抗IV型胶原酶单链抗体 本发明属于基因工程产品领域，是一种用于抑制肿瘤细胞转移的基因工程单链抗体。
侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，是引起肿瘤病人死亡的主要原因(Liotta，L.A.，Steeg，P.S.，Stetler-Stevenson，W.G.1991)。阻止肿瘤转移是治疗肿瘤的关键。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞首先穿过基底膜进入毛细血管，随血流到达远隔部位形成继发瘤。正常的基底膜主要是由连续致密的胶原蛋白和糖蛋白等成分组成，其中IV型胶原在基底膜中起支架作用，是保持基底膜结构完整的关键成分。当肿瘤发生时，肿瘤组织内IV型胶原酶的表达及其活性明显增高，继而降解基底膜中的IV型胶原蛋白，破坏基底膜，造成肿瘤细胞的侵袭和转移。因此寻找一种能抑制IV型胶原酶的物质，通过封闭IV型胶原酶的活性，而阻止肿瘤细胞的侵袭和转移已成为控制癌转移的重要策略(Stetler-Stevenson，W，G.1992；Liotta，L，A.，et al.1991)。
目前国内外已发现一些具有抑制IV型胶原酶活性的物质，如金属蛋白酶抑制，能够与IV型胶原酶结合并抑制IV型胶原酶的活性。有实验证明金属蛋白酶抑制剂能够降低肿瘤细胞的侵袭性。另外还有实验证明，用维甲酸处理人黑色瘤细胞，可降低细胞内IV型胶原酶的mRNA水平，使黑色素瘤的侵袭能力减弱(Sceenath.T.，et al.1992)。然而，上述的抑制作用都是非特异性的，在应用上会带来副作用。至今还未见到能够与IV型胶原酶特异性结合的抑制剂。
本发明的特点是利用抗体高度特异性的特点，研制抗IV型胶原酶抗体。通过抗体与IV型胶原酶的特异性结合，封闭肿瘤组织中IV型胶原酶的活性，从而达到抑制肿瘤细胞转移地目的。
本发明是利用生物工程技术，研制抗IV型胶原酶基因工程抗体。所采用的技术方案如下：从分泌IV型胶原酶单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、纯化mRNA。体外反转录cDNA。用PCR技术，在反应体系中加入cDNA和一套抗体轻链或重链可变区引物(Pharmacia)，10×PCR缓冲液，dNTP终浓度为2.5mM，2单位Taq DNA聚合酶。总反应体积为50μl。混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每个循环的条件是：94℃变性30秒，55℃退火90秒，72℃延伸90秒，反应进行到最后一个循环后在72℃中保温10分钟。用SephagelsTM Bandprep Kit(Pharmacia)回收轻链和重链可变区基因扩增产物。然后用一段编码(Gly4Ser)3的连接DNA把回收的轻链和重链可变区基因在等摩尔浓度的条件下，通过7次退火循环连接而成单链抗体基因。每个循环的反应条件为94℃变性30秒，64℃退火4分钟。以单链抗体基因为模板，在上述反应体系中，加入一对5’端含Sfi1和3’端含Not1酶切位点的引物，进行30次PCR循环，每次循环条件为94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟。最后一次循环后在72℃中保温10分钟。用SepheglosTMBandPrep Kit回收PCR产物。回收的单链抗体基因分别经过限制性内切酶Sfi1和Not1消化。在T4连接酶的作用下，与经过Sfi1和Not1双酶切的pCANTAB5E载体连接。连接反应条件为16℃过夜。将含单链抗体基因的重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞。在辅助噬菌体K07辅助下，产生重组噬菌体抗体。采用免疫亲和筛选方法，把含有重组噬菌体抗体的上清与包被于聚乙烯平皿中的IV型胶酶共温育2小时。用含0.1％Tween20的PBS缓冲液洗平皿20次，每次20ml。弃去PBS，在平皿内加入10ml处于对数生长期的TG1细胞，于37℃温育1小时。然后培养过夜。离心，取上清。进行下一轮筛选。重复“感染—扩增—筛选”过程3-4后，再感染TG1细胞，铺板过夜培养。从平板上随意挑选单菌落于30℃培养过夜。用M13 K07辅助噬菌体感染细胞，于37℃过夜培养。离心后取上清。用ELISA筛选IV型胶原酶噬菌体抗体。把那些与抗原结合活性最高的阳性克隆挑选出来，转入大肠杆菌HB2151。在IPTG的诱导下，表达可溶性IV型胶原酶单链抗体。收集含单链抗体的培养上清，并用50％硫酸铵沉淀，进一步用Sephadex G-75层析柱纯化单链抗体。
免疫活性鉴定证明该单链抗体能够与IV型胶原酶特异性结合。抗体COIV-19是目前已知的唯一能够与IV型胶原酶特异结合的小分子基因工程抗体。它将应用于恶性肿瘤的治疗。
实施例
1 细胞培养及鉴定：将分泌IV型胶原酶抗体的杂交瘤细胞培养于含15％牛血清的完全RPMI1640培养基中。培养箱含5％CO2的混合气体，湿度为98％。用ELISA方法鉴定培养上清中单抗的特异性和滴度。
2 mRNA的分离与纯化：用快速制备、纯化mRNA试剂盒(Promega)从大约2×107个杂交瘤细胞中提取并纯化mRNA。
