aPL免疫反应性肽和其缀合物以及 治疗aPL抗体-介导的疾病的方法 发明所属技术领域
本发明属于免疫学领域，同时涉及用于治疗和诊断抗磷脂(aPL)抗体-介导的疾病的组合物与方法。具体地说，本发明涉及化学限定的非免疫原性平台分子和aPL结合表位的特异性免疫类似物的缀合物以及用以产生这些缀合物的方法和组合物。优化的类似物缺乏T细胞表位。此外，本发明涉及用于检测生物样品中抗磷脂抗体的存在和测定其总量的诊断测定方法。本发明也涉及用随机肽文库鉴别aPL结合表位的特异性免疫类似物表位的方法。
发明背景
抗磷脂抗体发生在自身免疫疾病(如全身红斑狼疮症(SLE)和抗磷脂抗体综合症(APS)以及与感染和药物疗法联系的病症)中。APS的特性为具有一个或更多临床特征(如动脉或静脉血栓，血小板减少和胎丧失)。APS是基本的，或者它可能与其它病症相联系(主要是SLE)。(《磷脂结合抗体》(Harris等，eds.，CRC出版社，Boca Raton，FL，1991)；McNeil等，免疫学进展杂志，49卷，193-281页(Austen等，eds.，学院出版社，圣地亚哥，CA，1991))。近30-40％的SLE患者有aPL，而50％地带aPL抗体的病人却缺乏SLE。这50％的病人可能患有其它的自身免疫风湿疾病，或各种各样的病症，或者它们可能已经接受了药物(特别是氯丙嗪)治疗。在对70位(26位男性和44位女性)原发性APS(PAPS)(但无证据表明有SLE)的患者的一项研究中，观察到下列特征：患深静脉血栓症(DVT)的有31位；得动脉闭塞(特别是中风或者是瞬时局部缺血)有31位；患心肌梗塞的15位；患习惯性流产(fetal loss)的24位；患血小板减少症(TCP)的32位；10位的Coomb氏测验呈阳性；患Evans氏综合症的有7位；32位有抗核抗体(ANA)，但其中29位不到1∶160；大约24位有抗线粒体抗体(AMA)(McNeil等，同上)。只是在所有中风患者大约5％中估测有变化，aPL抗体被认为是一个重要的起作用的因子。
短暂存在的aPL抗体，如那些在VDRL试验中检测到的，发生在许多感染期间。大约30％的有永久aPL抗体的病人曾得过血栓病。aPL抗体的存在可在SLE患者群内定义一组病人，他们表现出包括一个或更多个血栓症、TCP和流产等临床特征的综合症。在SLE中得这种综合症的危险总体来说大约是25％；在aPL抗体存在时危险性增加到40％，而在它们不存在时危险性减少至15％。因为aPL抗体被认为是针对原生质膜中的磷脂的，人们假设它可能通过干扰在细胞(如血小板或者是内皮细胞)的磷脂膜上发生的止血过程在活体中产生直接致病效果。在PAPS患者中，aPL抗体看来是存在的唯一危险因子这一事实进一步证明了这些抗体有直接致病作用(Bakimer等，1992，J.Clin.Invest.89：1558-1563；Blank等，1991，美国科学院学报，88：3069-3073)。
在临床环境中的aPL抗体测量仍然不完善。一套可供使用的商业标准抗血清(APL诊断公司，Louisville，KY)可产生标准曲线以用于比较在各种实验室进行测定。然而，关于确切的GPL和MPL，IgG和IgM抗磷脂抗体的测量单位，对所给血清的等级分类和分为高、中、低滴定率的GPL和MPL的级别，在这些实验室各自获得的结果间有很多的不一致性。可供使用的商业试剂盒在商业可供使用的标准分配的值上变化很大(Reber等(1995)，血栓形成和止血剂73：444452)。尽管有这些局限性，一般认为，受在APS，PAPS和其它aPL抗体-介导的疾病(包括周期性中风和周期性流产)中抗体识别的表位位于β2-GPI的第5域中，并且在β2-GPI与心磷脂结合后暴露给抗体。
现在人们一般地接受是aPL抗体识别由β2-糖蛋白(β2-GPI)和带负电磷脂(例如心磷脂)构成的抗抗原复合体(McNeil等(1990)美国科学院学报，87：4120-4124；Galli(1990)Lancet I：1544-1547)(在下文为“aPL免疫原”)。β2-GPI是所发现的游离的较小血浆糖蛋白与脂蛋白脂类相联系，它也叫作载脂蛋白H(ape H)。它由被称作Sushi的5个独立折叠域或者是与其它蛋白质中类似域相似的短的共有重复域构成。已有报道β2-GPI在结合磷脂上经历了抗抗原的和构造上的变化(Wagenkneckt等(1993)血栓形成和止血剂69：361-365；Jones等(1992)第5届抗磷脂抗体国际会议议程(摘要5))。第5个域包含脂类结合和aPL抗体结合的假定位点(Hunt J.和S.Krilis(1994)免疫学杂志152：653-659；Lauer等(1993)免疫学80：22-28)。关于aPL的病理机制是未知的(McNeil等，同上)。大多数解释援引内皮细胞功能或者是血小板介入(Haselaar等(1990)血栓形成和止血剂63：169-173)。这些解释提出在血管内皮细胞伤害或者是血小板激活后，向原生质暴露表面的阴离子磷脂的暴露或转双面迁移可能会导致β2-GPI结合和引发aPL抗体形成。
aPL抗体可能通过减少前列环素形成而直接起原血栓形成作用的(Vermylen，J.和J.Arnout(1992)临床实验室医学杂志120：10-12)；通过直接干扰凝结蛋白质的作用；或者是通过封阻β2-GPI的能力来抑制内在的血液凝固途径，血小板凝血原酶活性，和腺苷二磷酸(ADP)调解的血小板聚合(Arvieux等(1993)血栓形成和止血剂60：336-341)。
提供巨大的分子多样性的组合文库已经是在搜索铅化合物的药物化学中的一种主要的新工具。分子多样性可以从化学合成或生物系统中产生(Scott.，J.K.[合理的药物设计](CRC出版社，Weiner，D.B.和W.V.Williams，eds.，Boca，Raton，FL.，1994)；Moos等(1993)药物化学年报28：315-324)。通过在丝状噬菌体的表面显示随机肽，人们已经创造了包含用临床的显著抗体来进行检测的数以亿计的克隆的表位文库(Scott，J.K.和G.P.Smith(1990)科学249：286-390；Cesareni，G.(1992)FEBS Lett.307：66-70)。通过把随机化的寡核苷酸序列(通常是pIII基因，该基因编码每个噬菌体表面上的单一肽序列)结合到噬菌体基因组中来制备这样的噬菌体文库。在亲和纯化和扩增的顺序循环之后，结合抗体的那些噬菌体在大肠杆菌和通过测序病毒脱氧核糖核酸(DNA)的相应编码区鉴别的结合肽中得到增殖。在大多数情况下，随后的研究将涉及相应的合成肽(在建立它们结合抗体的能力之后)。基于噬菌体的文库已用来模仿不连续的表位(Luzzago等(1993)基因杂志128：51-57；BaLass等(1993)美国科学院学报，90：10638-10642)。基于肽-的药物的潜在的血浆不稳定性已经成功地通过N-末端封阻或者是正确的使用氨基酸类似物得到克服(Powell，M.F.(1993)药物化学年报28：285-293)。
现在缺乏对显示aPL抗体高效价的患者的特异性免疫疗法。已经证明在许多用药(如阿斯匹林，甾类化合物，和华法令)的情况很大程度上不充分([磷脂-结合抗体](Harris等，eds.，CRC出版社，Boca Raton，FL，1991)；McNeil等，同上)。合成的模拟肽，其特征是(i)不能激活T细胞，但(ii)保持结合免疫B细胞的能力，用于以抗原-特定的方式耐受B细胞。这项技术公开在共有的共同未决美国专利申请08/118,055(申请于1993年9月8日)和美国专利5,268,454中，在本文中一并参考。如以上所引用的申请与专利中公开的，如在以上应用和专利中公开的B细胞耐受力限制了缀合到多价的，稳定的，非免疫原性平台的肽的施用，通过B细胞无变应性或在交叉连接免疫球蛋白后的克隆缺失废除抗体的产生。
虽然aPL抗体识别的靶表位的确切的分子性质是未知的，利用从表位文库所衍生的肽将允许成功的构建耐受原。用于与人类全身红斑狼疮有关的肾炎的治疗的B细胞耐受原也曾是在共有的美国专利5,276,013和5,162,515中公开，它们的全部在本文一并参考。
发明描述
本发明在于发现了一种利用随机肽噬菌体文库，用于鉴别在患者(患有PAPS、APS和其它aPL抗体-介导的疾病，如周期性中风和习惯性流产)中aPL抗体识别的关键表位的类似物的方法。
因此，本发明的一个方面是用于筛选随机肽噬菌体文库以鉴别充分模拟由aPL抗体识别的表位肽序列的一种改进的方法。该方法包括的步骤如下：(a)用在本领域中那些已知的修改的方法生物淘选(biopanning)所说的文库；(b)通过微淘选筛选(micropanning)自步骤(a)的噬菌体除去结合很弱的噬菌体：通过(i)在涂布有结合到蛋白质G的aPL抗体微型板孔中培养噬菌体，(ii)洗涤微型板孔移去未结合的噬菌体，(iii)洗脱结合的噬菌体，并且(iv)用所洗脱的噬菌体感染微生物如大肠杆菌，通过涂布在琼脂上以计算被感染过的微生物的数量；(c)通过噬菌体俘获ELISA的评价确定在(b)中回收的最强结合克隆：通过(i)把微型板面的孔涂布上一层aPL抗体，(ii)在所涂布的孔中温育通过在(b)中微淘选鉴别的最强结合克隆，并且洗掉未结合噬菌体，(iii)在比色ELISA测定中利用酶-缀合山羊-抗噬菌体抗体定量结合至抗体上的噬菌体，如果鉴别到若干相同强结合的克隆，则附加一次(d)在最强结合噬菌体-俘获-ELISA克隆上进行噬菌体-ELISA。
在这一点上，本发明包括用于鉴别特异性结合分离自患有aPL抗体-介导的疾病的人类aPL抗体之表位类似物的方法，该方法包括：(a)制备噬菌体随机肽文库；(b)筛选所说的具有aPL抗体的文库，以鉴别aPL模拟肽，其中所说的筛选包括：(i)通过生物淘选筛选所说的文库；(ii)通过微淘选筛选经(i)中的生物淘选分离的噬菌体；并且(iii)通过免疫测定鉴别在(ii)中回收的包含aPL抗体高亲和性结合肽的噬菌体。
本发明也包括一种生物淘选噬菌体随机肽文库以鉴别和分离结合到aPL抗体上的肽的方法，该方法包括：(a)使亲和纯化的aPL抗体与携带随机肽插入物的噬菌体反应；(b)回收携带有结合到aPL抗体上的随机肽插入物的噬菌体；(c)用在(b)中回收的噬菌体感染微生物；和(d)在包含抗生素的培养基中培养感染过的微生物以分离噬菌体。
本发明还包括一种微淘选噬菌体随机肽文库以鉴别和分离具有对aPL抗体的高结合亲和性的肽的方法，该方法包括：(a)通过生物淘选分离携带随机肽插入物的噬菌体；(b)在涂布有结合到蛋白质G上的aPL抗体的微型板孔中培养步骤(a)中回收的噬菌体；(c)洗涤微型板孔，除去未结合的噬菌体；(d)洗脱结合的噬菌体；(e)用在(d)中回收的噬菌体感染微生物；和(f)在包含抗生素的培养基中培养感染过的微生物以分离噬菌体。
本发明也包括上述所描述的方法，其中免疫测定是噬菌体-俘获ELISA，该方法包括：(a)在涂布有aPL抗体的微型板孔中，培养通过微淘选分离的携带随机肽插入物的噬菌体；(b)洗掉未结合噬菌体；(c)在孔中温育酶-标记的抗噬菌体抗体；(d)洗掉未结合的酶-标记的抗噬菌体抗体；(e)添加比色(colorimetric)底物；和(f)测量底物的吸收率，以鉴别高亲和性-结合噬菌体。
也包括在本发明中的是以上所述的方法，并且还包括进行附加的高亲合性结合噬菌体的噬菌体-俘获ELISA测定，该方法包括：(a)在微型板孔上涂布上相同数量的噬菌体；(b)在孔中温育aPL抗体；(c)洗掉未结合抗体；(e)用结合的aPL抗体与酶-标记的-抗-aPL抗体一起温育；(f)洗掉未结合的酶-标记的抗-aPL抗体；(g)将比色底物添加至孔中；(h)测量底物的吸收率，以测量噬菌体的相关的结合亲和性。
本发明也包括以上所述的方法，其中所说的免疫测定是一种菌落-印迹免疫测定，该方法包括：(a)在包含琼脂的培养基顶上的硝酸纤维素膜上培养受到携带随机肽插入物的噬菌体感染的微生物；(b)通过在包含琼脂的培养基顶上的第二个硝酸纤维素膜上印迹微生物来复制转移(a)中培养的微生物；(c)培养转移的微生物；(d)裂解所说的微生物；(e)以溶菌酶消化微生物；(f)以明胶溶液封阻膜：(g)将aPL抗体与膜一起温育；(h)洗掉未结合的aPL抗体；(i)将硝酸纤维素膜与酶-标记的抗-aPL抗体一起温育；(j)洗掉未结合的酶-标记的抗-aPL抗体；(k)添加比色底物；和(1)测量底物的吸收率以鉴别高亲和性结合的噬菌体。
本发明也包括一种用于测定和分级亲和-结合特征表位的方法，所说的表位特异性结合分离自患有aPL抗体-介导的疾病的患者的aPL抗体，该方法包括：(a)用心磷脂涂布微滴板的孔；(b)添加成年牛或人类血清，其作为结合到心磷脂上的β2-GPI源，并阻止非特异性结合到平板的孔上；(c)温育单节类似物溶液和高-效价aPL抗体一段预定的时间；(d)向微滴板孔中添加aPL抗体/类似物混合物并温育一段预定的时间；(e)洗涤孔以洗掉未结合aPL抗体；(f)将与标记缀合的抗-人类IgG添加到平板孔中，培养一段预定的时间；(g)洗涤孔以洗掉未结合的抗-人类IgG缀合物；(h)添加标记的缀合物的底物，进行底物/标记反应一段预定的时间；(i)测量底物/标记反应的最终-产物，并以数量表示结合至孔上的aPL抗体的量；(j)计算aPL抗体结合的抑制(如果有的话)百分比，以确定类似物对aPL抗体的亲和性。
本发明也包括一种用于确定从怀疑患有aPL抗体-介导的疾病的患者取得的体液中aPL抗体存在的诊断免疫测定法，该测定法包括将特异性结合aPL抗体的表位类似物与体液样品接触，并通过本领域所熟知的方法来确定aPL抗体是否在体液中存在，如果存在，用数量表示在液体中存在的aPL抗体的量。一个这样的免疫测定法包括：(a)用特异性结合aPL抗体的表位的类似物涂布在微滴板的孔上；(b)洗涤孔以洗掉未结合类似物；(c)将体液试验样品添加至孔中，并温育一段预定的时间；(d)洗涤孔以除去未结合的试验样品；(e)将与标记缀合的抗-人类IgG添加到平板孔中，温育一段预定的时间；(f)洗涤孔以洗掉未结合的抗-人类IgG缀合物；(g)添加标记的缀合物的底物，并进行底物/标记反应一段预定的时间；(h)测量底物/标记反应的最终-产物，以确定抗-aPL抗体在试验样品中的存在。本发明也包括一种如上所述的其中的免疫测定是定量的诊断免疫测定法。
噬菌体-ELISA测定包括：(i)在微滴板的孔上涂布上相同量的不同的克隆，随后(ii)通过在孔中添加抗体以鉴别孔最强地结合aPL抗体的肽插入物，并且用酶-标记抗-人类IgG缀合物进行该反应。如噬菌体-ELISA，菌落印迹或者是噬菌体-俘获-ELISA测量的，对aPL抗体具有高亲和性的噬菌体所显示的随机肽，代表着aPL-特定的表位类似物。然后合成这些肽并用竞争测定法按结合强度分成等级。
本发明的另一个方面是特异性结合到由aPL表位结合的B细胞的aPL抗体结合类似物。优化的类似物缺乏T细胞表位。
本发明的另一个方面是引发特定的对aPL免疫原的B细胞耐性的组合物，该组合物包含非免疫原性平台(platform)分子和aPL抗体结合类似物的缀合物，所说的抗体-结合类似物(a)特异性结合aPL免疫原结合于其上的B细胞和(b)缺乏T细胞表位。
附图简要说明
图1显示了在一个市售的aPL抗体标准的ELISA测定中鱼明胶取代成年牛血清废除了所有抗心磷脂(ACA)活性。这项结果支持了McNeil等，同上，和Galli等，同上的研究结果，注意到在定义ACA的靶表位中β2-糖蛋白I的(β2-GPI)重要性。
图2显示了免疫特异性结合到亲和-纯化的IgG上的命名为ACA-6501的树脂-结合类似物5A12。
