摩拉克氏菌的主要外膜蛋白CD 发明领域
本发明涉及免疫学领域，特别涉及来源于摩拉克氏菌的主要外膜蛋白，其生产方法和用途。
发明背景
中耳炎是儿童早期最常见的一种疾病，大约20％的小孩在七岁之前得过至少一次中耳炎。慢性中耳炎可导致小孩听力，说话和认知方面的损害。它是由肺炎链球菌(约50％)，非定型的流感嗜血杆菌(30％)及粘膜炎摩拉克氏菌(布兰汉氏球菌)(约20％)，感染引起的。仅在美国，治疗中耳炎每年要花费10到20亿美金用于抗生素和外科手术，比如：扁桃体切除术、腺切除术和鼓膜切开插管。由于中耳炎发生在一生中语言技能迅速发展的阶段，与学习和听觉尤其相关的发育障碍已被证明存在于经常患中耳炎的小孩中。
粘膜炎摩拉克氏菌主要聚生于呼吸道，主要是一种粘膜细菌病原体。通过培养鼓膜穿刺术获得的中耳流体的研究表明粘膜炎摩克拉氏菌导致了20％的中耳炎。(参考文献1-此申请从始至终，许多圆括号中提及地参考文献都更完全描述了本发明相关的领域的状况。每个引用的详细参考文献信息可在说明书的末尾，权利要求的前面找到，这些参考文献的内容在此引入作为本发明内容参考)。
粘膜炎摩拉克氏菌引起的中耳炎的发生正在增加。由于阻止肺炎球菌和流感嗜血杆菌引起的中耳炎的方法已得到发展，粘膜炎摩拉克氏菌作为一种中耳炎的病因的相对重要性估计将进一步增加。
粘膜炎摩拉克氏菌亦是成年人下呼吸道感染的一个重要因素，特别是慢性支气管炎和肺气肿(参考文献2、3、4、5、6、7和8)。粘膜炎摩拉克氏菌亦在小孩和成年人中引起窦炎(参考文献9、10、11、12和13)并且时常引起侵害性疾病(参考文献14、15、16、17、18和19)。
同其他革兰氏阴性菌一样，粘膜炎摩拉克氏菌的外膜由磷脂，脂多糖(LPS)，和外膜蛋白(OMPS)组成。8种粘膜炎摩拉克氏菌在OMPS已被鉴定为主要成分。这些蛋白用字母A至H表示，以OMP A开始，其分子量为98kDa，到OMP H，其分子量为21kDa(参考文献20)。
在粘膜炎摩拉克氏菌中已鉴定的主要OMPS中，一个表观双联体被命名为CD，是一种热可修饰蛋白。室温下其分子量为55kDa而在还原条件加热分子量为60kDa。一种用CD特异的单克隆抗体的研究证明此蛋白暴露于表面并在各种各样的粘膜炎摩拉克氏菌中是保守的(参考文献21)编码CD的基因最近由Murphy等人克隆并在大肠杆菌中得到表达(参考文献22)。粘膜炎摩拉克氏菌的30种分离株限制酶切图谱和相应于CD基因序列的寡核苷酸探针在Southern杂交分析中显现相同的带型，表明CD基因的序列是保守的。
所以，粘膜炎摩拉克氏菌的热可修饰蛋白CD是一种表面暴露、保守的蛋白，包含至少两个存于所有研究过的粘膜炎摩拉克氏菌的表位(参考文献21)，CD蛋白的特性表明此蛋白在诊断和疫苗接种抵抗由粘膜炎摩拉克氏菌或其他产生CD蛋白或产生一种能诱导产生特异与CD蛋白反应抗体的蛋白的细菌病原体引起的疾病中有用途。
提供纯化的CD蛋白(和纯化方法)以用作抗原，致免疫制剂如疫苗，其他抗原和免疫原载体以及生产诊断试剂都将是十分有好处的。
发明概述
本发明是涉及纯化的粘膜炎摩拉克氏菌的外膜蛋白CD的提供及CD蛋白的纯化方法。
根据本发明的一个实施方案，提供一种可从粘膜炎摩拉克氏菌分离的分离后并纯化，非变性的外膜蛋白CD。这种CD蛋白基本上处于天然构象状态(因而基本上具有摩拉克氏菌株CD蛋白的免疫原性特征)并且可从一种粘膜炎摩拉克氏菌株分离，比如从粘膜炎摩拉克氏菌4223或RH408分离。这样分离及纯化的CD蛋白基本上不含有摩拉克氏菌的非CD外膜蛋白，磷脂和脂多糖。
本发明亦提供一种免疫原性的组合物，此组合物包含具免疫效应量的此处所提供的外膜蛋白。这种免疫原性组合物可用来制作疫苗以在体内给予宿主针对如下疾病提供保护，由可产生CD蛋白的疫原菌导致的疾病或由可产生一种能在宿主体内诱导产生特异性与CD蛋白反应的抗体的蛋白的细菌病原体引起的疾病。具体地说，细菌病原体是粘膜炎摩拉克氏菌。
本发明的免疫原性组合物可制作成一种微粒，胶囊，ISCOM或脂质体制剂。这种免疫原性组合物亦可与靶向分子组合在一起输送到免疫系疫系统的特定细胞或粘膜表面。一些靶向分子包括B12菌株和细菌毒素的片断，如WO 92/17167所述(Biotech Australia Pty有限公司)，和单克隆抗体，如美国专利No.5,194,254中所述(Barber等人)。本发明的免疫原性组合物(包括疫苗)可进一步包含至少一种其他的免疫原性和免疫刺激性物质，而这个免疫刺激性物质可至少为一种佐剂。
用于本发明的合适的佐剂包括(但不限于)磷酸铝、氢氧化铝、QS21、Quil A，衍生物和其组分，ISCOM基质、磷酸钙、氢氧化钙、氢氧化锌、一种糖脂类似物，以及一种氨基酸的十八烷基酯、一种胞壁酰二肽、多聚磷腈、ISCOPRP、DC-Chol、DOBA和一种脂蛋白或其他佐剂来诱导Thl反应。联合使用佐剂的特别好处在共同未决的美国专利申请系列和261,194号中有所描述，此申请于1994年6月16日提交，转让给其受让人，其内容在此引入作为参考。
