菊PPDK基因进行的玉米转型
按照Gordon-Kamm W.J.等人(The Plant Cell 2：603-618，1990)或Koziel M.G.等人(Bio/Technology 11：194-200，1993)的方法，把pKK-brownii包覆在钨或金的微细粒子上，将其植入玉米的未成熟胚或悬浮培养细胞中。从导入处理的细胞筛选转型细胞，然后，将所得到的转型体愈伤组织(callus)按常法培养，再生植物体。转型方法不限于粒子枪法，还包括Electro-poration法(Rhodes C.A.et al.，Science 240：204-207，1988)、PEG法(Armstrong C.L.et al.，Plant Cell Reports 9：335-339，1990)、Tissue-electroporation法(D′Halluin K.et al.，ThePlant Cell 4：1495-1505，1992)或土壤杆菌法(Hiei Y.andKomari T.，WO 9400977)等。从所得到的植物体回收种子并使之发芽，再从所得到的植物的叶分离PPDK、测定其耐低温性。测定温度对转型植物和未转型植物光合成速度的影响。通过使那些在低温显示较高光合成速度的玉米植株繁育多代、测定不同温度的光合成速度和测定从植物体分离的PPDK的耐低温性，确保了所研究的转型的稳定性。
5.用棕黄花菊PPDK基因进行的双齿黄花菊转型
把含有序列号5所示全长cDNA并含有信息基因的中间载体导入肿胀土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的无害化Ti质粒中。这可以按照Draper J et al.eds.，Plant Genetic Transfomationand Gene Expression-a laboratory manual，BlackwellScientific Publications(ISBN 0-632-02172-1)中所述方法进行。
另一方面，使双齿黄花菊(F.bidentis)的叶组织或愈伤组织(callus)感染上述肿胀土壤杆菌(A.tumefaciens)。这可以通过使该组织或愈伤组织与肿胀土壤杆菌共存培养来进行。感染细胞根据抗药性进行选择。从所选择的愈伤组织按常法再生植物体。从所得到植物体得到种子、使之发芽，从所得到的植物的叶分离PPDK并测定其耐低温性。对于转型植物和未转型植物，考察温度对光合成速度的影响。通过使那些在低温显示较高光合成速度的双齿黄花菊植株繁育多代、测定不同温度的光合成速度和测定从植物体分离的PPDK的耐低温性，确保所研究的转型的稳定性。
【序列表】序列号：1序列长：2915序列型：核酸序列CGATCTCCTT CTGCTATTGC TGATATCTCA ATTTCACAGG TGAAGAAGG ATG ATG AGT 58
Met Met Ser
1TCG TTG TCT GTT GAA GGT ATG CTT CTC AAG TCA GCC CGT GAG TCG TGC 106Ser Leu Ser Val Glu Gly Met Leu Leu Lys Ser Ala Arg Glu Ser Cys
5 10 15TTA CCG GCG AGA GTG AAG CAA CGG CGA AAC GGT GAT CTC CGG CGA TTG 154Leu Pro Ala Arg Val Lys Gln Arg Arg Asn Gly Asp Leu Arg Arg Leu20 25 30 35AAC CAC CAC CGT CAA TCG TCG TTT GTC CGG TGT TTA ACT CCG GCG AGA 202Asn His His Arg Gln Ser Ser Phe Val Arg Cys Leu Thr Pro Ala Arg
40 45 50GTT AGC AGA CCA GAG TTG CGC AGC AGT GGC TTA ACT CCG CCG CGA GCA 250Val Ser Arg Pro Glu Leu Arg Ser Ser Gly Leu Thr Pro Pro Arg Ala
55 60 65GTT CTT AAT CCG GTG TCT CCT CCG GTG ACG ACG GCT AAA AAG AGG GTT 298Val Leu Asn Pro Val Ser Pro Pro Val Thr Thr Ala Lys Lys Arg Val
70 75 80TTC ACT TTT GGT AAA GGA AGA AGT GAA GGC AAC AGG GAC ATG AAA TCC 346Phe Thr Phe Gly Lys Gly Arg Ser Glu Gly Asn Arg Asp Met Lys Ser
85 90 95TTG TTG GGA GGA AAA GGA GCA AAT CTT GCT GAG ATG TCA AGC ATT GGT 394Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Ser Ser Ile Gly100 105 110 115CTA TCA GTT CCT CCT GGG CTC ACT ATT TCA ACT GAA GCA TGT GAG GAA 442Leu Ser Val Pro Pro Gly Leu Thr Ile Ser Thr Glu Ala Cys Glu Glu
120 125 130TAT CAA CAA AAT GGA AAG AGC CTA CCT CCA GGT TTG TGG GAT GAG ATT 490Tyr Gln Gln Asn Gly Lys Ser Leu Pro Pro Gly Leu Trp Asp Glu Ile
135 140 145TCA GAA GGC TTA GAT TAT GTC CAG AAA GAG ATG TCT GCA TCT CTC GGT 538Ser Glu Gly Leu Asp Tyr Val Gln Lys Glu Met Ser Ala Ser Leu Gly
150 155 160GAC CCG TCT AAA CCT CTC CTC CTT TCC GTC CGT TCG GGT GCT GCC ATA 586Asp Pro Ser Lys Pro Leu Leu Leu Ser Val Arg Ser Gly Ala Ala Ile
165 170 175TCT ATG CCT GGT ATG ATG GAC ACT GTA TTG AAT CTC GGG CTT AAT GAT 634Ser Met Pro Gly Met Met Asp Thr Val Leu Asn Leu Gly Leu Asn Asp180 185 190 195GAG GTC GTA GCT GGT CTA GCT GGC AAA AGT GGA GCA CGG TTT GCC TAT 682Glu Val Val Ala Gly Leu Ala Gly Lys Ser Gly Ala Arg Phe Ala Tyr
200 205 210GAC TCG TAT AGA AGG TTT CTC GAT ATG TTT GGC AAC GTT GTA ATG GGT 730Asp Ser Tyr Arg Arg Phe Leu Asp Met Phe Gly Asn Val Val Met Gly
215 220 225ATC CCG CAT TCA TTA TTT GAC GAA AAG TTA GAG CAG ATG AAA GCT GAA 778Ile Pro His Ser Leu Phe Asp Glu Lys Leu Glu Gln Met Lys Ala Glu
230 235 240AAA GGG ATT CAT CTC GAC ACC GAT CTC ACT GCT GCT GAT CTT AAA GAT 826Lys Gly Ile His Leu Asp Thr Asp Leu Thr Ala Ala Asp Leu Lys Asp
245 250 255CTT GTT GAG AAA TAC AAG AAC GTG TAT GTG GAA GCA AAG GGC GAA AAG 874Leu Val Glu Lys Tyr Lys Asn Val Tyr Val Glu Ala Lys Gly Glu Lys260 265 270 275TTT CCC ACA GAT CCA AAG AAA CAG CTA GAG TTA GCA GTG AAT GCT GTT 922Phe Pro Thr Asp Pro Lys Lys Gln Leu Glu Leu Ala Val Asn Ala Val
280 285 290TTT GAT TCT TGG GAC AGC CCA AGG GCC AAT AAG TAC AGA AGT ATT AAC 970Phe Asp Ser Trp Asp Ser Pro Arg Ala Asn Lys Tyr Arg Ser Ile Asn
295 300 305CAG ATA ACT GGA TTA AAG GGG ACT GCA GTT AAC ATT CAA AGC ATG GTG 1018Gln Ile Thr Gly Leu Lys Gly Thr Ala Val Asn Ile Gln Ser Met Val
310 315 320TTT GGC AAC ATG GGA AAC ACT TCA GGA ACT GGT GTT CTT TTC ACT AGG 1066Phe Gly Asn Met Gly Asn Thr Ser Gly Thr Gly Val Leu Phe Thr Arg
325 330 335AAC CCA AGC ACC GGT GAG AAG AAG CTA TAC GGG GAG TTT TTA ATC AAT 1114Asn Pro Ser Thr Gly Glu Lys Lys Leu Tyr Gly Glu Phe Leu Ile Asn340 345 350 355GCT CAG GGA GAG GAT GTT GTT GCT GGG ATC AGA ACA CCA GAA GAT TTG 1162Ala Gln Gly Glu Asp Val Val Ala Gly Ile Arg Thr Pro Glu Asp Leu
360 365 370GGG ACC ATG GAG ACT TGC ATG CCT GAT GCA TAC AAA GAG CTT GTG GAG 1210Gly Thr Met Glu Thr Cys Met Pro Asp Ala Tyr Lys Glu Leu Val Glu
375 380 385AAC TGC GAG ATC TTA GAG GGA CAC TAC AAA GAT ATG ATG GAT ATT GAA 1258Asn Cys Glu Ile Leu Glu Gly His Tyr Lys Asp Met Met Asp Ile Glu
390 395 400TTC ACA GTT CAA GAA AAC AGG CTT TGG ATG TTG CAA TGC CGA ACA GGG 1306Phe Thr Val Gln Glu Asn Arg Leu Trp Met Leu Gln Cys Arg Thr Gly