图3说明了来源于用结合aPL抗血清但是不结合正常的血清的ACA-6626筛选的aPL抗体-结合类似物。
图4也说明了免疫特异性结合ACA-6501抗血清，并且与ACA-6626有交叉反应的ACA6501/5A12类似物。
图4和5，说明当ACA6501/5A12和ACA6626/4D3 aPL抗体结合类似物来源于用在本发明之内的方法(优选地结合筛选抗体)筛选时，检测到明显程度的交叉反应。
图6说明用于计算ACA-6501aPL抗体的GPL得分的方法。
图7显示与GPL标准的血清相比的亲和性-分离的ACA-6501活性。
图8说明通过第四轮生物淘选在分离的序列多样性的明显下降。
图9说明三个克隆(3A12、3B3和3A5)在用ACA-6635的噬菌体-俘获ELISA中显示出很强的特异性免疫信号，而所有所试验的克隆与正常的IgG缺乏反应。
图10显示了在用ACA-6501的噬菌体-ELISA中七个克隆显示的强的信号。
图11显示了用ACA-6501的从肽5A12、CB2和3B10得到的竞争-结合ELISA的结果。0.16μg的肽5A12产生对ACA6501aPL抗体结合到结合至聚苯乙烯微型板孔的四价肽ACA6501/3B10的50％的抑制，其中需要0.08μg CB2和0.5μg 3B10来产生50％抑制。
图12说明修饰的ACA6641/3G3类似物的竞争活性。
图13说明在用ACA-6501抗体的竞争性-结合ELISA中肽139、142和143的50％抑制值分别是6.9、0.7和0.9μg。
图14说明在肽3B10中在3、9位和3与9两个位上取代α-Me-脯氨酸的影响。与“天然”肽比在9位α-Me-脯氨酸的取代增加了四-折叠肽的活性。
图15显示了肽6641/3G3(LJP 688)与九种亲和-纯化的ACA抗体高度的交叉反应。
图16和17显示了在脾细胞分别在100、20和4μM的LJP 685-MTU-DABA-PEG的缀合物(化合物36)和LJP 685-ATU-MTU-AHAB-TEG缀合物(化合物35)中培养2小时后，用经LJP 685-KLH免疫的小鼠脾细胞，在108M时抗-685抗体ABC剂量-依赖性减弱。
图18显示了最靠近所阐明肽925的九种结构的质心核磁共振结构，是肽925分子形状的合理的代表。
图19把肽925(在图的底部标记，如3G3)的结构与肽5A12的结构相比较。两种肽在肽序列中大约相同的位置都有转折。
图20A和B说明了aPL类似物的药效基因被暂时鉴别为小疏水基团和带正电的基团。如图20A所示肽925的gem-二甲基和氨基基团被暂时鉴别为这个肽的药效基因。在图20A中限定了药效基因限制到一些支架上的碳氢化合物接头的长度以及分开这些接头连到支架上的位点的距离。
实施发明的方式
A.定义
本文中所用的术语“aPL抗体”指任何可以特异性地结合介导疾病的β2-GPI的抗体。
如本文中所用的术语“B细胞无反应性”指需要T细胞辅助来产生和分泌抗体的那些B细胞的不反应性，包括(没有限制)未成熟和(或)成熟B细胞的无性系缺失和(或)B细胞无能力产生抗体。
“不反应性”指对免疫原的体液反应上的一种治疗上有效的降低。数量上的减弱(如在抗体产生上减弱所测量的)至少是50％，优选地至少是75％，最好为100％。
“抗体”指是T细胞依赖性的那些抗体。
如本文中所用的术语“免疫原”是指能引起包含aPL抗体的体液免疫反应的实体。免疫原有B细胞表位和T细胞表位。在aPL抗体-介导的病理学中涉及的aPL免疫原可能是外部的(对个体是外源的)免疫原如药物，包括对个体是外源的天然生物物质如治疗蛋白质、肽和抗体等或者是自身免疫原(自动免疫原)，如与抗体-介导的超凝固性(中风)有关的那些。
术语免疫原的“类似物”指一种分子，该分子(a)特异性地结合到与免疫原特异性地结合的抗体，(b)缺乏T细胞表位。尽管类似物通常将是免疫原的片段或者衍生物，由此与免疫原具有相同的化学类别(例如，免疫原是多肽而类似物也是多肽)，但化学相似不是必要的。因此，类似物可以是与免疫原相比有不相同的化学类别(如免疫原是碳水化合物而类似物是多肽)而同时它具有以上(a)和(b)的功能特征。类似物可能是肽、碳水化合物、脂类、脂多糖、核酸或其他生化体。另外，为本发明的目的免疫原和类似物的化学结构都不需限定。
术语免疫原的“类似物”也包括术语“模拟表位”。术语“模拟表位”指一种通过竞争阻止抗体结合免疫原的分子。因为它特异性结合所说的抗体，人们认为模拟表位是模仿了免疫原的抗原决定簇。
本文中用的“效价平台分子”意义为具有有利于一系列免疫原接触的位点的非免疫原性分子。
“非免疫原性”用来描述效价平台分子，同时意指当对个体施用其自身时，效价平台分子表示出缺乏免疫反应。
本文中用“个体”指哺乳动物种类中的一员并且包括人类、类人猿、大鼠和家畜(如牛和羊)、运动动物(如马)和宠物(如狗和猫)。
本文中用的“药效基因”指在aPL类似物与抗体靶结合中涉及到的主要的基团的三维方向和化学性质。B.aPL抗体结合类似物的鉴别
aPL抗体结合类似可以通过筛选侯选分子确定他们是否(a)特异性结合到aPL抗体上，同时(b)缺乏T细胞表位来鉴别。特异性结合aPL抗体可以用常规的免疫测定法如下例提到的ELISA法，同时T细胞表位的存在与否也可由实施例中描述的常规T细胞活性测定法确定。在这一点上，“特异性地结合”到免疫原的血清抗体上的类似物显示了其合理的亲和性，例如，107M-1。T细胞表位的存在与否也可由在08118,055号中所公开的氚化胸苷结合测定法测定。T细胞表位的存在也能通过本领域已知的方法测量T细胞-来源的淋巴激活素的分泌得到测定。在以上背景下不能引起胸苷的统计学上明显的结合的类似物被认为是缺乏T细胞表位的。胸苷结合的量随着免疫原变化将是人们所喜欢的。典型的刺激指数低于2-3，更常见的是大约1-2，表明缺乏T细胞表位。C.缀合物的制备
将aPL抗体-结合类似物连接到非免疫原性平台分子上以制备本发明的缀合物。优选的效价平台分子是生物上稳定的，即，它们表现一种从几小时到几天到几个月的活体排泄半寿期以赋予治疗功效，优选的包括限定的组合物的一条合成的单链。它们通常具有的分子量在200到200,000的范围内，通常大约200到20,000。在本发明中的效价平台分子的例子是聚合物如聚乙烯乙二醇(PEG)，聚-D-赖氨酸，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。优选的聚合物基于聚乙烯乙二醇(PEGs)，具有大约200到大约8,000的分子量。
其它适合于在本发明中的使用的效价平台分子是化学限定的，非多聚效价平台分子，这在共有共同未决的美国专利申请08/152,506(申请于1993年11月15日)中公开；在本文中一并参考。特别优选的同类的化学限定的适合于在本发明之内使用的效价平台分子是衍生的2，2｀-乙烯二氧乙二脂胺(EDDA)和三乙基乙二醇(TEG)。
附加的适合的效价平台分子包括四氨基苯，七氨基β环化糊精，t四氨基季戊四醇，1，4，8，11-四氮杂环十四烷(Cyclam)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷(Cyclen)。
aPL抗体结合类似物与效价平台分子的缀合可以以任何数量方式起作用，典型地包括一种或更多交叉连接剂以及在类似物和效价平台分子上的功能基团。
多肽类似物包含含有功能基团(如氨基，羧基，或者是巯基基团(作为连接类似物到载体的位点))的氨基酸的侧链部分。如果类似物还没有这些基团，可以将有这样的功能基团的残基添加到类似物上。这些残基可以通过固相合成技术或者是重组体技术整合，两种技术在肽合成领域中都是已知的。在碳水化物或者是脂类类似物的情况下，功能性氨基和硫氢基团可用常规化学结合整合到其中。例如，主要的氨基基团可通过在可以在氰基硼氢化钠存在下与乙烯二胺反应得到整合而硫氢基团则通过半胱胺赖氨酸二盐酸盐的反应与随后的一种标准的二硫化物还原剂的还原引入其中。如果不具有适合的功能基团，按一种类似的方式，效价平台分子也可以衍生出包含功能基团来。
可变长度的亲水接头对把肽或者其它生物活性分子与效价平台分子相连接来说是有用的。适合的接头包括乙二醇的线性低聚物或者是聚合物。这样的接头包括具有式R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2的接头，其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或一种保护基团如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基，例如，4-硝基苯基酯。这些接头对于通过硫醚，将包含硫醇反应基团(如卤乙酰、马来酰亚胺等)的分子连接到含有经酰胺键的氨基的第二分子上是有用的。这些接头在连接顺序上是灵活的，即，硫醚可以首先或者是最后形成。
通常配制缀合物供注射施用(例如，腹膜内注射，静脉注射，皮下注射，肌肉注射，等)。因此，典型地是将它们与药学上可接受的载体(如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液等)组合。缀合物通常占制剂重量的大约0.01％至10％。对个体施用的缀合物以“治疗有效的量”，即，施用量足以使B细胞对所涉及的免疫原无反应性，并影响所说的抗体-介导的病证的预防、改善或消除。特定的剂量方案(即，剂量、时间和重复)取决于特殊的个体以及该个体的病史。通常，对大约1μg到100mg缀合物/kg体重的剂量，优选地，大约100μg到10mg/kg体重，每周给一次。其他合适的用药方案的频度为例如每日一次或者是每周3个剂量，或者是每周1个剂量，或者是第2周到4周1个剂量，或者按月1个剂量，或者根据个体或者是疾病状态采用频度较低的方案。可能需要重复施用(通常根据B细胞转换率记时)以完成和/或者是保持体液无反应性状态。如果检测到抗体效价上的增加，这样的典型地重复施用包括每30至60天大约1μg到10mg/kg体重或者更高剂量。另外，缀合物的持续不断的释放配方可用于一些病态。用于完成持续释放的各种配方和仪器在本领域中也被人们所了解。
抗-辅助T细胞治疗可与缀合物一道施用。这样的治疗通常使用抑制T细胞的药剂，如甾类化合物或者是环孢菌素。D.aPL抗体的抗原的特性
本发明者在aPL抗体上的初始研究与对这些抗体识别的抗抗原位点的特性提出问题的出版物相吻合。最初人们认为这些抗体很象那些在VDRL试验中检测到的抗体识别心磷脂分子。如图1所示，在抗心磷脂抗体(ACA)固相ELISA中，以鱼明胶取代成年牛血清从根本上废除了所有作为ACA标准的购得的抗体制剂的ACA活性。这一发现表明ACA抗体识别在血清蛋白质上的决定簇，如由McNeil等，同上和Galli等，同上所提出的，而非心磷脂本身。这些作者显示的这个蛋白质是β2-GPI，这样，术语“ACA”或者是“抗心磷脂抗体”实际是用词不当，但是今天仍然用来指这些抗体。
自身免疫的大多数，IgG aPL抗体识别在β2-GPI分子上的决定簇。这些表位仅仅在它与心磷脂结合时才形成或者是暴露在β2-GPI上(neo表位)。另外，在β2-GPI上的表位存在于每一个β2-GPI分子的单个拷贝之中，并且可以对aPL抗体有较低的亲和性。保持抗体-抗原相互作用的足够亲合力只有通过由它们结合到心磷脂上排列在邻近β2-GPI上这两个位点达到。
在本发明(模拟天然B2-GPI的表位)之内通过对aPL类似物的核磁共振分析得到了β2-GPI表位结构的更深入的了解。例如，通过对与aPL抗体的高度交叉反应的两种肽aPL类似物的核磁共振溶液结构的比较显示，在肽序列中，两种肽都在大约相同的位置具有转折(turn)(参见图18和19)。E.ACA ELISA
与临床样品的GPL得分关连的大规模检验和研究抗体与β2-GPI的层析纯化的必要性导致开发了一种功能上与一套市售的试剂盒近一致并且与发现具有最佳可再现性(Reber等，同上)的设计相似的用于aPL抗体的ELISA测定法。F.aPL抗体的免疫亲合纯化
为了分离aPL抗体，将多层状、包含心磷脂的弥散体(脂质体；也包含胆甾醇和三十二烷基磷酸盐)与aPL血浆(或者是血清)一起温育。这些脂质体是通过离心从血清中沉淀得到的。在洗涤后，脂质体混合物由2％辛基葡糖苷去垢剂破坏，并且用于蛋白质A-琼脂糖柱。接着充分洗涤首先除去脂类，然后除去非IgG组分，用温和的酸把IgG aPL抗体从蛋白质A中洗脱，中和，进行缓冲液交换，并在ACA ELISA中测验。如以兔IgG-抗人类β2-GPI抗血清进行的Western印迹法所示，这一方法产生的aPL抗体达10,000-倍，对β2-GPI没有任何污染。G.丝状噬菌体随机肽文库的构建
在p-III蛋白质上构建十一个不同的flJSE 5丝状噬菌体随机肽文库得到构建(每噬菌体5个具有肽的p-III拷贝)。这些文库为拟表位的发现提供了一个巨大形状和结构组。4个文库，指定为“x”文库，具有肽插入物(长度分别是8、10、12和15个残基)，并且在氨基和羧基末端侧面上有脯氨酸残基。这些脯氨酸残基的作用在于破坏任何对二级结构的贡献(可能从天然P-III蛋白质产生并使插入物进入溶剂)。“y’”文库包含6、7、8、9、11和13个氨基酸长的半胱氨酸-结合插入物。除了缺乏6和8个氨基酸的插入物外，“y”文库与“y｀”文库相同。这些为“y”和“y｀”文库的肽插入物在氨基和羧基末端由半胱氨酸残基侧翼，形成环状更坚固的结构。由于类似于以上的那些“x”文库的理由，脯氨酸残基结合到这些半胱氨酸残基外部。“x”、“y｀”和“y”文库定位在天然的p-III蛋白质的氨基末端的5个残基。“z”文库包括定位于P-III蛋白质的氨基末端的随机的8个插入物，并且不包含任何侧翼脯氨酸或者是半胱氨酸残基。“x”、“y｀”和“z”文库的组合代表了十一个不同的文库，其中每个有大约一百万个不同的肽插入物。
通过利用标准的分子生物学技术将合适长度的随机寡核苷酸序列渗入，以给出插入进fUSE的P-III基因的所需长度来构建这些文库。在flJSE5DNA的限制性核酸内切酶消化之后，加入超量的作为缺口双链体的激酶寡核苷酸并连接。将DNA电穿孔进大肠杆菌并通过在四环素培养基中培养选择插入物。从上清液分离这种培养物的噬菌体(包含肽插入物)，并在缓冲液中洗涤和再悬浮。典型地文库显示在每mL 8×1012转导单位下具有7×1012个独立克隆。H.噬菌体-筛选方法
筛选噬菌体的本质显示肽文库具有将几十亿潜在的候选噬菌体减少到相对极少的具有显著的性质的能力。原来的筛选方案(由Scott，J.K.和G.P.Smith推荐，(1990)科学杂志249：315-324)经过大的修改有利选择各种aPL抗体的最好的表位。设计这些程序使选择更加严格，当筛选进行直到达到某一点时，其中代表最好的序列的一定数量的有用的克隆可以得到全面的研究。对一些抗体，文库看来似乎没有可以结合很紧的序列，如果用高度严格的方法筛选，则不存在特异性的克隆。在另一方面，所说的文库经常产生许多代表所说抗原的好类似物的克隆，同时有必要使用高度严格的方法来鉴别最好的表位。由于这一原因，开发了不同严格程度的测定法，以从表位文库筛选中鉴别最好的表位。测定按增加的严格程度在这里列出：生物淘选＜微淘选＜噬菌体-俘获ELISA＜噬菌体ELISA＝菌落印迹＝肽ELISA。
(i)生物淘选
“生物淘选”描述了这样的技术，其中，使亲和-纯化的aPL抗体和携带随机肽插入物的噬菌体混合，接着，抗体-特异性回收俘获结合的噬菌体。噬菌体赋予在四环素培养基中培养然后分离的大肠杆菌的四环素抗性，然后分离。多轮生物淘选增加了样品中特异性免疫噬菌体的数量。噬菌体总是在3至5轮选择后得到回收，但是可以仅代表对选择的抗体以低亲和性非特异性结合的序列。用于进一步评价这些噬菌体(微淘选)的方法是需要的。