本发明更进一步的方面是提供一种在宿主中产生免疫反应方法， 即在包括给宿主施用本文提供的免疫有效量的免疫原性组合物，这种免疫反应可是体液介导或细胞介导的免疫反应。此免疫反应可为由产生CD蛋白或产生一种能在宿主体内诱导产生特异性与CD蛋白反应的抗体的蛋白的细菌病原体所导致的疾病提供免疫保护。可被施与要保护的宿主包括包含人的灵长目动物。
本发明另一个方面是提供一种抗体，此抗体特异于CD外膜蛋白并可用此处所提供的免疫原性组合物免疫宿主诱导产生。
本发明的另一个方案是提供一种鉴定方法，可在一个样品中测定特异于粘膜炎摩拉克氏菌外膜CD蛋白的抗体的存在。此方法包括如下步骤：
(a)将此处所提供的CD蛋白与样品在一定的条件下接触反应产生复合物，此复合物包括CD蛋白及任何上述在样品中与其特异反应的抗体；并且
(b)测定复合物产生。
本发明的另一方面，本发明还提供一种测定样品中CD蛋白存在的方法，包括如下步骤：
(a)用此处提供的免疫原性组合物免疫受试验者，产生特异于CD蛋白的抗体；
(b)将样品与抗体接触产生包括样品中的CD蛋白及上述CD蛋白特异抗体的复合物；并且
(c)测定复合物的产生。
此CD蛋白可以是粘膜炎摩拉克氏菌株或一种细菌的一部分，这些菌均可产生CD蛋白或产生一种能诱导宿主体内产生特异性与CD蛋白反应的抗体的蛋白。
本发明的又一个方案是提供一种诊断试剂盒测定一个特异性与CD蛋白反应的样品中抗体的存在，包括：
(a)此处提供的CD蛋白；
(b)使CD蛋白与样品接触产生包含CD蛋白及任何上述存在于样品中的抗体的复合物的方法；以及
(c)测定复合物产生的方法。
本发明亦提供检测样品中CD蛋白存在的诊断试剂盒，包括：
(a)此处提供的CD蛋白的特异性抗体；
(b)使抗体与样品接触以产生包含CD蛋白及CD特异抗体的复合物的方法；以及
(c)测定复合物产生的方法。
本发明在另一方面，亦提供一种产生疫苗的方法，此疫苗可抵抗由产生CD蛋白或产生一种可在宿主体内诱导产生与CD蛋白特异反应的抗体的蛋白的细菌病原体所引起的疾病，包括将此处提供的免疫原性组合物施给测试宿主来确定其组分的相当量，给药频率以赋予抵抗由产生CD蛋白及产生一种诱导宿主体内产生特异性与CD蛋白反应的抗体的蛋白的细菌病原体引起的疾病的能力。本发明提供的方法还包括将免疫原性组合物制成一种适于施给所试宿主的型式，此型式与上述确定量和施与频率一致，所试宿主可为人。
本发明可进一步提供一种生产特异于摩拉克氏菌株外膜CD蛋白的单克隆抗体的方法，包括：
(a)将此处提供的免疫原性组合物施与给至少一个小鼠产生至少一个免疫小鼠；
(b)从至少一种免疫小鼠取出B淋巴细胞；
(c)以此小鼠取出B淋巴细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，因而产生杂交瘤；
(d)克隆产生选择性抗CD蛋白抗体的杂交瘤；
(e)培养此产生抗CD蛋白抗体的克隆；然后
(f)以培养物中分离抗CD蛋白抗体。
本发明的另一个方案是提供一种以产生CD蛋白的菌株中分离和纯化外膜CD蛋白的方法，包括如下步骤：
(a)提供大批量菌株的细胞；
(b)破碎细胞获取细胞裂解液；
(c)将细胞裂解液分断形成第一次上清和沉淀，此第一次上清包括大量可溶性细菌蛋白；
(d)将上述第一次上清与上述第一次沉淀分离；
(e)抽提第一次沉淀去除基本上所有可溶蛋白和除CD蛋白外的其它膜蛋白，产生次级上清和包含CD蛋白的抽提后的沉淀；
(f)将上述次级上清与沉淀分开；
(g)将抽提后的沉淀溶解产生溶解的抽提物；
(h)分级分离溶解的抽提物产生一个包含CD蛋白的上清和可丢弃的沉淀；然后
(i)把包含CD蛋白的上清与可丢弃的沉淀分开。
产生CD蛋白的细菌菌株可是一种粘膜炎摩拉克氏菌。细胞裂解液和溶解的抽提物都可用离心来分级分离。选择性抽提初级沉淀的步骤可包含至少一种(包括多种)去污剂抽提。抽提后的沉淀可用一种包含一种去污剂和一种溶剂的缓冲液在一定温度下，处理和溶解一定时间以产生溶解的抽提物。缓冲液pH值范围为7-8.5，包括0.1～2％重量的去污剂，比如Triton X-100，并含有约3-gM尿素作为溶解剂，如4M。溶解可在40°-70°，10-120分钟发生效应。
包含CD的上清通常接着通过透析去除去污剂和溶剂，以提供非变性状态CD蛋白的更进一步纯化液。
本发明的进一步的一个方面是提供一种非凝集的粘膜炎摩拉克氏菌株，其具有粘膜炎摩拉克氏菌RH 408(ATCC标示号第55,637号)的鉴别特征。此种非凝集菌株对于在大规模发酵罐中生长可能存在的成块问题具有特别的优越性。此非凝集菌株可用于测定一种抗血清的抗摩拉克氏菌的抗菌剂活性方法，作为本发明又一方面，它包括：
由抗血清行使的补体介导的对于预选定的非凝集菌株细胞的杀伤；和
测定由上述抗血清杀伤的预选细胞数的比例，作为上述抗摩拉克氏菌的抗菌剂活性的量度。