405 410 415AAA CGT ACT GGT AAA GGT GCA GTG AGA ATT GCA GTA GAT ATG GTG AAC 1354Lys Arg Thr Gly Lys Gly Ala Val Arg Ile Ala Val Asp Met Val Asn420 425 430 435GAA GGG CTA ATT GAT ACT AGA ACA GCA ATT AAG AGG GTT GAG ACT CAA 1402Glu Gly Leu Ile Asp Thr Arg Thr Ala Ile Lys Arg Val Glu Thr Gln
440 445 450CAT CTA GAT CAG CTT CTT CAT CCA CAG TTT GAG GAT CCG TCT GCT TAC 1450His Leu Asp Gln Leu Leu His Pro Gln Phe Glu Asp Pro Ser Ala Tyr
455 460 465AAA AGC CAT GTG GTA GCA ACC GGT TTG CCA GCA TCC CCC GGG GCA GCT 1498Lys Ser His Val Val Ala Thr Gly Leu Pro Ala Ser Pro Gly Ala Ala
470 475 480GTG GGA CAG GTT TGT TTT AGT GCA GAG GAT GCA GAA ACA TGG CAT GCA 1546Val Gly Gln Val Cys Phe Ser Ala Glu Asp Ala Glu Thr Trp His Ala
485 490 495CAA GGA AAG AGT GCT ATC TTG GTA AGG ACC GAA ACA AGC CCA GAA GAT 1594Gln Gly Lys Ser Ala Ile Leu Val Arg Thr Glu Thr Ser Pro Glu Asp500 505 510 515GTT GGT GGT ATG CAT GCA GCA CCT GGA ATC TTA ACC GCT AGA GGA GGC 1642Val Gly Gly Met His Ala Ala Ala Gly Ile Leu Thr Ala Arg Gly Gly
520 525 530ATG ACA TCA CAT GCA GCG GTG GTG GCT CGC GGA TGG GGC AAA TGT TGT 1690Met Thr Ser His Ala Ala Val Val Ala Arg Gly Trp Gly Lys Cys Cys
535 540 545GTT TCC GGT TGT GCT GAT ATT CGT GTG AAC GAT GAT ATG AAG ATT TTT 1738Val Ser Gly Cys Ala Asp Ile Arg Val Asn Asp Asp Met Lys Ile Phe
550 555 560ACG ATT GGC GAC CGT GTG ATT AAA GAA GGC GAC TGG CTT TCT CTT AAT 1786Thr Ile Gly Asp Arg Val Ile Lys Glu Gly Asp Trp Leu Ser Leu Asn
565 570 575GGT ACA ACT GGT GAA GTC ATA TTG GGT AAA CAG CTA CTG GCT CCA CCT 1834Gly Thr Thr Gly Glu Val Ile Leu Gly Lys Gln Leu Leu Ala Pro Pro580 585 590 595GCA ATG AGC AAT GAC TTA GAA ATA TTC ATG TCA TGG GCT GAT CAA GCA 1882Ala Met Ser Asn Asp Leu Glu Ile Phe Met Ser Trp Ala Asp Gln Ala
600 605 610AGG CGT CTC AAG GTT ATG GCA AAT GCA GAC ACA CCT AAT GAT GCA TTA 1930Arg Arg Leu Lys Val Met Ala Asn Ala Asp Thr Pro Asn Asp Ala Leu
615 620 625ACA GCC AGA AAC AAT GGT GCA CAA GGG ATC GGG CTC TGT AGA ACT GAA 1978Thr Ala Arg Asn Asn Gly Ala Gln Gly Ile Gly Leu Cys Arg Thr Glu
630 635 640CAT ATG TTT TTC GCT TCT GAT GAG AGG ATC AAA GCT GTA AGA AAG ATG 2026His Met Phe Phe Ala Ser Asp Glu Arg Ile Lys Ala Val Arg Lys Met
645 650 655ATC ATG GCG GTC ACT CCA GAA CAA AGA AAA GTG GCT CTA GAT CTC TTA 2074Ile Met Ala Val Thr Pro Glu Gln Arg Lys Val Ala Leu Asp Leu Leu660 665 670 675CTC CCA TAC CAA AGA TCC GAT TTT GAG GGC ATT TTC CGA GCA ATG GAT 2122Leu Pro Tyr Gln Arg Ser Asp Phe Glu Gly Ile Phe Arg Ala Met Asp
680 685 690GGA CTT CCT GTA ACT ATC CGC CTT CTA GAC CCT CCA CTT CAT GAG TTT 2170Gly Leu Pro Val Thr Ile Arg Leu Leu Asp Pro Pro Leu His Glu Phe
695 700 705TTA CCC GAA GGT GAT CTA GAA CAC ATA GTG AAC GAA CTT GCA GTC GAC 2218Leu Pro Glu Gly Asp Leu Glu His Ile Val Asn Glu Leu Ala Val Asp
710 715 720ACA GGC ATG AGT GCA GAT GAA ATC TAT TCA AAA ATC GAA AAT CTA TCT 2266Thr Gly Met Ser Ala Asp Glu Ile Tyr Ser Lys Ile Glu Asn Leu Ser
725 730 735GAA GTG AAC CCT ATG CTT GGT TTC CGT GGT TGC AGA TTA GGG ATT TCA 2314Glu Val Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg Gly Cys Arg Leu Gly Ile Ser740 745 750 755TAC CCC GAG CTA ACA GAA ATG CAA GTT CGT GCG ATC TTT CAA GCT GCA 2362Tyr Pro Glu Leu Thr Glu Met Gln Val Arg Ala Ile Phe Gln Ala Ala
760 765 770GTG TCT ATG ACC AAT CAG GGG GTG ACT GTA ATA CCA GAG ATC ATG GTT 2410Val Ser Met Thr Asn Gln Gly Val Thr Val Ile Pro Glu Ile Met Val
775 780 785CCG TTA GTG GGG ACA CCT CAG GAA TTA CGT CAT CAA ATC AGT GTA ATT 2458Pro Leu Val Gly Thr Pro Gln Glu Leu Arg His Gln Ile Ser Val Ile
790 795 800CGT GGA GTA GCT GCA AAT GTG TTT GCT GAA ATG GGG GTG ACA TTG GAA 2506Arg Gly Val Ala Ala Asn Val Phe Ala Glu Met Gly Val Thr Leu Glu
805 810 815TAT AAA GTG GGA ACG ATG ATT GAG ATT CCT CGA GCT GCT TTA ATA GCT 2554Tyr Lys Val Gly Thr Met Ile Glu Ile Pro Arg Ala Ala Leu Ile Ala820 825 830 835GAA GAG ATT GGA AAA GAA GCT GAT TTC TTT TCG TTT GGA ACC AAT GAT 2602Glu Glu Ile Gly Lys Glu Ala Asp Phe Phe Ser Phe Gly Thr Asn Asp
840 845 850CTG ACC CAG ATG ACA TTT GGG TAC AGC AGA GAT GAT GTT GGC AAG TTT 2650Leu Thr Gln Met Thr Phe Gly Tyr Ser Arg Asp Asp Val Gly Lys Phe
855 860 865TTG CAG ATT TAT CTT GCT CAA GGC ATT CTG CAG CAT GAT CCA TTT GAG 2698Leu Gln Ile Tyr Leu Ala Gln Gly Ile Leu Gln His Asp Pro Phe Glu
870 875 880GTT ATT GAC CAG AAA GGG GTG GGT CAG TTG ATT AAG ATG GCT ACG GAG 2746Val Ile Asp Gln Lys Gly Val Gly Gln Leu Ile Lys Met Ala Thr Glu
885 890 895AAA GGT CGT GCA GCA AAT CCT AAC TTA AAG GTT GGG ATA TGT GGG GAG 2794Lys Gly Arg Ala Ala Asn Pro Asn Leu Lys Val Gly Ile Cys Gly Glu900 905 910 915CAT GGT GGG GAG CCT TCT TCT GTT GCA TTT TTT GAT GGA GTT GGA CTA 2842His Gly Gly Glu Pro Ser Ser Val Ala Phe Phe Asp Gly Val Gly Leu
920 925 930GAT TAT GTG TCG TGC TCT CCA TTT AGG GTT CCT ATC GCA AGG TTG GCC 2890Asp Tyr Val Ser Cys Ser Pro Phe Arg Val Pro Ile Ala Arg Leu Ala
935 940 945GCT GCA CAA GTC ATT GTT TAAGCTT 2915Ala Ala Gln Val Ile Val