(ii)微淘选
噬菌体结合aPL抗体的相对强度的估计可以通过“微淘选”来进行。微淘选是3轮或是更多轮生物淘选后进行的并且与生物淘选方法使用相同的抗体。该方法包括稀释来自生物淘选的最后一轮的噬菌体，通过微淘选对50或更多个这样的克隆进行分析。通过使每个克隆增长到相似的密度，并且在预先涂布有常量抗体的微量滴定孔中培养以理想的单一浓度下稀释的噬菌体来完成微淘选。噬菌体的最理想的单一浓度是最有可能揭示微淘选得分的最宽的范围(从0到4+)的那一浓度，这样使得在测验的克隆中间有最大的差别。它是基于所选择的6个随机选择的克隆的微淘选行为，其中的得分是由系列稀释获得的每噬菌体浓度确定的。在与抗体一起培养之后，未结合的噬菌体被洗掉，同时结合噬菌体的量用作为抗体的噬菌体插入物的亲和性的指示。结合噬菌体的量是由温和的酸洗脱随后中和并以大肠杆菌感染确定的。通过将该微生物涂布在含四环素的琼脂平板上，然后确定每克隆达到的菌落密度，对感染的大肠杆菌的数量进行定量。
(iii)噬菌体-俘获ELISA
进行噬菌体-俘获ELISA试验是为了提供一种中间的水平测定来为比较低的严格微淘选测定和高的严格噬菌体-或者是肽-ELISA测定之间的间隙搭桥。初步的研究显示通过微淘选(但是没有通过噬菌体-ELISA或者是肽-ELISA)一些抗体制剂给出太多阳性克隆。以下所描述的噬菌体-ELISA的限制是只有P-III的五个拷贝位于每个噬菌体中，并且即使是以大量噬菌体涂布在孔上，插入物的极少拷贝被代表，并且检测需要抗体有对插入物十分高的亲和性。通过噬菌体-俘获ELISA，信号扩增许多倍从而有利于低亲和性的检测以及所说抗体与插入物之间的稳定的相互作用。
噬菌体-俘获ELISA包括下列步骤。将微量滴定孔涂布上aPL抗体和如在微淘选测定添加噬菌体克隆。未结合噬菌体被洗掉，利用结合噬菌体的大多数外壳蛋白的酶-缀合山羊抗抗血清来量化结合噬菌体的量。用噬菌体-俘获ELISA筛选的噬菌体与许多aPL抗体反应，在随后进行的ELISA测定中提供强的信号。这一敏感的中间水平使得肽合成更为有效率，因为极少微淘选-阳性噬菌体是噬菌体-俘获ELISA阳性的。结果是，从阳性的噬菌体-俘获ELISA噬菌体合成的肽一般是免疫反应性的。
(iv)噬菌体-ELISA
这种选择噬菌体的方法要求插入物十分紧地结合筛选的抗体。将噬菌体直接涂布在筛选在微滴板的孔上，与筛选的抗体一起培养。随后洗掉未结合的抗体，添加抗-人类IgG碱性磷酸酶缀合物以结合任何结合到噬菌体上的aPL抗体。按照本领域已知的方法通过在孔中加入比色底物使其与碱性磷酸酶反应来检测APL抗体。
(v)菌落印迹
该测定方法使得可以大规模地菌落筛选由生物淘选噬菌体感染的大肠杆菌。这一方法可替代噬菌体-ELISA来鉴别免疫反应的克隆，并且显示出敏感性上可比较的水平，而不需要在试验前单独的噬菌体克隆的培养。在这种测定中，将受到来源于一轮生物淘选的噬菌体感染的大肠杆菌扩散在一个大直径的硝酸纤维素(NC)膜上并且在含四环素的琼脂平面的表面上隔夜培养(Barbs等(1991)美国科学院学报USA 88：7978-7982)。每个菌落从经含有同一的序列的噬菌体感染产生。用这种NC“master”在NC上制出若干复制转移印迹并允许在琼脂平面的表面上生长。在菌落印迹上的噬菌体感染的菌落的化学和酶促破坏后，可以用一般用于Western印迹法的技术检测噬菌体，即，用染色或者是免疫印迹。被封阻的印迹可与筛选aPL抗体一起培养。在洗掉未结合的抗体后，添加抗-人类IgG辣根过氧物酶缀合物以结合结合到噬菌体上的任何aPL抗体。添加比色底物使得人们可以定位在主平板中的离散的菌落，该菌落代表可被克隆来供进一步研究的特异性免疫噬菌体。
(vi)肽-ELISA
随后的DNA测序用来确定以上描述的测定方法中最佳-反应的噬菌体的肽插入物序列，用本领域已知的标准的Fmoc肽化学制造相应的的肽。对于肽-ELISA测定，肽可以制造出来，例如，如出现分支四价分子，即，每个分子有插入物的四个拷贝。这样一种分子能涂布在微滴板的孔上，并且仍然使表位向溶液暴露允许由抗体结合。通过渗入赖氨酸作为头两个连接的支点合成四价肽，此类似于用于多抗原肽类(MAPS)的方法(Posnett等(1988)生物化学杂志263：1719-1725)。将由甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸组成的间隔添加在赖氨酸之后的每个臂上，然后添加插入物(包括在噬菌体中所发现的框架氨基酸，在羧基末端的脯氨酸-甘氨酸，和在氨基末端的丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸)。利用标准的Fmoc方法将所有在这种合成中的氨基酸一次加入一个。
这些肽由ELISA测定，即通过把这些肽涂布在微量滴定的孔上，然后以一种标准的ELISA方式用aPL抗体测定它们的反应。实际上，肽通常很强地结合在原来的筛选抗体上，同时显示与其它aPL抗体的一些交叉反应。包括非aPL抗体的对照以除去非特异性结合肽类。
(vii)竞争性结合肽-ELISA
一旦ELISA-阳性肽类得到鉴别，就有必要量化它们相应的对aPL抗体的结合亲和性，同时通过肽-竞争ELISA测定确定是否两肽结合给定的病人血清中抗体的相同的群。在这种测定中，各种单节肽与涂布上在微滴板上的四价肽竞争。为完成测定，利用标准的Fmoc化学将要评价的肽作为单体合成，即，在四价肽的合成中没有用赖氨酸分支。然后将单节肽纯化，并且在已知浓度中溶解。在微滴板的孔中涂布上已知结合到aPL抗体的四价肽。系列稀释的单节肽与恒定量稀释的aPL抗体一起温育。aPL抗体的稀释度预先经滴定四价肽并且在滴定率曲线的下斜部分上选择稀释度来确定。在温育抗体和单节肽一小时后，将抗体/肽溶液添加到微量滴定孔并进行标准的比色ELISA。减少aPL与四价肽结合的每个单节肽的浓度通过画每个孔的比色读数的散点图来测定。50％的抑制点用作为测量对单节肽的结合的相对的强度。
这一测定方法的一个变化是利用涂布上人类β2-糖蛋白I/心磷脂(β2-GPI/CL)(而不是四价肽)的微滴板，并检验单节肽封阻aPL抗体结合到在β2-GPI CL上的表位上的能力。在这种测定中，在优化浓度中耗尽IgG的人类血清用作β2-GPI的来源。用类似于用四价肽作为平板底物的测定的方式将单节肽在若干浓度下与优化浓度的aPL一起温育。在aPL/肽(β2-GPI/CL)上温育后，抗体结合和50％抑制所需的肽浓度以如在四价测定中的半最大吸收率确定。
(viii)以取代和缺失合成评价氨基酸对结合的贡献
耐受诱导所需表位应该尽可能与许多aPL抗体有强的相互作用并且不包含任何不必要的残基。为了推导一个表位的最小构造，制造了每肽的类似物：(i)缺乏所给定的残基的，例如，除去在羧基和/或氨基末端的框架残基，或者(ii)其中的氨基酸的取代已进行的而又不同于在表位文库筛中发现的序列。这些氨基酸取代物也可以天然的，例如，亮氨酸的异亮氨酸，或者是非自然的，例如，脯氨酸的α-甲基脯氨酸。这些缺失和/或者是取代的效果然后由肽-竞争ELISA测定。
(ix)通过β2-GPI第5域的诱变分组aPL血清特性
作为一般有效的耐受原，它必须结合在大多数患者中的aPL抗体的主要部分。确定来自不同的患者的几个抗体是否结合(如其他人提出含有靶表位的)β2-GPI的84个氨基酸第5域的相同残基是重要的。如果几个抗体结合相同残基，则可以构建来源于肽结构数据中衍生的模拟表位，它将与所有抗体进行反应。在另一方面，如果抗体结合不同的残基，则每个抗体需要单一耐受原。进行定点诱变来鉴别涉及aPL抗体结合的关键残基是否存在于β2-GPI的第5域中。试验形成的突变β2-GPI与几个aPL抗体的反应性。结果是不确定的。包含β2-GPI的第5域的融合蛋白质和glutathionineS转移酶从A-Steinkasserer中获得并在大肠杆菌中表达(Steinkasserer等(1992)FEBS Lett.313：193-197)。在ACA ELISA中天然的β2-GPI成功地被这一融合蛋白替代。用标准的定点诱变来进行氨基酸的取代。I.合成的aPL表位的分离
来自具有151 GPL得分(高滴度)并有周期性中风史、流产、狼疮、和三大血管瓣替代的患者的抗体ACA-6501在心磷脂脂质体上进行免疫亲和纯化。该抗体用于四个分开的噬菌体文库筛选，利用xy、xyz、xy｀z和特殊的pro/cys-结合的7-mer文库，在以前筛选的基础上，将精氨酸在第七个位置固定。如表1所示，在微淘选的噬菌体中(从试验的140个中)得到了36种序列。这些显得十分同源，同时在位置6和7的保守DR残基非常明显。共有的序列是CLLLAPDRC。尽管有这样的同源性，但只有7个噬菌体(见表2)在噬菌体-ELISA比色检验之后为阳性。用亲和纯化的ACA-6626(来自有高滴度，但是比ACA-6501的低的病人)筛选xy｀z噬菌体产生出五种经噬菌体-ELISA测验的单一序列。没有一种是颜色阳性的，但是当用化学发光底物进行ELISA免疫缀合时，两个是阳性。与ACA-6626联系的序列基序显出相联系但是不同于用ACA-6501看到的(见表3)。两个抗体优选在开放的前结合序列上的Cys-结合(可能是环化的和受约束的)表位。
表 1
ACA-6501噬菌体文库序列克隆 序列 克隆 序列xy文库2101 CNILVLDRCxyz文库5A12 CLILAPDRC 3C10 CILLAKNRC2D7 CLLLAPDRC 3C5 CIVLVPDRC3B6 CLVLALDRC 2F4 CLVIALDRC3E4 CLFVALDRC 5B1 CWFRSQSSC3E7 CILLAHDRC 3Ell CSPILRGNC2H1 CIILAPGRC 3E8 CHKFFWLTCxy｀z文库2A10 CTILAPDRC 2D12 CLVLAADRC2G12 CLLITPDRC 3B10 CLLLAPDRC2G11 CLLITHDRC 3F2 CFFHFDHSC2F10 ChTILVLDRC 2D3 CPLHTHHTC2E3 CPLITHDRC常规(X)6R文库G11 CTILTPDRC 1A4 CNLLALDRC2H5 CTILTPDRC 2H6 ChTLLAIDRC2H2 CTILTLDRC 1C3 CLLLAIDRC2H10 CTLLTPDRC 1D10 CTIITQDRC2E10 CIQLTPDRC 2H4 CNIITRDRC1B7 CHLLTPDRC 2G12 CILHAAHRC2H1 CLILTPDRC 1A9 CSSKSYWRC2H12 CSILAPDRC
表 2
ACA-6501比色ELISA-阳性噬菌体克隆 序列 克隆 序列5A12 CLILAPDRC 3B6 CLVLALDRC2H1 CLILTPDRC 2G11 CTILTPDRC3B10 CLLLAPDRC*3E7 CILLAHDRC2H2 CTILTLDRC*对应于共有或平均序列
表 3
ACA-6626 xy｀z噬菌体文库序列克隆 序列 克隆 序列4B11 CGNAADARC 4G7 CTNLTDSRC4D3 CTNWADPRC 4A2 CGNPTDVRC4C7 CGNIADPRC
根据本文描述的方法ACA-6644是另一个用于筛选混合的p-III噬菌体文库的高-滴定aPL抗体。发现了以下序列：
ACA 6644/CBc GILLNEFA
ACA 6644/CBd GILTIDNL
ACA 6644/CBf GILALDYV
这些序列都来自组分“z”表位文库，其在N-末端缺乏噬菌体框架残基。当作为肽合成时，这些序列与几种ACA血清(包括ACA-6644和ACA-6501)发生免疫反应。分析揭示了与以前用ACA-6501获得的序列的出乎意料的同源性，如表4所示。
表 4
ACA-6644/CBd GILTIDNL
ACA6501/2H2 CTILTLDRC
ACA-6644/CBf GILALDYV
ACA-6501/2F10 CNILVLDRC
ACA-6644/CBc GILLNEFA
ACA-6501/1D10 CTIITTODRC
来源于由这两种aPL抗体筛选的两个十分不同的源文库的趋同序列的同源性表明这些序列可以模仿天然靶抗原中的主要的(可能是免疫决定簇)区域。
用ACA-6701对P-III文库的筛选产生出有高度的内部同源性的两种单一序列，但是不同于以前以其它aPL抗体获得的其它序列。序列如下所示：
ACA-6701/3B1LSDPGYVRNIFH
ACA-6701/3E1LTDPRYTRDISNFTD
作为树脂-结合肽类，该序列是与亲本血清(ACA-6701)强免疫反应性的，但是与其它aPL抗体有最小的交叉-反应。
用亲和纯化的ACA抗体对随机的pIII噬菌体文库继续的筛选发现了一种肽，针对该肽最初的试验，其对所有九种亲和纯化的ACA抗体显示出明显交叉反应。尔后的检验测定了这种肽，具有AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)的ACA-6641/3G3是以前发现发现的任何肽中的交叉-反应最高的。当针对65种高滴度ACA抗血清的进行试验时，6641/3G3(LJP 688)或者是其截短的形式与这些血清的93.8％高交叉-反应，3.1％中度交叉-反应，无交叉反应占3.1％。对这肽进行化学优化是截短，系统的氨基酸取代，和非二硫化物环化研究所追求的。
从随机噬菌体文库筛选中选择的几个肽的基序如下：
ACA抗体 噬菌体插入物序列
6501 CLLLAPDRC (3B10)
6626 CTNWADPRC
6641 CLGVLGKLC (3G3)
6644 GILALDYV
6701 LTDPRYTRDISNFTD
6707 CAHPDWDRCJ.aPL-有关的肽与亲和纯化的IgG aPL抗体的免疫反应
在最近开发的用于组合合成肽文库的固相支持物上合成从亲和纯化的ACA-6501获得的并发现是呈噬菌体-ELISA阳性的噬菌体序列。这种支持物是一种Rapp树脂，有高的肽密度并在第一个氨基酸偶联前用亲水聚乙二醇隔离。该合成产生树脂-结合的肽，该肽用于抗体结合研究十分合适。如图2所示，肽5A12(序列CLILAPDRC)明显地优于一种无关的对照肽，但不显著地结合正常的IgG。测验其它的噬菌体-ELISA-阳性肽类获得了类似结果。在实验中显示，通过免疫结合显色反应检测到树脂-结合亲和纯化的aPL抗体。K.aPL血清抗体与合成的肽的反应性
利用血清树脂-结合肽类能免疫特异性地结合aPL的发现显著提高了测验aPL抗体的能力。如图3所显示的，来自ACA-6626筛选的肽结合aPL抗血清但是没有显示正常血清显著的结合。图3也说明了ACA6501-5A12肽对aPL血清的特异性免疫-结合行为。数据中正常血清的结合肽5A12是零而没有显示。L.合成肽对不是文库筛选抗体来源的aPL抗血清的交叉反应
选择两个肽用于aPL血清测定，一个(5A12)代表ACA-6501筛选而另一个(4D3)代表ACA-6626筛选。如图4和5中所示，其中的每个肽都对筛选抗体的亲本血清优先作出反应。然而明显程度的交叉反应特别是在ACA-6501和ACA-6626之间是可检测的。以5A12树脂-结合肽对19个患者血清(低或没有GPL得分)和13个病理血清(GPL得分从低到高)的研究表明13个病理样品中的8个有可检测的肽结合而19个对照样品显出低的肽结合。这些结合证明合成的肽在中风病人护理中对诊断或者是预诊的测定来说是有用的。