本发明的优点包括：
一一种用于分离、纯化产生CD蛋白菌株，包括粘膜炎摩拉克氏菌的外膜CD蛋白的简单的方法，
一一种分离并纯化以一种摩拉克氏菌株分离的非变性的外膜CD蛋白；以及
一用于特异鉴别摩拉克氏菌及进而受感染的宿主的诊断试剂盒和免疫试剂。
附图简述
本发明可参照附图，从下面的描述中得到进一步理解，其中：
图1是根据本发明的一个实施方案，从粘膜炎摩拉克氏菌中纯化CD蛋白方法的流程图；
图2表示用SDS-PAGE对分离和纯化的CD蛋白的分析；
图3表示用完整的粘膜炎摩拉克氏菌免疫后小鼠体内CD蛋白特异抗体的产生；
图4表示用分离纯化后的CD蛋白免疫后小鼠体内CD蛋白特异抗体的产生；
图5为一个免疫印迹，表明在许多种粘膜炎摩拉克氏菌中CD蛋白的抗原保守性；
图6表示用整个粘膜炎摩拉克氏菌或分离纯化的CD蛋白免疫后小鼠体内产生的IgG抗体各亚型情况的比较；
图7表示用流式细胞术测定的通过用完整的粘膜炎摩拉克氏菌或分离纯化的CD蛋白免疫后产生的小鼠抗血清与粘膜炎摩拉克氏菌表面的CD蛋白的结合力；
图8用免疫印迹来证明通过用纯化分离的CD蛋白免疫产生的小鼠抗CD抗血清特异性区分粘膜炎摩拉克氏菌与其他引起中耳炎细菌病原体的能力。
发明详述
在本申请中，术语“一种摩拉克氏菌株的一种外膜蛋白”用于定义粘膜炎摩拉克氏菌外膜蛋白CD的一个家族，它们具有并包括在氨基酸序列上有变异的蛋白质，包括在不同摩拉克氏菌株中天然存在的变异。在本申请中，如果第一种蛋白质与第二种蛋白质有免疫相关性和/或有相同功能，第一种蛋白即是第二种蛋白的“功能类似物”。功能类似物可以是，例如：此蛋白一个片段或取代、添加或其缺失突变体。
本发明提供一种新技术，可用来制备基本上纯化的CD外膜蛋白。任何产生CD蛋白或产生一种能诱导产生特异识别CD蛋白抗体一个片段或其类似物的蛋白的抗血清，均可方便地用来制备分离和纯化的外膜蛋白CD。本发明包括重组方法产生的CD蛋白和其保留有CD蛋白致免疫特性的类似物。细菌通常是一种细菌病原体，特别是一种摩拉克氏菌株，比如粘膜炎摩拉克氏菌。此菌株通常与以临床来源或从细菌保藏中心得到，合适的粘膜炎摩拉克氏菌株可包括粘膜炎摩拉克氏菌4223和RH 408。
参照图1，根据本发明一个实施方案绘制的一个以粘膜炎摩拉克氏菌中纯化CD蛋白的方法的流程图，完整细胞在传统的缓冲条件下裂解产生细胞裂解液。离心裂解液产生一个应弃去的上清，里面含有约95％的可溶蛋白，和一个沉淀(PPT1)，此沉淀被选择性地去污剂抽提，去掉残余的可溶蛋白和除CD蛋白外的外膜蛋白，同时去掉其他杂质， 包括磷脂和脂多糖。这种选择性抽提可在任何常规方式下实行。其中一个此类方法可包括多种去污剂对沉淀的抽提。更详细些来说，初级去污剂抽提可采用Triton X-100，基本上去掉残余的可溶蛋白，然后离心形成进一步沉淀(PPT2)，上清同样弃之。此Triton X-100的抽提可用浓度为约0.2-1％的Triton X-100进行，缓冲系统pH在7-8.5之间，通常用pH 8.0的Tris。
对于PPT2进一步的去污剂抽提可使用十二烷基磺酸钠(SDS)或其他方便的去污剂，比如脱氧胆酸钠，通过一步或多步来去除基本上除CD蛋白以外的所有外膜蛋白以及其他杂质，然后离心形成沉淀(PPT3)，再次弃掉上清。此步抽提可使用去污剂浓度约为0.1-1％重量比的溶液，更高浓度可能使得CD蛋白部分溶解，造成产物丢失，因而避免使用。去污剂溶液通常在缓冲条件下使用，如使用pH7-8.5的缓冲液，通常用pH8.0的Tris。
施用于PPT1至形成产物PPT3的去污剂抽提可在一个合适的温度范围内进行，如4℃-30℃左右。虽然上述选择性抽提步骤包括不同的去污剂抽提，此选择性抽提过程亦可只使用一种具合适的选择抽提能力的去污剂。
选择性抽提细胞裂解产物后获得固体沉淀PPT3包含CD蛋白和剩余细胞残渣，但基本上不含其他细菌蛋白和杂质。然后CD蛋白从固体沉淀中溶解并与细胞残渣分开，比如离心如此得来的溶液。此溶解步骤可先使用去污剂溶液分散固体沉淀，然后用一种蛋白溶解试剂，如尿素来溶解悬浮的CD蛋白，通过离心去掉细胞残渣。
用于分散沉淀PPT3的去污剂溶液可以是任何方便的去污剂，如Triton X-100，浓度0.1-2％重量比，在pH7-8.5的缓冲系中。使用的溶解试剂的量应该至少足以溶解基本上所有悬浮的CD蛋白。例如，当使用尿素时，可使用浓度为3-8M。溶解步骤可用升温来加速进行，比如40℃至70℃左右，并且维持时间至少足以基本上完全溶解CD蛋白，如10-120分钟。
把CD蛋白溶液与细胞残渣沉淀分开以后，溶解试剂可用任何合适的步骤去除，比如合适条件下透析，以获取一个CD蛋白溶液。通过此步骤，分离纯化的非变性的外膜蛋白存在于水相中。CD蛋白的水溶液可根据目的用途使用合适的浓度，通常约100-200μg/ml。进一步的溶液浓度可用任何方便的步骤得到。
