本发明涉及生物活性的维生素D化合物。更具体地，本发明涉及1α-羟基化维生素D化合物的19-降-类似物及其制备它们的一般方法。 维生素D的1α-羟基化代谢物（最重要的是1α，25-二羟基维生素D3和1α，25-二羟基维生素D2）被称为动物和人的钙体内平衡的高效调节剂，它们在细胞分化中的活性最近也已被证实。因此已制备和试验了这些代谢物的许多结构类似物，如具有不同侧链结构、不同羟基化形式、或不同立体化学的化合物。如此类似物的重要例子是1α-羟基维生素D3、1α-羟基维生素D2、1α，25-二羟基维生素D3的各种侧链氟代衍生物，以及侧链同系类似物。几种已知的这些化合物在体内或体外呈现高效活性，并具有有利的活性特点，因此用于或已提议用于治疗各种疾病，如肾病性骨营养不良、抗维生素D佝偻病、骨质疏松症、牛皮癣和某些恶性肿瘤。
在此之前未知的一类1α-羟基化维生素D化合物是19-降-类似物，即所有维生素D系列所特有的环A的环外亚甲基（碳19）被去除，并用两个氢原子取代的化合物。这些新类似物地结构特征通过如下所示的通式Ⅰ表示：
其中，X1和X2各选自氢和酰基，R表示维生素D型化合物的已知的任何特有侧链。因此R可以是烷基、氢、羟烷基或氟代烷基，或R可以表示如下的侧链：
其中，R1表示氢、羟基或O-酰基，R2和R3各选自烷基、羟烷基和氟代烷基，或它们一起表示基团--（CH2）m--，其中m是2至5的整数，R4选自氢、羟基、氟、O-酰基、烷基、羟烷基和氟代烷基，R5选自氢、氟、烷基、羟烷基和氟代烷基，或R4和R5一起表示双键连接的氧，R6和R7各选自氢、羟基、O-酰基、氟和烷基，或R6和R7一起表示一个碳-碳双键，其中n是1至5的整数，侧链的20、22或23位的任一位上的碳原子可被O、S或N原子所取代。
侧链的特别重要例子为用如下的式（a）、（b）、（c）、（d）和（e）表示的结构，即存在于25-羟基维生素D3（a）;维生素D3（b）;25-羟基维生素D2（c）;维生素D2（d）;和25-羟基维生素D2的C-24表异构物（e）中的侧链。
在本发明书及其诸权利要求中，术语“烷基”意指所有异构形式的1至5个碳原子的烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基等，术语“羟烷基“和“氟代烷基”分别指被一个或多个羟基或氟取代的烷基，术语“酰基”意为1至5个碳原子的脂族酰基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基等，或芳族酰基，如苯甲酰基、硝基苯甲酰基或卤代苯甲酰基，术语“芳基”意指苯基-，或烷基-、硝基-或卤素取代的苯基。
用一般的通用方法，以已知的维生素D化合物为起始原料便能制得具有上述基本结构的1α-羟基-19-降-维生素D化合物。适宜的起始原料如一般结构式Ⅱ的维生素D化合物：
其中R为如上所定义的任一侧链。作为起始原料的这些维生素D是一些已知化合物或是一些可用已知方法制备的化合物。
使用Deluca等人的方法（美国专利4，195，027），将起始原料转化为相应的1α-羟基-3，5-环维生素D衍生物，它具有如下一般结构式Ⅲ，其中X表示氢，Q表示烷基，优选甲基：
在接着的步骤中，为防止1α-羟基的不需要的反应，采用标准的酰化方法，如于室温或略升温（30-70℃）下用溶于吡啶中的酰酐或酰基卤进行处理，将羟基转化为相应的酰基衍生物，即如上所述的化合物Ⅲ，其中X表示酰基。当然这里说明了本发明的方法采用了酰基保护羟基官能团，也可采用另外的标准的羟基保护基团，如烷基甲硅烷基或烷氧基烷基。这样的保护基团在本领域内是众所周知的（如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、或四氢呋喃基、甲氧基甲基），它们的使用被认为是本发明方法范围内实验细节中的途径的变化。