950序列号：2序列长：2880序列型：核酸序列CGGCGCAGTA GGGGATCGGA AGG ATG GCG GCA TCG GTT TCC AGG GCC ATC TGC 53
Met Ala Ala Ser Val Ser Arg Ala Ile Cys
1 5 10GTA CAG AAG CCG GGC TCA AAA TGC ACC AGG GAC AGG GAA GCG ACC TCC 101Val Gln Lys Pro Gly Ser Lys Cys Thr Arg Asp Arg Glu Ala Thr Ser
15 20 25TTC GCC CGC CGA TCG GTC GCA GCG CCG AGG CCC CCG CAC GCC AAA GCC 149Phe Ala Arg Arg Ser Val Ala Ala Pro Arg Pro Pro His Ala Lys Ala
30 35 40CGC CGG CGT CAT CCG CTC CGA CTC CGG CGC GGG ACG GGG CCA CAT TGC 197Arg Arg Arg His Pro Leu Arg Leu Arg Arg Gly Thr Gly Pro His Cys
45 50 55TCG CCG CTG AGG GCC GTC GTT GAC GCC GCG CCG ATA CAG ACG ACC AAA 245Ser Pro Leu Arg Ala Val Val Asp Ala Ala Pro Ile Gln Thr Thr Lys
60 65 70AAG AGG GTG TTC CAC TTC GGC AAG GGC AAG AGC GAG GGC AAC AAG ACC 293Lys Arg Val Phe His Phe Gly Lys Gly Lys Ser Glu Gly Asn Lys Thr75 80 85 90ATG AAG GAA CTG CTG GGC GGC AAG GGC GCG AAC CTG GCG GAG ATG GCG 341Met Lys Glu Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Ala
95 100 105AGC ATC GGG CTG TCG GTG CCG CCA GGG TTC ACG GTG TCG ACG GAG GCG 389Ser Ile Gly Leu Ser Val Pro Pro Gly Phe Thr Val Ser Thr Glu Ala
110 115 120TGC CAG CAG TAC CAG GAC GCC GGG TGC GCC CTC CCC GCG GGG CTC TGG 437Cys Gln Gln Tyr Gln Asp Ala Gly Cys Ala Leu Pro Ala Gly Leu Trp
125 130 135GCC GAG ATC GTC GAC GGC CTG CAG TGG GTG GAG GAG TAC ATG GGC GCC 485Ala Glu Ile Val Asp Gly Leu Gln Trp Val Glu Glu Tyr Met Gly Ala
140 145 150ACC CTG GGC GAT CCG CAG CGC CCG CTC CTG CTC TCC GTC CGC TCC GGC 533Thr Leu Gly Asp Pro Gln Arg Pro Leu Leu Leu Ser Val Arg Ser Gly155 160 165 170GCC GCC GTG TCC ATG CCC GGC ATG ATG GAC ACG GTG CTC AAC CTG GGG 581Ala Ala Val Ser Met Pro Gly Met Met Asp Thr Val Leu Asn Leu Gly
175 180 185CTC AAC GAC GAA GTG GCC GCC GGG CTG GCG GCC AAG AGC GGG GAG CGC 629Leu Asn Asp Glu Val Ala Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ser Gly Glu Arg
190 195 200TTC GCC TAC GAC TCC TTC CGC CGC TTC CTC GAC ATG TTC GGC AAC GTC 677Phe Ala Tyr Asp Ser Phe Arg Arg Phe Leu Asp Met Phe Gly Asn Val
205 210 215GTC ATG GAC ATC CCC CGC TCA CTG TTC GAA GAG AAG CTT GAG CAC ATG 725Val Met Asp Ile Pro Arg Ser Leu Phe Glu Glu Lys Leu Glu His Met
220 225 230AAG GAA TCC AAG GGG CTG AAG AAC GAC ACC GAC CTC ACG GCC TCT GAC 773Lys Glu Ser Lys Gly Leu Lys Asn Asp Thr Asp Leu Thr Ala Ser Asp235 240 245 250CTC AAA GAG CTC GTG GGT CAG TAC AAG GAG GTC TAC CTC TCA GCC AAG 821Leu Lys Glu Leu Val Gly Gln Tyr Lys Glu Val Tyr Leu Ser Ala Lys
255 260 265GGA GAG CCA TTC CCC TCA GAC CCC AAG AAG CAG CTG GAG CTA GCA GTG 869Gly Glu Pro Phe Pro Ser Asp Pro Lys Lys Gln Leu Glu Leu Ala Val
270 275 280CTG GCT GTG TTC AAC TCG TGG GAG AGC CCC AGG GCC AAG AAG TAC AGG 917Leu Ala Val Phe Asn Ser Trp Glu Ser Pro Arg Ala Lys Lys Tyr Arg
285 290 295AGC ATC AAC CAG ATC ACT GGC CTC AGG GGC ACC GCC GTG AAC GTG CAG 965Ser Ile Asn Gln Ile Thr Gly Leu Arg Gly Thr Ala Val Asn Val Gln
300 305 310TGC ATG GTG TTC GGC AAC ATG GGG AAC ACT TCT GGC ACC GGC GTG CTC 1013Cys Met Val Phe Gly Asn Met Gly Asn Thr Ser Gly Thr Gly Val Leu315 320 325 330TTC ACC AGG AAC CCC AAC ACC GGA GAG AAG AAG CTG TAT GGC GAG TTC 1061Phe Thr Arg Asn Pro Asn Thr Gly Glu Lys Lys Leu Tyr Gly Glu Phe
335 340 345CTG GTG AAC GCT CAG GGT GAG GAT GTG GTT GCC GGA ATA AGA ACC CCA 1109Leu Val Asn Ala Gln Gly Glu Asp Val Val Ala Gly Ile Arg Thr Pro
350 355 360GAG GAC CTT GAC GCC ATG AAG AAC CTC ATG CCA CAG GCC TAC GAC GAG 1157Glu Asp Leu Asp Ala Met Lys Asn Leu Met Pro Gln Ala Tyr Asp Glu
365 370 375CTT GTT GAG AAC TGC AAC ATC CTG GAG AGC CAC TAC AAG GAA ATG CAG 1205Leu Val Glu Asn Cys Asn Ile Leu Glu Ser His Tyr Lys Glu Met Gln
380 385 390GAT ATC GAG TTC ACT GTC CAG GAA AAC AGG CTG TGG ATG TTG CAG TGC 1253Asp Ile Glu Phe Thr Val Gln Glu Asn Arg Leu Trp Met Leu Gln Cys395 400 405 410AGG ACA GGG AAA CGT ACG GGC AAA AGT GCC GTG AAG ATC GCC GTG GAC 1301Arg Thr Gly Lys Arg Thr Gly Lys Ser Ala Val Lys Ile Ala Val Asp
415 420 425ATG GTT AAC GAG GGC CTT GTT GAG CCC CGC TCA GCG ATC AAG ATG GTA 1349Met Val Asn Glu Gly Leu Val Glu Pro Arg Ser Ala Ile Lys Met Val
430 435 440GAG CCA GGC CAC CTG GAC CAG CTT CTT CAT CCT CAG TTT GAG AAC CCG 1397Glu Pro Gly His Leu Asp Gln Leu Leu His Pro Gln Phe Glu Asn Pro
445 450 455TCG GCG TAC AAG GAT CAA GTC ATT GCC ACT GGT CTG CCA GCC TCA CCT 1445Ser Ala Tyr Lys Asp Gln Val Ile Ala Thr Gly Leu Pro Ala Ser Pro
460 465 470GGG GCT GCT GTG GGC CAG GTT GTG TTC ACT GCT GAA GAT GCT GAA GCA 1493Gly Ala Ala Val Gly Gln Val Val Phe Thr Ala Glu Asp Ala Glu Ala475 480 485 490TGG CAT TCC CAA GGG AAA GCT GCT ATT CTG GTA ACG GCG GAG ACC AGC 1541Trp His Ser Gln Gly Lys Ala Ala Ile Leu Val Arg Ala Glu Thr Ser
495 500 505CCT GAG GAC GTT GGT GGC ATG CAC GCT GCT GTG GGG ATT CTT ACA GAG 1589Pro Glu Asp Val Gly Gly Met His Ala Ala Val Gly Ile Leu Thr Glu
510 515 520AGG GGT GGC ATG ACT TCC CAC GCT GCT GTG GTC GCA CGT TGG TGG GGG 1637Arg Gly Gly Met Thr Set His Ala Ala Val Val Ala Arg Trp Trp Gly
525 530 535AAA TGC TGC GTC TCG GGA TGC TCA GGC ATT CGC GTA AAC GAT GCG GAG 1685Lys Cys Cys Val Ser Gly Cys Ser Gly Ile Arg Val Asn Asp Ala Glu
540 545 550AAG CTC GTG ACG ATC GGA AGC CAT GTG CTG CGC GAA GGT GAG TGG CTG 1733Lys Leu Val Thr Ile Gly Ser His Val Leu Arg Glu Gly Glu Trp Leu555 560 565 570TCG CTG AAT GGG TCG ACT GGT GAG GTG ATC CTT GGG AAG CAG CCG CTT 1781Ser Leu Asn Gly Ser Thr Gly Glu Val Ile Leu Gly Lys Gln Pro Leu
575 580 585TCC CCA CCA GCC CTT AGT GGT GAT CTG GGA ACT TTC ATG GCC TGG GTG 1829Ser Pro Pro Ala Leu Ser Gly Asp Leu Gly Thr Phe Met Ala Trp Val
590 595 600GAT GAT GTT AGA AAG CTC AAG GTC CTG GCT AAC GCC GAT ACC CCT GAT 1877Asp Asp Val Arg Lys Leu Lys Val Leu Ala Asn Ala Asp Thr Pro Asp
605 610 615GAT GCA TTG ACT GCG CGA AAC AAT GGG GCA CAA GGA ATT GGA TTA TGC 1925Asp Ala Leu Thr Ala Arg Asn Asn Gly Ala Gln Gly Ile Gly Leu Cys
620 625 630CGG ACA GAG CAC ATG TTC TTT GCT TCA GAC GAG AGG ATT AAG GCT GTC 1973Arg Thr Glu His Met Phe Phe Ala Ser Asp Glu Arg Ile Lys Ala Val635 640 645 650AGG CAG ATG ATT ATG GCT CCC ACG CTT GAG CTG AGG CAG CAG GCG CTC 2021Arg Gln Met Ile Met Ala Pro Thr Leu Glu Leu Arg Gln Gln Ala Leu
655 660 665GAC CGT CTC TTG ACG TAT CAG AGG TCT GAC TTC GAA GGC ATT TTC CGT 2069Asp Arg Leu Leu Thr Tyr Gln Arg Ser Asp Phe Glu Gly Ile Phe Arg
670 675 680GCT ATG GAT GGA CTC CCG GTG ACC ATC CGA CTC CTG GAC CAT CCT TCT 2117Ala Met Asp Gly Leu Pro Val Thr Ile Arg Leu Leu Asp His Pro Ser
685 690 695TAC GAG TTC CTT CCA GAA GGG AAC ATC GAG GAC ATT GTA AGT GAA TTA 2165Tyr Glu Phe Leu Pro Glu Gly Asn Ile Glu Asp Ile Val Ser Glu Leu
700 705 710TGT GCT GAG ACG GGA GCC AAC CAG GAG GAT GCC CTC GCG CGA ATT GAA 2213Cys Ala Glu Thr Gly Ala Asn Gln Glu Asp Ala Leu Ala Arg Ile Glu715 720 725 730AAG CTT TCA GAA GTA AAC CCG ATG CTT GGC TTC CGT GGG TGC AGG CTT 2261Lys Leu Ser Glu Val Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg Gly Cys Arg Leu
735 740 745GGT ATA TCG TAC CCT GAA TTG ACA GAG ATG CAA GCC CGG GCC ATT TTT 2309Gly Ile Ser Tyr Pro Glu Leu Thr Glu Met Gln Ala Arg Ala Ile Phe
750 755 760GAA GCT GCT ATA GCA ATG ACC AAC CAG GGT GTT CAA GTG TTC CCA GAG 2357Glu Ala Ala Ile Ala Met Thr Asn Gln Gly Val Gln Val Phe Pro Glu
765 770 775ATA ATG GTT CCT CTT GTT GGA ACA CCA CAG GAA CTG GGG CAT CAA GTG 2405Ile Met Val Pro Leu Val Gly Thr Pro Gln Glu Leu Gly His Gln Val
780 785 790ACT CTT ATC CGC CAA GTT GCT GAG AAA GTG TTC GCC AAT GTG GGC AAG 2453Thr Leu Ile Arg Gln Val Ala Glu Lys Val Phe Ala Asn Val Gly Lys795 800 805 810ACT ATC GGG TAC AAA GTT GGA ACA ATG ATT GAG ATC CCC AGG GCA GCT 2501Thr Ile Gly Tyr Lys Val Gly Thr Met Ile Glu Ile Pro Arg Ala Ala
815 820 825CTG GTG GCT GAT GAG ATA GCG GAG CAG GCT GAA TTC TTC TCC TTC CGA 2549Leu Val Ala Asp Glu Ile Ala Glu Gln Ala Glu Phe Phe Ser Phe Gly
830 835 840ACG AAC GAC CTG ACG CAG ATG ACC TTT GGG TAC AGC AGG GAT GAT GTG 2597Thr Asn Asp Leu Thr Gln Met Thr Phe Gly Tyr Ser Arg Asp Asp Val
845 850 855CGA AAG TTC ATT CCC GTT CAT CTT GCT CAG CGC ATC CTC CAA CAT GAC 2645Gly Lys Phe Ile Pro Val His Leu Ala Gln Gly Ile Leu Gln His Asp
860 865 870CCC TTC GAG GTC CTG GAC CAG AGG GGA GTG GGC GAG CTG GTG AAG TTT 2693Pro Phe Glu Val Leu Asp Gln Arg Gly Val Gly Glu Leu Val Lys Phe875 880 885 890GCT ACA GAG AGG GGC CGC AAA GCT AGG CCT AAC TTG AAG GTG GGC ATT 2741Ala Thr Glu Arg Gly Arg Lys Ala Arg Pro Asn Leu Lys Val Gly Ile
895 900 905TGT GGA GAA CAC GGT GGA GAG CCT TCG TCT GTG GCC TTC TTC GCG AAG 2789Cys Gly Glu His Gly Gly Glu Pro Ser Ser Val Ala Phe Phe Ala Lys
910 915 920GCT GGG CTG GAT TTC GTT TCT TGC TCC CCT TTC AGG GTT CCG ATT GCT 2837Ala Gly Leu Asp Phe Val Ser Cys Ser Pro Phe Arg Val Pro Ile Ala
925 930 935ACG CTA GCT GCA GCT CAG GTG CTT GTC TGACGCTGCC TCCTCG 2880Arg Leu Ala Ala Ala Gln Val Leu Val
940 945序列号：3序列长：2610序列型：核酸序列GAATTCTCAA TCCTTTGCTC ATCGCAGCAT ATCAATGTTA ACACATAAAC TTTAGGAGGA 60AGAAAACTT ATG GCA AAA TGG GTT TAT AAG TTC GAA GAA GGC AAT GCA TCT 111
Met Ala Lys Trp Val Tyr Lys Phe Glu Glu Gly Asn Ala Set
1 5 10ATG AGA AAC CTT CTT GGA GGC AAA GGC TGC AAC CTT GCA GAG ATG ACC 159Met Arg Asn Leu Leu Gly Gly Lys Gly Cys Asn Leu Ala Glu Met Thr15 20 25 30ATC TTA GGA ATG CCG ATT CCA CAG GGC TTT ACT GTA ACA ACA GAA GCT 207Ile Leu Gly Met Pro Ile Pro Gln Gly Phe Thr Val Thr Thr Glu Ala
35 40 45TGT ACA GAG TAC TAC AAC AGT GGA AAA CAG ATC ACA CAG GAA ATT CAG 255Cys Thr Glu Tyr Tyr Asn Set Gly Lys Gln Ile Thr Gln Glu Ile Gln
50 55 60GAT CAG ATT TTC GAA GCT ATC ACA TGG TTA GAG GAA CTG AAC GGC AAG 303Asp Gln Ile Phe Glu Ala Ile Thr Trp Leu Glu Glu Leu Asn Gly Lys
65 70 75AAG TTC GGC GAC ACT GAA GAT CCG TTA TTA GTA TCT GTA CGT TCC GCG 351Lys Phe Gly Asp Thr Glu Asp Pro Leu Leu Val Set Val Arg Set Ala
80 85 90GCC CGC GCA TCC ATG CCG GGT ATG ATG GAT ACC ATC CTG AAC CTT GGT 399Ala Arg Ala Ser Met Pro Gly Met Met Asp Thr Ile Leu Asn Leu Gly95 100 105 110TTA AAC GAC GTT GCA GTA GAG GGC TTT GCA AAG AAA ACG GGA AAT CCA 447Leu Asn Asp Val Ala Val Glu Gly Phe Ala Lys Lys Thr Gly Asn Pro
115 120 125AGA TTT GCA TAT GAT TCT TAC AGA AGA TTT ATC CAG ATG TAT TCC GAC 495Arg Phe Ala Tyr Asp Ser Tyr Arg Arg Phe Ile Gln Met Tyr Set Asp