如在上述第一部分指明的，对一个合成肽，6641/3G3针对几个高滴度的ACA抗血清进行测定。发现这种肽与测验的大多数ACA抗血清有交叉反应(如图14中所说明的).在1.8mg/mL完全抑制(＞80％)下6641/3G3显示出与10种ACA抗体中的10个的剂量-依赖性交叉-反应，并如下表5所示对ACA抗体有特异性。
表 5
对AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)的交叉反应数据
带有心磷脂的ACA血清/β2-GPI-涂布的平板
ACA血清Nr IC50，mg/ml，对肽LJP688
[1]6501RS RFL 10.89，1.1
[2]6626 RS 1.09
[3]6635 RS 1
[4]6638 RS 0.81
[5]6641 RS 0.89，0.51
[6]6644 RS 0.76
[7]6701 RS 1.07
[8]6903 RS 0.8
[9]7004 RFL 0.67
[10]7005 RFL 0.75
平均数±标准差 0.86±0.16
RS＝周期性中风
RFL＝习惯性流产M.新的合成肽方法
经aPL文库筛选的新的侯选序列的鉴别需要试验新合成的肽对抗体的结合。用已知的肽取代的Rapp树脂，用放射性标记的aPLIgG可以实行定量的结合研究(如饱和结合分析和平均测量)。
肽合成使得可以通过选择性合成对模拟表位进行分子详细分析。这包括以增强抗体结合为目标修饰沿链的每个氨基酸。选择性合成揭示在序列中每个氨基酸的相对重要性。如果必要，可以设计在特殊残基位置的选择性的取代以便保持B细胞反应而废除在T细胞测验中发现的任何T细胞增殖反应。
对肽6641/3G3(LJP)进行一些分析。分析包括在N-末端和C-末端切短，二硫化物取代，对在位置2到8的氨基酸丙氨酸和甘氨酸的取代，在2、4、5和8位置上的分支脂族氨基酸的取代，影响肽的构造的氨基酸的取代(包括α-甲基氨基酸的取代)，位置7上碱性氨基酸的取代，位置2-9上D-氨基酸的取代，以及在1到9位置上N-α-甲基氨基酸的取代。这些结果如表8所示。这些取代与切断的结构/活性的关系如表6所示。
表6肽3G3的优化
总肽 1ulIV26.96 用ACA 6501位置编号 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B 150.ua/mL gtd截短分析
1 A G P C L G V L G K L C P G 850
2 G P C L G V L G K L C P G 180
3 P C L G V L G K L C P G 420
4 C L G V L G K L C P G 460
5 A G P C L G V L G K L C G 450
6 C L G V L G K L C 10 #906(LJP690)二硫化物取代
1 C L G V L G K L C 110 #952＝100
2 Hc L G V L G K L C 46
3 C L G V L G K L Hc 92
4 Hc L G V L G K L Hc 80Ala扫描
1 C A G V L G K L C 200 #952＝80
2 C L A V L G K L C 170
3 C L G A L G K L C 260
4 C L G V A G K L C lnf.
5 C L G V L A K L C 40
6 C L G V L G A L C lnf.
7 C L G V L G K A C 360Gly扫描
1 C G G V L G K L C 310 #952＝120
2 C L G G L G K L C lnf.
3 C L G V G G K L C lnf.
4 C L G V L G G L C lnf.
5 C L G V L G K G C 500
分支脂族氨基酸序列优化
1 C I G V L G K L C 60 #910＝40
2 C V G V L G K L C 130
3 C M G V L G K L C
4 C Cy G V L G K L C
5 C tL G V L G K L C
6 C mL G V L G K L C
7 C Iv G V L G K L C
8 C L G L L G K L C
9 C L G I L G K L C
10 C L G M L G K L C
11 C L G Cy L G K L C
12 C L G tL L G K L C
13 C L G mL L G K L C
14 C L G Iv L G K L C
15 C L G V I G K L C
16 C L G V V G K L C
17 C L G V M G K L C
18 C L G V Cy G K L C
19 C L G V Lt G K L C
20 C L G V mL G K L C
21 C L G V Iv G K L C
22 C L G V L G K I C
23 C L G V L G K V C
24 C L G V L G K M C
25 C L G V L G K Cy C
26 C L G V L G K tL C
27 C L G V L G K mL C
28 C L G V L G K Iv C
构象扫描氨基酸
1 C L P V L G K L C
2 C L mP V L G K L C
3 C L mA V L G K L C
4 C L cG V L G K L C
5 C L G V L P K L C
6 C L G V L mP K L C
7 C L G V L mA K L C
8 C L G V L cG K L C
9 C L dA V L G K L C
10 C L G V L dA K L C
11 C P G V L G K L C 160 #952＝100
12 C L P V L G K L C 340 (Pro scan)
13 C L G P L G K L C 180
14 C L G V P G K L C lnf.
15 C L G V L P K L C 350
16 C L G V L G P L C 160
17 C L G V L G K P C 550
18 C pG G V L G K L C 130 #910＝40
19 C L pG V L G K L C 70
20 C L G pG L G K L C 70
21 C L G V pG G K L C 35
22 C L G V Lp G K L C 30 #910＝6
23 C L G V L G pG L C 230
24 C L G V L G K pG C 80α Me AA 25 C alB G V L G K L C 370 910＝40
26 C L alB V L G K L C 80
27 C L G alB L G K L C 110
28 C L G V alB G K L C lnf.
29 C L G V L alB K L C 110
30 C L G V L G alB L C 450
31 C L G V L G K alB C ＞470
碱性氨基酸
1 C L G V L G R L C 160 #952＝120
2 C L G V L G Or L C 40 910＝643
3 C L G V L G mK L C
D氨基酸(小写字母d) 1 dp C L G V L G K L C 120 #952＝100 2 C dL G V L G K L C 180 #952＝30 3 C L G dV L G K L C 260 #952＝30 4 C L G V dL G K L C 230 #952＝30 5 C L G V L G dK L C 170 #952＝60 6 C L G V L G K dL C 140 #962＝36 7 C dL G dV L G K L C 8 C dV G dV L G K L C 9 C dL G dL L G K L C10 C L G dV dL G K L C 50 #952＝3011 C L G dL dV G K L C12 C L G dV dV G K L C13 C L G dL dL G K L C14 C L G V dL G dK L C15 C L G V dK G dL L C16 C L G V dL G dL L C17 C L G V dK G dK L C18 C L G V L G dK dL C 150 #952＝6019 C L G V L G dL dK C20 C L G V L G dK dK C21 C L G V L G dL dL C22 C L G V L dA K L C 140 #952＝30
C L G V L G K L dC 140 #952＝60
氨基酸(nAA)1 nC L G V L G K L C2 3 C Ln G V L G K L C 70 #952＝604 C L G nV L G K L C 2205 C L G V nL G K L C 1806 C L G V L nG K L C 5507 C L G V L G nK L C8 C L G V L G K nL C 240 #952＝669 C L G V L G K L nC
其它1 C L G V L G K L C ATU-Y 300 #952＝602 Y ATU C L G V L G K L C 1703 C L G V L G K L C TGR re 5004 C L G V L G K L dC TGR re 6205 dC L G V L G K L C6 dC L G V L G K L dC TGR 树脂硫醚： 单一缺失1 Hc L G V L A K L C2 Hc G V L A K L C3 Hc L V L A K L C4 Hc L G L A K L C5 Hc L G V A K L C6 Hc L G V L K L C7 Hc L G V L A L C8 Hc L G V L A K C
缩小化1 Hc V L A K L C2 Hc L A K L C3 Hc L A K C
分支的1 Hc L G V L G K L Pe2 Hc L G V L G K L dPe3 Pe L G V L G K L Hc4 dpe L G V L G K L Hc5 dPe L G V L G K L dPe
D氨基酸1 dHc L G V L G K L C2 dHc L G V L G K L dC3 Hc L G V L G K L dC去氨基
1 By L G V L G K L Hc 去氨基HHTE
2 By L G V L G K L C 去氨基HCTE
3 Pp L G V L G K L Hc 去氨基CHTE
4 Pp L G V L G K L C 去氨基CCTE缩写
Hc 高半胱氨酸
Cy 环己基丙氨酸
tL 三级亮氨酸
mL α-甲基亮氨酸？
tv α甲基，α氨基丁酸？
mP α-甲基脯氨酸
mA α-甲基丙氨酸
aB 氨基异丁酸
pG 苯基甘氨酸
cG 环丙基甘氨酸
dA D丙氨酸
dP D脯氨酸
dL D亮氨酸
dV D缬氨酸
dK D赖氨酸
nC N-α-甲基半胱氨酸
nL N-α-甲基亮氨酸
nG N-甲基甘氨酸
IV N-α-甲基缬氨酸
IK N-α-甲基赖氨酸
mK N-ε-甲基赖氨酸
Pe 青霉胺
By 丁酰基
Pp 丙酰基
Or 乌氨酸
表 7
交叉反应的ACA表位的结构活性关系
结构 相对活性
AGPCLGVLGKLCPG(3G3)(LJP 688) 100
CLGVLGKLC(LJP 690) 3.5
CLGVLAKLC 1.8
CLGVLpGKLC 1.4
CLGdVdLGKLC 5.9
HcLGVLGKLC(硫醚) 1.6
SLGVLGKLS ∞
CLGVAGKLC ∞
CLGVLGALC ∞N.用α-甲基氨基酸取代提高肽的免疫活性并赋与基对蛋白酶攻击的抗性
脯氨酸残基有一种特殊的重要性，这是因为它们对多肽的链构造的影响。它们经常出现在球状蛋白的表面上的转折处。在本发明的噬菌体表位文库中，所有随机肽插入物侧翼于边界脯氨酸。此外，所发现的具有ACA-6501的大多数模拟表位有第三个脯氨酸，这是基于计算机的预测，很有可能作为β-转折的部分存在。β-转折模拟物能用来提高在小肽中转折构象的稳定性。这样的模拟物是(S)-α-甲基脯氨酸(α-MePro)，脯氨酸类似物，除此之外能稳定转折构象，赋予其对蛋白酶降解的抗性。蛋白酶抗性对于所设计的在血浆中作用的潜在的药物是一种理想的性质。肽ACA-6501/3B10 AGPCLLLAPDRCPG(粗体部分为插入物)是一种共有肽。基于与其他35个同源序列的比较，它具有的序列特性是在每个位置有最有优势的残基。由于其代表性特征，对其序列进行一些系统的修饰和缺失，因此它的活性通过aPL抗体结合来评价。在最重要的发现中脯氨酸在3和9位置这一发现对活性来说是重要的。脯氨酸来自噬菌体框架而不是随机插入物的一部分。最明显的影响是通过由MePro在9位置取代脯氨酸获得的。这个取代导致在免疫活性上6倍的提高。
在肽6641/3G3上进行的α-甲基和N-α-甲基氨基酸的取代研究的结果如上表6中所示。M.环硫醚类似物的制备
用本发明的方法所鉴别的拟环硫醚能进一步修饰使其含有硫醚取代物。环二硫化物类似物和环硫醚类似物的修饰将延长类似物缀合物的半寿期，因此，需要一个更低的剂量。环硫醚类似物也消除了二硫键交换问题，这种交换经常随环二硫化物多肽发生。此外，环硫醚类似物也可以参与对T细胞进行的MHC II类呈递，这样，有利于无反应性的诱导。最后，环硫醚类似物在用于效价平台分子缀合物的产生的硫依赖性结合反应中有用。
根据在共有共同未决的专利申请(代理人摘要号252312006600)中描述的方法，其制备了四种环硫醚类似物，在本文中全部一并参考。利用RinkTM酰胺4-甲基苯氢氨基树脂或者是MBHA树脂制备6641/3G3的全长度肽类似物，并将其转化成氯-肽，从固相载体中切除，然后环化该类似物。详见以下硫醚反应方案。
适合的环硫醚类似物包括以下显示的类似物。环硫醚反应方案1另外，硫醚类似物也可根据以下反应方案制备。
环硫醚反应方案2下列类似物代表环硫醚反应方案2所制造的类似物。
例证性的环硫醚类似物就针对ACA的抗体ACA 6501和ACA 6701测定其活性。结果如下表7所示。
表 7
IC50值(μg/0.1mL)
硫醚 ACA6501 ACA6701
CCTE，LJP 698 11.0 5.0
HCTE，LJP 699 4.6 3.0
CHTE，LJP 702 9.2 3.2
HHTE，LJP 703 8.0 3.6
LJP690 10.0 4.0
CTE A 0.08
CTE B 0.5
CTE C 0.9
CTE D 3.2
CTE E 6.3
HCTE类似物LJP 699，优于参考肽LJP 690，其是LJP688的截短的形式CLGVLGKLC，LJP 688的，AGPCLGVLGKLCPG。
本文引用的所有文章、专利和专利申请全部一并参考。下列实施例进一步说明本发明和它的独特性。这些实施例无意以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1：血清6501中抗心磷脂抗体(ACA)的测定