参照图2，表示用如图1图解表示的方法纯化的CD蛋白，用SDS-PAGE电泳分析来分析CD蛋白的纯度。在图2中，第2道表示粘膜炎摩拉克氏菌的细胞裂解液；第3道表示用50mM Tris，pH8.0处理细胞裂解液并离心后包含95％可溶蛋白的上清；第4和第5道分别表示通过在50mM Tris pH8.0缓冲系中用一个和二个去污剂抽提处理并离心得到的上清。第6道表示纯化的CD蛋白，其具有该蛋白已知的分子量(为55660kDa)。此处提供的纯化外膜CD蛋白的方法产生至少70％纯的CD蛋白制剂。图2中第6道的制剂根据密度扫描至少为95％纯。
根据图3和4，表示本发明中分离纯化的外膜蛋白在小鼠中的免疫原性。图3表示用整个粘膜炎摩拉克氏菌免疫后小鼠体内CD特异抗体的产生。图4表示用本发明中的纯的CD蛋白免疫后特异抗体的产生。从这些数据中可看出，纯化的CD蛋白具有高的免疫原性能力。并且具有与当CD蛋白作为细菌的一部分呈递给免疫系统时相仿的免疫原性。
当用作免疫原性组合物(包括疫苗)的一个成分和诊断方案中的抗原时，此处描述的纯化的CD蛋白应该有利于产生识别或中和大多数粘膜炎摩拉克氏菌的抗体。参照图5(A部)，图示为一个免疫印迹，表示用此处提供的纯化的CD蛋白免疫后产生的抗CD的抗血清识别从各种来源分离的粘膜炎摩拉克氏菌外膜蛋白CD的能力。测试的粘膜炎摩拉克氏菌株如下：
道 粘膜炎摩拉克氏菌 来源
2 纯化的CD 本发明
3 4223 中耳流质
4 5191 中耳流质
5 59 痰
6 25240 ATCC 25240
7 135 中耳流质
8 585 血液
9 3 痰
10 8185 鼻咽图5(B部)亦表明通过用完整的灭活的粘膜炎摩拉克氏菌免疫后得到的免疫血清显示出与纯化的CD蛋白(2道)粘膜炎摩拉克氏菌(第3-10道)高的反应活性。这表明CD蛋白是粘膜炎摩拉克氏菌中一个高效的致免疫蛋白。
参照图6，显示通过完整的灭活的粘膜炎摩拉克氏菌或分离纯化的CD蛋白免疫后，鼠体内产生的抗CD的IgG亚类的比较。最明显的反应是IgG1和IgG2同种型。进一步可看出，通过完整的灭活的粘膜炎摩拉克氏菌或纯化的CD蛋白来免疫获得的IgG亚类情况非常相似，表明此处描述的分离纯化的CD蛋白基本上处于其天然构象状态。
参照图7，显示流式细胞仪对抗CD的抗血清与粘膜炎摩拉克氏菌的结合的分析。用分离纯化的CD蛋白免疫后产生的收集的鼠与抗CD的抗血清与天然粘膜炎摩拉克氏菌的结合力(A部分)几乎等同于用完整的粘膜炎摩拉克氏菌免疫产生的抗粘膜炎摩拉克氏菌抗血清(B部分)。结合是粘膜炎摩拉克氏菌特异的，因为同样的抗血清并不显示对不产生CD蛋白的流感嗜血杆菌的明显结合(D部分)。比较来看，收集的鼠抗流感嗜血杆菌抗血清则与流感嗜血杆菌强烈结合(E部分)。
C部分与F部分分别表示未免疫血清与粘膜炎摩拉克氏菌和流感嗜血杆菌的结合基本上没有。这一流式细胞仪分析表明用分离纯化的CD蛋白免疫得到的抗CD抗体识别天然粘膜炎摩拉克氏菌的表面的CD蛋白，并进一步证明此处提供的CD蛋白基本上处于其天然构象状态。
在本发明的一个实施方案中，此处提供的分离纯化的CD蛋白可用于产生特异区别粘膜炎摩拉克氏菌和其他引起中耳炎的细菌病原体的抗体。因而参照图8，图示的免疫印迹表明用此处提供的CD蛋白免疫产生的抗CD抗血清的特异反应活性。分析的细菌如下：
道 细菌 来源
1 粘膜炎摩拉克氏菌 135 中耳流质
2 粘膜炎摩拉克氏菌 5195 中耳流质
3 粘膜炎摩拉克氏菌 4223 中耳流质
4 非定型流感嗜血杆菌 中耳炎分离物
5 非定型流感嗜血杆菌 中耳炎分离物
6 非定型流感嗜血杆菌 中耳炎分离物
7 肺炎链球菌 ATCC 6304
8 肺炎链球菌 ATCC 6306
9 肺炎链球菌 ATCC 6314
图8显示的结果清楚表明了此处提供的CD特异的抗血清区分和鉴定引起同样临床病症疾病的病原体的用途。
下面表1显示的结果表明用此处提供的CD蛋白免疫后产生的小鼠或豚鼠抗CD抗血清溶解两种不同粘膜炎摩拉克氏菌的能力。结果显示用菌株4223分离的CD蛋白免疫获得的两种血清针对来源于粘膜炎摩拉克氏菌4223的同源非凝集粘膜炎摩拉克氏菌，以及异源的非凝集菌株Q8(Dr，M.G.Bergeron赠送，Laval大学中心医院，Foy街，魁北克)具有杀菌效应。豚鼠免疫血清中的杀菌剂效价是很高的(1∶1，024)。鼠抗CD抗血清的杀菌活力针对两种菌株约为1∶128。这与用完整的灭活粘膜炎摩拉克氏菌免疫获得的抗血清的效价相仿。此处提供的分离纯化的CD蛋白产生杀菌抗体的能力是体内利用CD蛋白作为疫苗的证据，证明其可用作疫苗抵抗由粘膜炎摩拉克氏菌或其他产生CD蛋白或产生诱导产生特异识别CD蛋白抗体的蛋白的细菌病原体所导致的疾病。
因而，依据本发明的另一个方面，将提供一种疫苗抵抗摩拉克氏菌或其他产生CD蛋白或产生一种能诱导产生特异识别CD蛋白的抗体的蛋白的细菌病原体引起的疾病。此CD蛋白包括一定具免疫效应量的此处所提供的CD蛋白及一个生理上可接受的载体。此处提供的CD蛋白亦可用作半抗原。脂多糖的载体蛋白，或用来制造针对与CD蛋白无关的抗原决定簇的疫苗的多肽的载体蛋白。