130 135 140GTA GTT ATG GAA GTT CCG AAG TCC CAT TTC GAG AAA ATC ATC GAT GCG 543Val Val Met Glu Val Pro Lys Ser His Phe Glu Lys Ile Ile Asp Ala
145 150 155ATG AAA GAA GAA AAG GGC GTT CAC TTC GAT ACA GAC CTG ACT GCC GAT 591Met Lys Glu Glu Lys Gly Val His Phe Asp Thr Asp Leu Thr Ala Asp
160 165 170GAT TTA AAA GAG CTG GCT GAG AAG TTC AAA GCT GTT TAC AAA GAG GCT 639Asp Leu Lys Glu Leu Ala Glu Lys Phe Lys Ala Val Tyr Lys Glu Ala175 180 185 190ATG AAC GGC GAA GAG TTC CCA CAG GAG CCG AAG GAT CAG TTA ATG GGC 687Met Asn Gly Glu Glu Phe Pro Gln Glu Pro Lys Asp Gln Leu Met Gly
195 200 205GCT GTT AAA GCA GTT TTC CGT TCC TGG GAC AAC CCT CGT GCA ATC GTA 735Ala Val Lys Ala Val Phe Arg Ser Trp Asp Asn Pro Arg Ala Ile Val
210 215 220TAC CGC CGT ATG AAC GAT ATC CCT GGA GAC TGG GGT ACT GCA GTT AAC 783Tyr Arg Arg Met Asn Asp Ile Pro Gly Asp Trp Gly Thr Ala Val Asn
225 230 235GTT CAG ACC ATG GTA TTT GGT AAC AAG GGC GAG ACC AGC GGT ACA GGC 831Val Gln Thr Met Val Phe Gly Asn Lys Gly Glu Thr Ser Gly Thr Gly
240 245 250GTT GCC TTC ACA CGT AAC CCA TCC ACA GGT GAA AAA GGC ATC TAC GGT 879Val Ala Phe Thr Arg Asn Pro Ser Thr Gly Glu Lys Gly Ile Tyr Gly255 260 265 270GAG TAC CTG ATC AAT GCA CAG GGC GAG GAC GTA GTT GCA GGT GTC CGC 927Glu Tyr Leu Ile Asn Ala Gln Gly Glu Asp Val Val Ala Gly Val Arg
275 280 285ACA CCA CAG CCT ATC ACC CAG TTA GAG AAC GAT ATG CCT GAC TGC TAC 975Thr Pro Gln Pro Ile Thr Gln Leu Glu Asn Asp Met Pro Asp Cys Tyr
290 295 300AAG CAG TTC ATG GAT CTG GCC ATG AAG CTG GAG AAA CAT TTC CGT GAC 1023Lys Gln Phe Met Asp Leu Ala Met Lys Leu Glu Lys His Phe Arg Asp
305 310 315ATG CAG GAT ATG GAG TTC ACA ATC GAG GAA GGT AAA TTA TAC TTC TTA 1071Met Gln Asp Met Glu Phe Thr Ile Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Phe Leu
320 325 330CAG ACA CGT AAC GGC AAG AGA ACA GCT CCG GCT GCT CTT CAG ATT GCC 1119Gln Thr Arg Asn Gly Lys Arg Thr Ala Pro Ala Ala Leu Gln Ile Ala335 340 345 350TGC GAT TTA GTA GAC GAA GGC ATG ATC ACA GAG GAA GAG GCT GTT GTA 1167Cys Asp Leu Val Asp Glu Gly Met Ile Thr Glu Glu Glu Ala Val Val
355 360 365AGA ATC GAA GCA AAA TCT CTT GAT CAG TTA CTT CAC CCG ACC TTC AAC 1215Arg Ile Glu Ala Lys Ser Leu Asp Gln Leu Leu His Pro Thr Phe Asn
370 375 380CCG GCT GCT TTA AAG GCC GGC GAA GTA ATC GGT TCC GCT CTT CCG GCA 1263Pro Ala Ala Leu Lys Ala Gly Glu Val Ile Gly Ser Ala Leu Pro Ala
385 390 395TCT CCT GGC GCA GCA GCA GGT AAA GTA TAC TTC ACC GCT GAT GAG GCT 1311Ser Pro Gly Ala Ala Ala Gly Lys Val Tyr Phe Thr Ala Asp Glu Ala
400 405 410AAG GCT GCC CAC GAG AAG GGT GAG AGA GTT ATC CTT GTT CGT CTT GAG 1359Lys Ala Ala His Glu Lys Gly Glu Arg Val Ile Leu Val Arg Leu Glu415 420 425 430ACA TCT CCG GAA GAT ATC GAA GGT ATG CAT GCA GCC GAA GGT ATC CTG 1407Thr Ser Pro Glu Asp Ile Glu Gly Met His Ala Ala Glu Gly Ile Leu
435 440 445ACA GTG CGC GGC GGT ATG ACA AGC CAT GCA GCC GTA GTT GCA CGT GGT 1455Thr Val Arg Gly Gly Met Thr Ser His Ala Ala Val Val Ala Arg Gly
450 455 460ATG GGA ACA TGC TGC GTA TCC GGA TGC GGT GAG ATC AAG ATC AAC GAA 1503Met Gly Thr Cys Cys Val Ser Gly Cys Gly Glu Ile Lys Ile Asn Glu
465 470 475GAA GCT AAG ACA TTC GAA CTT GGC GGA CAC ACA TTT GCA GAG GGA GAT 1551Glu Ala Lys Thr Phe Glu Leu Gly Gly His Thr Phe Ala Glu Gly Asp
480 485 490TAC ATC TCC TTA GAT GGT TCC ACA GGT AAG ATT TAC AAG GGC GAC ATC 1599Tyr Ile Ser Leu Asp Gly Ser Thr Gly Lys Ile Tyr Lys Gly Asp Ile495 500 505 510GAG ACT CAG GAA CGT TCC GTA AGC GGA AGC TTC GAG CGT ATC ATG GTA 1647Glu Thr Gln Glu Arg Ser Val Ser Gly Ser Phe Glu Arg Ile Met Val
515 520 525TGG GCT GAC AAG TTC AGA ACA TTA AAG GTT CGT ACA AAT GCC GAC ACA 1695Trp Ala Asp Lys Phe Arg Thr Leu Lys Val Arg Thr Asn Ala Asp Thr
530 535 540CCG GAA GAT ACA CTC AAT GCC GTT AAA CTG GGT GCA GAG GGC ATC GGT 1743Pro Glu Asp Thr Leu Asn Ala Val Lys Leu Gly Ala Glu Gly Ile Gly
545 550 555CTT TCC CGT ACA GAG CAT ATG TTC TTC GAG CCT GAC AGA ATC ATG AAG 1791Leu Cys Arg Thr Glu His Met Phe Phe Glu Ala Asp Arg Ile Met Lys
560 565 570ATC AGA AAG ATG ATC CTT TCC GAT TCA GTG GAA GCA AGA GAA GAG GCT 1839Ile Arg Lys Met Ile Leu Ser Asp Ser Val Glu Ala Arg Glu Glu Ala575 580 585 590CTG AAC GAA TTA ATC CCG TTC CAG AAG GGC GAT TTC AAG GCT ATG TAC 1887Leu Asn Glu Leu Ile Pro Phe Gln Lys Gly Asp Phe Lys Ala Met Tyr
595 600 605AAA GCT CTG GAA GGC AGG CCA ATG ACG GTT CGC TAC CTG GAT CCG CCG 1935Lys Ala Leu Glu Gly Arg Pro Met Thr Val Arg Tyr Leu Asp Pro Pro
610 615 620CTG CAT GAG TTC GTT CCT CAT ACA GAA GAG GAG CAG GCT GAA CTG GCT 1983Leu His Glu Phe Val Pro His Thr Glu Glu Glu Gln Ala Glu Leu Ala
625 630 635AAG AAC ATG GGC CTT ACT TTA GCA GAA GTA AAA GCA AAA GTT GAC GAA 2031Lys Asn Met Gly Leu Thr Leu Ala Glu Val Lys Ala Lys Val Asp Glu
640 645 650TTA CAC GAG TTC AAC CCA ATG ATG GGC CAT CGT GGC TGC CGT CTT GCA 2079Leu His Glu Phe Asn Pro Met Met Gly His Arg Gly Cys Arg Leu Ala655 660 665 670GTT ACC TAT CCG GAA ATT GCA AAG ATG CAG ACA AGA GCC GTT ATG GAA 2127Val Thr Tyr Pro Glu Ile Ala Lys Met Gln Thr Arg Ala Val Met Glu