以每孔30μL乙醇中的50μg心磷脂(西格马化学公司，圣路易斯，MO)涂布在Immulon I微滴板(Dynatech实验室，Inc.，Chantilly，VA)的偶数孔中。将平板在4℃下干燥一夜，并在室温(RT)下在磷酸盐-缓冲盐水(ABS/PBS)中以200μL 10％的成年牛血清(Irvine科学公司，Santa Ana，CA)封阻2小时。在加入10μL aPL标准和试验血清ACA-6501之前，将平板以Tris-缓冲盐水(TBS)洗涤5次。根据制造厂商的说明重建该aPL标准(APL诊断公司，Louisville，KY)，并用10％ABS-PBS将其稀释至1∶50。将试验血清ACA-6501用10％的ABS-PBS连续稀释(从1∶50到1∶2,000)，将其加到选择的重复的孔中并在室温下温育2小时。将平板用TBS和100μL的1∶1,000的山羊-抗人类-IgG/碱性磷酸酶缀合物(Zymed，南旧金山，CA，Cat.62,8422号)洗涤5次，加入10％ABS-PBS并在室温下温育1小时。将平板用TBS再洗涤5次并通过添加100μL酚酞脱氧次黄苷酸(PPMP)底物溶液(西格马，Cat.P-5758号)进行测定，该溶液是从0.13M PPMP和7.8M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇的储备溶液制备的(在用去离子水稀释到1∶26之后，用HCl将其pH值调到10.15)。在大约30分钟之后，在每孔中加入50μL的0.2M双碱价磷酸钠(Mallinckrodt，分析试剂)来终止反应。在微型板自读仪(Bio-Tek仪器，Winooski，VT，EL311型)中在550nm处读其光密度。从偶数孔的光密度中减去奇数对照孔(空白，没有心磷脂(CL))的光密度。用Graph Pad Prizm软件μgraph Pad软件公司，圣地亚哥，CA)将aPL标准的吸收率读数制成散点图以形成GPL(IgG磷脂)标准曲线。依据GPL标准曲线用稀释的6501试验血清吸收率读数来计算GPL得分。实施例2：从血清6501纯化抗心磷脂抗体(ACA)
在25ml园底烧瓶(Kontes Scientific Co.，Vineland，N.J.)中，用Rotavap(Buchi，Switzerland)将1.2ml抗心磷脂(西格玛化学公司，圣路易斯，MO，#C-1649)，0.464ml胆固醇(西格玛Diag.，圣路易斯，MO.，#965-25)，0.088ml 5mg三十二烷磷酸盐(西格玛化学公司，圣路易斯，MO，D-2631/ml氯仿的混合物干燥约5分钟。在除去溶剂后，添加2ml0.96％(wt./vol.)的NaCl(J.T.Baker，Inc..Phillipsburg，NJ)Baker分析试剂)，并在Vortex Genie Mixer(科学工业，公司，Bohemia，NY)中混合1分钟。于37℃将脂质体悬液温育1小时。同时，于8℃下在Sorvall RT 6000离心机(杜邦公司.Wilmington，DE)中在600×g下离心血清6501 10分钟。将4ml上清液置于具有1ml制备的脂质体悬液的25ml园底烧瓶中，于4℃在搅拌下以中等速度在有轨摇床Tektator V(Scientfic Products，McGraw Park，IL)上温育混合物48小时，在37℃温育另外的2小时。加入20ml冷的TBS，将混合物转移到50ml聚碳酸酯离心管(Nalge Co.，Rochester，NY)中，于4℃在27,000×g下离心15分钟(在SS-34回转装置中的RC3离心机(Sorvall-Dupont，Wilmington，DE)中)。用RC3离心机以25ml冷的0.96％NaCl洗涤沉淀3次。将沉淀溶解在1ml 2％(wt/vol)在TBS中的n-辛基-β-D-葡糖吡喃糖苷(Calbiochem，LJolla，CA)的溶液中，用于0.6ml蛋白质A/交联琼脂糖(Repligen公司.Cambridge.MA)柱，该柱已以15倍柱床体积的1M乙酸预洗涤过，并用15倍柱床体积TBS平衡过。用40倍柱床体积的2％辛基葡糖吡喃糖苷洗涤抗体-蛋白质A/琼脂糖柱，以除去脂质，接着用TBS充分洗涤，直到洗脱物在280nm的光密度达到基线。结合的抗体用1M乙酸洗脱。收集1ml组分，每一组分立即用0.34ml 3M Tris(Bio-Rad，电泳级试剂)中和，并保持在冰浴上。在分光光度计(Hewlett-Packard，8452A Diode Array分光光度计，Pale Alto，CA)中在280nm测定各组分的光密度。合并含有抗体的组分，按制造者的方案在Centricon-30浓缩器(Amicon Division，W.R.Grace&Co.，Beverly，MA)中浓缩和用TBS洗涤4次。
通过读取浓缩试样在280nm的光密度确定从4ml血清6501产生纯化的抗体的最终产率，其中1mg＝1.34 OD280。所获得的平均产率是从4ml血清6501得到750μg抗体。用纯化的抗体试验ACA活性，并由LaemmliSDS-PAGE检查纯度。实施例3：构建D-IIT文库载体制剂
fUSE 5(Scott，J.K.和G.Smith，同上)用作构建p-III文库的载体，将Holmes，D.S.和M.Quigley(1981)，Ana/.Biochenl.144：193的修改的方法用于产生双链重复形式(RF)。简言之，在剧烈振荡下，于37℃在含有20毫克/ml四环素的2YT培养基(Difco Labs，Am Arbor，MI)中培养大肠杆菌K802(具有fUSE 5)的800ml培养物18小时。通过离心收集细胞，并重悬于75ml STET中。STET由在50mM Tris/HCl pH8.0中的8％蔗糖，50mM EDTA组成，并含有0.5％Triton X-100。将在STET中的10mg/mL溶菌酶添加到最终浓度或1mg/mL。在RT下1分钟后，将三个等分样置于沸水浴(偶尔振荡)中3.5分钟。在18000×g下离心粘性浆状物30分钟，将等体积的异丙醇添加到上清液中。将溶液冷却至-20℃，通过离心收集核酸。通过Sambrook等，分子克隆：实验室手册(冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，第二版，1989)的描述从CsC1梯度分离RF。制备随机插入物随机插入物
通过Cwirl等1990，美国科学院学报，87：6378-6382描述的＂缺口双螺旋＂法产生用于插入的DNA。在这一方法中，中间含有简并区的寡核苷酸被寡核苷酸各端的短的恒定区包围。使两个较短的互补的寡核苷酸退火以形成＂缺口双螺旋＂，其具有互补于由用于消化载体的限制性内切核酸酶产生的粘性末端的突出端。在这种情况下，较长的简并寡核苷酸具有序列：5′GGGCTGGACCC(NNK)xCCGGGGGCTGCTG 3′，其中N＝A或C或G或T，K＝G或T，x是在随机区中密码子的数量。E piGS2被设计成简并寡核苷酸的5’末端的碱基对，具有序列5′GGGTCCAGCCCCGT 3′。类似地EpiGS3被设计成退火到简并寡核苷酸的3′末端，具有序列5′CAGCCCCCGG 3′。当正确退火时，三种寡核苷酸形成＂缺口双螺旋＂，其在插入到用Sfil消化的fUSE 5中时，恢复具有接近5’末端的随机插入物的p-III读框。
以上所描述的寡核苷酸是从聚丙烯酰胺凝胶切下制备的。1 nanomole的EpiGS2、EpiGS3和50 picomole的简并寡核苷酸分别在66微升体积中用激酶处理。然后合并三种寡核苷酸添加50mM NaCl。将混合物加热至65℃ 5分钟，其后缓慢冷却至RT。将退火的寡核苷酸在冰上冷却，直接用于与5fUSE的连接反应。连接反应物由10毫克fUSE 5 DNA(用Sfil消化完全)、30μL＂缺口双螺旋＂溶液和1000U T4连接酶组成(在450微升总体积中)。于16℃温育连接物18小时。然后用苯酚-三氯甲烷提取混合物，用乙醇沉淀，将沉淀溶解在20μL水中。产生如扩增文库
经电穿孔(Dower等，(1988)核酸的研究，16：6127-6145)将连接DNA引入大肠杆菌中。将冷冻的电组分(electrocompetent)MC1061细胞(0.1ml)在冷的2mM透明小容器中与连接的DNA混合，用BTX电穿孔装置(BTX公司，San Diego，CA)施加2.5kV 5.2mS脉冲。紧接着脉冲之后，加入1mLSO(一种细胞生长培养基(参见Dower等，同上)。进行5种不同的电穿孔，收集并在37℃培养1小时。此时，移走样品并稀释，以测定产生的克隆的总数量。用含有20毫克/毫升四环素的1升2YT(1.6％蛋白胨，140，1％22酵母膏，和0.5％NaCl，Difco，Ann Arbor，MI)稀释剩下的混合物，并于37℃在275rpm振荡下培养18小时。经2次PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并悬浮在包含0.02％叠氮化钠的1.2ml TBS中。将在269nm的吸收率估计颗粒数量。通过将稀释的噬菌体与10微升饥饿的大肠杆菌混合测定噬菌体的滴度。实施例4：筛选具有aPL抗体的p-III文库
于RT下在硅氧烷化的1.4ml离心聚丙烯管中，将亲和-纯化的ACA-6501(affACA-6501，10μg；7μL 11.44mg/mL贮存溶液)温育2小时，所述离心聚丙烯管含有合并的来源于x，y和z文库(epiXYZ)[分别11μL+8.5μL+2μL；总体积＝21.5μL，～1010个克隆]的噬菌体，具有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的最终体积为100μL的TBS(pH7.4F)。在这一温育期间，进行制备新鲜的饥饿大肠杆菌菌株K-91的最后步骤。将于37℃在250rpm振荡下在2YT培养基中新鲜生长约5小时的大肠杆菌悬液于RT用50ml聚丙烯管在1000×g下离心10分钟。将20ml 80mM NaCl添加到紧密的大肠杆菌沉淀上，并在100rpm下于37℃温育45分钟。在以上离心后，将饥饿的大肠杆菌沉淀悬浮在1ml 50mM磷酸铵/80mM NaCl中，以后用于噬菌体扩增。将蛋白质G-琼脂糖珠用TBSIBS洗涤2次，用TBS/0.5％Tween-20洗涤2次，以在TBS/Tween中的50％悬液贮存于4℃。
然后将200μL蛋白质G-琼脂糖珠悬液添加到ACA-6501/噬菌体混合物中，在RT下继续温育1小时。此时，急冷混合物，用冷的TBS/Tween洗涤3次，经在冷的房间离心收集沉淀。将洗涤过的珠转移到新的用TBS/BSA和TBS/Tween预洗涤的离心管中，以阻止非特异性粘附。在用TBS/Tween额外洗涤3小时后，通过在RT下搅动10分钟用300μL 0.2NHCl/甘氨酸，pH2.1洗脱具有结合的ACA-6501-产生噬菌体的珠。在16,000×g离心后，收集酸性洗脱物上清液，将另外的100μL洗脱液液添加到珠沉淀上，重复这一操作。10分钟后，收集(～400μL)后洗脱物的噬菌体(代表未扩增的第一轮噬菌体)，置于无菌的17×100mm聚丙烯细胞培养管中，向该管中添加50μL 0.5M NaCl，接着用2.5M Tris碱(通常～25-35μL)进行pH中和。立即加入等体积的饥饿的大肠杆菌悬液，然后在37℃在100rpm下培养10分钟。接着将混合物转移至250ml无菌培养瓶(含有具有20μg/mL四环素(Tet)的25ml 2YT)中，在37℃在250rpm下培养一夜。
为了分离从过夜培养物扩增的噬菌体，用聚碳酸酯试管在12,000×g下离心10分钟。弃去沉淀。在70℃加热在聚丙烯管中的上清液30分钟后，再次用聚碳酸酯管离心，保存上清液。向上清液中加入1/4体积的20％(w/v)聚乙二醇，分子量8000(PEG 8000)，以沉淀噬菌体。通过倒转100次混合溶液，然后在4℃下温育2小时。于4℃在35,000×g下离心30分钟后，将含有噬菌体的沉淀重悬于-0.5ml TBS/BS中，并转移至1.4ml离心管中。在16,000×g下在微量离心机中离心1分钟后，将上清液转移至清洁的试管中，标记第一轮扩增的噬菌体。
在第二、三和四轮生物淘选期间，在100微升终体积中将三轮的75μL扩增的噬菌体与7μL affACA-6501一起温育。对第五轮噬菌体，首先以1∶1000稀释affACA-6501，然后如其它轮所述处理。如第一轮所述进行所有其它的后续步骤。将生物淘选第五轮的噬菌体点滴(spot-titered)在2YT/Tet平板上，以测定噬菌体浓度。点滴扩增的噬菌体需要采用TBS/BSA或2YT培养基的1×106稀释度。对每一轮，在37℃下将1010μL稀释的噬菌40μL饥饿的大肠杆菌一起无振荡培养10分钟。在加入950μL2YT/稀释的Tet(0.2μg/mL)后，将混合物于37℃在250rpm振荡下培养30-45分钟，将10μL纯粹的和稀释(1∶10，1∶100和1∶1000)的噬菌体溶液试样点滴在2YT/dilute Tet上(采用含有20μg/mL Tet的琼脂板)。微淘选
用蛋白质G涂布Immulon 2型平板。用0.1M NaHCO3以10μg/mL制备蛋白质G，以每孔100μL添加到微滴板的孔中，于4℃温育一夜。在从平板弃去过量的蛋白质G溶液后，于RT在搅拌下在振动平台上用250-300μL 2YT封阻1小时。将Tris-缓冲的盐水(pH7.4/0.5％Tween20(TBS/Tween))与自动平板洗涤仪一起使用，以便用200μL洗涤每孔4次。100μL affACA-6501(或对照正常IgG)用2YT稀释成2.5μg/mL，将其添加到洗涤的孔中。在旋转平台上于室温温育接近1小时时，把平板转移至冷室回转装置(rotator)中。
待经微淘选试验的噬菌体经生物淘选从琼脂板产生。用无菌牙签将待试克隆转移至园底96孔微滴板(Coming，Coming，NY)的孔的不同的孔(含有250μL 2YT/Tet/孔)中，并在37℃培养一夜。克隆的命名基于筛选的抗体，来源的生物淘选轮次和克隆在过夜培养板上的位置，例如ACA-6501/3B10指这样一种克隆，其是通过ACA-6501，在第三轮中，从位于微滴板的命名为B10的孔分离的。在过夜培养后，采用微滴板夹持装置于RT在1300×g下离心噬菌体培养物10分钟。上清液构成＂纯粹的＂噬菌体的来源。
起始微淘选限制在6个克隆，这些克隆用以1∶10到1∶106的系数扩展的稀释度试验。从这些试点克隆产生的结果用于说明合适的单一稀释度(对各轮的源平板中的克隆其产生可分级的结果)。将代表培养的从生物淘选的第三、第四和第五轮随机选择的克隆的平板用2YT在微滴板中以每孔250μL的终体积从“纯粹的”溶液稀释成1∶100,000。将代表所需稀度的最后平板的100μL添加到含有蛋白质G-结合的ACA-6501和如上所述制备的正常IgG的平板上。在水平的回转装置上于4℃进行稀释噬菌体与aPL抗体或对照IgG的温育。在自动平板洗涤仪中用TBS/Tween洗涤9次后，用20μL 0.2N HCl-甘氨酸/0.1％BSA，pH 2.2洗脱IgG-结合的噬菌体。在RT下继续温育洗脱物10分钟，在此期间，制备每孔含有20μL新鲜饥饿大肠杆菌的新的Corning微滴板，并冷却。将140μL 29mM Tris添加到含有噬菌体洗脱物的平板上，以中和pH，接着从各孔将20μL噬菌体悬液转移到含有饥饿的大肠杆菌的平板的相应的孔中。在37℃培养10分钟后，加入200μL 2YT/dil Tet，在37℃进行另外的30分钟培养。用多段式吸移管将各孔的10μL点滴在大的2YT/Tet琼脂板，而保留原来的8×12孔格式和最后微滴板的方向。在使斑点干燥30分钟后，将平板在37℃温育。下一天，用从0到4+半定量计分菌落，0表示＜10个菌落s；+/-，10-20个；1+，20-50个；2+，50-70％汇合；3+，70-90％汇合；4+代表＞90％汇合的菌落。94个在1∶105稀释度[代表81个第三轮、6个第四轮、7个第五轮克隆]测定的克隆中，6个克隆具有0的微淘选得分，3个得分为1+，14个得分为2+，62个得分为3+，9个得分为4+。通过如以下所描述的G-跟踪DNA测序进行来源于代表生物淘选的第二到第五轮的平板的随机克隆的测定。结果显示第四轮生物淘选的序列差异戏剧性地下降(参见图8)，因此，第二平板用噬菌体在3×105稀释度微淘选，此时变化较早(第二)轮的克隆。试验总共94个克隆，包括在1×105稀释度具有高分的29个克隆[26个来源于第三轮，1个来源于第四轮，2个来源于第五轮]和以前已试验的第二轮的65个克隆。在1∶3×105稀释度试验的94个克隆中，26个得分为0，11个得分为+/-，10个得分为1+，13个得分为2+，34个得分为3+，0个得分为4+。G-跟踪DNA测序