此处提供的CD蛋白可用作一种诊断试剂，一种抗原或用来产生抗CD的抗体。制作疫苗的抗原。这些疫苗可抵抗各种摩拉克氏菌和其他产生一种能诱导特异识别CD抗体的蛋白的细菌病原体引起的疾病；CD蛋白还可用来检测由摩拉克氏菌和其他此类菌引起的感染。
在本发明另外的实施方案中，此处提供的CD蛋白可用作一种载体分子来制备嵌合体分子和偶联疫苗(包括糖联合体)以抵抗细菌病原体。包括有荚膜细菌。因而糖联合体如本发明中的可用来抵抗由任何带有多糖抗原包括脂寡聚糖(LOS)和PRP的细菌引起的疾病和感染。此类细菌病原体包括诸如：流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、伤寒沙门氏菌、变异链球菌、新型隐球酵母、克雷白氏杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌。特殊的可与CD蛋白偶联的抗原和获得此类偶联物的方法在已公开的PCT申请wO 94/12641中有描述。此专利已转让给其受让人其内容在此引入以为参考。
在另一个实施方案中，CD蛋白的载体功能可用来，比如：诱导针对肿瘤细胞的异常多糖，或产生抗肿瘤的抗体，此抗体可与化疗或生物活性试剂上偶联。
本发明扩展至把从一种摩拉克氏菌株可分离部分的分离纯化的非变性外膜CD蛋白用作一种活性的药物。特别是作为一种抵抗摩拄克氏菌感染的疾病的疫苗的活性成分。
对本领域的技术人员显而易见的，本发明的各种实施方案可运用于疫苗、诊断、治疗比如摩拉克氏菌和其他能诱导产生特异识别CD抗体的细菌病原体感染和产生免疫球蛋白试剂等领域中。此类用途的进一步非限制性讨论在下面进一步提出。
1.疫苗制剂及用途
适于用作疫苗的免疫原性组合物可从此处公开的CD蛋白制备。优选地，抗原物质被广泛地透析去掉不需要的小分子量分子并且/或者冻干燥以便更易制成需要的载体。此免疫原性组合物在一个受试者内诱导免疫反应，产生抗体，包括抗CD抗体和具调理作用或杀菌作用的抗体。如果免疫受试者受到摩拉克氏菌或其他类产生的蛋白能诱导特异识别CD蛋白的抗体的细菌的攻击，此抗体便结合并灭活细菌。进一步来说，调理素作用或杀菌的抗CD抗体可通过两种可选择机制来提供保护。
免疫原性组合物包括疫苗可制作注射剂、液体溶液或乳剂。CD蛋白可与之可配伍的药学上可接受的赋形剂相混合，此类赋形剂包括水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇及他们的组合使用。免疫原性组合物和疫苗可进一步包含附加物质，如湿润或乳化剂、pH缓冲剂、或佐剂来增强其效应。免疫原性组合物和疫苗可非胃肠道给药，如皮下或肌内注射。可替代地，根据本发明制成的免疫原性组合物可制成并以一种引起粘膜表面免疫反应的方式运送。这样以来，免疫原性组合物可通过鼻或口腔通道(胃内)施给粘膜表面。可替代地，其它给药方式包括栓剂和口服制剂都是可行的。对于栓剂来说，粘合剂和载体可包括诸如聚亚烷基二醇或甘油三酯。此类栓剂可从包含约0.5-10％优选为1-2％的活性成分的混合。口服制剂可包括通常使用的初始剂如药物级糖、纤维素和碳酸镁。这些组合物可采取以下形式：溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂，其中包括约1-95％的CD蛋白，优选约20-75％。
此致免疫制剂和疫苗采用适合于制剂剂量的方式给药，并采用具治疗、保护和免疫原性的量。给药的量决定于受治疗的个体，包括，比如：个体免疫系统合成抗体的能力，以及在需要时，产生细胞介导的免疫的能力。需要给药的活性成分的精确量依赖于医师的判断。然而，合适的剂量范围可轻易地为本领域技术人员所确定，而且可能在每次免疫时为微克级CD蛋白。起始给药剂量与促进剂量的用药方式亦是不同的，但可包括一次起始给药和随后的给药。剂量亦决定于给药的途径而且将随宿主的大小而变化。
根据本发明的一种免疫原性组合物的CD蛋白的浓度通常大约为1-95％，包含仅一种病原体的抗原物质的疫苗是一种单价疫苗。包含几种病原体抗原物质的疫苗为组合疫苗，亦属于本发明。此类联合疫苗包括，比如，来自不同病原体或同一病原体不同菌株，或来自不同病原体的组合。
如果抗原与佐剂一同给药则免疫原性可大大增加，通常使用一种0.05-0.1％的磷酸盐缓冲盐溶液。佐剂能增强抗原的致免疫力但其自身不一定具免疫原性。佐剂发挥功能可通过将抗原滞留在给药的局部位点，以产生一个库(depot)效应来促进抗原缓慢、持续的释放到免疫系统的细胞中。佐剂亦可吸引免疫系统的细胞到抗原库并刺激此类细胞产生免疫反应。