然后将上面得到的衍生物与四氧化锇反应制得10，19-二羟基类似物Ⅳ（其中X为酰基），用偏过碘酸钠或类似的连二醇裂解剂（如四乙酸铅）将此羟基类似物进行二醇裂解得到10-氧代-中间体，它具有如下结构式Ⅴ（其中X为酰基）：
按照Paaren等人介绍的方法〔J.Org.Chem.48，3819（1983）〕进行该两连续步骤。如果侧链单元R带有连二醇（如24、25-二羟基-或25，26-二羟基等），当然，在高碘酸盐分裂反应之前它们也需予以保护，如通过酰化、甲硅烷基化或作为异亚丙基衍生物。
在大多数情况下，如上所述的1α-羟基基团的酰化也将同时引起侧链羟基官能团的酰化，当然可适当调节酰化条件（如升温、采用较长的反应时间）以确保完全保护侧链连二醇基团。
本方法的下一步包括将10-氧代-基团还原为相应的10-醇，它具有如下表示的结构式Ⅵ（其中X为酰基，Y为羟基），当X是酰基时，该还原可方便地在大约0℃至大约室温下，于有机溶剂中，用NaBH4或等当量的氢化物还原剂有选择性地将羰基还原而使酯官能团不裂开下进行。显然，当X是一个对于还原剂稳定的羟基保护基团时，也可以使用其他任何氢化物还原剂（如LiAlH4，或类似的试剂）。
在适宜的溶剂（如吡啶）中用烷基-或芳基磺酰卤（如甲烷磺酰氯）处理10-羟基中间体得到相应的10-O-烷基-或芳基磺酰基衍生物（具有上述结构式Ⅵ的化合物，其中Y是烷基-SO2O-，或芳基-SO2O-），然后在醚溶剂中，于0℃至该溶剂的沸腾温度下用氢化铝锂或已知的类似物氢化烷基铝锂试剂直接还原此磺酸酯中间体以置换磺酸酯基团得到10-脱氧衍生物，用上述结构式Ⅵ表示，其中X和Y均为氢。如上述结构式所示，在此还原步骤中，也可使前体化合物Ⅴ的1-O-酰基官能团裂开产生游离的1α-羟基官能团，当然，正如本领域中所熟知的那样，侧链上的O-酰基保护基团也可还原为相应的游离醇官能团。如果需要的话，C-1的羟基（或侧链上的羟基）通过酰化或甲硅烷基化或成醚再予以保护而得到相应的酰基、烷基甲硅烷基或烷氧基烷基衍生物，但这样的保护是不必要的。在此还原步骤中，可保留另外的羟基保护基团，如烷基甲硅烷基或烷氧基烷基，但如需要的话，可用本领域中已知的标准方法在本方法的此步骤或以后的步骤中将其除去。
采用Deluca等人的条件（美国专利4，195，027和4，260，549），在低分子量有机酸的存在下，将上述1α-羟基-10-脱氧环维生素D中间体加溶剂分解。当在乙酸中进行溶剂分解时，得到1α-羟基-19-降-维生素D3-乙酸酯和1α-羟基-19-降-维生素D1-乙酸酯（如下的化合物Ⅶ和Ⅷ）的混合物，当用其他酸进行溶剂分解时，得到类似的1-和3-酰化产物。
然后在标准条件下直接将此混合物进行碱性水解得到所需的上述结构式Ⅰ的1α-羟基-19-降-维生素D化合物（其中X1和X2均为氢）。此外，也可将上述的单乙酸酯混合物进行分离（如通过高压液相色谱），然后得到的1-乙酸酯和3-乙酸酯异构体分别进行水解，由两者得到同一最终产物，即结构式Ⅰ的1α-羟基-19-降-维生素D化合物。当然也可按标准的方法，用任何所需的酰基，将分离出的结构式Ⅶ或Ⅷ的单乙酸酯或游离的1，3-二羟基化合物再酰化，便得到上述结构式Ⅰ的产物，其中X1和X2表示相同或不同的酰基。
1α-羟基-19-降-维生素D化合物的生物活性