从在37℃过夜培养的培养物中分离单链病毒DNA。为了制备培养物，用来源于以前生长的微滴板培养物的扩散平板的单个噬菌体接种2YT/Tet(以在试管中的2ml或者在微滴板园底孔中的250μL)。如Smith，G.P.和J.K.Scott，＂丝状真菌上显示的肽和蛋白质文库＂(1993)，酶学方法，217：228-257(有关试管中的培养物)中的描述以及Haas，S.J.和G.P.SmithG.P.，＂从丝状真菌噬菌体快速测序DNA＂(1993)生物技术，15：422-431(有关微滴板中的噬菌体)的描述，经20％PEG/2.5M NaCl沉淀培养物上清液和经苯酚-氯仿抽提或经碱性变性分离或释放病毒粒子DNA。如Smith和Scottt同上(有关试管培养物噬菌体DNA)的描述以及Haas和Smith，同上(有关微滴板上噬菌体DNA)的描述，用市售的测序试剂盒(U.S.Biochemical/Amersham，Arlington Heights，IL)实施Sanger等(Sanger等，＂用链终止抑制剂的DNA测序＂(1970)美国科学院学报，74：5463-5467)的双脱氧核苷酸链终止DNA测序技术。通过仅采用ddCTP终止混合物，7％聚丙烯酰胺/脲测序凝胶上电泳和将放射自显影显示后获得G跟踪或由单碱基μg)给出的序列格式。按照标准的凝胶电泳和放射自显影方法(Sambrook等，同上)进行。
G-跟踪的76个克隆(来源于ACA-6501文库筛选的在噬菌体稀释度1∶1×105试验的微筛选平板的)揭示出11个独特的序列，而在噬菌体稀释度1∶3×105试验的第二微筛选平板的64个克隆显示出30个独特的序列。将采用所有4个双脱氧核苷酸三磷酸的常规DNA测序用于具有最高微淘选得分和独特的序列的噬菌体克隆，导致出现表1所示的xyz文库的12个序列。噬菌体俘获ELISA
将克隆ACA-6635/3A12、3B3、3C8、3A5、3C9和3B7以3ml培养物培养。将亲和纯化的ACA-6635在磷酸缓冲盐水(pH7.2)中稀释到2.5μg/ml，向Immulon-2微量滴定板的孔中加入100μl。然后在每孔中用溶解在PBS中的150μl 0.1％BSA(游离球蛋白)封阻此平板。在4℃下放置1小时后，将此平板如上所述洗涤3次。以17,000×g将每一种噬菌体培养物离心3分钟后，在0.1％BSA/PBS中以1∶10稀释每一种上清液，并向每一个涂上一层亲和纯化的ACA-6635的孔中加入100μl，4℃下温育2小时。然后如上所述用TBS/Tween洗涤平板。在0.1％BSA/PBS中以1∶5,000稀释辣根过氧化物酶-缀合的羊IgG抗-M13噬菌体抗体(Pharmacia公司，Piscataway，NJ)，并向每个孔中加入100μl。4℃下温育1小时后，如上所述将此平板洗涤4次。将按照缀合厂商的指导制备的100μl底物加入到每个孔中。19分钟后，在自动微量平板吸收率测定仪(Biotek，Winooski，VT)上测定每孔在405nm的吸收率。选择了测验的由ACA-6635噬菌体文库筛选的7个克隆，这是因为它们高的微淘选得分和阴性噬菌体ELISA得分(参见下文)。如图9所示，所实验的7个克隆中有3个(3A12、3B3和3A5)在噬菌体俘获ELISA中显示出很强的免疫特异信号。噬菌体-ELISA
由上述以亲和纯化的ACA-6501在几个噬菌体文库筛选物中分离的35个克隆制备3ml培养物，并以一个缺乏肽插入物的FUSE 2噬菌体克隆作为对照。在以17,000×g离心3分钟后，将100μl的各种噬菌体上清液(以吸收率为基础调至-2×1011粒子/毫升)加入到微量滴定板的孔(Falcon，Becton-Dickinson Labware，Lincoln Park，NY)中，并在4℃下过夜温育。用TBS 7.4洗涤4次后，在室温下用125μl的0.5％BSA/TBS将此平板封阻1小时。经TBS再洗涤4次后，将100μl原来在TBS/BSA中稀释到2.5μg/ml的affACA-6501加入到每个孔中，在37℃下温育1小时。再洗涤4次后，将在TBS/0.5％Tween中以1∶1000稀释的100μl抗人类IgG加入到每个孔中。室温下放置1小时后，加入酶底物，并温育2小时。然后加入50μl 0.2M Na2HPO4终止反应，在自动平板吸收率测定仪上以550nm测量吸收率。如图10所示，7个克隆在带有ACA-6501的噬菌体-ELISA中具有明显的信号：5A12、3B6、3E7、3B10(和2D7具有相同的序列)、2G11、2H1和2H2。中心克隆的序列如表2所示。肽-ELISA
在标准方案中，将溶解在二甲基甲酰胺中的四体肽贮存溶液在pH9.5的碳酸盐缓冲液中稀释1000倍，即10μg/ml。用100μl稀释的肽在每一个微量滴定板的孔上涂上一层，然后用缓冲白蛋白封阻，4℃下过夜。在室温下将每一个涂上一层肽的微量滴定板孔与不同稀释浓度(以1∶50开始)的aPL血清一起温育1-2小时。洗涤后，按照标准的ELISA方法使用酶-缀合的抗人类IgG确定结合肽的人类IgG的存在。竞争性结合肽-ELISA
在每一个Immulon II平板(Dynatech实验室公司，Chantilly VA)的孔中涂上一层含有溶解在50mM碳酸钠(pH9.5，含有35mM重碳酸钠)(Fisher Scientmc，Pittsburgh，PA，试剂等级)中的10μg四价肽ACA6501/3B10，室温下放置至少1小时(除了用作空白对照的3个孔外)。然后，将此液体从孔中除去，向每个孔(包括空白孔)中加入用于封阻的200μl溶解在TBS中的0.5％(wt/vol)BAS(Sigma化学药品，St.Louis，MO，#A7638)，将其在室温下温育至少1小时。将4个1.5毫升的离心管标记为1-4。在第一个离心管(Brinkman Instruments，Westbury，NY)中混合下列试剂：30μl的5％BSA；284μl TBS；8μl大约400-500μg/ml的单体肽(ACA-5A12或-CB2或-3B10或混杂的-3B10作为阴性对照)TBS溶液的贮存溶液；8.2μl 1∶10稀释的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。在第二个离心管中混合下列试剂：30μl的5％BSA；290μl TBS；2μl大约400-500μg/ml的单体肽(ACA-5A12或-CB2或-3B10或混杂的-3B10作为阴性对照)TBS溶液的贮存溶液；8.2μl 1∶10稀释的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。在第三个离心管中混合下列试剂：30μl的5％BSA；287μl大约400-500μg/ml的单体肽(5A12或-CB2或-3B10或混杂的-3B10作为对照)的1∶10稀释液；8.2μl原来以1∶10稀释的ACA-6501血清的0.5％BSA-TBS溶液。在第四个Eppendorf离心管中混合下列试剂：60μl 5％BSA；584μl TBS和16.5μl的1∶10稀释的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。用TBS将封阻的平板洗涤5次。将第一个离心管的溶液加入到3个孔中，每孔100μl。将相同数量的第二、第三和第四离心管的溶液也加入到三个孔中。将第四个离心管中的100μl溶液加入到微量滴定板的三个封阻的空白孔的每一个中。室温下将此平板在40rpm的有轨振荡器(AmericanDade，Miami，FL.，Rotator V)中温育1小时，然后用TBS洗涤5次。加入溶解在0.5％BSA-TBS中的100μl 1∶1000稀释的山羊-抗人类-IgG/碱性磷酸酯酶缀合物(Zymed，南旧金山，CA，产品号62-8422)溶液，室温下温育1小时。然后用TBS洗涤此平板5次，如实施例1所述通过加入100μlPPMP稀释的底物溶液进行测定。20分钟后，通过向每孔中加入50μl的0.2M Na2HPO4(Mallinckrodt，St.Louis，MO.，试剂等级)终止反应。在微量平板测定仪(Bio-Tek仪器，Winooski，VT，Model EL 311)上以550nm测定光密度。将550nm下的光密度对每孔中的肽量在Graph Pad Priun(GraphPad软件公司，San Diego，CA)上作图。从此图计算血清6501与四价3B10结合的50％抑制作用所需要的肽量。
(B)用心磷脂(CL，50μg；Sigma化学药品公司，St.Louis，MO)的乙醇溶液以30μl/孔的量将Immulon I96孔平底的聚苯乙烯微量滴定板(Dynatech实验室公司，Chantilly，VA)涂上一层。两个对照孔中只含有30μl的乙醇。4℃下，过夜蒸发后，室温下将每个孔用200μl 5％(w/v)鱼明胶的PBS溶液封阻。然后用TBS洗涤5次涂上一层CL的封阻的平板，并向每个孔中加入β2-GPI(作为100μl 2.3％(以v/v表示的PBS溶液)IgG已耗尽的人类血清)(Sigma化学药品公司，St.Louis，MO)，室温下温育2小时。
在温育过程中，使用Eppendorf离心管，将数量可变化的6种肽的每一种与22μlACA6501血清混合(所说的血清是用溶解在TBS/PBS(1∶1)中的3％鱼明胶稀释(最终为1∶400的稀释液)的)，最终体积为220μl。特异地，在管1中混合了181.3μl的3％鱼明胶的TBS-PBS溶液，16.7μl的肽贮存物溶液+22μl的ACA 6501血清(在3％鱼明胶的TBS-PBS溶液中稀释40倍)。对于肽951(二丝氨酸非环化的阴性控制)、952(大量的LJP 690)和硫醚(CCTE-3G3、CHTE-3G3、HCTE-3G3和HHTE-3G3)贮存物溶液的浓度从450-800μg/ml变化。在2号管中加入下列物质：148μl的鱼明胶/TBS-PBS，50μl的肽贮存物溶液+22μl 40倍稀释的ACA6501血清。3号管含有48μl的鱼明胶/TBS-PBS，50μl的肽贮存物溶液+22μl 40倍稀释的ACA6501血清。4号对照管中含有396μl的鱼明胶/TBS-PBS和+44μl40倍稀释的ACA6501血清(不含肽)。室温下将每一个管温育大约1小时。
用TBS洗涤CL/β2-GPI微量滴定板5次，将100μl Eppendorf管1、2、3、4中的含有抗体肽(或者没有肽混合物)的溶液重复加入到这些孔中。将100μl的管4的溶液重复加入到不含心磷脂的对照孔中。室温下将此平板在40rpm的轨道振荡器(American Scientific，Rotator V)中温育1小时，然后用TBS洗涤5次。加入溶解在0.5％BSA-TBS中的100μl 1∶1000稀释的山羊-抗人类-IgG/碱性磷酸酯酶缀合物(Zymed，产品号62-8422)溶液。室温下温育1小时后，然后再用TBS洗涤此平板5次，通过加入100μlPPMP溶液(7.8g酚肽-磷酸盐+69.5g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇的100ml水贮存物溶液，用水以1∶26稀释)进行酶比色测定。21分钟后，通过向每孔中加入50μl的0.2M Na2HPO4(Mallinckrodt)终止反应。在微量平板测定仪(Bio-Tek仪器，Winooski，VT，Model EL 311)上以550nm测定吸收率。将吸收率对加入的肽量在Graph Pad Priun(Graph Pad软件公司)上作图。从此图的增加的肽量与最大吸收率一半的交叉点计算50％抑制ACA6501结合(IC50)的肽量。实施例5：肽3B10的截短实验和所形成的肽竞争ELISA结果
室温下以每孔100μl的四体ACA-6501/3B10肽(为10μg/ml的碳酸盐缓冲液(pH9.6，15mM Na2CO3/35mM NaHCO3))溶液)涂布微量滴定板(96孔、平底的聚苯乙烯Immulon-2，Dynatech实验室公司，Chantilly，VA)。从孔中除去液体后，室温下用200μl的0.5％(wt/vol)BSA(游离球蛋白，产品号A7638，Sigma化学药品公司，St.Louis，MO)的TBS溶液封阻1小时。此平板左边的三个孔没有涂布四价的肽，目的是作为空白对照孔。
在封阻期间，每一种可溶的待测的单体肽排列在三个实验管(Eppendorf小实验管，Brinkmann仪器，Westbury，NY)中，每个管中含有30μl 5％BSA/TBS、8.2μl ACA-6501血清(用0.5％BSA/TBS以1∶10稀释)+体积可变的肽/TBS贮存物、必要量的TBS，使最终体积为330μl。330μl足以产生3个100μl的每一种肽浓缩物的样品，这些样品用于检测其封阻ACA-6501与四价肽涂布的平板的结合能力。对于肽139(其氨基末端是截短的，并缺乏正常实验的框架ala-gly)，此贮存物溶液的浓度为大约340-400μg/ml TBS，除去19μl，75μl，和292μl的该溶液以便制备三种肽浓度的管。对于肽142(只是没有N-末端ala)和肽143(没有截短)，贮存物溶液的浓度为大约400-500μg/ml TBS。从每一种贮存物溶液中除去1μl，4μl，和16μl的等分溶液，用来制备每种肽的三种浓度的管。对于肽单体对照管(没有肽)，制备最终体积为660μl的管，其包含60μl 5％BSA，16.5μl1∶10的ACA-6501的稀释液和583.5μl的TBS(即与330μl的管具有相同的最终浓度(0.5％BSA和1∶400的ACA-6501血清)，但是体积是它的两倍，不含肽)。