3 制备cDNA：以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。
4 制备抗体可变区基因：用PCR方法以cDNA为模板，在PCR反应体系中分别加入一套轻链或重链可变区引物(Pharmacia)，10×PCR缓冲液5μl，dNTP终浓度为2.5mM，混匀后经100℃变性5分钟，加入2单位Taq DNA聚合酶。总反应体积为50μl。混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每个循环的条件是：94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸90s，反应进行到最后一个循环后在72℃中保温10分钟。反应结束后，用SephaglesTM Bandprep Kit(Pharmacia)回收轻链和重链可变区基因扩增产物。DNA序列分析证明IV型胶原酶抗体轻链可变区是由336个核甘酸组成，其基因序列如下：
5‘ TCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAACTTCCTTAGCTGCATCTCTGGGGCAGAGGGCCA
CCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAA
CCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCT
GGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATC
CTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGGCTTACACGTT
CGGAGGAGGGACCAAGTTGGAAATCAAACGG 3‘重链可变区是由348个核甘酸组成，其基因序列如下：5‘ ATGGCCCAGGTCAAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGACCTGGTGAAGCCCTCTCAGTCACTT
TCACTTACCTGCACTGTCACTGGCTATTCCATTACCGTTCGTTATAGCTGGCACTGGATC
CGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATATATTACAATGGTACCACT
AACTACAACCCATCTCTCAGAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAG
TTCTTCCTGAAGTTGAGTTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGA
TGGGATGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCC 3’
5 单链抗体基因的组装：回收的轻链和重链可变区基因与连接引物(Phamacia)在等摩尔浓度的条件下，加入2.5mM dNTP和3单位Taq DNA聚合酶，反应体积为50μl。用液体石蜡油封闭后进行7次退火循环。每个循环的反应条件为94℃变性30s，64℃退火4分钟。
6 单链抗体基因的扩增：以单链抗体基因为模板，在上述反应体系中，加入一对5’端含Sfi1，3’端含Not1酶切位点的引物，进行30次PCR循环，每次循环条件为94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟。最后一次循环后在72℃中保温10分钟。用SephglesTM BandPrep Kit回收PCR产物。DNA序列分析证明IV型胶原酶单链抗体基因是由729个核甘酸组成，其核甘酸序列如下：
1 ATGGCCCAGGTCAAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGACCTGGTGAAGCCCTCTCAGTCACTT
61 TCACTTACCTGCACTGTCACTGGCTATTCCATTACCGTTCGTTATAGCTGGCACTGGATC
121 CGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATATATTACAATGGTACCACT
181 AACTACAACCCATCTCTCAGAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAG
241 TTCTTCCTGAAGTTGAGTTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGA
301 TGGGATGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGC
361 GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCA
421 ACTTCCTTAGCTGCATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGT
481 GTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCC
541 AGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGC
601 AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCA
661 ACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGGCTTACACGTTCGGAGGAGGGACCAAGTTGGAA
721 ATCAAACGG
7 单链抗体基因与表达载体的连接：回收的单链抗体基因分别经过限制性内切酶Sfi1和Not1消化。然后在T4连接酶的作用下，与经过Sfi1和Not1双酶切的pCANTAB5E载体连接。连接反应条件为16℃过夜。
8 单链抗体基因的表达：将含单链抗体基因的重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞，并把转化的细胞涂在含100μg/ml氨苄青霉素LB培养板上，于37℃过夜培养。
把生长在LB培养板上的转化菌收集下来，用适量SOC培养基(含100ug/ml氨苄青霉素和2％w/v葡萄糖)稀释细胞悬液至A600光吸收值约0.2左右，于37℃培养至A600光吸收值约0.4左右。加入2.5×109pfu M13K07辅助噬菌体，于37℃培养大约1小时。离心，把细胞沉淀重悬于10ml不含葡萄糖，含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的SOC培养液中，于37℃培养过夜。离心收集含有重组噬菌体的上清。
9 感染—扩增—筛选：用0.05M NaHCO3 pH9.6稀释IV型胶酶，使其终浓度为10μg/ml，包被于聚乙烯平皿中，4℃过夜。次日用PBS缓冲液洗平皿三次，然后加20ml 1％BSA封闭液，于室温温育1h。再用PBS洗平皿三次。把封闭液与含重组噬菌体抗体的上清按1∶1等体积混合，取20ml混合液加入平皿中，于37℃温育2小时。用PBS缓冲液洗平皿20次，每次20ml含0.1％Tween 20。弃去PBS，加入10ml处于对数生长期的TG1细胞，于37℃温育1小时。然后培养过夜。离心，取上清，进行下一轮筛选。重复“感染—扩增—筛选”过程3-4后，再感染TG1细胞，铺板。次日从平板上随意挑选单菌落，分别接种于100μl含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的SOC培养液中，于30℃培养过夜。再用M13 K07辅助噬菌体分别感染转化细胞，于37℃培养1h，离心，将细胞沉淀分别重选于含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素培养液中，37℃过夜培养。离心后取上清。
10 筛选IV型胶原酶噬菌体抗体：用IV型胶原酶10μg/ml(溶液为0.05M Na2HCO3 pH9.6)包被96孔酶联板，于4℃过夜。次日用1％BSA封闭酶联板。于室温温育1h。再用PBS洗板三次。把封闭液与含重组噬菌体抗体的上清按1∶1等体积混合，每孔加入100μl混合液，于37℃温育2小时。洗板4次，每次200μl含0.1％Tween 20。弃去PBS，每孔加入1∶2000倍稀释的抗M13噬菌体抗体(Phamacia)100μl。37℃反应1小时。洗4次后加入底物双氧水和邻苯二胺(H2O2-OPD)，室温作用15分钟，加2 M H2SO4终止反应液50μl，于A495处检测每孔的光吸收值。把其中一株与IV型胶原酶结合活性最高的阳性克隆，命名为COIV-19。
11 单链抗体的制备：把含有COIV-19基因的重组质粒转入HB2151细胞。在SOBAG培养基上涂板，30℃培养过夜。随意从板上挑选单菌落，分别培养于2ml含100μg/ml氨苄青霉素2％葡萄糖的2×YT培养液中，30℃培养过夜。离心，细胞重悬于含1mM IPTG，100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养液中，于30℃培养20小时。离心，收集上清。用50％硫酸铵沉淀上清，经过Sephadex G-75层析柱纯化，最后获得可溶性抗IV型胶原酶单链抗体，分子量为29KD。从DNA序列推导IV型胶原酶单链抗体是由243个氨基酸组成，其序列是：
MAQVKLQQSGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITVRYSWHWIRQFPGNKL
EWMGYIYYNGTTNYNPSLRSRISITRDTSKNQSSLKLSSVTTEDTATYY
CARWDAMDYWGQGTTWTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPTSLA
ASLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLES
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIREAYTFGGGTKLEIKR