血小板生成素及其生产工艺 本发明属于生物制药领域
血小板生成素(Thrombopoietin TPO)是肾细胞产生的一种糖蛋白生长因子，已知是由332氨基酸组成，分子内部有多个糖基化位点，但由于糖基化位点不十分清楚，所以报导的分子量多在30000-50000道尔顿范围内，等电点为4.4左右。
血小板生成素最初发现是在患严重血小板减少的动物和人的血浆、血清和尿液中存在的一种体液因子。由于血小板生成素对一些不治之症(如血小板减少症、再障等)具有肯定的疗效，前景非常看好，所以血小板生成素已成为许多国际开发研制的热点。目前其它国家多从患有血小板减少症病人的尿中提取；有的是从血浆及血清中提取纯化；有的是从人肾细胞培养提取纯化；有的是采用DNA重组技术人工合成。
上述开发研制血小板生成素的过程中主要存在以下问题为之不足。1.收集患有血小板减少症病人的尿太困难，由于患病人数太少，因此尿(原料)的缺乏，不能形成工业化生产，不具有实用性。2.从血浆、血清中分离血小板生成素，因其含量极微，故而收率太低，成本高。又因原料中杂蛋白干扰太大，致使纯化度这不到质量要求及使用要求。3.从人肾细胞培养、提取、纯化工艺更复杂，成本昂贵。4.应用DNA重组技术人工合成，工艺复杂，成本昂贵。
鉴于上述存在的问题，本发明的目的就是解决原料来源困难，提取纯化工艺复杂，生产成本昂贵等之不足及寻找一种纯天然制品。发明内容：附生产工艺流程图
收集男性新鲜尿，检测PH为6-7之间，经检查无细菌污染后，经微孔滤膜、砂芯及石棉滤器过滤均可，以微孔膜为佳，以除去杂质，滤液按尿液体积1∶1加蒸馏水稀释或不稀释后通过离子交换纤维素(DeAe，DeAe-Sephadex，Amberlite 1R-4B)柱层析，柱层析预先用含0.1克分子浓度氯化钠的0.01克分子浓度PH6.5-6.8的磷酸缓冲液(PBS)平衡后即可上样。上完样以0.1克分子浓度氯化钠磷酸缓冲液洗涤至流出液中无蛋白为止，此液为峰1弃之不用，再用含0.15克分子浓度氯化钠的磷酸缓冲液冲洗至流出液中无蛋白为止，此液为峰2仍弃之不用，最后用0.35克分子浓度滤氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，此液为峰3，收集峰3液，加入饱和硫酸铵至50-80％饱和度置冷过液，在4-10℃低温离心，收集沉淀物，将其溶于少量蒸馏水中用透析袋对水透析至无硫酸根(SO4)为止，然后取透析液生物胶通过(Bio-gel P-30)或交联葡聚糖凝胶(Sephadex G25-100、Sephacry S-100-4000)均可做为分离介质的凝胶过滤柱进行分离，凝胶过滤柱先用0.01克分子浓度PH7.0磷酸缓冲液平衡后上样，洗脱液在紫外检测仪上出现三个峰，峰I和峰II弃掉，收集峰III再经一次纤维素层析(P-纤维素，CM-纤维素)用PH6.5-7.0，0.01克分子浓度磷酸缓冲液进行洗脱，该液再经截止分子量3-5万的超滤膜进行超滤，以除去病毒，最后以速冻干燥即得。本工艺生产的血小板生成素(TPO)具有以下理化性质及药效一、分子量：经SDS-PAGE检查分子量主要为32000和16000道尔左右的两种蛋白带，等电点为4.4-4.5，比活性100000-150000单位/mg蛋白。通过HPLC凝胶柱检查分子量为30000-50000道尔顿占总蛋白地80％以上。二、药效学试验：1.小白鼠试验：
小鼠经环磷酸胺注射后造成血小板降低约50％，注射5000单位/kg，1500单位/kg，500单位/kg三个剂量的TPO后，血小板均有十分明显的升高，高剂量组可恢复到起始血小板数的85％，而对照组只有42％，血小板的升高与TPO剂量呈正比关系。2.大鼠：分(1)组：经4.0GY60钴照射后造成血小板严重下降经TPO500单位/kg，1000单位/kg，2000单位/kg两周治疗后，血小板回升到照射前的65％，而对照组只回升30％。3.人体治疗研究：