免疫刺激剂或佐剂已使用多年来提高宿主对诸如疫苗的免疫反应。内源性佐剂，如脂多糖，通常是已杀死或毒性减弱的细菌的成分被用作疫苗。外源疫苗是免疫调节剂，通常非共价地结合到抗原上并配制来提高宿主免疫反应。这样，增强对于非肠道运送的抗原的免疫反应的佐剂被鉴别出来。然而一些这样的佐剂有毒性并能导致不必要的副作用，使得他们不适用于人和许多动物。事实上，只有氢氧化铝和磷酸铝(通常指明矾)被常规用作人和兽类疫苗的佐剂。明矾增加对于白喉和破伤风类毒素化合物的抗体反应的效能已完善地建立而且一种乙肝表面抗原疫苗已用明矾作佐剂。虽然明矾对于一些应用的用法已完善地建立，它仍有缺陷。比如，明矾对于流感疫苗无效而且不能持续诱发细胞介导免疫。在小鼠中，明矾佐剂的抗原诱导的抗体主要是IgG1同种体，它对于某些疫苗试剂提供的保护并不为最佳。
广谱的外源佐剂可引起对抗原很强的免疫反应。这些包括皂素与膜蛋白抗原的复合物(免疫刺激复合物)，带矿物油的普朗尼克聚合物，矿物油中的杀死的分枝杆菌，弗氏完全佐剂，细菌产物如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂质A和脂质体类化合物。
为了有效地诱导体液免疫反应(HIR)和细胞介导免疫(CMI)，免疫原应在佐剂中乳化。许多佐剂有毒，诱导肉芽瘤，急性及慢性炎症(弗氏完全佐剂，FCA)，细胞裂解(皂素和普朗尼克聚合物)，致热原性，关节炎和前葡萄膜炎(LPS和MDP)，虽然FCA是一种非常好的佐剂并在科研中广泛应用，由于其毒性而没有被批准在人类和兽类疫苗中使用。
理想的佐剂合乎需要的特征包括：
(1)无毒性；
(2)刺激长期免疫反应的能力；
(3)操作的简单性和长期贮存的稳定性；
(4)如果需要的话，能引起对于不同途径施予的抗原的细胞介导的免疫和体液免疫反应；
(5)与其他佐剂的协同作用；
(6)选择性与抗原呈递细胞作用的能力；
(7)特异性诱导适当的TH1和TH2的细胞特异的免疫反应的能力；以及
(8)选择性增加抵抗抗原的适宜的抗体同种型水平(如IgA)的能力。
1989年8月8日授与Lockoff等人的美国专利4,855,283中讲述了作为免疫调节剂或佐剂的糖脂类似物，包括N-糖酰胺类、N-糖基脲类和N-糖基氨基甲酸酯类，他们均在糖残基上有一个氨基酸替换。因而，Lockhoff等人(美国专利4,855,283和参考文献27)报道与天然存在的糖脂结构类似的N-糖脂类似物，比如：鞘糖脂和糖基甘油三脂，能以单纯性疱疹病毒疫苗和假性狂犬病毒疫苗的方式诱导强烈免疫反应。一些糖脂已从长链烷基胺和脂肪酸合成，它们都通过异头碳原子直接与糖相连，以模仿天然存在的脂残基的功能。
授予Moloney的美国专利已转让给受让人，在此引入作为参考。此专利中讲述到，当与破伤风类毒素和甲醛水溶液灭活的I、II、III型炎髓灰质炎病毒疫苗混合时，盐酸十八烷基酪氨酸(OTH)具有佐剂的功效。同样，Nixon-George等(参考文献24)报道芳香族氨基酸的十八烷基酯与重组乙型肝炎表面抗原混合，增强了宿主对于乙型肝炎病毒的免疫反应。
合成肽的脂化亦被用来增加其免疫原性。因而，Wiesmuller(参考文献25)描述了一种其序列与口蹄疫病毒蛋白类似的肽，此肽与一种佐剂三棕榈酰-δ-甘油酰-半胱氨酰丝氨酰丝氨酸偶联，该佐剂是来源于革兰氏阴性菌的脂蛋白N-末端部分的合成类似物。Deres等(参考文献26)进一步报道了体内用合成的脂肽疫苗启动病毒特异的细胞毒T淋巴细胞。此疫苗包括来源于流感病毒核蛋白的经修饰的合成肽，连接于一个脂肽：N-棕榈酰-S-〔2，3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基-〔R〕-半胱氨酸(TPC)。
2.免疫分析
本发明的CD蛋白可用作产生抗CD抗体的免疫原，作为免疫分析的抗原包括酶联免疫吸附分析(ELISA)，酶联免疫吸附实验(RIAS)和其他本领域已知的用于检测抗细菌，抗摩拉克氏菌和抗CD抗体的非酶联抗体结合分析的方法。在ELISA分析中，CD蛋白被固定于一个选定的表面，一个可结合蛋白的表面如一个聚苯乙烯微量滴度板的孔内。洗去未完全吸附的CD蛋白以后，一种非特异蛋白如牛血清白蛋白(BSA)的溶液被结合到此选定表面牛血清白蛋白对测试样品来说是抗原性为中性的，此步骤将固定表面的非特异吸附位点封闭，因而减少了抗血清对于表面非特异结合的背景。
固定CD蛋白的表面然而与某种样品如临床或生物材料接触，通过导致免疫复合物(抗原抗体)形成的方式测试。此步可包括把样品用稀释剂稀释，如用BSA溶液，牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸缓冲盐溶液(PBS)/吐温液。然后样品被温育2-4小时，温度可在25℃-37℃之间。温育后，接触样品的表面被冲洗以去掉非免疫复合物材料。冲洗步骤包括用溶液PBS/吐温或硼酸盐缓冲液冲洗。当测试样品与结合的CD蛋白形成免疫复合物及冲洗后，免疫复合物的发生，甚至其量可通过将复合物与特异性结合一抗的二抗反应来确定。如果测试样品来源于人，则二抗为一特异结合人类免疫球蛋白，通常为IgG的抗体。为了提供检测方法，二抗可带有一种附加活性，如与合适的产色底物孵育后能产生不同颜色程序的酶促活性。然后可通过用如分光光度计来测定颜色产生的程度来定量。