本发明的新化合物有出乎意料的生物活性型式，即在促进恶性细胞分化时表现出高效性，在钙化骨组织中少或没有活性。分别概括于表1和2中的由1α，25-二羟基-19-降-维生素D3（化合物1α）所得的生物测定结果说明了这一点。表1列出了已知活性代谢物1α，25-二羟基维生素D3和19-降类似物（Ⅰa）于培养物中将人白血病细胞（HL-60细胞）诱导分化为正常细胞（单核细胞）的活性的比较。采用三种标准的分化试验测定分化活性，在表1中缩写为NBT（氮蓝四唑还原）、NSE（无特异酯酶活性）和PHAGO（吞噬作用活性）。根据已知的方法，如Deluca等人（美国专利4，717，721）和Ostrem等人，（J.Biol.Chem、262，14164，1987）所给出的方法，进行测定。对于每种测定，根据试验化合物的给定浓度，用已分化为正常细胞的HL-60细胞的百分数来表示试验化合物的分化活性。
概括于表1中的结果清楚地表明在促进白血病细胞分化中新类似物1α，25-二羟基-19-降-维生素D3（Ⅰa）和1α，25-二羟基维生素D3一样有效。1α，25-二羟基维生素D3浓度为1×10-7摩尔时在上述三种测定中均使接近90%的白血病细胞诱导分化，用19-降-类似物（Ⅰa）也达到同样的分化度（即90、84和90%）。
表1
HL-60细胞的分化作用
1α，25-二羟基维生 %被分化的细胞
素D3（摩尔/升） （平均值±SEM）
NBT NSE PHAGO
1×10-786±2 89±1 87±3
1×10-860±2 60±3 64±2
1×10-933±2 31±2 34±1
1α，25-二羟基-19
-降-维生素D3（Ⅰa）
（摩尔/升）
2×10-794±2 95±3 94±2
1×10-790±4 84±4 90±4
5×10-872±3 73±3 74±3
1×10-861±3 60±3 56±1
1×10-932±1 31±1 33±1
与前面的结果相反，新的19-降类似物（Ⅰa）在测量骨的钙化的测定中不表现活性，而这种骨的钙化活性是由维生素D化合物所激发的典型应答。概括于表2中的有关数据表示1α，25-二羟基维生素D3和1α，25-二羟基-19-降-维生素D3（Ⅰa）化合物对鼠的骨钙化活性对比的测定结果。此测定是根据Tanaka等人，Endocrinology92，417（1973）描述的方法进行的。
列于表2中的结果表明1α，25-二羟基维生素D3具有预料的骨钙化活性，其结果通过在各种剂量水平下百分骨灰和总灰量的增加来反映。相反，同维生素D-缺乏（-D）的对照组相比，19-降类似物Ⅰa在全部三种剂量水平下均未表现出活性。
表2
钙化活性
化合物 给药量＊%灰 总灰（mg）
（微微摩尔/ （平均值±SEM） （平均值±SEM）
天/7天）
-D（对照） 0 19±0.8 23±1.2
1α，25-二羟 32.5 23±0.5 34±1.6
基维生素D365.0 26±0.7 36±1.1
325.0 28±0.9 40±1.9
1α，25-二羟 32.5 22±0.9 28±1.6
基-19-降- 65.0 19±1.5 28±3.4
维生素D3（Ⅰa） 325.0 19±1.2 30±2.4
＊每一测定组包括6只鼠，接受所指定的试验化合物的量，以每天腹膜腔注射给药，七天为一周期
因此，新的19-降类似物表明具有选择活性特性，它将在诱导恶性细胞分化中的高效性与非常低的或无骨钙化活性结合在一起。因此这种新的结构类型的化合物可用作治疗恶性肿瘤的治疗剂。由于维生素D化合物对于皮肤角化细胞的分化活性（Smith等人，J.Invest.Dermatol.86，709，1986;Smith等人，J.Am.Acad.Dermatol.19，516，1988）被认为是成功治疗牛皮癣的表征（Takamoto等，Calc.Tissue Int.39，360，1986），所以证明这类化合物可用于治疗以使未分化的皮肤细胞增生为特征的这种和其他的皮肤病。这些化合物也可用于抑制甲状旁腺组织，如在肾病中发现的继发性甲状旁腺机能亢进病例（Slatopolsky等人，J.Clin.Invest.74，2136，1984）。
