一株有机磷农药降解菌的培养方法 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，涉及一株高效降解有机磷类农药的芽孢杆菌的培养方法。
技术背景
有机磷农药以其品种多、药效高、防治范围广谱等特点，至今仍是农药中的用量最多的类别，在农业生产中起到了举足轻重的作用，我国有机磷农药的生产和使用量占农药总生产和使用量的一半以上。但是，有机磷农药具有较强的毒性，长期、大量使用后，其在农作物上的残留会引起食品安全问题，也影响了我国农产品出口，而且散落的农药也会使水和土壤受到污染。
利用微生物降解有机磷农药残留的生物修复方法具有低成本、无毒、无二次污染等优点，是最具应用前景的削减农药污染的方法之一。有机磷农药降解微生物的培养方法多数以葡萄糖提供碳源，酵母膏、蛋白胨或铵盐提供氮源，还需要补充磷酸盐和微量元素。例如：中国发明专利(申请号：200510022544.9)公开了一株降解有机磷农药毒死蜱的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，主要培养基成分包括：葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁等；中国发明专利(申请号：200410081019.X)公开了一株降解有机磷农药的苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，其培养基组成也主要是葡萄糖、蛋白胨、磷酸盐、微量元素等，这些培养基的成本较高，培养微生物菌体的成本也相应较高。
甘薯易腐烂，不宜长期存放。甘薯的深加工，可以解决因贮存鲜薯不当而导致大量烂薯的现象，甘薯精制淀粉经过不同深度的加工，可生产出数百种有价值的产品，增值10-30倍左右。但是，目前的加工工艺，每生产1吨甘薯淀粉大约产出6吨高浓度有机废水，这些废水的COD值高达10000mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白质、果胶、有机酸及少量的油脂，易腐败发酵，使水质发黑发臭，排入河流会消耗水中的溶解氧，促进藻类及水生植物繁殖，量大时河流严重缺氧，发生厌氧腐败，散发恶臭，鱼、虾、贝类等水生动物可能会因此而窒息死亡。而采用一般污水处理工艺将如此高浓度的废水处理达标，消耗惊人。从另一个角度考虑，甘薯淀粉废水中的有机质(包括：蛋白质、果胶、糖类等)是微生物生长的良好营养底物，可以做成微生物培养基，发酵生产微生物产品。
本专利发明了一种用甘薯淀粉废水为主要原料，生产有机磷农药降解菌的方法，采用的菌株是从油菜叶际分离出的一株高效降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。目前尚未发现文献报道用甘薯淀粉废水生产降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的培养方法。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种利用甘薯淀粉废水为主要原料，生产高效降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的方法。
本发明采用的降解有机磷农药的菌株是由我们实验室从油菜的叶面上分离筛选出来的。将其编号为N14，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年11月2日，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为：CGMCC No.3374。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为GU086422。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性最高，可以达到99％以上。
本发明所述的菌剂的生产方法如下：
1、培养基配制：
1)菌种保藏培养基(固体)：硫酸铵1～3g，磷酸氢二钾1～2g，硫酸镁0.1g，琼脂20g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；
2)菌种活化培养基(液体)：硫酸铵1～3g，磷酸氢二钾1～2g，硫酸镁0.1g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；
3)种子培养基(液体)：硫酸铵10～30g，磷酸氢二钾10～20g，硫酸镁1.0g，加甘薯淀粉废水至10L，pH 7.0-7.5；
4)发酵培养基(液体)：硫酸铵0.1～0.5kg，磷酸氢二钾0.1～0.4kg，硫酸镁20g，加甘薯淀粉废水至200L，pH 7.0-7.5；
以上培养基均在121℃灭菌15-30min。
2、菌种转接与活化：挑取斜面保存的有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基平板，35℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于35℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；
3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种步骤2活化的有机磷农药降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子。
4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种步骤3制备的有机磷农药降解菌液体种子，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物，菌体浓度达到50亿CFU/mL以上。
5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，加入甘氨酸(质量分数0.3％-2％)和甘油(质量分数0.5％-5％)，灌装保藏。使用时用水稀释500-1000倍。
由本发明技术方案生产的有机磷农药降解菌剂能够有效降解作物表面残留的有机磷农药，而且生产成本低廉，还实现了高浓度有机废水的资源化。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目地在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1：有机磷农药降解菌剂培养方法
1、培养基配制：
1)菌种保藏培养基(固体)：硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.1g，琼脂20g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；
2)菌种活化培养基(液体)：硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.1g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；
3)种子培养基(液体)：硫酸铵20g，磷酸氢二钾20g，硫酸镁1.0g，加甘薯淀粉废水至10L，pH 7.0-7.5；
4)发酵培养基(液体)：硫酸铵0.5kg，硫酸镁20g，磷酸氢二钾0.4kg，加甘薯淀粉废水至200L，pH 7.0-7.5；
以上培养基均在121℃灭菌15-30min。
2、菌种转接与活化：挑取斜面保存的有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基平板，35℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于35℃，150r/min摇床振荡培养20h；
3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％的接种量接种有机磷农药降解菌，于37℃，通空气培养24h，得到液体种子。
4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照10％的接种量接种有机磷农药降解菌液体种子，于37℃，通空气培养36h，得到活菌体培养物，菌体浓度达到50亿CFU/mL。
5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，加入甘氨酸(质量分数1％)和甘油(质量分数2％)，灌装保藏。使用时用水稀释500-1000倍。
实施例2：有机磷农药降解菌剂对油菜叶面敌敌畏农药残留的降解效果
1)选取两个完全相同的油菜地块，各30m2，均匀喷洒1000倍稀释的80％敌敌畏乳油农药；
2)喷洒敌敌畏12h后，害虫已被杀死，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释600倍)，以喷施清水作对照；
3)喷洒菌剂24h后，五点取样法检测油菜叶面敌敌畏残留，发现喷洒菌剂的处理组与不喷洒菌剂的对照组相比，敌敌畏残留量显著降低，低于蔬菜中敌敌畏残留国家限量标准(0.1mg/kg)。
实施例3：有机磷农药降解菌剂对油菜叶面乐果的降解效果
1)选取两个完全相同的油菜地块，各30m2，均匀喷洒1000倍稀释的50％乐果乳油农药；
2)12h后，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释500倍)，以喷施清水作对照；
3)48d后，五点取样法检测油菜叶面乐果的残留，发现处理组较对照组油菜中乐果残留量显著降低，低于蔬菜中乐果残留国家限量标准。
本发明所提供的降解有机磷农药的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年11月2日，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为：CGMCC No.3374。