675 680 685GCT GCT ATC GAA GTG AAG GAA GAG ACA GGA ATC GAT ATT GTT CCT GAG 2175Ala Ala Ile Glu Val Lys Glu Glu Thr Gly Ile Asp Ile Val Pro Glu
690 695 700ATC ATG ATT CCG TTA GTT GGC GAG AAG AAA GAG CTT AAG TTC GTT AAG 2223Ile Met Ile Pro Leu Val Gly Glu Lys Lys Glu Leu Lys Phe Val Lys
705 710 715GAC GTA GTT GTG GAA GTA GCT GAG CAG GTT AAG AAA GAG AAA GGT TCC 2271Asp Val Val Val Glu Val Ala Glu Gln Val Lys Lys Glu Lys Gly Ser
720 725 730GAT ATG CAG TAC CAC ATC GGT ACC ATG ATC GAA ATT CCT CGT GCA GCT 2319Asp Met Gln Tyr His Ile Gly Thr Met Ile Glu Ile Pro Arg Ala Ala735 740 745 750CTC ACA GCA GAT GCC ATC GCT GAG GAA GCA GAG TTC TTC TCC TTC GGT 2367Leu Thr Ala Asp Ala Ile Ala Glu Glu Ala Glu Phe Phe Ser Phe Gly
755 760 765ACA AAC GAC TTA ACA CAG ATG ACA TTC GGC TTC TCC CGT GAC GAC GCC 2415Thr Asn Asp Leu Thr Gln Met Thr Phe Gly Phe Ser Arg Asp Asp Ala
770 775 780GGC AAG TTC CTG GAT TCC TAC TAT AAA GCA AAA ATT TAT GAG TCC GAT 2463Gly Lys Phe Leu Asp Ser Tyr Tyr Lys Ala Lys Ile Tyr Glu Ser Asp
785 790 795CCA TTC GCA AGA CTT GAC CAG ACA GGC GTT GGC CAG TTA GTA GAG ATG 2511Pro Phe Ala Arg Leu Asp Gln Thr Gly Val Gly Gln Leu Val Glu Met
800 805 810GCA GTT AAG AAA GGC CGT CAG ACA CGT CCG GGC CTT AAG TGC GGC ATC 2559Ala Val Lys Lys Gly Arg Gln Thr Arg Pro Gly Leu Lys Cys Gly Ile815 820 825 830TGC GGC GAG CAC GGC GAG ATC CTT CTT CCG TAGAGTTCTG CCACAAAGTA 2609Cys Gly Glu His Gly Glu Ile Leu Leu Pro
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Met Gln Arg
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5 10 15GGA AAG GGA GCT GGA CTT TGC ACA ATG ACA AAA ATT GGA CTT CCA GTT 152Gly Lys Gly Ala Gly Leu Cys Thr Met Thr Lys Ile Gly Leu Pro Val20 25 30 35CCA CAA GGA TTT GTT ATT ACA ACT GAA ATG TGT AAA CAA TTC ATT GCT 200Pro Gln Gly Phe Val Ile Thr Thr Glu Met Cys Lys Gln Phe Ile Ala
40 45 50AAT GGA AAC AAA ATG CCA GAA GGA TTA ATG GAA GAA GTT AAA AAA GAA 248Asn Gly Asn Lys Met Pro Glu Gly Leu Met Glu Glu Val Lys Lys Glu
55 60 65TAT CAA TTA GTT GAA AAG AAA TCA GGA AAA GTC TTT GGA GGA GAA GAA 296Tyr Gln Leu Val Glu Lys Lys Ser Gly Lys Val Phe Gly Gly Glu Glu
70 75 80AAT CCA CTT CTT GTT TCA GTC AGA TCA GGA GCT GCT ATG TCT ATG CCA 344Asn Pro Leu Leu Val Ser Val Arg Ser Gly Ala Ala Met Ser Met Pro
85 90 95GGT ATG ATG GAT ACT ATT CTT AAT CTT GGA CTT AAT GAT AAA ACT GTT 392Gly Met Met Asp Thr Ile Leu Asn Leu Gly Leu Asn Asp Lys Thr Val100 105 110 115GTT GCT CTT GCT AAA TTA ACC AAC AAT GAA AGA TTT GCA TAT GAT TCA 440Val Ala Leu Ala Lys Leu Thr Asn Asn Glu Arg Phe Ala Tyr Asp Ser
120 125 130TAC AGA AGA TTT GTT TCC CTC TTC GGA AAG ATT GCT CTT AAT GCT TGT 488Tyr Arg Arg Phe Val Ser Leu Phe Gly Lys Ile Ala Leu Asn Ala Cys
135 140 145GAT GAA GTT TAT GAT AAG ACT CTT GAA AAC AAA AAA GTT GAA AAG GGA 536Asp Glu Val Tyr Asp Lys Thr Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Lys Gly
150 155 160GTT AAA TTA GAT ACT GAA TTA GAT GCT AAT GAT ATG AAA GAA CTT GCA 584Val Lys Leu Asp Thr Glu Leu Asp Ala Asn Asp Met Lys Glu Leu Ala
165 170 175CAA GTC TTC ATT AAA AAG ACT GAA GAA TTC ACT AAA CAA CCA TTC CCA 632Gln Val Phe Ile Lys Lys Thr Glu Glu Phe Thr Lys Gln Pro Phe Pro180 185 190 195GTT GAT CCA TAT GCT CAA TTA GAA TTT GCC ATT TGT GCT GTA TTC AGA 680Val Asp Pro Tyr Ala Gln Leu Glu Phe Ala Ile Cys Ala Val Phe Arg
200 205 210TCA TGG ATG GGA AAG AGA GCT GTT GAT TAC AGA AGA GAA TTC AAG ATT 728Ser Trp Met Gly Lys Arg Ala Val Asp Tyr Arg Arg Glu Phe Lys Ile
215 220 225ACT CCA GAA CAA GCT GAT GGA ACT GCT GTT TCA GTT GTT TCT ATG GTT 776Thr Pro Glu Gln Ala Asp Gly Thr Ala Val Ser Val Val Ser Met Val
230 235 240TAT GGT AAT ATG GGT AAT GAT TCA GCT ACT GGT GTT TGT TTC ACT AGA 824Tyr Gly Asn Met Gly Asn Asp Ser Ala Thr Gly Val Cys Phe Thr Arg
245 250 255GAT CCA GGA ACA GGA GAA AAT ATG TTC TTC GGA GAA TAT CTT AAG AAT 872Asp Pro Gly Thr Gly Glu Asn Met Phe Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Asn260 265 270 275GCA CAA GGA GAA GAT GTT GTT GCT GGT ATT AGA ACA CCA CAA ATT ATT 920Ala Gln Gly Glu Asp Val Val Ala Gly Ile Arg Thr Pro Gln Ile Ile
280 285 290TCA AAG ATG GCA GAA GAT CGA GAT CTT CCA GGT TGC TAT GAA CAA CTT 968Ser Lys Met Ala Glu Asp Arg Asp Leu Pro Gly Cys Tyr Glu Gln Leu
295 300 305CTT GAT ATT AGA AAG AAA TTA GAA GGA TAT TTC CAT GAA GTA CAA GAC 1016Leu Asp Ile Arg Lys Lys Leu Glu Gly Tyr Phe His Glu Val Gln Asp
310 315 320TTT GAA TTC ACT ATT GAA AGA AAG AAA CTT TAC ATG CTC CAA ACT AGA 1064Phe Glu Phe Thr Ile Glu Arg Lys Lys Leu Tyr Met Leu Gln Thr Arg
325 330 335AAT GGA AAG ATG AAT GCA ACT GCT ACT GTC AGA ACA GGA GTT GAT ATG 1112Asn Gly Lys Met Asn Ala Thr Ala Thr Val Arg Thr Gly Val Asp Met340 345 350 355GTT GAA GAA GGA CTT ATT ACA AAA GAA CAA GCC ATT ATG AGA ATT GCA 1160Val Glu Glu Gly Leu Ile Thr Lys Glu Gln Ala Ile Met Arg Ile Ala
360 365 370CCA CAA TCA GTT GAT CAA TTA CTT CAT AAG AAT ATG CCA GCT AAT TAT 1208Pro Gln Ser Val Asp Gln Leu Leu His Lys Asn Met Pro Ala Asn Tyr