封阻温育后，将用四价肽涂布的平板用TBS洗涤5次。将每一个330μl的以不同浓度含有肽139、142和143的管中的100μl溶液加入到涂布的三重孔中。将不含肽的660μl的对照管中的三份100μl等分溶液分别加入到涂布的孔中，另外三份100μl的等分溶液分别加入到未涂布的空白孔中。室温下将此平板在40rev/分钟的旋转有轨振荡器(Rotator V，AmericanDade，Miami，FL)中温育1小时，然后用TBS洗涤5次。向微量滴定板中加入溶解在BSA-TBS中的100μl 1∶1000稀释的山羊-抗人类-IgG/碱性磷酸酯酶缀合物(产品号62-8422，Zymed，South San Francisco，CA)溶液。室温下温育1小时后，然后再用TBS洗涤此平板5次。向每孔中加入100μl新制备的稀释PPMP底物溶液后可产生颜色。PPMP的稀释溶液(酚肽一磷酸盐，产品号P-5758，Sigma化学样品公司，St.Louis，MO)是通过以1∶26用水稀释PPMP贮存物溶液(0.13M PPMP、7.8M氨基-2-甲基-1-丙醇(用HCl将其pH调至10.15))制备的。30分钟后，通过向每孔中加入50μl的0.2M Na2HPO4(试剂级，Mallinckrodt，St.Louis，MO)终止反应。在微量平板测定仪(Bio-Tek仪器，Winooski，VT，Model EL 311)上以550nm测定吸收率，将吸收率对每孔加入的肽量在Graph Pad Priun(Graph Pad软件公司，San Diego，CA)上作图。如图11所示，划出的基线相当于在没有单体肽竞争抑制作用时的结合反应最大值的一半。50％的抑制值如图2所示。所得的结果表明N-末端Ala的缺失没有负作用，而Gly的再缺失则增加了获得50％抑制作用所必需的浓度大约8倍。实施例6：取代3B10中的α-甲基及所得到的ELISAs
使用实施例5描述的方法实验肽ACA-6501/3B10和其类似物(其中3和9位上的脯氨酸由α-Me-Pro代替)。使用四体肽3B10涂布的微量滴定板和ACA-6501血清在竞争结合ELISA中检验作为可溶单体肽的肽3B10，726(在3位上αMe-Pro取代的)，727(在9位上αMe-Pro取代的)，和728(在3和9位上αMe-Pro取代的)。
如实施例5所述将微量滴定板用四体肽3B10涂上一层。对于所实验的4种肽的每一种，在管中制备3种浓度的肽。这12个管的最终浓度为0.5％BSA/TBS、以1∶400最终稀释的ACA-6501血清，总体积为330μl。所有的肽贮存物溶液为400-500μl/ml TBS。向含有30μl 5％BSA/TBS和8.2μl ACA-6501血清(用0.5％BSA/TBS以1∶10稀释)的管中，加入4种肽贮存物溶液的每一种：1μl、4μl和16μl的等分溶液，另外加入合适体积的TBS，使最终体积为330μl。如实施例5所述，制备最终体积为660μl的不含竞争肽的对照管。
四价肽涂布的平板的温育封阻后，如实施例5的描述实验来源于四种肽的各种肽浓度管中的三份100μl等份样品、以及来源于不包含肽的对照管和空白对照中的等份样品。如实施例5的描述实施微量滴定板ELISA方法和进行数据处理。如图13所示，肽727(其中在9位置上的α-Me-Pro被取代)与未改变的肽3B10或带有改变的脯氨酸的类似物(肽728)相比具有明显提高的活性。肽726(其在3位发生取代)由于这种取代而失去了活性。实施例7：使用6626抗体筛选的简要描述和相应的序列
通过亲和纯化从上述的8ml ACA-6626血浆中分离亲和纯化的ACA-6626(AffACA-6626)。将AffACA-6626(10μg)与含有全部的p-III感受态的一组文库(最终体积为100μl)(如上文用于ACA-6501生物淘选的描述)的表位xy′z噬菌体文库一起温育。在三轮生物淘选之后，通过显微淘选检验从第二轮和第三轮中随机选择的噬菌体。只有几个克隆在1∶1000稀释浓度下具有微弱的免疫阳性。对另外的第四轮进行生物淘选。94个第四轮克隆的显微淘选显示出43个免疫阳性，有些在高达1∶100000稀释度下表现出免疫阳性。如上文用于ACA-6501的描述所进行的43个免疫阳性克隆的G-示踪DNA测序表明5个单一序列。在常规的四碱基DNA测序后，获得了表3的翻译氨基酸序列。实施例8：患者6644的特异性ACA序列的鉴定
使用与实施例4类似的方法通过患者6644的ACA亲和纯化的抗体筛选epixy′z噬菌体显示文库。在肽合成前使用上述的菌落印迹分析作为最后的鉴定步骤。在原来硝酸纤维素膜上接种大约150个菌落，并对其进行分析。以1μg/ml的浓度使用患者6644的抗体。在此筛选中，在硝基纤维素膜上平板接种和分析的150个菌落中，只有四个具有较强的阳性，2个表现出微弱的阳性。此筛选中选择出的6个阳性噬菌体的插入物的测序表明所有这些插入物都来自具有游离氨基末端(epiz)的八聚体文库。
Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Gly(3个插入片段)
Gly-Ile Leu-Thr-Ile-Asp-Asn-Leu-Gly-Gly(1个插入片段)
Gly-Ile-Leu-Leu-Asn-Glu-Phe-Ala-Gly-Gly(2个插入片段)实施例9：具有ACA-6641的噬菌体文库的筛选概述
从患者6641的4ml血浆中分离AffACA-6641。如上所述将AffACA-6641(10μg)与一组p-III噬菌体文库(最终体积为100μl)一起温育。在四轮生物淘选之后，通过显微淘选检验从第三轮和第四轮中的45个克隆。在45个克隆中有23个是阴性的。第三轮噬菌体产生标记为4+的两个克隆、标记为3+的两个克隆、标记为2+的两个克隆。在第四轮中一个克隆标记为4+，一个克隆标记为3+，3个克隆标记为2+。G-示踪的DNA测序显示出6个单一序列。只有一个克隆(3G3)在噬菌体俘获ELISA中显示出较强的阳性。四个碱基的DNA测序得到下列翻译的肽序列：C L G V L G K L C。实施例10：肽与非免疫原性多价载体的缀合
如共有共同未决美国专利申请08/118,055(1993年9月8日申请)、08/152,506(1993年11月15号申请)和美国专利5,268,454、5,276,013和5,162,515(其全部内容本文一并参考)中所述，已经研究出用于产生B细胞耐受原的一些四价平台。结合通过表位文库的aPL抗体筛选选择的候选肽，并检验它的免疫化学行为(如抗体结合)的改变。
按照下面的方案合成带有胺基团的非免疫原性多价平台。
平台上的胺-肽上的羧基化合物2
将溶解在50ml纯EtOH和35ml环己烯中的8.0g(5.7mmol)化合物1溶液放置在氮气中，在碳上加入500mg 10％Pd。将混合物振荡回流2小时。冷却时经Celite过滤，浓缩得到油状的5.0g化合物2。1H NMR(50/50CDCl3/CD3OD)d 1.21(m，8H)，1.49(m，8H).1.62(m，8H)，2.19(t，J＝7.4Hz，8H)，2.67(t，J＝7.4Hz，8H)，3.36(bd s，16H)，3.67(s，4H)，3.71(m，4H)：4.21(m，4H)。带有游离羧基的保护肽(PHN-肽-CO2H)
在Wang(对烷氧基苯)树脂上利用FMOC化学经标准固相方法合成肽，其中使用三氟乙酸(TFA)稳定保护基团(在羧基的苯酯或环己烷酯和在氨基上的苄氧羰基(CBZ))。将氨基酸残基顺序地加入到氨基末端。利用TFA从树脂上取出肽，以便提供在羧基末端具有一个游离羧基的肽，所有其它的羧基和氨基都被封阻。通过反相HPLC纯化保护的肽。肽-平台缀合物4
把保护的肽(0.3mmol)溶解在1ml的二甲基甲酰胺(DMF)，向溶液中加入0.3mmol二异丙基碳二亚胺、0.3mmol 1-羟基苯并三唑氢氧化物(HOBT)。将此溶液加入到含有0.025mmol四氨基平台、化合物2(1mlDMF溶液)的溶液。加入后真空除去DMF以产生粗制的完全保护的缀合物3。在0℃下用氢氟酸(HF)在茴香醚存在下处理缀合物3产生缀合物4。
通过制备型反相HPLC进行纯化。
下列的方案显示出肽的氨基附着在平台的羧基上。平台上的羧基-配体上的胺化合物5-带有4个羧酸基团的平台
将琥珀酐(1.0g，10mmol)加入到溶解在20ml1/1二氧六环/水中的861mg(1.0mmol)的化合物2和252mg(3.0mmol)的NaHCO3溶液中，将混合物在室温下搅拌16小时。用1N HCl将混合物酸化，并将其浓缩。通过硅胶层析纯化此浓缩物，产生化合物5。带有游离氨基的保护的肽(H2N-肽-CONH2)
使用TFA稳定保护基团(在羧基的苯酯或环己烷酯和在氨基上的CBZ)在酰胺树脂上经标准的固相方法合成肽，这样，从此树脂上切割后产生羧基末端的酰胺，使用标准的FMOC化学向氨基末端顺序加入氨基酸残基。使用三氟乙酸从树脂上除去此肽以产生带有游离氨基接头的保护的肽。经反相HPLC纯化此保护的肽。肽-平台缀合物7
制备溶解在1ml的DMF中的0.05mmol带有游离氨基的保护肽(H2N-肽-CONH2)、0.1mmol二异丙乙基胺、0.01mmol的化合物5溶液。加入BOP试剂(苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨)磷律六氟磷酸)(0.1mmol)，搅拌混合物直到经分析型HPLC确定反应完全。0℃下在茴香醚存在时通过HF处理除去肽保护基团，得到除去肽保护基因的缀合物7。经制备型反相HPLC纯化化合物7。
下列方案表明如何将巯基接头与肽的氨基末端结合，接下来将肽/接头与四溴乙酰化的平台结合产生化合物13。平台上的卤乙酰和肽上的巯基化合物9
将浓硫酸(100μL)添加到4.48g三苯甲醇(17.2mmol)和1.62g(15.3mmol，1.3ml)3-巯丙酸在35ml EtOAc中的60℃溶液中。在60℃将混合物搅拌10分钟，使其冷却至室温(RT)，置于冰上1小时。通过过滤收集所形成的白色国体，给出4.52g(75％)化合物9。化合物10
将二环己基碳二亚胺(DCC)(2.41g，11.7mmol)添加到2.72g(7.8mmol)化合物9和1.08g(7.8mmol)对硝基苯酚在41ml CH2Cl2中的0℃溶液中。将混合物搅拌16小时，使其到达RT。过滤混合物以除去N，N-二环己基脲(DCU)，浓缩滤液。从己烷/二氯甲烷结晶残渣，产生3.17g(86％)淡黄色结晶状的化合物10。化合物11-具有连接的巯丙基的环状硫醚肽
将环状硫醚肽(一种二硫化环状肽类似物，其中一个硫原子被一个CH2取代)和碳酸氢钠在水和二氧六环中的溶液用对硝基苯酯10处理。如果肽含有赖氨酸，则其必须进行合适的封阻。将所形成的稀释肽用三氟醋酸处理，产生硫醇接头肽11。化合物13-环状硫醚肽和溴乙酰化平台的缀合物
向0.10mmol硫醇修饰肽11在100mM硼酸钠中的He喷雾溶液(pH9)加入0.025溴乙酰化平台12(以在9/1 MeOH/H2O中的40mg/mL溶液)。在N2氛围下搅拌溶液，直到由HPLC证实缀合完全。实施例12：合成LJP 685γ-溴-N-BOC-α-氨基丁酸叔丁酯，化合物14
在40ml干THF中的4.03g(13.3mmol)N-BOC-谷氨酸-α-叔丁酯和1.61ml(1.48g，14.6mmol)N-甲基吗啉在N2氛围下冷却至15℃。将氯甲酸异丁酯(1.73ml，1.82g，13.3mmol)逐滴加入到混合物中。将混合物搅拌10分钟，加入2.03g(16.0mmol)N-羟基-2-巯基吡啶在8ml of THF中的溶液，接着加入2.23ml(1.62g，16.0mmol)Et3N。将混合物用箔包裹以避光，使其在室温下搅拌1小时。过滤混合物，在旋转蒸发器上浓缩滤液，小心尽量不暴露于光下。将浓缩物溶解在20ml BrCCl3中，将溶液冷却至-70℃。将固体置于真空中，然后用N2清除，使其达到室温，置于20℃的水浴中，在近距离内从上用500W太阳灯照射5分钟。在旋转蒸发器上浓缩混合物，将硅胶色谱纯化(40mm×150mm，甲苯用作洗脱液直到UV活性物完全洗脱，2％EtOAc/甲苯(500ml)，5％EtOAc/甲苯(500mL)。再纯化不纯的组分。合并TLC(R，0.23，5％EtOAc/甲苯)纯化的组分，浓缩，产生3.23g(72％)蜡状固体状化合物14。N-BOC-甘氨酰脯氨酸-4-硝基苯酯，化合物15：
将3.0g(11.6mmol)N-BOC-甘氨酰脯氨酸和1.93g(13.9mmol)4-硝基苯酚在82ml of干THF中的溶液冷却至0℃，加入3.34g(16.2mmol)DCC。将混合物在0℃下搅拌1小时，移去冰浴。将混合物在室温下搅拌16小时。将HOAc(579 CLL)加入到混合物中搅拌30分钟。将混合物保持在冰箱中30分钟，在真空下过滤。浓缩滤液，经硅胶色谱(18×150mm柱，2.50％EtOAc/97.5％CH2Cl2/1％HOAc)纯化。通过在旋转蒸发器上从二氧六环浓缩几次除去微量的乙酸。用3/1己烷Et2O研磨浓缩物，经过滤收集所形成的白色固体，产生4.1g(90％)白色固体状化合物15。TLC Rf0.09，40/60/1 EtOAc/己烷/HOAc；1H NMR(CDCl3)δ1.09-2.55(m，4H)，1.48(s，9H)，3.47-3.77(m，2H)，4.05(m，2H)，4.74(m，1H)，5.45(bd s，1H)，7.35(d，2H)，8.30(d，2H)。N-FMOC-S-叔丁基硫代半胱氨酸酰胺(thiocysteineamide)，化合物16：
将5.0g(11.6mmol)FMOC-S-叔丁基硫代半胱氨酸和1.33g(11.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺在115ml THF中的溶液冷却至0℃。向溶液中加入3.58g(17.37mmol)DCC，在0℃搅拌混合物1小时，加入1.6g(NH4)HCO3在50ml水中的42.9ml溶液。将混合物搅拌4.5小时，使冰浴逐渐温热至室温，在旋转蒸发器上浓缩，以除去THF，产生具有白色固体的水相。将混合物与200ml CH2Cl2一起搅拌，直到大多数固体溶解，然后与100ml 1N HCl一起振荡。用100ml饱和NaHCO3溶液洗涤CH2Cl2层。干燥(Na2SO4)并过滤。在热的平板上使滤液沸腾，从300mlCH2Cl2/己烷结晶，产生4.36g(87％)白色固体状化合物14：mp 127-129℃；TLC Rf 0.29，95/5/1 CH2Cl2/CH3CN/MeOH，1H NMR(CDCl3)δ1.36(s，9H)：3.06-3.24(m，2H)，4.25(t，1H)，4.55(m，3H)，5.56(bd s，1H)，5.70(bd s，1H)，6.23(bd s，1H)；13C NMR(CDCl3)29.8，41.9，47.1，48.5，54.2，67.2，120.0，125.0，127.1，127.8，141.3，143.6，156.1，172.2.分析计算值：C，61.4％；H，6.1％；N，6.5％.实测值：C，61.5％；H，6.0％；N，6.5％。化合物17：