3.生物保藏
此处描述和引用的一种粘膜炎布兰汉氏球菌菌株RH 408依据布达佩斯条约并在此申请提交以前，已经被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，此单位位于美国马里兰州，Rockville 12301 Parklaun路。粘膜炎布兰汉氏球菌RH 408已被按登记号55,637登记并于1994年12月13日提交。在基于此美国专利申请的专利授权后，保藏的菌株样品可对大众公开。此处描述和要求权利的发明并不被限制在保藏菌株范围内，因为保藏的实施方案只作为本发明的一个说明。任何等同或类似的菌株，如其不凝集并具有与此申请中描述的同样特征，都包括在本发明的范围之内。
实施例
以上公开概括介绍了本发明。参照下面特异的实施例，我们可获得一个更全面的理解。这些实施例仅仅是为了说明而不是限制本发明的范围的。形式的改变和等同物的替换均被认为是可很容易被提示或实现的。此处虽然引入了特殊的术语，但此类术语是为了描述的目的而不是限制的目的。此内容里使用但并未详述的分子遗传学、蛋白质生化和免疫学方法及这些实例在科学文集里有充分报道，并且是本领域里技术人员所能做到的。实施例1
此实施例阐明了粘膜炎摩拉克氏菌的生长。
粘膜炎摩拉克氏菌株4223接种入20毫升脑心浸液(BHI)肉汤。37℃，通风情况下培养过夜。在铁离子限制条件下的生长，1毫升过夜培养物接种入20毫升含20μM EDDA的BHI肉汤中在37℃培养3-4小时。生长在对数中期的细菌(A578＞0.5)通过10000×g离心20分钟收集，沉淀物用来提取实施例3中的CD蛋白。实施例2
此实施例阐明了粘膜炎摩拉克氏菌的非凝集菌株(RH 408)的产生。
粘膜炎摩拉克氏菌4223接种入几个含20毫升BHI肉汤培养基的烧瓶内，37℃孵育并170转/分振摇过夜。5毫升每一个过夜培养物被转入到单独的1毫升小管内，室温静置3-8小时，使细菌沉淀。如上所述，100μl澄清的培养基上清被用来接种25毫升BHI肉汤，然后于37℃孵育过夜。这种传代共重复六次，对于每一次过夜培养物，用25微升澄清的培养基来接种25ml BHI肉汤。非凝集细菌培养物通过每隔3小时测定A578来鉴定，以将传代菌株的沉淀速率与原始菌株4223的沉淀速率进行比较。将凝集的突变体，包括粘膜炎摩拉克氏菌RH 408，在3小时间隔期内不聚集。在BHI琼脂板上，RH 408菌株有所有非凝集菌株的克隆形态。实施例3
这一实施例阐明了CD蛋白的抽提和纯化。
CD蛋白通过图1中描述的步骤从粘膜炎摩拉克氏菌中分离。如实施例1中描述的一样，每250ml培养物的粘膜炎摩拉克氏菌的细胞沉淀，重悬于50mM Tris-HCl，pH8.0，并超声破碎(3×10分钟，70％负载周期)。抽提物在20000×g离心，得到的上清包含超过95％的粘膜炎摩拉克氏菌的可溶蛋白，弃之。
残余沉淀(PPT1)首先用含0.5％Triton X-100和10mM EDTA的50mM Tris，pH8.0溶液40ml抽提一次，然后用含0.5％SDS，50mM Tris，pH8.0溶液40ml抽提两次。这两次抽提去掉残余可溶蛋白和大部分除CD蛋白以外的膜蛋白。
将以上抽提得到的沉淀(PPT3)用作纯化CD的起始材料。沉淀用含0.5％Triton X-100，10mM EDTA的50mM Tris，pH8.0溶液重悬。在重悬液中加入尿素至终浓度为6M，然后悬液60℃加热30分钟。溶解CD蛋白。20,000×g离心30分钟之后，所得上清包含同质的纯化的CD蛋白并已与沉淀分开。纯化的CD蛋白溶液在pH8.0，50mMTris溶液中透析过夜，去除尿素，然后进一步离心，20000×g，30分钟，以去除任何可能从溶液中析出的沉降物质。在这些条件下，CD蛋白仍保持溶解状态。最终制剂的CD蛋白量通过BCA蛋白分析确定为大约100μg/ml，CD蛋白纯度通过SDS-PAGE电泳分析和密度测定法确定。(见图2)图2显示的CD蛋白纯度大约95％。SDS-PAGE分析确证了生产的CD蛋白具有已知的此蛋白的分子量55-60kDa(参考文献21)。纯化的CD蛋白的特性通过对溴化氰断裂片断进行氨基酸序列分析并与发表的序列(参考文献22)比较来确证。纯化的CD蛋白贮于-20℃。实施例4
此实施例阐明了用纯化CD蛋白对小鼠和豚鼠的免疫。
5只Balblc小鼠每组的多组小鼠在第1、第29和43天，用灭活的粘膜炎摩拉克氏菌(约105细胞)或实施例3中那样产生的纯化的CD蛋白(0.3μg-10μg)，连同AlPO4(1.5mg每次剂量)，分别进行三次皮下注射。在第14、28、42和56天分别采取血样，用EIAs法分析抗CD抗体的效价。