375 380 385GCA GAA GCT CCA TTA GTT AAA GGA CTT CCA GCA TCA CCA GGA GCT GCT 1256Ala Glu Ala Pro Leu Val Lys Gly Leu Pro Ala Ser Pro Gly Ala Ala
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520 525 530AAA AAG ATT GGA GTT TTT GCT GCT GGA GAT CTT CCA TCA GCT GCT AAG 1688Lys Lys Ile Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Leu Pro Ser Ala Ala Lys
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550 555 560CGT ATG TTC AAT GCA GTT GAA AGA CTT CCA ATT GTT GTC AAG ATG ATT 1784Arg Met Phe Asn Ala Val Glu Arg Leu Pro Ile Val Val Lys Met Ile
565 570 575CTT TCA AAT ACC CTT GAA GAA AGA AAG AAA TAT CTT AAT GAA CTT ATG 1832Leu Ser Asn Thr Leu Glu Glu Arg Lys Lys Tyr Leu Asn Glu Leu Met580 585 590 595CCA CTT CAA AAA CAA GAT TTC ATT GGA TTA TTG AAG ACT ATG AAT GGA 1880Pro Leu Gln Lys Gln Asp Phe Ile Gly Leu Leu Lys Thr Met Asn Gly
600 605 610CTT CCA GTC ACT GTC AGA CTT CTT GAT CCA CCA TTA CAT GAA TTC CTC 1928Leu Pro Val Thr Val Arg Leu Leu Asp Pro Pro Leu His Glu Phe Leu
615 620 625CCA ACT CTT GAA GAG TTA ATG AGA GAA ATC TTT GAA ATG AAA CTT TCA 1976Pro Thr Leu Glu Glu Leu Met Arg Glu Ile Phe Glu Met Lys Leu Ser
630 635 640GGT AAG ACT GAA GGA CTT GCA GAA AAA GAA GTT GTT CTT AAG AAA GTT 2024Gly Lys Thr Glu Gly Leu Ala Glu Lys Glu Val Val Leu Lys Lys Val
645 650 655AAA GAA CTT ATG GAA GTT AAT CCA ATG ATT GGA CAC AGA GGA ATT AGA 2072Lys Glu Leu Met Glu Val Asn Pro Met Ile Gly His Arg Gly Ile Arg660 665 670 675CTT GGA ACT ACT AAT CCA GAA ATT TAT GAA ATG CAA ATT AGA GCA TTC 2120Leu Gly Thr Thr Asn Pro Glu Ile Tyr Glu Met Gln Ile Arg Ala Phe
680 685 690TTA GAA GCT ACT CGT GAA GTT ATT AAG GAA GGA ATT AAC GAT CAT CGA 2168Leu Glu Ala Thr Arg Glu Val Ile Lys Glu Gly Ile Asn Asp His Arg
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710 715 720AGA AAG AAT GTT CTT GAA CCA GTT CAT GAA GAA GTT GAA AAG AAA TAT 2264Arg Lys Asn Val Leu Glu Pro Val His Glu Glu Val Glu Lys Lys Tyr
725 730 735GGT ATT AAA GTA CCA TTC TCG TAT GGT ACT ATG GTT GAA TGT GTT AGA 2312Gly Ile Lys Val Pro Phe Ser Tyr Gly Thr Met Val Glu Cys Val Arg740 745 750 755GCA GCA TTA ACA GCT GAT AAG ATT GCT ACA GAA GCT TCA TTC TTC TCA 2360Ala Ala Leu Thr Ala Asp Lys Ile Ala Thr Glu Ala Ser Phe Phe Ser
760 765 770TTC GGA ACT AAT GAT CTT ACA CAA GGA ACA TTC TCA TAC TCA CGT GAA 2408Phe Gly Thr Asn Asp Leu Thr Gln Gly Thr Phe Ser Tyr Ser Arg Glu
775 780 785GAT TCA GAA AAC AAA TTC ATT CCA AAA TAT GTT GAA CTT AAG ATT CTT 2456Asp Ser Glu Asn Lys Phe Ile Pro Lys Tyr Val Glu Leu Lys Ile Leu
790 795 800CCA GCT AAT CCA TTT GAA ATT CTT GAT AGA CCA GGT GTT GGA GAA GTT 2504Pro Ala Asn Pro Phe Glu Ile Leu Asp Arg Pro Gly Val Gly Glu Val
805 810 815ATG AGA ATT GCT GTT ACT AAA GGA AGA CAA ACA AGA CCA GAA TTA CTT 2552Met Arg Ile Ala Val Thr Lys Gly Arg Gln Thr Arg Pro Glu Leu Leu820 825 830 835GTT GGT ATT TGT GGA GAA CAC GGA GGA GAA CCA TCA TCA ATT GAA TGG 2600Val Gly Ile Cys Gly Glu His Gly Gly Glu Pro Ser Ser Ile Glu Trp
840 845 850TGC CAC ATG ATT GGA TTG AAC TAT GTT TCA TGT TCT TCA TAC AGA ATT 2648Cys His Met Ile Gly Leu Asn Tyr Val Ser Cys Ser Ser Tyr Arg Ile
855 860 865CCA GTT GCT AGA ATT GCT GCT GCT CAA GCC CAA ATT AGA CAT CCA AGA 2696Pro Val Ala Arg Ile Ala Ala Ala Gln Ala Gln Ile Arg His Pro Arg
870 875 880GAA AAT TAAATTAACT TTTTTGGTTT 2722Glu Asn
885序列号：5序列长：3180序列型：核酸序列CTGAAATTCC CGTAATCTAT CATCATTTAC ACCACAAATC GATTCACATC CTCACCGAAT 60AGAAATCAAA TATCATTTAC TCCATCTCAC GATCTCCTTT TGCTATTGCT GATACCTCAA 120TTTCGCAGGT GAAGGCGGAC G ATG AGT TCG TTG TTT GTT GAA GGT ATG CCT 171
Met Ser Ser Leu Phe Val Glu Gly Met Pro
1 5 10CTG AAG TCA GCC AAT GAG TCG TGC TTA CCG GCG AGC GTG AAG CAA CGG 219Leu Lys Ser Ala Asn Glu Ser Cys Leu Pro Ala Ser Val Lys Gln Arg
15 20 25CGA ACC GGT GAT CTC AGG CGA TTG AAC CAC CAC CGT CAA CCG GCG TTT 267Arg Thr Gly Asp Leu Arg Arg Leu Asn His His Arg Gln Pro Ala Phe
30 35 40GTC CGG GGG ATT TGC CGT CGG AAG TTG AGT GGA GTT AGC AGA ATA GAG 315Val Arg Gly Ile Cys Arg Arg Lys Leu Ser Gly Val Ser Arg Ile Glu
45 50 55TTG CGC ACC GGT GGT TTA ACT CTG CCA CGA GCG GTG CTT AAT CCG GTG 363Leu Arg Thr Gly Gly Leu Thr Leu Pro Arg Ala Val Leu Asn Pro Val
60 65 70TCT CCT CCG GTA ACG ACG ACT AAA AAG AGG GTT TTC ACT TTT GGT AAA 411Ser Pro Pro Val Thr Thr Thr Lys Lys Arg Val Phe Thr Phe Gly Lys75 80 85 90GGA AAC AGT GAA GGC AAC AAG GAC ATG AAA TCC TTG TTG GGA GGA AAA 459Gly Asn Ser Glu Gly Asn Lys Asp Met Lys Ser Leu Leu Gly Gly Lys
95 100 105GGT GCA AAT CTT GCA GAG ATG GCA AGC ATT GGC CTA TCA GTT CCT CCT 507Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Ala Ser Ile Gly Leu Ser Val Pro Pro
110 115 120GGG CTC ACT ATT TCA ACT GAA GCA TGT GAG GAA TAT CAA CAA AAT GGA 555Gly Leu Thr Ile Ser Thr Glu Ala Cys Glu Glu Tyr Gln Gln Asn Gly
125 130 135AAA AAA CTG CCT CCA GGT TTA TGG GAT GAG ATT CTG GAA GGC TTA CAG 603Lys Lys Leu Pro Pro Gly Leu Trp Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Gln
140 145 150TAT GTC CAG AAA GAG ATG TCT GCA TCT CTC GGT GAC CCG TCT AAA GCT 651Tyr Val Gln Lys Glu Met Ser Ala Ser Leu Gly Asp Pro Ser Lys Ala155 160 165 170CTC CTC CTT TCC GTC CGT TCG GGT GCT GCC ATA TCG ATG CCT GGT ATG 699Leu Leu Leu Ser Val Arg Ser Gly Ala Ala Ile Ser Met Pro Gly Met
175 180 185ATG GAC ACT GTA TTG AAT CTC GGG CTT AAT GAT GAG GTC GTA GAT GGT 747Met Asp Thr Val Leu Asn Leu Gly Leu Asn Asp Glu Val Val Asp Gly
190 195 200CTA GCT GCC AAA AGT GGA GCT CGC TTT GCC TAT GAC TCG TAT AGG AGG 795Leu Ala Ala Lys Ser Gly Ala Arg Phe Ala Tyr Asp Ser Tyr Arg Arg
205 210 215TTT CTA GAT ATG TTT GGC AAC GTT GTA ATG GGT ATC CCA CAT TCG TTA 843Phe Leu Asp Met Phe Gly Asn Val Val Met Gly Ile Pro His Ser Leu
220 225 230TTT GAT GAA AAG TTA GAG CAG ATG AAA GCT GAA AAA GGG ATT CAT CTC 891Phe Asp Glu Lys Leu Glu Gln Met Lys Ala Glu Lys Gly Ile His Leu235 240 245 250GAC ACT GAT CTC ACT GCT GCT GAT CTT AAA GAT CTT GCT GAG CAA TAC 939Asp Thr Asp Leu Thr Ala Ala Asp Leu Lys Asp Leu Ala Glu Gln Tyr
255 260 265AAG AAC GTG TAT GTG GAA GCA AAG GGC GAA AAG TTT CCC ACA GAT CCA 987Lys Asn Val Tyr Val Glu Ala Lys Gly Glu Lys Phe Pro Thr Asp Pro
270 275 280AAG AAA CAG CTA GAG TTA GCA GTG AAT GCG GTT TTT GAT TCT TGG GAC 1035Lys Lys Gln Leu Glu Leu Ala Val Asn Ala Val Phe Asp Ser Trp Asp
285 290 295AGC CCA AGG GCC AAT AAG TAC AGG AGT ATT AAC CAG ATA ACT GGG TTA 1083Ser Pro Arg Ala Asn Lys Tyr Arg Ser Ile Asn Gln Ile Thr Gly Leu
300 305 310AAG GGG ACC GCG GTT AAC ATT CAA TGG ATG GTG TTT GGC AAC ATG GGG 1131Lys Gly Thr Ala Val Asn Ile Gln Cys Met Val Phe Gly Asn Met Gly315 320 325 330AAC ACT TCA GGA ACC GGT GTT CTT TTC ACT AGG AAC CCA AGC ACT GGT 1179Asn Thr Ser Gly Thr Gly Val Leu Phe Thr Arg Asn Pro Ser Thr Gly
335 340 345GAG AAG AAG CTG TAT GGG GAG TTT TTA GTC AAT GCT CAG GGA GAG GAT 1227Glu Lys Lys Leu Tyr Gly Glu Phe Leu Val Asn Ala Gln Gly Glu Asp
350 355 360GTT GTT GCT GGG ATC AGA ACA CCA GAA GAT TTG GTG ACC ATG GAG ACT 1275Val Val Ala Gly Ile Arg Thr Pro Glu Asp Leu Val Thr Met Glu Thr
365 370 375TGC ATG CCT GAA GCA TAC AGA GAG CTT GTG GAG AAC TGT GTG ATT TTA 1323Cys Met Pro Glu Ala Tyr Arg Glu Leu Val Glu Asn Cys Val Ile Leu
380 385 390GAG AGA CAC TAC AAA GAT ATG ATG GAT ATT GAA TTC ACA GTT CAA GAA 1371Glu Arg His Tyr Lys Asp Met Met Asp Ile Glu Phe Thr Val Gln Glu395 400 405 410AAC AGA CTT TGG ATG CTG CAA TGC CGA ACA GGG AAA CGT ACT GGG AAA 1419Asn Arg Leu Trp Met Leu Gln Cys Arg Thr Gly Lys Arg Thr Gly Lys
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430 435 440ACT AGA ACA GCA ATT AAG AGG GTT GAG ACT CAA CAT CTA GAT CAG CTT 1515Thr Arg Thr Ala Ile Lys Arg Val Glu Thr Gln His Leu Asp Gln Leu
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460 465 470GCA ACC GGT TTG CCA GCA TCC CCT GGG GCA GCC GTG GGG CAG GTT GTG 1611Ala Thr Gly Leu Pro Ala Ser Pro Gly Ala Ala Val Gly Gln Val Val475 480 485 490TTC AGC GCA GAG GAT GCT GAA ACA TGG CAT GCA CAA GGA AAG AGT GCT 1659Phe Ser Ala Glu Asp Ala Glu Thr Trp His Ala Gln Gly Lys Ser Ala
495 500 505ATC TTG GTA AGG ACT GAA ACA AGC CCA GAA GAT GTT GGT GGT ATG CAT 1707Ile Leu Val Arg Thr Glu Thr Ser Pro Glu Asp Val Gly Gly Met His
510 515 520GGA GCA GCT GGA ATC TTA ACC GCT AGA GGA GGA ATG ACA TCA CAT GCA 1755Ala Ala Ala Gly Ile Leu Thr Ala Arg Gly Gly Met Thr Ser His Ala
525 530 535GCA GTG GTG GCT CGG GGA TGG GGC AAA TGT TGT GTT TCT GGT TGT GCT 1803Ala Val Val Ala Arg Gly Trp Gly Lys Cys Cys Val Ser Gly Cys Ala
540 545 550GAT ATT CGT GTG AAC GAT GAT ATG AAG GTT TTT ACG ATA GGT GAC CGT 1851Asp Ile Arg Val Asn Asp Asp Met Lys Val Phe Thr Ile Gly Asp Arg555 560 565 570GTG ATT AAA GAA GGT GAC TGG CTT TCA CTT AAT GGT TCA ACT GGC GAA 1899Val Ile Lys Glu Gly Asp Trp Leu Ser Leu Asn Gly Ser Thr Gly Glu
575 580 585GTC ATA TTG GGT AAA CAG CTA CTG GCT CCA CCT GCA ATG AGC AAT GAT 1947Val Ile Leu Gly Lys Gln Leu Leu Ala Pro Pro Ala Met Ser Asn Asp
590 595 600TTA GAA ACA TTC ATG TCA TGG GCT GAT CAA GCA AGG CGT CTC AAG GTT 1995Leu Glu Thr Phe Met Ser Trp Ala Asp Gln Ala Arg Arg Leu Lys Val
605 610 615ATG GCA AAT GCA GAC ACA CCT AAT GAT GCA TTA ACA GCC AGA AAC AAT 2043Met Ala Asn Ala Asp Thr Pro Asn Asp Ala Leu Thr Ala Arg Asn Asn
620 625 630GGT GCA CAA GGG ATC GGA CTC TGT AGA ACT GAA CAT ATG TTT TTC GCT 2091Gly Ala Gln Gly Ile Gly Leu Cys Arg Thr Glu His Met Phe Phe Ala635 640 645 650TCT GAC GAG AGG ATC AAA GCT GTA AGA AAG ATG ATC ATG GCG GTC ACT 2139Ser Asp Glu Arg Ile Lys Ala Val Arg Lys Met Ile Met Ala Val Thr
655 660 665CCA GAA CAA AGA AAA GCG GCT CTA GAC CTC TTA CTC CCA TAC CAA AGA 2187Pro Glu Gln Arg Lys Ala Ala Leu Asp Leu Leu Leu Pro Tyr Gln Arg
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685 690 695ATC CGC CTT CTA GAC CCT CCA CTT CAT GAG TTT CTA CCC GAA GGT GAT 2283Ile Arg Leu Leu Asp Pro Pro Leu His Glu Phe Leu Pro Glu Gly Asp
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735 740 745CTT GGT TTC CGT GGT TGC CGA TTA GGG ATT TCA TAC CCC GAG CTA ACA 2427Leu Gly Phe Arg Gly Cys Arg Leu Gly Ile Ser Tyr Pro Glu Leu Thr
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