将水(16.9mt)添加到在33.8ml二氧六环中的2.91g(6.75mmol)化合物16中，用氮喷雾溶液5-10分钟。将混合物保持在氮氛围下，加入1.13g(13.5mmol)NaHCO3，接着加入1.77ml(1.44g，7.09mmol)PBu3。在室温下搅拌混合物1小时，在1×100ml 1N HCl和2×100ml CH2Cl2之间分配。合并CH2Cl2层，浓缩，将所形成的白色固体部分溶解在33.8ml二氧六环中。加入水(9ml)，用氮净化混合物5-10分钟。将混合物保持在氮氛围下，加入2.17g(16.9mmol)K2CO3，接着加入2.63g(8.1mmol)化合物14。将混合物搅拌16小时，在1×100ml 1N HCl和2×100ml 10％MeOH/CH2Cl2之间分配。合并CH2Cl2层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩成半固体残渣。经硅胶色谱(1/3 CH3CN/CH2Cl2)纯化，产生3.2g(80％)化合物17白色固体；TLC Rf 0.27，1/3 CH3CN/CH2Cl2。通过从己烷/EtOAc重结晶进行分析样品的进一步纯化；mp 104-106.5℃；1H NMR(CDCl3)δ1.47(s，9H)，1.49(s，9H)，1.96(m，1H)，2.11(m，1H)，2.69(m，2H)，2.88(m，1H)，3.03(m，1H)，4.29(t，1H)，4.36(m，2H)，4.50(m，2H)，5.21(m，1H)，5.49(m，1H)，5.81(m，1H)，6.54(m，1H)，7.34(t，2H)，7.42(t，2H)，7.61(d，2H)，7.80(d，2H)；13C NMR(MeOH)δ26.1，26.7，28.2，28.7，34.8，54.8，55.7，68.1，80.5，82.7，120.9，126.3，128.2，128.8，142.6，145.2，160.0，162.7，173.4，175.8。C31H91N3O7S分析计算值：C，62.08：H，6.89；N，7.01；实测值：C，62.23；H，7.12；N，7.39。化合物18：
将20/1/1 TFA/H2O/巯基乙醇(23.2ml)溶液加入到1.27g(2.11mmol)化合物17中。在室温下搅拌混合物1小时，浓缩至约3ml体积。添加50ml乙醚以沉淀产物。用两份多乙醚洗涤所形成的固体，并在真空下干燥，产生812mg固体。将该固体悬浮在10.6ml二氧六环和10.6ml H2O中。将NaHCO3(355mg，4.22mmol)添加到混合物中，接着添加1.33g(3.38mmol)化合物15在10.5ml二氧六环的溶液中。在室温下搅拌混合物20小时，在100ml 1N HCl和3×100ml CH2Cl2中分配。干燥合并的CH2Cl2层(Na2SO4)，过滤并浓缩。将硅胶色谱纯化(35×150mm；梯级梯度，5/95/1MeOH/CH2Cl2/HOAc(1L)到10/95/1)。浓缩纯的组分，与乙醚一起研磨残渣，产生881mg(60％)化合物18；TLC Rf0.59，10/90/1 MeOH/CH2Cl2/HOAc；mp 116-117.5℃；1H NMR(CDCl3)δ1.41(s，9H)，2.00(m，2H)，2.18(m，2H)，2.56(m，1H)，2.69(m，1H)，2.85(m，2H)，3.49(m，2H)，3.62(m，2H)，3.85(m，2H)，4.08(m，1H)：4.12(m，1H)，4.22(t，1H)，4.38(m，1H)，4.49(m，2H)，4.61(m，2H)，7.78(d，bd s，1H)，6.12(bd s，1H)，6.43(bds，1H)，7.35(d，2H)，7.40(d，2H)，7.61(d，2H)，7.78(d，2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.3，27.8，28.6，29.4，32.6，35.1，44.1，46.9，47.3，52.2，53.9，61.2，67.8，80.8，120.8，125.7，128.2，129.0，142.0，144.5，157.6，157.8，170.6，181.2，182.9，183.1.分析计算值C34H43N5O9S：C，58.52；H，6.21；N，10.03.实测值：C，58.38，11，6.17；N，10.20。N-FMOC-L-丙氨酰-L-2-甲基脯氨酸，化合物19：
将2-甲基脯氨酸(Seebach等(1983)美国化学会杂志，105：5390-5398)(1.00g：4.76mmol)，4.00g(47.6mmol)NaHCO3和31mg(0.23mmol)HOBT在6.9ml DMF中的溶液冷却至0℃，加入3.18g(6.66mmol)N-FMOC-L-丙氨酸。在0℃搅拌反应物1小时，然后在室温下搅拌18小时。将混合物在50ml EtOAc和3×50ml 1N HCl中分配，干燥EtOAc层(MgSO4)，过滤并浓缩。经硅胶色谱(梯级梯度45/55/1 EtOAc/己烷/HOAc到47/53/1 EtOAc/己烷/HOAc到50/50/1 EtOAc/己烷/HOAc)纯化，产生1.72g(86％)化合物19白色固体。将产物从二氧六环浓缩几次，以除去微量的乙酸：mp 59-60℃；1H NMR(CDCl3)δ1.39(d，3H)，1.93(m，2H)，2.06(m.2H).3.78(m，2H)，4.22(m，1H)，4.40(d，2H)，4.56(m，1H1)，5.09(t，1H)，5.69(d，1H)，7.32(t，2H)，7.42(t，2H)，7.62(d，2H)，7.78(d，2H)；13CNMR(CDCl3)δ17.8，21.8，23.8，37.9，47.1，48.5，65.9，67.0，120.0，125.1，127.1，127.7，141.3，144.1，155.6，172.9，175.1。N-FMOC-L-亮氨酰-HMPB-MBHA树脂：
制备N-FMOC-L-亮氨酸在22.5ml CH2Cl2中的溶液和几滴DMF，冷却至0℃。向溶液中加入1.71ml(1.38g，10.9mmol)二异丙基碳化二亚胺(DIC)，在0℃下搅拌混合物20分钟。将混合物浓缩成油状，同时，将足够量的DMF(约3ml)加入到2.5g(0.87mmol/g，2.18mmol)HMPB-MBHA树脂(Nova Biochem)上，以膨胀树脂。将浓缩的油状物溶解少量DMF(约1ml)中，并添加到膨胀的树脂上，接着加入溶解在约1ml DMF中的266mg(2.18mmol)DMAP溶液。轻轻摇动混合物1小时，洗涤(2×DMF，2×MeOH，2×DMF，2×MeOH)。将树脂在真空下干燥，产生2.77g(85％)，取代基由Geisen试验测得为0.540mmol/g。具有在天冬氨酸上的丁酯和在精氨酸上的Pmc基以及具有硫醚插入物的N-FMOC-线性肽，化合物20：
在N-FMOC-L-亮氨酰-HMPB-MBHA树脂上经标准FMOC合成法制备该肽。除了化合物18的偶联步骤外，在各偶联步骤中使用三当量的氨基酸，HOBT和(DIC)。两当量的化合物18与三当量的HOBT和二异丙基碳化二亚胺一起使用。采用10μL溴酚蓝指示剂监测各步反应。也用茚三酮试验(在100℃加热2分钟，用1滴吡啶和1滴在EtOH中的5％茚三酮和1滴在EtOH中的80％苯酚，液滴变蓝)估计反应的完成情况。这样，将1.13mg(0.613mmol)树脂用于制备所说的肽。在最后的偶联步骤后，通过用1％三氟乙酸在CH2Cl2中的溶液处理2分钟完成从树脂上裂解。2分钟后，减压过滤进30ml 10％吡啶在MeOH中的溶液中。重复这一操作10次。合并经HPLC(C18，梯度，60/40/0.1 CH3CN/H2O/TFA到90/10/0.1CH3CN/H2O/TFA，210nm，1ml/min，4.6mm×250mm柱)证实含有肽的滤液并浓缩。将浓缩物溶解在40ml 10％HOAc溶液中，经HPLC纯化，产生0.528g(49％)肽20。将肽20转化成肽21(除去FMOC基，结晶和除去保护基)：
将99μL DBU在10ml CH3CN中的溶液(5ml)添加到96mg(0.052mmol)肽20中。搅拌溶液1小时，浓缩成残渣。将该残渣与2×10ml Et2O一起研磨，产生白色固体。将该固体溶解在100ml CH3CN和312μL(0.312mmol)0.1M二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)在CH3CN中的溶液中。将混合物搅拌20小时，并在旋转蒸发器上浓缩。将该残渣与2×50ml Et2O一起研磨，白色的不透明残渣用5ml 92/3/2/3 TFA/茴香醚/EDT/Me2S处理1小时。通过将混合物加入到在50ml聚丙烯离心管中的40ml Et2O中沉淀产物。将沉淀冷却至0℃，在2000rpm下离心5分钟。倾析上清液，用Et2O洗涤沉淀并再离心。干燥沉淀并溶解在4ml 50/50 CH3CN/H2O中。用36ml H2O/0.1％TFA稀释混合物，经HPLC(1＂C18柱，梯度，10/90/0/1CH3CN/H2O/TFA到35/65/0.1 CH3CN/H2O/TFA，230nm)纯化。冷冻干燥经HPLC证实的纯化的组分，产生52mg(90％)化合物21。实施例12：合成LJP 685缀合物
用3-三苯甲基巯基丙酸PNP酯处理LJP 685(也称为化合物21)，将产生的产物脱三苯甲基化，产生化合物22，具有游离硫醇接头的肽。过量化合物22与效价平台分子U的反应产生四价的缀合物25。用较长的接头，化合物15(参见以下反应方案)处理化合物21，接着脱三苯甲基产生化合物24。化合物24与效价平台分子12反应产生四缀合物26。通过HPLC，两种缀合反应显得非常清楚。将MTU接头连接到LJP 685上，合成化合物24：
向15mg(0.013mmol)化合物21中加入160μL 29.5mg化合物21的溶液和17.5μL在0.5ml DMF中的二丙基乙胺的溶液。.将混合物搅拌2小时，并从Et2O中沉淀。干燥沉淀并溶解在650μL1/1/0.056/0.040TFA/CH2Cl2/苯硫酚/Me2S溶液中，使溶液静置1小时。从Et2O沉淀，产生粗化合物24，经HPLC(C18，15-45％CH3CN/H2O，0.1％TFA)纯化。将含有纯化的产物的组分冷干，产生8.6mg化合物24白色固体。LJP 685-MTU-AHAB-TEG，化合物26：
向8.6mg(6.3×10-6mol)化合物24在630μL He喷雾的pH8.5 200mM硼酸盐缓冲液中的溶液中加入40μL 40mg/mL化合物12在9/1MeOH/H2O的溶液，搅拌混合物24小时，加入1ml 10％HOAc/H2O溶液，经HPLC(C18，梯度25-55％CH3CN/H2O，0.1％TFA)纯化混合物，产生8.3mg化合物26(LJP 685-MTU-AHAB-TEG)。实施例13：展开延伸的SH接头
从化合物22制备硫代苯甲酸酯，化合物28。将化合物28部分转化成化合物29。经乙醇解除去硫代苯甲酸酯，将形成的硫醇三苯甲基化。然后水解乙基醚，产生化合物29。从化合物29制备硝基苯基磷酸(PNP)酯，化合物24。通过用叠氮化钠处理化合物22并还原成胺制备氨基trioxou癸酸乙基酯，化合物31，用化合物30处理酰基化胺31，产生化合物32。通过用氢氧化钠处理进行化合物32的水解，产生游离的羧酸。用对硝基苯酚缩合中间体羧酸，产生对硝基苯基酯，化合物33。将接头33连接到肽上，除去三苯甲基，产生化合物34，其用于产生MTU-ATU-AHAB-TEG缀合物。实施例14：合成(LJP685)4/MTU-ATU-AHAB-TEG缀合物，化合物35
如下所示制备四效价缀合物。将具有连接的接头的肽(化合物34)溶解在He喷雾的(pH8.5)200mM硼酸盐缓冲液中，向化合物加入0.3mol当量的化合物12。将混合物搅拌1小时，经HPLC纯化产物。实施例15合成(LJP685)4/DABA-PEG缀合物，化合物36
用在8.5硼酸盐缓冲液中的化合物24处理IA-DABA-PEG产生缀合物36。实施例16 T细胞活化测定
在96孔园底平板中监测肽-刺激T细胞产生的三苯甲基化胸腺嘧啶核甙摄取。将消耗淋巴结细胞(小鼠)或分离外围的血淋巴细胞(人)的单-细胞悬液5×105以每孔150μl终体积与1和30μg之间的肽混合，在5％二氧化碳中于37℃下培养5天。培养结束时加入1微居里标记的胸腺嘧啶核甙，并培养另外的15-24小时。将收获的细胞收集在滤器上，由液态闪烁光谱测定法计数。实施例17体外诱导的耐受性
8组(每组包含5只C57B1/6小鼠)用10μg/小鼠在明矾上的LJP685-KLH缀合物加作为佐剂的B.pertussis疫苗灌注。在3周之后，收获脾并制备单细胞悬液，用平衡盐溶液洗涤3次，以等同于1个脾/1.5ml培养基的浓度重悬于完全RPMI-1640培养基中。将细胞悬液分成2.5mL/培养皿的等分样，在37℃以100μM、20μM和4μM浓度与(LJP685)4-DABA-PEG(化合物36)和(LJP685)4-TEG(化合物35)一起培养2小时。一组细胞在没有耐受原存在下培养，作为阳性对照。然后用大体积的平衡盐溶液洗涤细胞，并重悬于2.5mL平衡盐溶液中。接着将细胞注射进650R放射同系(syngeneic)受体小鼠，使得所有来源于给定处理组的细胞平等地分成5组受体。用10μg盐水中的LJP 685-KLH腹膜内强化免疫包括阳性对照在内的所有受体小鼠。在强化免疫后七天，对小鼠放血，其血清用于试验抗LJP 685抗体的存在。用两种缀合物处理产生如图16和图17所示的抗LJP685抗体的明显剂量依赖性降低，其是通过如Iverson，G.M.，在试验免疫学手册，第二卷，细胞免疫学中的＂体内过继免疫反应测定＂(Weir，D.M.，ed.，Blackwell科学出版社，Pale Alto，CA，1986)中所描述的抗原结合能力(ABC)测定的。实施例18 5A12，CB2和3G3肽的NMR溶液结构分析
对采用以上实施例中所描述的方法从噬菌体文库筛选分离的两种肽进行NMR分析。原来的肽在倒数第二为有脯氨酸，而这一氨基酸被除去，因为二维(2D)双量子滤过相关光谱学(DQF-COSY)NMR数据表明两个在这一位置上的不同于顺式和方式异构体的结构。除去脯氨酸给出具有结合ACA抗体的在50-100nM范围内的Kd’和在DQF-COSY谱指纹区中预定数目的峰的肽。所形成的环状肽是5A12(GPCLILAPDRCG)和CB2(GPCILLARDRCG)。所述肽之间的主要区别是8位上脯氨酸取代精氨酸，其导致CB2(与5A12是刚性肽是一致的)的1D1H NMR谱中少得多的弥散。精氨酸取代也产生pK值所反映的离子化天冬酰基羧基的0.55kcal/mol稳定化。在更加规则的5A12肽上进行结构分析。尽管重氢交换和温度系数数据显示没有氢结合的证据，但核Overhauser效应(NOE)、旋转Overhauser效应(ROE)和连接数据是与一个结构一致的。距离几何学计算给出50个结构的家族。15个最好的具有2.1±0.2埃的所有原子的平均根平均平方偏差(RMSD)。我们确定，所说的肽具有椭圆形，在分子相对的端、二硫化物和脯氨酸8(其是顺式的)处有转折。在骨架LIL区中也有结。最后，羧基末端甘氨酸是非常易变的，因为其是具有阳性内残基NOE的仅有的残基。这代表有关肽(其模仿在β2-GPI上的ACA表位)的所确定的第一结构信息。
与距离几何学计算相联系的NMR数据用来确定肽925(CLGVLAKLC)、具有在肽925的6位丙氨酸取代甘氨酸的截短的肽3G3(AGPCLGVLGKLCPG)的三维结构。于25℃ pH3.8下在水中测定肽925的结构。计算了全部9个结构，所有的均与NMR数据一致。当每一结构与质心比较时，所有非氢原子的RMSD是2.45±0.36埃。图18显示了最接近质心的全部结构，因此是肽925分子形状的合理的代表。图19将肽925的结构(如3G3，在图的底部标记)与肽5A12的结构进行了比较。在肽序列中两种肽大约在相同的位置具有转折。
肽的药效基因已被暂时鉴定为小的疏基团和带正电荷的基团。肽925的gem-二甲基和氨基已被暂时鉴定为这一肽的药效基因，如图20所示。限制药效基因在某些支架上的碳氢化合物具有图20限定的长度，这些接头连接到脚手架上的位点由限定的距离分开。最后，限定两种接头相对取向的两面角被确定为22°。