为治疗的目的，本发明的新化合物可用本领域内已知的常规方法进行配制，如用无毒溶剂配制成溶液，或用适宜的无毒溶剂或载体制成乳液、悬浮液或分散剂，或含固态载体的丸、片或胶囊。对于表面的应用，最好将化合物配制成乳膏或软膏或适宜于表面应用的类似的载体。任何这类制剂也可含有药物上可接受的并且无毒的其他赋形剂，如稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、着色剂或乳化剂或改味剂。
便于这些化合物给药的方式可以是注射、或适宜的无菌溶液的静脉输注，或经消化道口服、或以软膏、洗液或适宜于透过皮肤斑的形式的表面给药。为了治疗恶性肿瘤疾病，给受治疗者服用本发明化合物19-降-维生素D的剂量应足以抑制恶性细胞的增生并能诱导它们分化为正常的单核细胞-巨噬细胞。同样，为治疗牛皮癣，本发明的化合物经口服或表面给药的量应足以抑制未被分化的角化细胞的增生，在治疗甲状旁腺机能亢进时，服用的化合物的剂量应足以抑制甲状旁腺的活性，以使甲状旁腺的激素水平达到正常的范围。适宜剂量为每天1-500μg化合物，正如本领域内众所周知的那样，应根据被治疗的疾病，其严重性、治疗对象的反应或病情对其加以调整。
通过下面的说明性实施例对本发明作更具体的说明，在这些实施例中，用罗马数字和字母（即Ⅰa，Ⅰb，…，Ⅱa，Ⅱb，…等）指出的具体产物系指前面叙述中定义的具体结构和侧链的结合体。
实施例1
1α，25-二羟基-19-降-维生素D3（Ⅰa）的制备
（a）.1α，25-二羟基-3，5-环维生素D31-乙酸酯，6-甲基醚：
以25-羟基维生素D3（Ⅱa）为起始原料，按照已公开的方法（Deluca等人，美国专利4，195，027和Paaren等人，J.Org.Chem.45，3252（1980））制备已知的1α，25-二羟基-3，5-环维生素D3衍生物Ⅲa（X＝H），然后在标准条件下，把此产物乙酰化得到相应的1-乙酸酯衍生物Ⅲa（X＝Ac）。
（b）.10，19-二氢-1α，10，19，25-四羟基-3，5-环维生素D31-乙酸酯，6-甲基醚（Ⅳa）：
按照Paaren等人（J.Org.Chem，48，3819（1983））描述的一般方法，用在吡啶中的略过量摩尔的四氧化锇处理中间体Ⅲa（X＝Ac）得到10，19-二羟基化的衍生物Ⅳa。质谱m/z（相对强度），506（M+，1），488（2），474（40），425（45），396（15），285（5），229（30），133（45），59（80），43（100）。
1H NMR（CDCl3）g 0.52（3H，s，18-CH3），0.58（1H，m，3-H），0.93（3H，d，J＝6.1Hz，21-CH3），1.22（6H，s，26-CH3和27-CH3），2.10（3H，s，COCH3），3.25（3H，s，6-OCH3），3.63（2H，m，19-CH2），4.60（1H，d，J＝9.2Hz，6-H），4.63（1H，dd，1β-H），4.78（1H，d，J＝9.2Hz，7-H）。
（c）1α，25-二羟基-10-氧代-3，5-环-19-降-维生素D31-乙酸酯，6-甲基醚（Ⅴa）：
按照Paaren等人给出的方法（J.Org.Chem.48，3819，1983）用偏高碘酸钠溶液处理10，19-二羟基化中间体Ⅳa得到10-氧代-环维生素D衍生物（Ⅴa，X＝Ac）。质谱m/z（相对强度）442（M+-MeOH）（18），424（8），382（15），364（35），253（55），225（25），197（53），155（85），137（100）。1H NMR（CDCl3）δ0.58（3H，s，18-CH3），0.93（3H，d，J＝6.6Hz，21-CH3），1.22（6H，s，26-CH3和27-CH3），2.15（s，3-OCOCH3），3.30（3H，s，6-OCH3），4.61（1H，d，J＝9.1Hz，6-H），4.71（1H，d，J＝9.6Hz，7-H），5.18（1H，m，1β-H）。