两只每组的豚鼠第1天用10μg剂量完全佛氏佐剂乳化的(CFA)纯化CD蛋白进行肌内免疫(i.m.)。在第14和29天用同样剂量在不完全佛氏佐剂(IFA)里乳化的蛋白进行免疫促进。第42天采取血样分析抗血清的杀菌活性。实施例5
此实施例阐明了用来确定小鼠抗血清中抗CD抗体的EIAs方法。
EIAs方法基本按照Panezuffi等描述的进行(参考文献23)。微量滴度孔用1μg CD蛋白室温包被16小时，然后滴量度板用0.1％(w/v)的PBS溶解的牛血清白蛋白封闭。小鼠抗血清梯度稀释，加入孔内，然后室温孵育1小时。亲合纯化的羊抗鼠IgG(Fc特异)抗体的F(ab′)2片段交联上辣根过氧化物酶被用作二抗。反应利用四甲基联苯胺(TMB/H2O2)发生，吸光值在-种叫Flow Multiskan MCC的微量板阅读仪上测定450nm波长光吸收(用540nm作为一种参考波长)。抗血清的反应效价用持续显示吸光值二倍增加的稀释度与免疫前血清样品的吸光值的倒数来定义。实施例6
此实施例阐明了EIAs法确定小鼠血清中抗CD IgG的亚类。
微量滴度孔用1μg纯化的CD蛋白包被免疫原性研究(如实施例4中所述)中的小鼠血清样品的最后的血被收集并用EIAs测试。大鼠抗小鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b抗体交联于辣根过氧化物酶及交联于辣根过氧化物酶的兔抗鼠IgG3被用作EIAs的试剂。每种交联剂的工作稀释度用纯化的抗体亚类确定以避免交叉反应。反应效价用实施例5中描述的方法确定。实施例7
此实施例阐明了流式细胞分析法。
用实例1中所述的方法，粘膜炎摩拉克氏菌株RH 408长至约2×108cfu/ml后，每100μl与200μl以1/500比例用含1％BSA的PBS(4mMNa2HPO4·7H2O，1.5mM KH2PO4，140mM NaCl，7mM KCl，pH7.3)稀释的抗血清混合。流感嗜血杆菌菌株12亦长至2×108cfu/ml，用同样的抗血清孵育，用作阴性对照。其他对照包括在没有任何原始抗血清的条件下单独与交联剂孵育。第一次孵育过后，细胞用含1％BSA的PBS洗两次，然后与200μl稀释的亲合纯化的羊抗鼠免疫球蛋白-DTAF混合(Jackso免疫研究室，Inc.，Mississaga Ontario)。细菌在4℃与交联物孵育30分钟，用PBS/BSA洗两次，然后重悬于1％的多聚甲醛。
染色过的细菌的荧光用Coulter Elite流式细胞仪分析，每次分析10,000个细菌。一种氩激光被使用，而525nm的发射信号被收集。抗体结合水平用基于对数刻度的荧光平均道数表示。实施例8
此实施例阐明了对于粘膜炎摩拉克氏菌的杀菌测试。
血清样品(25μl)加热至56℃，并维持30分钟以去除补体活性，再用含0.1BSA的佛罗那缓冲液(VBS)1∶8稀释，然后加入到96孔Nure微量滴度板的第一个孔中。抗血清2倍的梯度稀释液加入到其余各孔中。长至A578＞0.5的细菌用VBS1∶200,000稀释，25μl细菌悬液加入到每个孔中。一种豚鼠补体(Biowhittaker，Walkersville，MD)用VSA1∶10稀释并把25μl稀释液加入到每个孔中起动反应。滴度板37℃孵育60分钟，然后将50μl每种反应混合物铺板于含2.2％Mueller-Hinton肉汤和1.5％琼脂的Mueller-Hinton琼脂板上。在37℃孵育48小时后，计数克隆来确定杀菌效价(与含免疫前血清的对照相比，能够杀死大于50％细菌的抗血清的最高稀释度的倒数)。
公开内容小结
在此公开内容的小结中，本发明提供了一种分离并纯化的非变性的外膜蛋白CD，它是或与摩拉克氏菌分离的部分相关；本发明亦提供了从细菌菌株中分离此蛋白的方法。任何修改在本发明范围内都是可能的。
表1
抗CD抗血清和抗粘膜炎摩拉克氏菌抗
血清对于粘膜炎摩拉克氏菌的杀菌活性
粘膜炎摩拉 杀菌效价1动物种类 抗原 克氏菌株 免疫前血清 免疫后血清小鼠2 CD RH 408 ＜1∶8 1∶128小鼠 CD Q8 ＜1∶8 1∶128小鼠 全细胞 RH 408 ＜1∶8 1∶512小鼠 全细胞 Q8 ＜1∶8 1∶512豚鼠3 CD RH 408 ＜1∶8 1∶1,024豚鼠 CD Q8 ＜1∶8 1∶1,0241 杀菌效价表示为与对照相比能够杀死50％细胞的最高稀释度。2 5只每组的Balb/c小鼠在第1、29和43天用灭活的粘膜炎摩拉克 氏菌4223或3μg纯化的CD蛋白连同AlPO4进行皮下注射。第54 天采取血样分析杀菌活性。3第1天，两只每组的豚鼠用10μg剂量以完全佛氏佐剂(CFA)乳 化的纯化的CD蛋白肌肉(i.m.)免疫。第14和29天，用同样剂量 以不完全佛氏佐剂乳化的CD蛋白促进免疫，第42天采取血样分析 杀菌活性。
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