用血小板治疗四例慢性再障碍性贫血，肌肉注射血小板生成素，每日一次，每次40000单位，结果：血色素及血小板比治疗前分别平均上升42.75克/升及50.28克/升，用药前后对比，具有显著性差异(P＜0.01)，治疗八周后，骨髓象基本正常(粒红比为1.24∶1，巨核细胞12只，血小板散在可见)。三、药理及毒理学试验：
1.一般药理：结果表明TPO对大鼠心血管呼吸系统精神系统均未发现有明显影响。
2.急性毒理：小鼠静脉注射相当临床拟用量10000倍，肌肉注射相当于临床拟用量的15000倍，观察14天，小鼠健存，因而测不出LD50(半数致死量)。
3.长期毒性：大鼠注射给药三个月，每日一，次剂量为5000单位/kg，1250单位/kg为临床拟用剂量的71倍和178倍，结果表明：体重、行为、心电图、血尿常规、血液生化及重要脏器均未发现器质性变化，仅有可逆性变化。4.过敏及安全试验：TPO对豚鼠的试验证明，无过敏反应而且安全合格。四、稳定性：保存在0-10℃18个月TPO的活性无变化。本发明与现有技术相比其优点和积极效果1.本发明为纯天然产品，具有肯定的治疗效果，无毒付反应。2.原料非常充足，不用投资可得到。3.生产工艺简单，能源消耗低，成本低。五、实施例：例1，批号为941026
新鲜人尿38升，检查PH为6.5左右，过滤待用，按照尿液体积1∶1加入无热源水，通过直径10cm，高12cm的离子交换纤维素柱进行层析，柱子预先用含0.1克分子浓度氯化钠的0.01克分子浓度6.8的磷酸缓冲液(PBS)平衡，样品上完后，以平衡缓冲液洗至流出液无蛋白质为止，改用含0.15克分子浓度氯化钠的PBS洗至流出液中无蛋白质，改用含0.35克分子浓度氯化钠的PBS洗脱，收集洗脱峰，得1200ml，浓度为0.056mg/ml总蛋白67.2mg。加入硫酸铵至80％饱和度，0℃放置过夜，次日在4-10℃低温离心收集沉淀，溶于少量蒸馏水中，对水透析至无SO4，得87ml。蛋白质浓度为0.48mg/ml，总蛋白为42mg。取Bio-gel P30，加水，沸水浴中溶胀3分钟，用蒸馏水洗净，装柱，柱直径2.5cm，高100cm，用0.01克分子浓度PH7.0磷酸缓冲液平衡，将透析浓缩后溶液上样，每次70ml左右，以平衡缓冲液分离，可得三个峰，取第III峰，得64ml，蛋白浓度为0.108mg/ml，总蛋白量为6.9mg。经超滤除去病毒热源，再经纤维素层析用PH6.5-7.0，0.01浓度克分子磷酸缓冲液冲洗进行洗脱，收集洗脱液，最后速冻干燥即得，实得蛋白质3.8mg，此为TPO。例2.批号941102.
取新鲜人尿25.6升方法同前，经过离子交换纤维素层析得到1070ml洗脱液，硫酸铵沉淀离心、透析后得到73ml，蛋白浓度为0.52mg/ml，总蛋白为38mg，经Bio-gel凝胶柱过滤，收得活性峰56ml，蛋白浓度为0.12mg/ml，总蛋白为6.72mg，经超滤除去病毒，再经纤维素层析，实得蛋白质3.1mg，比活为103,0000u/mg为TPO成品。例3.批号941110。
取新鲜人尿24.6升，方法同例1，经过离子交换纤维素层析得到1200ml洗脱液，经硫酸铵沉淀，离心透析后得到42ml，蛋白浓度为0.565mg/ml，总蛋白为31.64mg，经过Bio-gel凝胶过滤，得到活性峰74ml，蛋白浓度为0.104mg/ml，总蛋白7.696mg，经超滤除去病毒再经纤维素层析实得蛋白质3.3mg，比活为112,000u/mg，为TPO成品。