也已发现此二醇分裂反应无需升温，实际上该反应一般最好在接近室温下进行。
（d）.1α-乙酸基-10，25-二羟基-3，5-环-19-降-维生素D36-甲基醚（Ⅵa.，X＝Ac，Y＝OH）：
将10-氧代衍生物Ⅴa（X＝Ac）（2.2mg，4.6umol）溶解在0.5ml乙醇中，向此溶液中加入50ul（5.3umol）NaBH4溶液（由20mg NaBH4，4.5ml水和0.5mol0.01N NaOH溶液制备的），在0℃下将该混合物搅拌约1.5小时，然后保持在0℃16小时。向此混合物中加入乙醚，有机相经盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并蒸发。粗品用硅胶色谱柱（15×1cm）纯化，用乙酸乙酯和己烷的混合物洗脱此醇Ⅵa（X＝Ac，Y＝OH）得到1.4mg（3u mol）产物。质谱m/z（相对强度）476（M+）（1），444（85），426（18），384（30），366（48），351（21），255（35），237（48），199（100），139（51），59（58）。
（e）.1α，25-二羟基-19-降-维生素D3（Ⅰa，X1＝X2＝H）：
将10-醇（Ⅵa，X＝Ac，Y＝OH）（1.4mg）溶于100μl无水CH2Cl2和10μl（14μmol）三乙胺溶液〔由12mg（16μl）三乙胺溶于100μl无水CH2Cl2所制备〕中，接着在0℃下加入7μl（5.6μmol）甲磺酰氯溶液（9mg甲磺酰氯（6.1μl）溶于100μl无水CH2Cl2中）。在0℃下将该混合物搅拌2小时，用氩气流除去溶剂，将残余物（含化合物Ⅵa，X＝Ac，Y＝CH3SO2O-）溶于0.5ml无水四氢呋喃中。0℃下加入5mg LiAlH4并将混合物在0℃下保持16小时。过量的LiAlH4用湿乙醚分解，乙醚相用水洗涤，MgSO4干燥，过滤并蒸发，得到19-降产物Ⅵa（X＝Y＝H）。
将该产物溶于0.5ml乙酸中并在55℃下搅拌20分钟，冷却此混合物，加入冰水，用乙醚萃取。乙醚相用冷的10%碳酸氢钠溶液，盐水洗涤，MgSO4干燥，过滤并蒸发，得到预期的3-乙酸基-1α-羟基-和1α-乙酸基-3-羟基异构体混合物，通过HPLC（Zorbax Sil柱，6.4×25cm，2-丙醇的己烷溶液）将其分离并纯化，得到化合物Ⅶa和Ⅷa各约70μg。UV（EtOH中）λmax 242.5（OD 0.72），251.5（OD 0.86），260（OD 0.57）。
用同样的方法，将19-降-1，25-二羟基维生素D3乙酸酯Ⅶa和Ⅷa进行水解，将每一种单乙酸酯溶于0.5ml乙醚中，并加入0.5ml0.1N的KOH甲醇溶液。在氩气氛下将混合物搅拌2小时，再加入乙醚，有机相用盐水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤并蒸发，将残余物溶于2-丙醇和己烷（1∶1）的混合物中，通过Sep Pak柱，并用同样的溶剂洗涤。蒸去溶剂，残余物用HPLC（Zorbax Sil，6.4×25cm，10%2-丙醇的己烷溶液）纯化。Ⅶa和Ⅷa的水解产物是相同的，得到66μgⅠa（X1＝X2＝H）。质谱（m/z相对强度）404（M+）（100），386（41），371（20），275（53），245（51），180（43），135（72），133（72），95（82），59（18），C26H44O3的精确计算的分子量为404.3290，实验值为404.3272，1H NMR（CDCl3）δ0.52（3H，s，18-CH3），0.92（3H，d，J＝6.9Hz，21-CH3），1.21（6H，s，26-CH3和27-CH3），4.02（1H，m，3α-H），4.06（1H，m，1β-H）5.83（1H，d，J＝11.6Hz，7-H），6.29（1H，d，J＝10.7Hz，6-H），UV（EtOH中），λmax243（OD 0.725），251.5（OD 0.823），261（OD 0.598）。
实施例2
1α-羟基-19-降-维生素D3（Ⅰb）的制备
（a）.以维生素D3（Ⅱb）为起始原料，采用实施例1a的条件，制得已知的1α-羟基-3，5-环维生素D31-乙酸酯，6-甲基醚化合物Ⅲb（X＝Ac）。
（b）.使上面实施例2a中获得的中间体Ⅲb（X＝Ac）经过实施例1b的条件的处理，得到10，19-二氢-1α，10，19，-三羟基-3，5-环维生素D31-乙酸酯，6-甲基醚Ⅳb（X＝Ac）。
（c）.按照上述实施例1c的方法，用偏高碘酸钠处理中间体Ⅳb（X＝Ac），得到1α-羟基-10-氧代-3，5-环-19-降-维生素D31-乙酸酯，6-甲基醚Ⅴb（X＝Ac）。
（d）.在上述实施例1d的条件下，将10-氧代-中间体Ⅴb（X＝Ac）还原，得到1α-乙酸基-10-羟基-3，5-环-19-降-维生素D36-甲基醚Ⅵb（X＝Ac，Y＝OH）。
（e）.按照上述实施例1e中所给出的方法处理中间体Ⅵb（X＝Ac，Y＝OH），得到1α-羟基-19-降-维生素D3（Ⅰb，X1＝X2＝H）。
实施例3
1α，25-二羟基-19-降-维生素D3的制备
（a）.以25-羟基维生素D2（Ⅱc）为起始原料。在类似于实施例1a的实验条件下，制得1α，25-二羟基-3，5-环维生素D21-乙酸酯，6-甲基醚，化合物Ⅲc（X＝Ac）。
（b）.使上面实施例3a中得到的中间体Ⅲc（X＝Ac）经过实施例1b的反应条件的处理，得到10，19-二氢-1α，10，19，25-四羟基-3，5-环维生素D21-乙酸酯，6-甲基醚，Ⅳc（X＝Ac）。
（c）.按照上述实施例1c的一般方法，用偏高碘酸钠处理中间体Ⅳc（X＝Ac），得到1α，25-二羟基-10-氧代-3，5-环-19-降-维生素D21-乙酸酯，6-甲基醚Ⅴc（X＝Ac）。
（d）.在类似于上述实施例1d的条件下，将10-氧代-中间体Ⅴc（X＝Ac）还原，得到1α-乙酸基-10，25-二羟基-3，5-环-19-降-维生素D2，6-甲基醚Ⅵc（X＝Ac，Y＝OH）。
（e）按照上述实施例1e的操作步骤处理中间体Ⅵc（X＝Ac，Y＝OH），得到1α，25-二羟基-19-降-维生素D2（ⅠcX1＝X2＝H）。
实施例4
1α-羟基-19-降-维生素D2的制备
（a）.以维生素D2（Ⅱd）为起始原料，采用实施例1a的条件，得到已知的1α-羟基-3，5-环维生素D21-乙酸酯，6-甲基醚，化合物Ⅲd（X＝Ac）。
（b）.使上面实施例4a中得到的中间体Ⅲd（X＝Ac）经过实施例1b的条件的处理，得到10，19-二氢-1α，10，19，-三羟基-3，5-环维生素D21-乙酸酯，6-甲基醚，Ⅳd（X＝Ac）。
（c）.按照上述实施例1c的方法，用偏高碘酸钠处理中间体Ⅳb（X＝Ac），得到1α-羟基-10-氧代-3，5-环-19-降-维生素D21-乙酸酯，6-甲基醚，Ⅴd（X＝Ac）。
（d）.在上述实施例1d的条件下，将10-氧代-中间体Ⅴd（X＝Ac）还原，得到1α-乙酸基-10-羟基-3，5-环-19-降-维生素D26-甲基醚，Ⅵd（X＝Ac，Y＝OH）。
（e）按照上述实施例1e中所给出的方法处理中间体Ⅵd（X＝Ac，Y＝OH），得到1α-羟基-19-降-维生素D2（Ⅰd，X1＝X2＝H）。